Изучение генетических факторов риска развития рака яичников
На правах рукописи
ПРОКОФЬЕВА ДАРЬЯ СИМОНОВНА ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ РИСКА РАЗВИТИЯ РАКА ЯИЧНИКОВ 03.02.07 – генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Уфа-2013 2
Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики человека Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН
Научный консультант: Хуснутдинова Эльза Камилевна доктор биологических наук, профессор
Официальные оппоненты: Викторова Татьяна Викторовна доктор медицинских наук, профессор, Башкирский государственный медицинский университет, зав. кафедрой биологии.
Александр Васильевич Карпухин доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение, Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук, руководитель лаборатории молекулярной генетики сложно наследуемых заболеваний
Ведущая организация: ГБОУ ВПО российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова.
Зав. кафедрой общей и медицинской генетики МБФ Ситников Владимир Федорович
Защита диссертации состоится «_» июня 2013 г. в «» часов на заседании Диссертационного совета Д 002.133.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики УНЦ РАН по адресу: 450054, Уфа, Пр. Октября, 71. ИБГ УНЦ РАН
С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, Пр. Октября, 71 и на сайтах ВАК РФ и ИБГ УНЦ РАН: vak.ed.gov.ru, ibg.anrb.ru e-mail: [email protected]
Автореферат разослан «_» мая 2013г.
Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н С.М. Бикбулатова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Во всем мире проблема заболеваемости и смертности, связанная с онкологическими заболеваниями, на протяжении многих лет занимает лидирующие позиции и является актуальной. Ежегодно от рака умирают более 4 млн. человек во всем мире (Pertmuth-Wey et al., 2009). В России за последние два десятилетия отмечается неуклонный рост показателей заболеваемости злокачественными новообразованиями, а также тенденция к "омоложению" рака.
Рак яичников (РЯ) занимает первое место по смертности среди гинекологических раков, поскольку часто заболевание диагностируется на поздних стадиях развития (III или IV). В России ежегодно регистрируют более 12000 случаев заболевания раком яичников (Чиссов с соавт., 2011). Высокий уровень заболеваемости наблюдается также в Республике Башкортостан (РБ). Ежегодно выявляют более 700 случаев рака яичников, при этом, наблюдается высокий уровень смертности от данного заболевания, около 400 человек в год (Ручкин с соавт., 2011;
Кудряшова с соавт., 2012).
На сегодняшний день не вызывает сомнения ведущая роль генетических факторов в развитии рака яичников. Высокий риск развития заболевания в первую очередь связан с нарушениями в генах BRCA1 и BRCA2 (Antoniou et al., 2005;
Janavicius, 2010). Продукты этих генов вовлечены в общий сигнальный путь ответа клетки на повреждения ДНК, который включает в себя множество участников:
BRCA1, BRCA2, CHEK2, NBN, ATM, MDC1, PALB2, RAD51D, TP53, MRE11 и другие (Petrini et al., 2003). Нарушения в генах, которые являются компонентами процессов передачи сигнала о повреждении ДНК, регуляции клеточного цикла, репарации ДНК и апоптоза, вовлечены в развитие опухолей различной локализации, в том числе РЯ (O’Donovan et al., 2010).
Эпидемиологические исследования указывают на то, что семейная история заболевания, гормональный статус, возраст, бесплодие, образ жизни, вредные привычки играют важную роль в развитии РЯ (Permuth-Wey et al., 2009).
Рак яичников относят к гормонозависимым опухолям и нарушения метаболизма эстрогенов являются одним из факторов канцерогенеза. Эстрогены могут напрямую или опосредованно влиять на образование опухоли. Под воздействием эстрогенов могут возникать спонтанные ошибки репликации ДНК.
Продукты метаболизма эстрогенов содержат активные формы кислорода и могут участвовать в повреждении ДНК. Также эстрогены способствуют пролиферации клеток с возникшей мутацией (Заридзе, 2004). Генетические нарушения в генах метаболизма эстрогенов могут приводить к изменению активности ферментов, что также может способствовать развитию гормонозависимых опухолей.
Для всестороннего и комплексного изучения рака яичников эпидемиологами, клиницистами, генетиками создан международный консорциум для проведения масштабных исследований, в том числе и полногеномного анализа ассоциаций (GWAS), который направлен на поиск новых генов, вовлеченных в патогенез заболевания (Song H. et al., 2009). В результате GWAS были обнаружены новые гены кандидаты: BNC2, MERIT40, HOXD1, TiPARP, MYC, SKAP1 и TERT, ассоциированные с раком яичников (Goode et al., 2008;
Song et al., 2009;
Goode et al., 2010, Bolton et al., 2010, Beesley et al., 2011, Bolton et al., 2012;
Pharoah et al., 2013).
Изучение генетических факторов рака яичников проводится и в России, которое, главным образом, сконцентрировано в Москве и Санкт-Петербурге (Хансон с соавт., 2000;
Suspitsin et al., 2009;
Любченко с соавт., 2010). В Республике Башкортостан существует значительное своеобразие генофонда населения, формирование которого имеет длительную и сложную историю, что должно отражаться на структуре заболеваемости онкопатологиями, в том числе и рака яичников.
На основании всего вышеизложенного нами были сформулированы цель и задачи исследования.
Цель работы: молекулярно-генетическое изучение рака яичников в Республике Башкортостан.
Задачи исследования:
1. Провести скрининг мутаций c.5266dupC, с.181TG и c.4034delA в гене BRCA1, c.5946delT в гене BRCA2, CHEK2dele9,10(5kb), c.444+1GA, c.1100delC и c.470TC в гене CHEK2, с.5932GT в гене ATM, c.657del5 в гене NBN, инсерции с.3855ins123 в гене MDC1 у больных РЯ.
2. Провести поиск изменений нуклеотидной последовательности в гене PALB у больных раком яичников.
3. Провести поиск изменений нуклеотидной последовательности в гене RAD51D у больных раком яичников с семейной формой заболевания.
4. Изучить динамику репарации ДНК от двунитевых разрывов после воздействия радиации в клетках (LCL), гомозиготных по инсерции с.3855ins123 в гене MDC1.
5. Провести анализ ассоциации 8 однонуклеотидных полиморфных вариантов rs3814113 в регионе 9p22.2, rs8170 в гене MERIT40, rs2072590 в регионе 2q31, rs2665390 в гене TiPARP, rs10088218 в регионе 8q24, rs9303542 в гене SKAP1, rs2736108 и rs2736109 в гене TERT с риском развития рака яичников.
6. Провести анализ ассоциации 5 полиморфных локусов rs762551, rs2740574, rs1056836, rs4680 и rs700519 в генах метаболизма эстрогенов CYP1A2, CYP3A4, CYP1B1, COMT и CYP19, соответственно, с риском развития рака яичников.
Научная новизна исследования. Проведено молекулярно-генетическое изучение рака яичников в Республике Башкортостан на репрезентативных выборках больных РЯ (n=243) и контрольной группы (n=374). С высокой частотой обнаружена мутация c.5266dupC в гене BRCA1 (5,3%). У больных РЯ впервые выявлена мутация p.R145W в гене CHEK2 с частотой 0,8% у женщин русского и татарского происхождения. Впервые обнаружены мутация c.172_175delTTGT в гене PALB2 у больной РЯ (0,4%) русской этнической принадлежности и новый полиморфный вариант c.26TA (p.L9L).
Впервые дана оценка ассоциации полиморфных вариантов rs3814113 в регионе 9p22.2, rs8170 в гене MERIT40, rs2072590 в регионе 2q31, rs2665390 в гене TiPARP, rs10088218 в регионе 8q24, rs9303542 в гене SKAP1, rs2736108 и rs2736109 в гене TERT с раком яичников при анализе больных из РБ. Обнаружена ассоциация полиморфного локуса rs2072590, расположенного на хромосоме 2q31, c РЯ в общей выборке больных (OR=1.5, 95% CI 1.0-2.1, p=0.045). Выявлена ассоциация полиморфного варианта rs8170 в гене MERIT40 с риском развития РЯ у русских (OR= 0.5;
95% CI 0.3-0.9, p=0.03).
Проведен анализ ассоциации 5 полиморфных вариантов генов системы метаболизма эстрогенов rs762551/CYP1A2, rs2740574/CYP3A4, rs105683/CYP1B1, rs4680/COMT и rs700519/CYP19 с РЯ у женщин из РБ. Показано, что данные полиморфные варианты не являются маркерами риска развития рака яичников.
Научно-практическая значимость работы. Данные, полученные в результате нашего исследования, расширяют знания о генетических основах предрасположенности к развитию рака яичников. Результаты диссертационной работы востребованы при медико-генетическом консультировании в Республике Башкортостан и при проведении ДНК – тестирования.
Материалы диссертации могут быть включены в курс лекций биологических факультетов университетов, медицинских ВУЗов, на курсах повышения квалификации медицинских работников.
Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на Всероссийской конференции, посвященной 10-летию кафедры генетики БГПУ им. М.
Акмуллы, приуроченной к ежегодным Вавиловским чтениям (Уфа, 2009);
VI съезде общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010);
II Всероссийской научно практической конференции “Медико-биологические аспекты мультифакториальных патологий” (Курск, 2011);
Международной конференции по генетике человека (Amsterdam, 2011);
II Всероссийской школе молодых ученых уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии (Уфа, 2011);
V Всероссийской конференции с международным участием “Пренатальная диагностика и генетический паспорт основа профилактической медицины в век нанотехнологий (Санкт-Петербург, 2012);
Всероссийской школе-конференции молодых ученых: “Актуальные проблемы генетики человека, животных, растений и микроорганизмов” (Уфа, 2012).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ, из которых статей в иностранных журналах и 2 в российских изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 190 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов работы, главы результатов исследований и их обсуждений, выводов и перечня цитируемой литературы, состоящего из 297 источников ( отечественных и 285 зарубежных). Рукопись содержит 36 таблиц и 60 рисунков.
Благодарность. Автор данной работы выражают благодарность доктору биологических наук, профессору Эльзе Камилевне Хуснутдиновой, доктору естественных наук T. Doerk и доктору естественных наук Богдановой Н.В.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы исследования. Работа выполнена на образцах ДНК, выделенных из крови 243 больных с диагнозом «рак яичников». Материал собран в отделении гинекологии Клинического онкологического диспансера Министерства Здравоохранения РБ г. Уфы и онкологического отделения Городской клинической больницы № 1 (n=87) г. Стерлитамака, за период 2007 -2012 гг. Забор крови осуществлялся на базе вышеуказанных лечебных учреждений после осмотра исследуемых групп. Данные о каждой пациентке со злокачественным новообразованием яичников, собранные путем опроса, объективного и физикальных методов обследования, занесены в специально разработанную нами формализованную карту, на основании которой создана компьютерная база данных.
Средний возраст манифестации заболевания у женщин с РЯ составляет 50 лет (17 - 76 лет). По этническому составу группа больных РЯ не однородна: русские – (52%), татары – 51 (27%), украинцы - 13 (7%), башкиры - 7 (4%), чуваши – 6 (3%), метисы - 10 (5%), к оставшимся 2% относятся представители других этнических групп (Рис. 1). Среди 243 больных РЯ у 20 женщин отмечены случаи заболевания РЯ и/или РМЖ в семье. Репродуктивная функция на момент манифестации заболевания сохранена у 49% пациенток, в состоянии менопаузы - 51% больных.
Поражение обоих яичников выявлено у 62% женщин с РЯ. В выборке больных РЯ, в основном, преобладают серозные опухоли.
Чуваши 3% Метисы 5% др. нац. 2% Башкиры 4% Украинцы 7% Русские 52% Татары 27% Рис. 1. Этнический состав больных РЯ (%).
Контрольную выборку составили 374 женщины без онкологической патологии, проживающие в РБ. По этническому составу контрольная группа соответствует группе больных РЯ: русские – 46%, татары - 33%, башкиры – 8%, чуваши –6 %, украинцы- 2%, метисы – 2%, к оставшимся 3% относятся представители других этнических групп. Средний возраст женщин из контрольной группы составил 41 год (18 - 69 лет).
Для сравнительного анализа на отдельных этапах выполнения работы были использованы образцы ДНК 977 больных раком молочной железы (РМЖ). Средний возраст пациенток с РМЖ - 52 года.
Все участники исследования дали информированное согласие на проведение молекулярно-генетических исследований. Работа одобрена биоэтическим комитетом ИБГ УНЦ РАН.
В работе были использованы лимфобластоидные клеточные линии: L (клеточная линия здорового донора);
L493 (клеточная линия, гомозиготная по инсерции с.3855ins123 в гене MDC1);
L226 (клеточная линия, дефицитная по NBN);
L56 (клеточная линия, дефицитная по ATM).
Методы исследования. Выделение ДНК из периферической крови проводили методом последовательной фенольно-хлороформной экстракции по Мэтью (Mathew, 1984). В работе применялись следующие методы: полимеразная цепная реакция (ПЦР);
анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ);
анализ кривых плавления с высокой разрешающей способностью (HRM) на Rotor-Gene или с использованием CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System флуоресцентного красителя Eva Green;
дискриминация аллелей TaqMan (Applied Biosystems);
прямое секвенирование на автоматическом секвенаторе ABI PRISM согласно протоколу фирмы производителя;
Вестерн-блот анализ;
иммуно цитохимический анализ.
Математическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ: MS Office Excel 2003 (Microsoft), STATISTICA v.6.0. (StatSoft), BIOSTAT (Гланц, 1999);
попарное сравнение частот аллелей и генотипов в группах больных и контроля – с помощью критерия 2 (p) для таблиц сопряженности 2x2 с поправкой Иэйтса на непрерывность;
анализ силы ассоциаций – с помощью значений показателя соотношения шансов Odds Ratio (OR) (Schlesselman et al., 1982);
анализ межгенных взаимодействий – с помощью программ MDR (Richie et al., 2001) и GMDR (Lou et al., 2007;
Chen et al., 2011).
ДИЗАЙН ИССЛЕДОВАНИЯ Больные РЯ/контроль Определение Скрининг мутаций Поиск изменений функциональной нуклеотидной c.5266dupC, c.4034delA, с.181TG в гене BRCA1;
значимости последовательности инсерции c.5946delT в гене BRCA2;
в генах PALB2 и с.3855insC в гене dele9,10(5kb), c.444+1GA, RAD51D c.1100delC и полиморфного Методы: MDC варианта c.470TC в гене - HRM Методы:
CHEK2;
c.657del5 в гене NBN;
- секвенирование.
с.5932GT в гене ATM - Вестерн-блот;
Методы: - иммуно - аллель-специфическая ПЦР цитохимический - аллель-специфическая анализ.
дуплексная ПЦР - ПДРФ анализ - дискриминация аллелей TaqMan.
- секвенирование Ассоциативные исследования По данным GWAS: Гены метаболизма эстрогенов:
- rs3814113/9p22.2;
- rs762551/CYP1A2;
- rs8170/19p13.11;
- s2740574/CYP3A4;
- rs2072590/2q31;
- rs105683/CYP1B1;
- rs2665390/3q25;
- rs4680/COMT;
- rs10088218/8q24;
- rs700519/CYP19.
- rs9303542/17q21;
Методы: ПДРФ анализ.
- rs2736108/ TERT;
- rs2736109/TERT.
Методы: дискриминация аллелей TaqMan.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Скрининг мутаций в генах BRCA1, BRCA2, CHEK2, ATM, NBN у больных РЯ.
BRCA1 - ген, ассоциированный с раком молочной железы, 1. В нашем исследовании проведен скрининг мутаций c.5266dupC, c.4034delA, с.181TG в гене BRCA1 у 243 больных РЯ. Мутация c.5266dupC выявлена в общей выборке больных с наибольшей частотой, которая составляет 5,3% (13/243), OR: 10.3;
95% CI 2.3-46.0;
p=0.0005. Дупликация c.5266dupC выявлена у женщин, принадлежащих к разным этническим группам: русские – 5/13, татары – 5/13, башкиры -2/13, украинцы -1/13.
Средний возраст манифестации заболевания у носительниц мутации c.5266dupC в гене BRCA1 – 51 год. У двух пациенток отмечается семейная история РМЖ и/или РЯ.
У 8/13 больных РЯ с дупликацией c.5266dupC в гене BRCA1 наблюдается поражение обоих яичников. 4 пациентки находились в менопаузе в момент постановки диагноза.
Известно, что мутация c.5266dupC в гене BRCA1 широко распространена в разных популяциях мира, но максимальной частоты достигает у больных РЯ в Восточной Европе (Польша – 7.7%, Латвия – 4,8%, Чешская Республика – 8%, Белоруссия – 12,9%) (Рис. 2).
Рис. 2. Частота мутации c.5266dupC в гене BRCA1 у больных раком яичников в европейских странах (Van der Looij et al., 2000;
Menkiszak et al., 2003;
Zikan et al., 2005;
Ferla et al., 2007;
Bogdanova et al., 2010;
Plakhins et al., 2011).
Мутация с.181TG в гене BRCA1 выявлена в нашей выборке больных раком яичников с частотой 1,2% (3/243). Средний возраст манифестации заболевания у женщин с данной мутацией 47 лет. У одной пациентки отмечается заболевание РМЖ в семье (I степень родства). По этническому составу женщины с мутацией с.181TG разного происхождения: татары – 2, русские – 1. Согласно литературным данным, мутация с.181TG в гене BRCA1 также встречается у больных РЯ из Белоруссии 1,5% (Bogdanova et al., 2010), Чешской Республики - 9.8% (Machackova et al., 2008) и Польши - 3,6% (Menkiszak et al., 2003).
Среди больных раком яичников из Республики Башкортостан число носительниц мутаций c.5266dupC и с.181TG в гене BRCA1 выше в группе пациенток с семейной формой заболевания, чем в группе женщин со спорадическим РЯ (15% (3/20) и 6% (13/223), соответственно).
Делеция c.4034delA в гене BRCA1 не обнаружена среди больных РЯ и здоровых доноров из нашего региона.
CHEK2 - ген киназы сверочных точек 2. В нашей работе проведен скрининг мутаций CHEK2dele9,10(5kb), c.444+1GA, c.1100delC и c.470TC в гене СНЕК2 у 243 больных РЯ и 368 человек контрольной группы. Мутация CHEK2dele9,10(5kb) выявлена у 2 (0.8%) женщин русской этнической принадлежности. У обеих пациенток диагноз РЯ был установлен в период постменопаузы. У одной из носительниц этой мутации отмечается поражение обоих яичников.
Мутация сайта сплайсинга c.444+1GA в гене СНЕК2 не определена у больных РЯ из РБ, но обнаружена в контрольной выборке с частотой 0,5%. Мутация с.
1100delC не выявлена ни у больных РЯ, ни у здоровых индивидов.
В результате секвенирования 2 и 3 экзонов гена СНЕК2 в нашей выборке больных РЯ выявлено 2 (0,8%) женщины с мутацией р.R145W. Согласно данным литературы, мутантная форма p.R145W в FHA домене киназы СНЕК2 не фосфорилируется через АТМ и не активируется под действием ионизирующего облучения, что было показано в работе Wu et al. (Wu et al., 2001).
Известно, что мутации в гене СНЕК2 ассоциированы с риском развития РМЖ (Bogdanova et al., 2005;
Gorski et al., 2005;
Cybulski et al., 2007), результаты исследований у больных РЯ не многочисленны и противоречивы. В нашей работе показано, что нарушения в гене СНЕК2 не вносят значительного вклада в формирование генетической предрасположенности к РЯ, частота двух мутаций CHEK2dele9,10(5kb) и р.R145W в выборке больных РЯ составляет 1,6%.
ATM (ген атаксии телеангиэктазии), NBN (ген нибрина), BRCA2 (ген, ассоциированный с раком молочной железы, 2). У больных раком яичников и в группе контроля из РБ мутации c.5946delT в гене BRCA2, с.5932GT в гене ATM и c.657del5 в гене NBN не обнаружены.
Анализ кодирующего региона гена PALB2 (партнер и локализатор BRCA2) у больных раком яичников.
В 2006 году был открыт новый участник комплекса белков, вовлеченных в репарацию повреждений ДНК, PALB2. Протеин PALB2 необходим для локализации BRCA2 в участках повреждения ДНК и взаимодействия белков BRCA1 и BRCA2 (Xia et al, 2007).
В нашей работе проведен поиск изменений нуклеотидной последовательности кодирующей части гена у 243 больных РЯ. Выявлены мутация PALB c.172_175delTTGT (Рис. 3) и 9 полиморфных вариантов, один из которых обнаружен впервые (Таблица 1).
Мутация определена у одной женщины русского c.172_175delTTGT этнического происхождения, что составляет 0,4%. В результате делеции четырех нуклеотидов, расположенной в 3 экзоне гена PALB2, происходит сдвиг рамки считывания и формирование преждевременного стоп-кодона, что приводит к синтезу укороченного белка, неспособного связывать протеины BRCA1 и BRCA2 и определять положение белка BRCA2 в ядре. У женщины с данной мутацией диагностирована серозная карцинома с высокой степенью злокачественности и с поражением обоих яичников в возрасте 46 лет. Ранее у этой пациентки была диагностирована меланома кожи. Согласно литературным данным, делеция c.168_175del4 (c.172_175delTTGT) в гене PALB2 также обнаружена у больной РМЖ, проживающей в Ирландии (Casadei et al., 2011).
c.172_175delTTGT c.172_175delTTGT в) Рис. 3. а, б. Анализ кривых плавления с высокой разрешающей способностью (HRM): а) нормированный график кривых HRM образцов без мутации и с мутацией c.172_175delTTGT;
б) кривые плавления образцов в норме и с делецией c.172_175delTTGT;
в) фрагмент нуклеотидной последовательности гена PALB2 с мутацией c.172_175delTTGT.
Дополнительно, нами был проведен поиск выявленной делеции в группе из больных РМЖ из РБ и обнаружены три (0,3%) носительницы мутации c.172_175delTTGT в гене PALB2. У двух пациенток с РМЖ диагноз был поставлен в возрасте до 50 лет, у одной из них отмечается семейная история заболевания. Все женщины с выявленной мутацией были русской этнической принадлежности.
Возможно, что c.172_175delTTGT является специфичной мутацией для славянских популяций.
Таблица 1.
Изменения, выявленные в гене PALB2, у больных раком яичников из Республики Башкортостан.
Число Изменения на Изменения на пациентов Час Экзон нуклеотидном аминокислот- с тота, Ссылка уровне ном уровне изменения- % ми (n) 5 c.-47GA - 11 4,3 rs UTR данное c.26TA p.L9L 1 0, исследование c.172_175delTT p.S58fsX8 1 0,4 Casadei et al.
GT c.212-58AC - 4 1,6 rs c.1010TC p.L337S 1 0,4 rs c.1676AG p.Q559R 51 20 rs c.2014CG p.E672Q 18 7,1 rs c.2794GA p.V932M 2 0,8 rs c.2993GA p.G998E 9 3,5 rs c.3300TG p.T1100T 14 5,5 rs Таким образом, результаты нашей работы говорят в пользу того, что ген PALB ассоциирован с раком яичников, но мутации в этом гене встречаются с низкой частотой. Спектр мутаций данного гена ограничивается одним вариантом, который также выявлен у больных РМЖ славянского происхождения.
Анализ кодирующего региона гена RAD51D (RAD51 гомолог D (S.
cerevisiae)) у больных раком яичников с семейной историей рака яичников и/или рака молочной железы Известно, что мутации в гене RAD51D ассоциированы с высоким риском развития наследственного РЯ (Loveday et al., 2011). В ходе нашей работы проведено прямое секвенирование 10 экзонов гена RAD51D у 15 больных раком яичников.
Выборка сформирована с учетом семейной истории заболеваний РЯ и/или РМЖ, у которых не обнаружено мутаций в генах BRCA1 и BRCA2. В результате исследования у двух пациенток выявлено два полиморфных варианта rs9901455 и rs4796033 (Рис.
4). Мутаций в гене RAD51D, приводящих к потере функции белка, не обнаружено.
а) б) Рис. 4. Фрагменты нуклеотидной последовательности гена RAD51D: а) полиморфный вариант rs9901455;
б) полиморфный вариант rs4796033.
Изучение особенностей репарации ДНК после ионизирующего облучения в лимфобластоидных клетках с инсерцией с.3855ins123 в гомозиготном состоянии в гене MDC1 (медиатор сверочных точек повреждений ДНК 1).
Ген MDC1 рассматривается в качестве гена-кандидата при изучении онкологических заболеваний. Белок MDC1 является важным модулятором в процессе передачи сигнала о повреждении ДНК. Взаимодействие MDC1 с белком ATM способствует пролонгированной локализации последнего в местах двунитевых разрывов ДНК и фосфорилированию отдаленных молекул гистонов H2AX, что, в свою очередь, содействует распространению и усилению первоначального сигнала о повреждении ДНК (Lou et al., 2006). Протеин MDC1 действует не только как сенсор о повреждении хроматина (взаимодействуя с -H2AX), но и как сенсор для активации ATM (So et al., 2009).
В результате совместных исследований с коллегами из Медицинской школы Ганновера (Германия) при анализе гена MDC1 была выявлена ранее не описанная в литературе инсерция c.3855ins123. Это изменение приводит к удлинению белка на аминокислоту. В выборке РЯ инсерция определена у 12/243 (5%) женщин.
Дополнительно данный локус был изучен в выборке больных РМЖ, где были обнаружены две гомозиготные носительницы с.3855ins123 в гене MDC1. Для оценки функциональной роли инсерции был проведен ряд экспериментов.
От пациентки, являющейся гомозиготой по инсерции с.3855ins123 в гене была установлена лимфобластоидная клеточная линия с помощью MDC1, иммортализации периферических В-лимфоцитов крови вирусом Эпштейна-Барра (EBV) – L493. В работе также были использованы клеточные линии лимфобластов от здорового донора L325, а также, дефицитная по NBN - L226 и дефицитная по ATM L56 (Медицинская школа Ганновера, Германия).
На первом этапе проведен Вестерн-блот для анализа уровня белков SMC1 (Ser 969), KAP1 (Ser-824), CHEK2 (Ser-19) в облученных (6 Гр) и не облученных клетках.
В качестве количественного контроля был использован -actin (Рис. 5).
Анализируемые протеины являются основными эффекторами MDC1. Белок SMC1 (Structural maintenance of chromosomes 1) выполняет важную роль в процессах сцепления сестринских хроматид, конденсации хромосом, рекомбинации и репарации ДНК. В ответ на повреждение ДНК MDC1 опосредованно регулирует активацию протеина SMC1 Белок MDC1 также регулирует (Stewart et al., 2003).
фосфорилирование фактора конденсации хроматина KAP1 (Kruppel-associated Box (KRAB)-associated protein 1) (Noon et al., 2009), который в ответ на повреждение ДНК фосфорилируется белком ATM в позиции Ser-824, взаимодействует с конденсированным хроматином и вызывает релаксацию нуклеосом. В отсутствие фосфорилированного KAP1 происходит задержка репарации гетерохроматина (Yuan et al., 2009). В ответ на ионизирующее излучение белок MDC1 через FHA домен связывается с киназой CHEK2 и способствует фосфорилированию протеина р53 (Lou et al., 2003). Белок CHEK2 также необходим для деградации фосфатазы Cdc25A, препятствуя, тем самым, активации циклин-зависимой киназы Cdk2 и инициации репликации ДНК (Falck et al., 2002).
В результате проведенного анализа не было обнаружено различий в количестве белков SMC1, KAP1, CHEK2 между клетками L325 и L493, в отличие от клеток, дефицитных по или для которых характерна повышенная ATM NBN, чувствительность к ионизирующей радиации.
- + - + - + - + p. SMC 170 kDa (Ser 969) p. KAP1 150 kDa (Ser 824) 62 kDa p. CHEK (Ser19) 37 kDa -actin L 325 L 493 L 226 L N ins123 NBN ATM Т Рис. 5. Вестерн-блот анализ фосфорилированных белков SMC1, KAP1 и CHEK2. L 325 – клеточная линия здорового донора;
L 493 – клеточная линия, гомозиготная по инсерции с.3855ins123 в гене MDC1;
L 226 – клеточная линия, дефицитная по NBN;
L 56 – клеточная линия, дефицитная по ATM.
На втором этапе для оценки уровня двунитевых разрывов ДНК и эффективности их репарации использовался метод анализа флуоресцентных фокусов белков репарации ДНК H2AX и 53BP1. Клетки опухолевой линии от больного, гомозиготного по MDC1(ins123bp), подвергались воздействию ионизирующей радиации 6Gy.
Известно, что гистон Н2АХ немедленно фосфорилируется в сайтах повреждений ДНК и фосфорилированный Н2АХ (-Н2АХ) может быть визуализирован с применением специфичных антител. Гистон -Н2АХ локализуется точно на двунитевых разрывах и служит идеальным маркером для их визуализации.
Другим не менее важным маркером двунитевых разрывов ДНК является белок 53BP1, который формирует дискретные ядерные "фокусы" при действии ионизирующей радиации и колокализуется с Н2АХ и DNA-PK. Идентификация этих белков позволяет получить полную информацию о локализации двунитевых разрывов в ядре, их количестве, эффективности и кинетике репарации повреждения.
Уровень фокусов H2AX оценивали через 24 часа и 48 часов, в случае 53BP через 1 час, 24 часа и 48 часов после облучения (Рис. 6). Увеличение числа фокусов отмечалось через один час. Поскольку радиационно-индуцированные фокусы белков репарации ДНК – это динамичная структура, и их количество точно отражает количество двунитевых разрывов, в норме через 24 часа должно происходить восстановление поврежденных участков ДНК, уменьшение числа и исчезновение фокусов фосфорилированного гистона H2AX и медиаторного белка 53BP1. Нами были проведены 3 повторности эксперимента.
а) б) Рисунок 6. а) Иммуно-цитохимический анализ фокусов -H2AX и 53BP1 в клеточной линии здорового донора (L325);
б) в лимфобластоидной клеточной линии, гомозиготной по с.3855ins123 гена MDC1 (L493): UNT - необлученные клетки;
6Gy 1h - облученные клетки, 1 час после облучения;
6Gy 24h - облученные клетки, 24 ч.
после облучения;
6Gy 48h - облученные клетки, 48 ч. после облучения. DAPI окраска ядра;
-H2AX - окраска гистона -H2AX;
53BP1 - окраска белка 53BP1;
Merge - все красители вместе.
Динамика образования фокусов белка 53BP1 не различалась между клеточными линиями L325 и L493. При этом, кинетика формирования фокусов гистона -H2AX в клетках L493 отличалась от таковой в клетках L325 и была ближе к клеткам L56, для которых характерны нарушения в активации точек проверки клеточного цикла и репарации двунитевых разрывов, от пациентки с синдромом Атаксия-Телеангиэктазия (Рис. 7). Количество фокусов -H2AX через 24 и 48 часов после облучения не достигало исходного уровня, характерного для нормальных клеток без каких-либо нарушений, что указывает на задержку репарации ДНК в клетках гомозиготных по инсерции с.3855ins123 в гене MDC1.
-H2AX 53BP 12 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 13 4 1 34 13 4 1 L325 L493 L226 L56 L325 L493 L226 L Рис. 7. Количество фокусов -H2AX и 53BP1: 1 – необлученные клетки;
2– облученные клетки, через 1 час после облучения, с дозой радиации 6Gy;
3 – облученные клетки, через 24 часа после облучения, с дозой радиации 6Gy;
4– облученные клетки, через 48 часов после облучения, с дозой радиации 6Gy.
Таким образом, изучение особенностей репарации ДНК в клетках лимфобластов после воздействия ионизирующего излучения показало, что восстановление поврежденной ДНК в клетках с инсерцией с.3855ins123 в гене MDC происходит не полностью, что может способствовать накоплению мутаций и дальнейшей злокачественной трансформации клеток.
Анализ ассоциаций полиморфных вариантов 8 rs3814113/9p22.2, rs8170/19p13.11, rs2072590/2q31, rs2665390/3q25, rs10088218/8q24, rs9303542/17q21, rs2736108 и rs2736109 в гене TERT с раком яичников В качестве другого подхода к изучению генетических факторов, предрасполагающих к развитию рака яичников, мы использовали анализ ассоциаций полиморфных вариантов, оперируя значениями частот аллелей и генотипов при сравнении группы больных и контроля. Выбор исследуемых локусов базировался на данных полногеномных исследований SNPs (Song et al., 2009;
Goode et al., 2010, Bolton et al., 2010, Beesley et al., 2011).
Нами поведен анализ 8 полиморфных локусов rs3814113 в регионе 9p22.2, rs8170 в области 19p13.11, rs2072590 на хромосоме 2q31, rs2665390 в регионе 3q25, rs10088218/8q24 на длинном плече хромосомы 8, rs9303542 в регионе 17q21, rs2736108 и rs2736109 в гене TERT в выборках больных РЯ и контрольной группе.
В результате нашего исследования установлено, что локус rs2072590 в регионе 2q31 ассоциирован с раком яичников в общей выборке больных, OR= 1.5, 95% CI 1.0 2.1, p=0.045 (Рис. 8). Однако, сравнительный анализ частот аллелей и генотипов между группами больных и контроля в разных этнических группах достоверных различий не выявил.
Полиморфный вариант rs2072590 локализован на второй хромосоме в области, содержащей семейство гомеобоксных генов, необходимых для регуляции процессов эмбриогенеза и органогенеза, в некодирующем регионе между генами HOXD3 и HOXD1. Оба гена вовлечены в процесс опухолеобразования (Okubo et al., 2002, Jacinto et al., 2007).
OR=1.42, p= 0. Рис. 8. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного варианта rs2072590/2q31 среди больных РЯ и здоровых женщин.
У больных раком яичников из РБ выявлена ассоциация полиморфного варианта rs8170, локализованного в гене MERIT40 (медиатор взаимодействия и связывания, 40 KD)), с РЯ у русских, OR=0.5, 95% CI 0.3-0.9, p= 0.03 (Рис. 9).
Известно, что продукт гена MERIT40 способствует пролонгированной локализации протеина BRCA1 в местах двунитевых разрывов (Wang et al., 2009). В работе Bolton et al. при проведении GWAS была показана ассоциация полиморфного варианта rs8170 с высоким риском развития эпителиального РЯ (OR= 1.12;
95%, CI 1.07–1.17, p=3.6106) (Bolton et al., 2010).
OR= 0.6, p= 0. OR= 0.5, p= 0. Рис. 9. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного варианта rs8170 в гене MERIT40 у больных РЯ и контрольной группы русской этнической принадлежности.
Анализ ассоциации полиморфных локусов rs762551 в гене CYP1A2, rs2740574 в гене CYP3A4, rs1056836 в генеCYP1B1, rs4680 в гене COMT и rs в гене CYP19 с раком яичников.
В работе изучено 5 полиморфных вариантов генов системы метаболизма эстрогенов rs762551 в гене CYP1A2, rs2740574 в гене CYP3A4, rs105683 в гене CYP1B1, rs4680 в гене COMT и rs700519 в гене CYP19 у больных раком яичников и в контрольной группе. Данные полиморфные локусы влияют на каталитическую активность ферментов, что приводит к изменениям в процессах синтеза и метаболизма эстрогенов, что в свою очередь может способствовать развитию гормонозависимых опухолей (Badawi et al., 2001;
Lord et al., 2007;
Tao et al., 2007;
Onsory et al., 2008).
Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфных локусов в генах CYP1A2, CYP3A4, CYP1B1, COMT и CYP19 не выявил достоверных различий между больными РЯ и контрольной группой, как в целом, так и при разделении по этническим группам. Наши данные не согласуются с результатами исследований других авторов. Например, в одной из работ Mikhailova et al. (2006) была показана ассоциация полиморфного варианта rs762551 в гене CYP1A2 с риском развития РЯ (OR:0.50, p= 0.0003). Данное несоответствие можно объяснить как небольшим объемом анализируемых групп, так и их этнической гетерогенностью.
Исследование роли межгенных взаимодействий в формировании предрасположенности к раку яичников В нашей работе проведено моделирование межгенных взаимодействий исследованных полиморфных локусов: 1 – [rs3814113/9p22.2, rs8170/19p13.11, rs2072590/2q31, rs2665390/3q25, rs10088218/8q24, rs9303542/17q21, rs2736108/TERT и rs2736109/TERT] и 2 – [rs762551/CYP1A2, rs2740574/CYP3A4, rs105683/CYP1B1, rs4680/COMT и rs700519/CYP19] в отношении риска развития РЯ с помощью программ MDR и GMDR (Ritchie et al., 2001;
Lou et al., 2007), которые позволяют выбрать комбинации генных локусов, обладающих наибольшей значимостью в патогенезе РЯ. Однако, в результате данного анализа, не было выявлено статистически значимых моделей межгенных взаимодействий.
ВЫВОДЫ Мутации c.5266dupC и с.181TG в гене BRCA1 обнаружены у женщин с раком 1.
яичников разной этнической принадлежности с частотой 5,3% и 1,2%, соответственно. Идентифицированные мутации встречаются у больных раком яичников с семейной формой заболевания с более высокой частотой (15%), по сравнению со спорадическими случаями (6%). Мутация c.4034delA в гене BRCA1 не выявлена.
В гене киназы CHEK2 у женщин с раком яичников русской и татарской 2.
этнической принадлежности обнаружены мутации dele9,10(5kb) (0,8%) и p.R145W Мутации c.5946delT в гене с.5932GT в гене атаксии (0,8%). BRCA2, телеангиоэктазии (ATM) и c.657del5 в гене нибрина (NBN) у пациенток с раком яичников из Республики Башкортостан не выявлены.
В гене партнера и локализатора BRCA2 (PALB2) у женщин с раком яичников 3.
впервые обнаружены мутация c.172_175delTTGT с частотой 0,4% и полиморфный вариант c.26TA (0,4%).
В гене гомолога D S. cerevisiae RAD51 (RAD51D) у больных раком яичников с 4.
семейной формой заболевания обнаружены полиморфные варианты rs9901455 (20%) и rs4796033 (13,3%). Мутаций, приводящих к синтезу укороченного белка RAD51D, не выявлено.
Инсерция с.3855ins123 в гене медиатора сверочных точек повреждений ДНК 5.
(MDC1) определена у 5% женщин с раком яичников. Установлено, что при воздействии ионизирующей радиации изменяется динамика накопления фосфорилированного гистона -H2AX в лимфобластоидных клетках, гомозиготных по инсерции с.3855ins123 в гене MDC1, по сравнению с клетками здорового донора, что свидетельствует о задержке репарации ДНК.
Выявлена ассоциация полиморфного варианта rs2072590, расположенного в 6.
регионе 2q31, с риском развития рака яичников (OR=1.5, 95% CI 1.0-2.1, p=0.045) и полиморфного варианта rs8170 в гене MERIT40 у русских (OR= 0.5;
95% CI 0.3-0.9, p=0.03).
Ассоциации полиморфных вариантов rs762551, rs2740574, rs105683, rs4680 и 7.
rs700519 в генах метаболизма эстрогенов CYP1A2, CYP3A4, CYP1B1, COMT и CYP19, соответственно, с риском развития рака яичников не обнаружено.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ 1. Prokofyeva, D. Rare occurrence of PALB2 mutations in ovarian cancer patients from the Volga-Ural region / D. Prokofyeva, N. Bogdanova, M. Bermisheva, G. Zinnatullina, P.
Hillemanns, E. Khusnutdinova, T. Drk. // Clinical Genetics. 2012. V. 82 (1):P. 100-101.
2. Prokofyeva, D. Nonsense mutation p.Q548X in BLM, the gene mutated in Bloom’s syndrome, is associated with breast cancer in Slavic populations / D. Prokofyeva, N.
Bogdanova, N. Dubrowinskaja, М. Bermisheva, Z. Takhirova, N. Antonenkova, N.
Turmanov, I. Datsyuk, S. Gantsev, H. Christiansen, Tjoung-Won Park-Simon, P.
Hillemanns, E. Khusnutdinova, T. Doеrk // Breast Cancer Res Treat. 2013. V. 137(2): P.
533-539.
3. Ghoussaini, M. Genome-wide association analysis identifies three new breast cancer susceptibility loci / M. Ghoussaini, O. Fletcher, K. Michailidou, C. Turnbull, M.
Bermisheva, D. Prokofieva, E. Khusnutdinova et al. // Nature Genetics. 2012. V. 44 (3): P.
312-318.
4. Lambrechts, D. 11q13 is a Susceptibility Locus for Hormone Receptor Positive Breast Cancer / D. Lambrechts, T. Truong, C. Justenhoven, M.K. Humphreys, E. Khusnutdinova, M. Bermisheva, D. Prokofyeva et al. // Human mutation. 2012. V. 33 (7): P. 1123-1132.
5. Figueroa, J. Associations of common variants at 1p11.2 and 14q24.1 (RAD51L1) with breast cancer risk and heterogeneity by tumor subtype: Findings from the Breast Cancer Association Consortium / J. Figueroa, M. Garcia-Closas, M. Bermisheva, D. Prokofyeva, S.H. Gancev, E. Khusnutdinova, (HUBCS) et al. //Hum. Mol. Genet. 2011. V. 20 (23): P.
4693-4706.
6. Milne, R.L. Confirmation of 5p12 As a Susceptibility Locus for Progesterone-Receptor– Positive, Lower Grade Breast Cancer / R.L. Milne, E.L. Goode, E. Khusnutdinova, M.
Bermisheva, D. Prokofyeva, A. Farahtdinova et al. // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev.
2011. V. 20 (10): P. 2222-2231.
7. Прокофьева, Д.С. Анализ мутаций в генах BRCA1, NBN и CHEK2 у больных раком яичников в Республике Башкортостан / Д.С. Прокофьева, Ш.Х. Ганцев, М.А.
Бермишева, Э.К. Хуснутдинова // Креативная хирургия и онкология. № 4. Стр. 50-52.
8. Хуснутдинова, Э.К. Молекулярно-генетическое изучение рака молочной железы в Республике Башкортостан / Э.К. Хуснутдинова, Ш. Ганцев, М.А. Бермишева, А.Р.
Фарахтдинова, В.А. Кононова, Г.Ф. Зиннатуллина Д.С. Прокофьева // Креативная хирургия и онкология. № 4. Стр. 56-58.
9. Прокофьева, Д.С. Роль полиморфных вариантов генов метаболизма эстрогенов в развитии рака яичников / Д.С. Прокофьева, М.А. Бермишева, А.Р. Фарахтдинова, Э.К.
Хуснутдинова // Сборник материалов всероссийской школы-конференции молодых ученых “Актуальные проблемы генетики человека, животных, растений и микроорганизмов”. 2012. Стр. 135.
10. Прокофьева, Д.С. Анализ мутаций в гене PALB2 у больных раком яичников из Республики Башкортостан / Д.С. Прокофьева, М.А. Бермишева, Н.В. Богданова, T.
Drk-Bousset, Э.К. Хуснутдинова // Материалы V Всероссийской конференции с международным участием “Перинатальная диагностика и генетический паспорт основа профилактической медицины в век нанотехнологий. 2012. Стр. 195.
11. Прокофьева, Д.С. Вклад мутаций в генах BRCA 1, BRCA 1 и PALB2 в развитие рака яичников у жителей Республики Башкортостан / Д.С. Прокофьева, М.А.
Бермишева, В.Ю. Фролова, Г.Ф. Зиннатуллина, А.Р. Фарахтдинова, Н.В. Богданова, T. Doerk-Bousset, Ш. Ганцев, Э.К. Хуснутдинова // Материалы II Всероссийской школы молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии. 2011. Стр. 101.
12. Prokofyeva, D. Contribution mutations of CHEK2 gene in ovarian cancer development in populations of the Volga-Ural region of Russia / D. Prokofyeva, M. Bermisheva, S.
Gancev, V. Frolova, V. Kononova, O. Popov, T. Drk-Bousset, E. Khusnutdinova // European Human Genetics Conference. 2011. P. 227.
13. Прокофьева, Д.С. Роль мутаций в генах BRCA1, BRCA2 и CHEK2 в развитии рака яичников у жителей Республики Башкортостан / Д.С. Прокофьева, М.А. Бермишева, Ш.Х. Ганцев, В.Ю. Фролова, В.П. Кононова, Э.К. Хуснутдинова // Сборник материалов Всероссийской научно-практической конференции “Медико II биологические аспекты мультифакториальных патологий”. 2011. Стр. 90.
14. Прокофьева, Д.С. Изучение генетических факторов риска развития рака яичников в республике Башкортостан / Д.С. Прокофьева, М.А. Бермишева, Э.К. Хуснутдинова // VI съезд Общества медицинских генетиков 2010. № 6. Стр. 148.
15. Прокофьева, Д.С. Анализ мутаций в гене BRCA1 у больных раком яичников / Д.С.
Прокофьева, М.А. Бермишева, Э.К. Хуснутдинова // труды Всероссийской конференции, посвященной 10-летию кафедры генетики БГПУ им. М. Акмуллы, приуроченной к ежегодным Вавиловским чтениям. 2009. Стр. 72-75.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ РЯ –рак яичников РМЖ –рак молочной железы РБ – Республика Башкортостан –Odds Ratio (соотношение шансов) OR –Confidence interval (доверительный интервал) CI – полногеномный анализ ассоциаций GWAS – Breast cancer 1 gene (ген, ассоциированный с РМЖ,1) BRCA – Breast cancer 1 gene (ген, ассоциированный с РМЖ, 2) BRCA – Checkpoint kinase 2 (ген киназы сверочных точек 2) CHEK – Ataxia-telangectasia mutated gene (ген атаксии телеангиэктазии) ATM – Nibrin (ген нибрина) NBN – Mediator of DNA damage checkpoint protein 1 (медиатор сверочных MDC точек повреждений ДНК 1) – Pertner and localizer of BRCA2 (партнер и локализатор BRCA2) PALB – RAD51, S. Cervisiae, homolog of, D (RAD51 гомолог D (S. cerevisiae)) RAD51D –однонуклеотидный полиморфный вариант SNP