Яна александровна взаимодействие -спиральных пептидов в биомембранах: моделирование методом монте-карло.

на правах рукописи

УДК 533.9 ВЕРЕЩАГА ЯНА АЛЕКСАНДРОВНА Взаимодействие -спиральных пептидов в биомембранах:

моделирование методом Монте-Карло.

03.00.02. – биофизика автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 2005

Работа выполнена в Лаборатории структурной биологии Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и на кафедре физико-химической биологии и биотехнологии Факультета молекулярной и биологической физики Московского Физико-Технического Института.

Научный консультант:

Доктор физико-математических наук Ефремов Роман Гербертович

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Коротков Евгений Вадимович Доктор физико-математических наук, профессор Шайтан Константин Вольдемарович

Ведущая организация:

МИФИ, Факультет экспериментальной и теоретической физики, Кафедра прикладной математики.

Защита состоится 15 декабря 2005 г. в час. мин на заседании диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте (141700, Московская обл., г. Долгопрудный, Институтский пер. 9, МФТИ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ.

Автореферат разослан «» _ 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат физико-математических наук В.Е. Брагин Актуальность проблемы.

Исключительно важная роль мембранных белков (МБ) в клетке обусловлена их способностью детектировать и передавать сигналы через липидный бислой, осуществлять транспорт ионов и различных веществ, участвовать в слиянии мембран и т.п. Понимание связи между структурой МБ и их функцией представляет собой одну из актуальных и интереснейших задач структурной биологии. Решение указанной проблемы имеет и большой практический интерес. В частности, МБ являются привлекательными объектами для создания новых лекарственных препаратов. Многие такие белки содержат в своих мембранных доменах несколько участков полипептидной цепи и/или функционируют в олигомерных состояниях – в виде димеров, тримеров и т.д. Механизмы ассоциации и межбелкового узнавания, играющие важную роль в ряде клеточных процессов [1-2], являются ключом для понимания функционирования белковых комплексов. В связи с этим, большой интерес представляют задачи по изучению детальных молекулярных механизмов межбелковых взаимодействий в такой гетерогенной среде, какой является липидный бислой. Получение структурной информации о процессах олигомеризации белков в мембранах с помощью современных экспериментальных методов крайне затруднено из-за больших сложностей с выделением, очисткой, приготовлением образцов [3]. Многообещающей альтернативой в решении данной проблемы является применение методов компьютерного моделирования.

Наиболее подходящими объектами для разработки и тестирования таких методов являются -спиральные комплексы в мембранах. Эти системы достаточно стабильны и состоят из гидрофобных и/или амфифильных -спиралей. Появление единственной на сегодняшний день пространственной модели трансмембранного (ТМ) димера гликофорина А человека (GpA) [4] стимулировало разработку теоретических методов исследования взаимодействия -спиралей в мембранных доменах белков. В настоящее время предпринимаются лишь первые попытки создания указанных подходов.

Предлагаемые методики характеризуются целым рядом ограничений, возникающих вследствие сложности корректного представления влияния мембранного окружения [5-7].

Цели настоящей работы:

- разработка теоретического метода предсказания пространственной структуры -спиральных димерных комплексов в мембранном окружении;

- применение разработанного подхода для моделирования димерных комплексов с неизвестной пространственной структурой.

На защиту выносятся следующие основные положения и результаты:

1. Разработана методика моделирования -спиральных димерных комплексов методом Монте-Карло (МК) с использованием модели неявно заданной мембраны (на примере димера GpA).

2. Моделирование без учета мембранного окружения не позволяет корректно описать поведение ТМ -спиралей GpA.

3. Предложенная методика адекватно описывает следующие аспекты поведения спиралей GpA в бислое: а) Пептиды, сохраняя -спиральную конформацию, встраиваются в мембрану в ТМ положении и образуют димеры в ориентации «голова к голове»;

б) Конформации низкоэнергетических состояний хорошо согласуются с данными мутагенеза;

в) Найдена группа димерных состояний, структура которых близка к установленной экспериментально с помощью спектроскопии ЯМР.

4. Предложена альтернативная модель димера, также хорошо согласующаяся с данными мутагенеза и удовлетворяющая ограничениям на расстояния, полученным методом спектроскопии ЯМР.

5. Впервые проведено моделирование пространственной структуры димера ТМ сегмента белка BNIP3 с помощью предложенного подхода. Полученные модели хорошо согласуются с данными мутагенеза.

6. На основании анализа гидрофобных/гидрофильных характеристик ТМ сегментов GpA/BNIP3 и расчетов МК предложены мутантные формы ТМ пептида BNIP3, потенциально обладающие улучшенной димеризационной способностью.

Научное значение и новизна работы.

Разработана новая теоретическая методика, позволяющая предсказывать пространственную структуру -спиральных димерных комплексов в мембранном окружении. Подход не подразумевает использования априорной информации ни о расположении субъединиц в комплексе, ни об их ориентации относительно мембраны.

Метод дает возможность охарактеризовать особенности спираль-спирального взаимодействия в мембранном окружении, а также идентифицировать а.к. остатки, важные для димеризации.

Практическое значение работы.

Применение разработанного подхода открывает перспективы конструирования пептидов с заданными свойствами, например, с измененной димеризационной способностью. Полученные результаты помогут создавать de novo пептиды, обладающие (или, наоборот, не обладающие) высокой аффинностью друг к другу, либо к заданным пептидам-мишеням, что имеет большое значение для разработки новых лекарственных препаратов, вакцин и т.д. В частности, данная методика может оказать существенную помощь в проектировании пептидов-ингибиторов для разнообразных ТМ рецепторов, пептидов с канал-образующей активностью и т.д.

Таким образом, создан подход для дальнейшего изучения димеризации белков с неизвестной пространственной структурой. Высказанные в работе гипотезы и созданные модели дают возможность их проверки в эксперименте, что будет стимулировать дальнейший прогресс в понимании физико-химических закономерностей, определяющих механизм олигомеризации пептидов и белков в липидных бислоях, и позволит усовершенствовать существующие алгоритмы моделирования этих сложных систем.

Публикации и апробация.

Основные результаты работы изложены в статье, опубликованной в Journal of Chemical Theory and Computation, и в двух статьях, направленных в печать. Материалы диссертации докладывались международном симпозиуме «Пептид-мембранные взаимодействия» (Намюр, Бельгия, 2004), на 4-ой международной конференции по биоинформатике (Новосибирск, 2004), международной конференции по вычислительной молекулярной биологии (Москва, 2003), на 10-ом германо-российском пептидном симпозиуме (Тюрингия, 2003), на Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, 2003), на 15-ой и 14-ой зимних международных молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2003/2002).

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа имеет следующую структуру: Во Введении (Глава I) сформулированы основные цели и задачи, их взаимосвязь с общими тенденциями развития моделирования олигомерных взаимодействий в -спиральных комплексах.

Глава II представляет собой обзор литературы, посвященный известным теоретическим моделям упаковки спиралей. Рассматриваются наиболее изученные экспериментально димерные комплексы, представляющие интерес для биомедицинских применений.

Полученные результаты и их обсуждение представлены в Главе III, состоящей из 2-х разделов. В разделе III.1 на примере димера GpA показана поэтапная разработка методики моделирования димерных комплексов в гетерогенном мембранном окружении. В разделе III.2 предложенный подход использован для исследования возможных механизмов димеризации ТМ сегмента белка BNIP3, пространственная структура которого еще не установлена. Глава IV (Заключение) содержит перечень основных результатов работы, обсуждение их научно-практического значения, а также дальнейшие перспективы исследований в данной области. Завершает диссертационную работу Список литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. ВВЕДЕНИЕ.

В первой главе обосновывается необходимость применения методов молекулярного моделирования для исследования ассоциации -спиральных пептидов в мембранном окружении, сформулированы направления и цели исследования.

II. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ.

В данной главе рассматриваются основные принципы образования -спиральных комплексов в мембранном окружении. Проведен обзор нескольких белков, функционирующих в димерном состоянии и активно изучаемых в настоящий момент в мире. Рассматриваются существующие на сегодняшний день подходы в молекулярном моделировании ассоциации ТМ -спиралей.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

III.1. Разработка методики моделирования пространственной структуры спиральных димеров в мембранном окружении на примере димера гликофорина А (GpA).

В данной главе описана поэтапная разработка методики моделирования пространственной структуры димерных -спиральных комплексов в мембранном окружении на примере ТМ сегмента (S69EPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRR97) гликофорина А человека.

III.1.1. Моделирование мономера GpA в «вакууме».

Расчет мономера GpA в «вакууме» приводит к нарушению -спиральной структуры в области, наиболее подверженной конформационным перестройкам: Gly79 Gly86 (Рис.1А-В) (структуры такого вида в дальнейшем будут называться «шпильками»).

Существенное влияние на формирование подобных состояний оказывают пары заряженных аминокислотных остатков на концах - Glu70,71 и Arg96,97. Противоположно заряженные группы атомов формируют выгодные электростатические контакты. Ранее [8 9] поведение мономера было изучено с применением модели неявно заданной мембраны.

В этом случае наиболее энергетически выгодным состоянием является ТМ -спираль (Рис.1Д). Таким образом, наличие сольватационного терма, имитирующего гетерогенное мембранное окружение, препятствует образованию нековалентных взаимодействий между удаленными по последовательности остатками. Структура пептида определяется балансом следующих групп энергетических вкладов: сольватационного терма и энергии водородных связей – с одной стороны, и ван-дер-ваальсовых и кулоновских взаимодействий – с другой. Пренебрежение эффектами среды приводит к преобладанию взаимодействий второй группы и, следовательно, к дестабилизации вытянутой спиральной конформации и образованию «шпильки».

Рисунок 1. МК расчет -спиральных мономеров GpA в «вакууме» (А-В) и в мембране с ТМ потенциалом (Г-Д).

А) Стартовая структура -спирального мономера GpA в «вакууме»;

Б-В) Низкоэнергетические конформации типа «шпилька». Г) Стартовая конформация «развернутой» полипептидной цепочки GpA. Д) Низкоэнергетическое состояние в мембране – -спираль. Ленточной диаграммой обозначена -спиральная структура мономера. “N” и “С” – N и С – концы, соответственно.

Значками «+» и «-» указаны заряженные остатки Arg86-87, Glu70,72, соответственно. Выделены боковые цепи этих остатков и тяжелые атомы их полипептидной цепи.

Границы -спиральных сегментов обозначены числами, соответствующими номерам а.к. остатков.

III.1.2. Моделирование двух -спиральных сегментов в «вакууме».

Среди низкоэнергетических состояний наблюдали два вида топологий: «спираль шпилька» и димерные состояния в ориентации «голова к хвосту» (антипараллельный димер, ). Между мономерами возникает образование ряда выгодных ван-дер ваальсовых и электростатических контактов, что, по-видимому, приводит к стабилизации -спиральной конформации (Рис. 2). Образуется большое число выгодных электростатических контактов на концах мономеров (Рис. 2). В центральной части димера плотной упаковки между -спиралями не наблюдается, что хорошо видно из Рис.2Б-В, поэтому взаимодействуют мономеры преимущественно за счет остатков с длинными боковыми цепями.

Таким образом, межмономерные контакты для структур, рассчитанных в «вакууме», сильно отличаются от «мотива димеризации» LIxxGVxxGVxxT (где x – любой остаток), установленного для GpA экспериментально. По-видимому, мембранная среда оказывает существенное влияние как на взаимную ориентацию мономеров (в структуре, полученной методом спектроскопии ЯМР (в дальнейшем – модель GpAЯМР), мономеры расположены «голова к голове»), так и на плотность их упаковки. Следовательно, необходимо рассмотреть механизм межмолекулярного взаимодействия с учетом гетерогенного окружения «вода-мембрана-вода». Ниже приводятся результаты, полученные с использованием подобной модели, в которой обе поверхности эквивалентны с точки зрения их математического описания. В этом приближении модель представляет собой мембрану без приложенного ТМ электростатического потенциала.

Рисунок 2. Моделирование двух -спиральных мономеров GpA в «вакууме». А) Исходное расположение мономеров относительно друг друга: показан мономер 1 и различные положения мономера 2 (2, 2’, 2’’);

Б-В) Низкоэнергетические димерные конформации. Буквенными обозначениями показаны остатки, образующие межмономерные контакты, серым цветом выделены а.к. остатки, совпадающие с данными мутагенеза [10]. Остальные детали - как в подписи к Рис. 1.

III.1.3. Взаимодействие -спиральных сегментов в мембранах разной толщины без приложенного ТМ потенциала.

Рисунок 3. Расположение мономеров в стартовых состояниях при расчете методом МК (А-В). Г) Стартовая структура димера GpAЯМР. «1» и «2» мономеры 1 и 2, соответственно. Серым цветом обозначена гидрофобная область мембраны.

МК-поиск низкоэнергетических состояний с произвольно заданных стартовых положений -спиральных мономеров (Рис. 3) показал, что обеим субъединицам энергетически выгодно принять ТМ ориентацию – при этом практически все гидрофобные остатки располагаются в неполярной области (|z| D, где D – толщина мембраны, z – координата Z атомов остатков, ось Z перпендикулярна плоскости мембраны), имитирующей липидный бислой, а полярные и заряженные остатки экспонированы в водную фазу.

Из Рис. 4 видно, что мономеры взаимодействуют друг с другом, образуя комплексы с различной структурой. Среди низкоэнергетических состояний обнаружены следующие виды топологий - антипараллельный ТМ-димер (ТМ, Рис. 4:A1-2, Б3, В1), параллельный ТМ-димер (ТМ Рис. 4:Б4), «спираль-шпилька» (Рис. III.4:В5), «шпилька-шпилька» (Рис.

4:В6), нетрансмембранные димеры. Заметим, что «шпильки» образовывались только при D = 36 (Рис. 4В) и 40, а нетрансмембранные димеры - при D = 40 (не показаны).

Анализ отдельных энергетических термов полученных комплексов свидетельствует о том, что оба типа состояний, ТМ и ТМ, характеризуются низкой энергией взаимодействия со средой. Симметричная модель мембраны не создает выделенного направления для дипольных моментов -спиралей, поэтому оба типа димеров (ТМ и ТМ) являются энергетически выгодными состояниями. Очевидно, что структуры ТМ гораздо более стабильны в мембране без ТМ потенциала – учитывая значительную величину дипольного момента -спирали GpA (~90-100 Дебай), можно ожидать, что наличие ТМ электростатического потенциала ( 0) будет приводить к значительному повышению энергии таких конформаций.

Рисунок 4. Низкоэнергетические конформации димеров GpA, полученные методом МК в симметричной мембране разной толщины (D=24;

30;

36). Цифрами обозначены группы выделенных состояний.

Многие обнаруженные группы состояний наблюдаются лишь при одном из значений D.

Исключение составляет группа 1 состояний с параметрами: d 9.5 ± 0.5 и || 160 ± 10 (здесь d и – расстояние и угол между осями -спиралей) (Рис.

4:A1,В1), которая присутствует при всех значениях D. В этом наборе структур интерфейс димеризации формируется посредством аминокислотных остатков LIxxGVxxGxxxTxxLI, что хорошо согласуется с данными мутагенеза (LIxxGVxxGVxxT). Видно, что даже при антипараллельной ориентации мономеров образуются схожие контакты, обеспечиваемые специфической последовательностью пептида. Замечено, что плотные контакты между -спиралями позволяют мономерам синхронно «подстраиваться» под толщину мембраны (Рис. 4A1,В1), т.е. угол наклона осей спиралей по отношению к плоскости мембраны () меняется одновременно на одну и ту же величину при увеличении толщины мембраны от 24 до 36. Так, при D=24 угол наклона каждого из мономеров составлял 1 2 45( Рис. 4A1), при D=30 - 1 60, а при D =36 1 2 75 ( Рис. 4В1) (1 и 2 - углы наклона мономеров 1 и 2, соответственно). При такой «подстройке» гидрофобный участок каждого из мономеров GpA наилучшим образом контактирует с гидрофобной областью мембраны, что хорошо согласуется с известным эффектом «гидрофобного/гидрофильного соответствия», наблюдаемого экспериментально [11]. Таким образом, мы полагаем, что в дополнение к описанным выше факторам, важным для стабилизации ТМ -спиральных олигомеров, на формирование структуры также оказывают существенное воздействие электростатические взаимодействия и эффект «гидрофобного/гидрофильного соответствия».

III.1.4. Моделирование с электростатическим потенциалом на мембране.

Присутствие разности потенциалов на мембране имеет большое значение для многих процессов в клетке, например, для явлений, связанных с запасанием и преобразованием энергии, для управления транспортом ионов и молекул через мембрану, для встраивания белков в липидный бислой, и т.д. [12]. ТМ потенциал может играть существенную роль во взаимодействии белков с мембраной и в процессах сборки мембраносвязанных белковых фрагментов. Следует ожидать, что при этом влияние будет особенно значительным для -спиральных пептидов, обладающих большим значением дипольного момента. Учет изменения потенциала вдоль нормали к плоскости мембраны (координата z, = 300 мВ) описывали энергетическим термом ( последний добавляли в выражение для полной энергии системы) следующего вида:

N E = ( F D ) qi zi, где qi и zi – парциальный заряд и координата Z атома i, F – i = константа Фарадея. В случае zi z0, E = 0 [9].

МК поиск с трех независимых стартовых положений спиралей GpA друг относительно друга и относительно мембраны показал, что низкоэнергетические состояния (с энергией в диапазоне [Eмин., Eмин. + Е], где Eмин. - минимальная энергия, Е = 15 ккал/моль), характеризуются следующим образом. Как и в случае симметричной ( = 0) мембраны, мономеры хорошо сохраняют -спиральную конформацию (Рис. 5). При этом каждая из -спиралей принимает ТМ ориентацию, мономеры образуют плотно упакованные комплексы в мембране в ориентации «голова-к-голове».

Рисунок 5. Низкоэнергетические состояния, рассчитанные методом МК в неявно заданной мембране с приложенным ТМ потенциалом (1-6). Номера групп соответствуют номерам групп в Табл. 1. GpAЯМР-мем – низкоэнергетическое состояние, полученное в результате моделирования методом МК в мембране при старте с экспериментально установленной структуры (Рис.3Г) [4].

Остальные детали см. в подписи к Рис. 1.

Приложенный потенциал существенно влияет на геометрию упаковки ТМ спиралей GpA в димере при 0. Среди низкоэнергетических структур наблюдаются разнообразные типы упаковки спиралей (Рис. 5), отличающиеся значениями параметров d и (Табл. 1). Тем не менее, во всех этих структурах в спираль-спиральных контактах участвуют остатки, важная роль которых в процессе димеризации GpA была установлена экспериментально [4].

Таблица 1. Параметры групп низкоэнергетических состояний, рассчитанных в несимметричной ( 0) мембране.

d2 Группа1 Eполн. 4 Eэлект. Eвдв Eсольв.

Интерфейс димеризации SEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRR _IIVMV_I_ -629.8 18.2 -370.4 -191. 10.1 -50. 1 (ТМ) _IIVMV_I_ (0.5) (0.2) (0.3) (0.4) (0.1) (0.5) _ELIGVGVT_I -628.4 17.4 -372.7 -192. 5 9.1 -25. 2 (GPAМК) _ELIGVGVT_I (4.4) (0.4) (2.5) (3.7) (0.4) (1.4) (ТМ) I_IVGVT_IG -632.4 18.9 -382.3 -185. 9.2 22. 3 (ТМ) IVGVTLI_ (1.7) (0.2) (1.5) (0.6) (0.1) (1.1) LIGV_AGGLLYR_ 6.9 42.6 -629.3 21.6 -392.3 -174. 4 (ТМ) _E_IGV_AGGLLY (0.1) (0.8) (1.6) (0.4) (1.4) (0.7) _IGV_AGGLLY 5.5 60.2 -626.5 19.3 -378.6 -190. 5 (ТМ) _IGV_AGGLL_ (0.2) (2.0) (2.9) (1.3) (3.0) (1.2) I_IVMV_II_I 9.0 5.9 -626.9 18.8 -379.3 -188. 6 (ТМ) _ELIGVGGTL_G_ (0.1) (0.2) (2.7) (0.3) (1.9) (1.3) _ELIGVGVT_I 7.1 -39.8 -622.3 20.6 -382.5 -187. GpAЯМР-мем 6 _ELIGVGVT_I (0.1) (0.3) (1.0) (0.2) (3.7) (2.8) (ТМ) Номера групп соответствуют номерам групп на Рис. 5. ТМ - димеры в параллельной ориентации, соответственно.

d и - средние значения расстояния (в ) и угла (в град.) между осями -спиралей. В скобках приведены значения стандартных отклонений.

Остатки, найденные на интерфейсе димеризации, обозначены буквой. Серым цветом окрашены а.к. остатки на интерфейсе димеризации, совпадающие с данными мутагенеза [10].

Eполн., Eэлект.., Eвдв, Eсольв. – полная энергия, энергия электростатических и ван-дер-ваальсовых взаимодействий, энергия сольватации (ккал/моль), соответственно. В скобках приведено стандартное отклонение.

GpAМК - группа расчетных конформеров, наиболее близкая к структуре димера (GpAЯМР), установленной экспериментально [4].

GpAЯМР-мем – низкоэнергетические состояния, полученные при моделировании методом МК при старте с экспериментально установленной модели GpAЯМР структуры (Рис.3Г) [4].

Интересно также, что возможны варианты укладки спиралей как с положительными (кластеры 3-6, Табл. 1), так и с отрицательными (кластеры 1-2, Рис. 5, Табл. 1) значениями угла. Первые из них отвечают двойной суперспирали с левой закруткой, а вторые – с правой. Среди состояний с 0 наилучшее совпадение с экспериментально установленной структурой GpAЯМР (d 7, -40°) наблюдается у состояний из кластера-2: d 8.3, -27 (Табл. 1, Рис. 5), хотя расстояние между мономерами в них несколько превышает наблюдаемое в ЯМР-моделях. (В дальнейшем эта структура обозначается символом GpAМК.) Именно для подобных состояний интерфейс димеризации полностью симметричен и практически не отличается от обнаруженного по данным мутагенеза и ЯМР.

III.1.5. Сравнительный анализ моделей димера, полученных с помощью спектроскопии ЯМР и рассчитанных методом Монте-Карло.

Особый интерес представляет набор рассчитанных состояний, обладающих плотной упаковкой спиралей и левой закруткой друг относительно друга ( 0). К ним относятся состояния из кластеров 4 и 5 с параметрами (d 7.0 ;

40) и (d 6.0 ;

55), соответственно (Табл. 1). Мономеры в указанных кластерах образуют выгодные ван-дер-ваальсовы контакты, обладают энергетически выгодной симметричной и плотной упаковкой -спиралей за счет контактов в их центральной части – посредством мотива GVxAGxxG. На наш взгляд, наличие структур такого типа поднимает вопрос о возможном существовании моделей димера GpA, альтернативных полученным по данным ЯМР спектроскопии. Заметим, что основанием для построения моделей GpA Энгельманом и др.

являлись данные мутагенеза, позволившие определить остатки, участвующие в димеризации [10], а также набор из пяти пар ограничений на расстояния между мономерами, полученный из анализа сигналов ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО) в спектрах ЯМР [4]. Возможно ли существование гипотетической структуры димера с 0°, удовлетворяющей данным мутагенеза [10] и ЯМР [4] ?

Для ответа на этот вопрос был проведен следующий вычислительный эксперимент.

Полученная методом МК конформация димера с параметрами d 6.0 ;

55 была выбрана в качестве структурного шаблона для построения искомой модели. На ее основе сконструирована конформация димера, состоящего из идеальных -спиралей, ориентированных друг относительно друга как в исходной МК-модели ( в дальнейшем эта структура обозначается символом GpAL). Анализ экспериментальных данных по ограничениям на межмономерные расстояния [4] для моделей GpAЯМР, GpAL и GpAМК показывает, что суммарные значения нарушений достаточно близки. ( Для 19 моделей димера GpA, рассчитанных на основе ограничений ЯМР, среднее отклонение от ограничений составило 0.74 ± 0.07, для моделей GpAL и GpAМК суммарное значение нарушений - 1.10 и 2.17, соответственно.) Следовательно, пространственная структура гипотетической модели GpAL в целом не противоречит имеющимся данным ЯМР спектроскопии. Анализ упаковки мономеров в модели GpAL показывает, что интерфейс димеризации в ней сформирован остатками I76xxG79V80xA82G83xxG86xxL89L90 (Табл. 1).

Заметим, что ряд остатков, важная роль которых в димеризации была установлена с помощью мутагенеза, формируют интерфейс спираль-спираль в модели с 0°. Это – Leu75, Ile76, Gly79, Val80, Gly83, Thr87. Кроме них, в межспиральном взаимодействии участвуют Gly86, Leu89, Leu90. Согласно данным мутагенеза, замена каждого из указанных остатков может существенно влиять на процесс димеризации, хотя в итоговой модели Энгельмана они не лежат на межмономерном интерфейсе.

III.1.6. Гидрофобная организация -спиральных димерных комплексов GpA.

Одним из критериев качества пространственных моделей димера может служить характер распределения их гидрофобных/гидрофильных свойств на поверхности каждого из мономеров. В частности, комплементарность таких свойств в областях контакта спираль-спираль и спираль-мембрана характерна для ТМ сегментов белков. Для оценки гидрофобных свойств -спиралей GpA использовали метод молекулярного гидрофобного потенциала (МГП), который ранее успешно применялся для изучения мембрано связанных -спиралей [13]. На Рис. 6 представлены двумерные карты гидрофобности, рассчитанные для одной из -спиралей (69-97) в моделях GpAЯМР, GpAL и GpAМК.

Рисунок 6. Распределение гидрофобных / гидрофильных свойств и димерная упаковка.

Вверху: Изопотенциальные двумерные карты молекулярного гидрофобного потенциала (МГП) на поверхности -спиральных мономеров в димерных комплексах.

Серым цветом окрашена область межмономерных контактов в димерных структурах: А) GpAЯМР;

Б) GpAМК;

В) GpAL. Переменная по оси X – угол вращения относительно оси спирали.

Переменная по оси Y- смещение вдоль оси спирали. Показаны только области с МГП 0.09, контурные линии построены с интервалом 0.015. Позиции остатков показаны буквенными обозначениями. Карты рассчитаны, как описано в [13]. Внизу: Модели соответствующих димеров.

Пептиды изображены с помощью ленточных диаграмм, в области димерного интерфейса показаны атомы структуры. Остатки Gly окрашены в черный цвет, Val – в серый, Ile76 и Thr87 – в темно-серый. Неполярная область мембраны окрашена в светло-серый цвет.

Контурными изолиниями показаны только наиболее гидрофобные области поверхности, обладающие высокими значениями МГП. Характерной особенностью поверхности -спирали является ее высокая степень гидрофобности и наличие относительно более полярного «-образного» паттерна, формируемого остатками Ser92, Thr87, Gly83, Gly79, Gly86 и Gly94. Можно предположить, что -спирали GpA могут взаимодействовать посредством контактов между остатками, которые образуют протяженную область полярности на их поверхности. В этом случае обеспечивается высокая степень комплементарности между их полярными участками, а большая часть гидрофобной поверхности экспонирована в неполярное липидное окружение. В принципе, согласно предложенным критериям, для -спиралей GpA возможны два варианта укладки – с участием остатков, формирующих левый (Ser92, Thr87, Gly83, Gly79) и правый (Gly94, Gly86, Gly79) «рукава» «-образного» паттерна. Интересно, что именно эти два варианта и реализуются как в реальном, так и в вычислительном экспериментах. В частности, в моделях с правой закруткой -спиралей (GpAЯМР и GpAМК) интерфейс димеризации совпадает с первой из полярных областей (Рис. 6А,Б), а в модели с левой закруткой (GpAL) – со второй (Рис. 6В). Как видно из Рис. 6А,Б, в структуре GpАМК область межспирального контакта хорошо согласуется с наблюдаемой в GpАЯМР, хотя в теоретической модели паттерн интерфейса на поверхности характеризуется меньшим углом наклона к оси спирали и, следовательно, меньшей степенью суперспирализации димера. Кроме того, в обеих моделях зона контакта включает как гидрофильный, так и параллельный ему гидрофобный паттерн. Последний образован остатками Ile76, Val80, Val84, Ile91.

III.1.7. Влияние степени гидрофобности мембраны на результаты моделирования.

Чтобы оценить, насколько результаты моделирования димера GpA чувствительны к изменению параметров липидного бислоя, расчеты, аналогичные описанным выше, были проведены с использованием как «менее», так и «более гидрофобной мембраны». (В дальнейшем термины «менее гидрофобная мембрана» и «более гидрофобная мембрана» обозначают модели неявно заданной среды, описываемые атомными параметрами сольватации «вода-октанол-вода» и «вода-циклогексан’-вода» (см. ниже)).

В первом случае «менее гидрофобное» мембранное окружение моделировали с помощью аппроксимации неполярной части октанолом, обладающего более полярными свойствами по сравнению с циклогексаном. Полученные в результате МК-поиска низкоэнергетические состояния представляют собой ТМ -спиральные димеры, большинство из которых обладают параметрами d 10, || 10 (Рис.7:A1’), а менее представленная группа состояний - параметрами d 9, || 50 (Рис.7:A3’). Также присутствовали шпилькообразные димеры, где «излом» -спирали наблюдался на участке GxxxG (Рис.7:А2’). -Спирали взаимодействуют в основном за счет остатков с протяженными гидрофобными боковыми цепями, и интерфейс димеризации сильно отличается от экспериментально установленного (данные не приведены). Таким образом, более полярное окружение способствует образованию контактов между наиболее гидрофобными остатками. При этом не найдено групп состояний, близких по структуре к описанным выше (полученным экспериментально, либо рассчитанных в немодифицированной мембране).

Модель «более гидрофобной мембраны» основана на искусственном увеличении (на 40%) степени гидрофобности центрального слоя мембраны путем изменения значений АПС в модели неявно заданного растворителя [8]. (Циклогексан’ имитируется модифицированными АПС «водяной пар - циклогексан»). Среди набора низкоэнергетических конформеров (~103 структур) наиболее специфичной упаковкой ( конформации воспроизводились в независимых расчетах с различных стартовых состояний ) обладала группа 1 (~150 структур) – эти состояния представляли собой левозакрученные, плотно упакованные димеры с параметрами d= 6.5 ±0.3, = 65.2 ±4.2° и интерфейсом димеризации IxxGVxAGxGxxLLxxY (Рис. 7:Б1”). Конформации представителей данного класса практически совпадают с моделями GpAL, наблюдавшимися в немодифицированной мембране («вода-циклогексан-вода», см. выше).

Конформеры, соответствующие остальным расчетным состояниям, обладают сильной гетерогенностью (Рис. 7:Б2”-6”), и для них представляется затруднительным выявить специфичность в образовании межспиральных контактов.

Рисунок 7. Низкоэнергетические димерные состояния, полученные методом МК в неявно заданных мембранах с разной степенью гидрофобности. А) в «менее гидрофобной мембране»;

Б) в «более гидрофобной мембране».

Мы полагаем, что на стадии сборки димерного комплекса в мембране важную роль играют эффекты сольватации, и необходима аккуратная параметризация используемого силового поля. Нарушение баланса между энергетическими термами Есольв. и Eвдв, Eэлект. и т.д. приводит к нарушению сборки димерных комплексов. В значении АПС заложена в неявном виде информация о многих факторах – понижение энтропии, связанное с упорядочением растворителя у поверхности белка, дальнодействующая электростатическая компонента свободной энергии сольватации белка, конфигурационная энтропия боковых цепей и т.д. Данный численный эксперимент демонстрирует также, что разные по свойствам модельные искусственные мембраны могут влиять на способность к димеризации.

Таким образом, ab initio предсказание структуры димера возможно лишь при условии корректного описания мембранного окружения – например, с помощью модели сольватации, основанной на АПС «водяной пар - вода» и «водяной пар - циклогексан».

III.2. Изучение димеризации ТМ сегмента белка BNIP3 методом Монте-Карло в неявно заданной мембране.

III.2.1. Характер взаимодействия мономера BNIP3 с мембраной: роль заряженных остатков на концах.

Белок BNIP3 (Bcl-2/19-кDa, домен 3) является представителем семейства BCL-2, ответственного за реализацию активной формы гибели клетки – апоптоза. Установлено, что этот белок образует гомодимеры в мембранах и в мицеллах детергентов [14-15]. В отсутствие C - концевого ТМ домена он не способен образовывать димеры и локализоваться на внешней митохондриальной мембране, вследствие чего теряется его проапоптотическая активность.

C - концевой участок BNIP3 включает в себя ярко выраженный гидрофобный сегмент Val163-Gly184, на N-конце которого содержится ряд заряженных (Arg146, Lys152, Lys153, Glu160, Lys163) и ароматических ( Phe156, Phe160, Phe164) остатков, а на C-конце расположены положительно заряженные остатки - Arg185-186 (Рис. 8Б). Исследование возможных мод связывания пептидов c мембраной проводили с мономерами разной длины (варианты 1-6) (Рис. 8): «длинными» ( 1, 2) «средними» ( 3, 4), «короткими» ( 5, 6).

А Б Типы мономеров «Длинные» 1 R146NTSVMKKG154GIF157SAEF161LK163V164F165LPSLLLSHLLAIGLGIYIGRR 2 G154GIF157SAEF161LK163V164F165LPSLLLSHLLAIGLGIYIGRR «Средние» 3 (BNIP3RR) K163V164F165LPSLLLSHLLAIGLGIYIGRR 4 (BNIP3R) K163V164F165LPSLLLSHLLAIGLGIYIGR «Короткие» 5 V164F165LPSLLLSHLLAIGLGIYIGRR 6 V164F165LPSLLLSHLLAIGLGIYIG Рисунок 8. А) Низкоэнергетические состояния ТМ сегментов пептида BNIP3 разной длины (см. п.

Б), полученные методом МК в неявно заданной мембране;

Б) А.к. последовательности моделируемых пептидов. Другие детали см. в подписи к Рис.1.

Уже на первых шагах конформационного поиска методом МК энергия мономеров значительно уменьшилась за счет перехода субъединиц из водного окружения в мембрану (Рис. 8А), и, независимо от длины а.к. последовательности, наиболее гидрофобный участок Val167-Gly184 мономеров находился преимущественно в -спиральной конформации в бислое. Между тем, также присутствовали и состояния с изломом спирали для пептидов группы 4 (Рис. 8А, 4а). Оказалось, что на характеристики связывания мономеров разной длины с мембраной влияет присутствие заряженных остатков на концах пептидов. Так, -спирали в «средних» и «длинных» мономерах располагались под углом 75-80 к плоскости мембраны (Рис. 8), в то время как угол наклона оси спирали «коротких» пептидов составил 45. Таким образом, ориентация ТМ сегмента BNIP3 в мембране определяется как длиной гидрофобного участка (происходит «подстройка» пептида под толщину гидрофобной области мембраны за счет изменения угла наклона оси спирали), так и за счет взаимодействия заряженных остатков Lys163, Arg185, окаймляющих гидрофобный участок, с водным окружением. Заряженные остатки Arg144, Lys152-153, Glu160 в примембранном -спиральном участке не влияют на характеристики связывания ТМ сегмента с мембраной. В дальнейшем, для упрощения задачи конформационного поиска и более эффективного исследования спираль спиральных контактов, при моделировании димера была выбрана группа 4 «средних» пептидов (BNIP3R).

III.2.2. Гидрофобные/гидрофильные свойства ТМ сегмента BNIP3.

Рисунок 9. Распределение гидрофобных/гидрофильных свойств на поверхности ТМ сегмента белка BNIP3. Другие детали см. в подписи к Рис.6.

Гидрофильный паттерн на поверхности -спирали BNIP3 ( гидрофильный относительно сильно гидрофобных остатков этих пептидов Leu, Val, Phe и т.д.) имеет вид : S168xxxS172H173xxA176xxxG180xxxG184 (Рис. 9).

Он содержит все три остатка (His176, Ala173, G180), влияние которых на димеризацию было выявлено с помощью экспериментов по направленному мутагенезу [14]. Как отмечают авторы [14], влияние остатка His173 на димеризацию не всегда очевидно. Известно, что ионизация боковой цепи остатка His в сильной степени зависит от окружения (pKa боковой цепи 6.3). Экспериментально зафиксирована активация белка BNIP3 только при низких значениях рH [16]. Возможно, что протонирование остатка His173 имеет функциональное значение. В настоящий момент механизм действия BNIP3 на молекулярном уровне далек от понимания, поэтому влияние зарядового состояния остатка His173 на димеризацию требует дополнительного изучения.

III.2.3. Расчет димерных состояний ТМ сегментов BNIP3.

Проведен аb initio конформационный поиск (в данном контексте термин ab initio означает, что при моделировании не использовали каких-либо ограничений на структуру) низкоэнергетических состояний системы, состоящей из двух субъединиц BNIP3R в мембранном окружении. Влияние последнего аппроксимируется с помощью модели неявно заданного растворителя [8]. Выявлены группы параллельных димерных упаковок, как с правой, так и с левой закруткой. Наиболее специфичными межспиральными взаимодействиями обладала группа правозакрученных димеров (Табл. 2) с параметрами d 5.7, -19.8° и симметричным интерфейсом димеризации FxxLxxxHxxAxxLGxxIG (Mab11R). Интересно, что могут реализовываться и другие состояния, для которых также характерны контакты вдоль гидрофильного паттерна ( -20.5°, Mab12R) (Рис. 9).

Однако, ввиду того, что мономеры в комплексе расположены несимметричным образом, не достигается плотной упаковки между мономерами (6.2 10.0, Табл. 2), и теряется тонкая специфическая межспиральная подстройка. Таким образом, высокая степень комплементарности обеспечивает плотную межмономерную упаковку, что, по-видимому, является приоритетным при олигомеризации, также как и в процессах межбелкового узнавания.

Роль ионизации боковой цепи остатка His173.

Моделирование проводили с учетом двух возможных зарядовых состояний боковой цепи His173. Класс правозакрученных димерных упаковок (Mab11R) воспроизводился как в случае протонированного, так и в случае непротонированного остатка His173 (Табл. 2). Интересным фактом является образование левозакрученных димерных структур с плотной упаковкой на С - конце. Интерфейс димеризации также совпадает с данными мутагенеза – межспиральные контакты образованы за счет остатков H173xxA176xxxG180. В данном случае упаковка левозарученных димеров зависела от зарядового состояния His173. Так, в вычислительном эксперименте с His+ формировались структуры с 20° (Mab21R), а в случае с незаряженным остатком His угол составил 60° (Mab22R). Сравнение ориентации остатков His друг относительно друга в разных укладках показало (Рис. 10), что боковые группы His173 имеют тенденцию образовывать невалентные «стэкинг» взаимодействия. В зависимости от типа укладки, ароматические кольца находятся на разных расстояниях (h). Так, наибольшая сближенность между плоскостями ароматических колец His (h) наблюдается у состояний с 60°:

h 4.0. В конформациях с 20°: h 7.0, а в моделях с - 20°: h 8.5.

Рисунок 10. Нижний ряд: расположение расчетных структур в «мембране» c параметрами: А) Mab11R(His,His+) d 6, -20°;

Б) Mab21R (His+) d 9, 20°;

В) Mab22R(His) d 8, 60° (см.

Табл. 2). Верхний ряд: вид сверху этих структур. В полноатомном виде представлены остатки His173, а также заряженные остатки на концах (Lys163, Arg185).

Остальные детали см. в подписи к Рис.5.

Таблица 2. Низкоэнергетические димерные состояния, рассчитанные методом МК в неявно заданной мембране. В скобках показано, была ли эта группа получена с заряженным остатком His173 (His+), незаряженным (His) или в обоих случаях (His+, His).

№1 d2 2 Последовательность3 Eполн. 4 Eэлкт. Eвдв Eсольв.

Ab initio расчет Mab11R KVFLPSLLLSHLLAIGLGIYIGR (His,Hi 5.7±0.0 -19.8±0.1 FLSHALGIG -441.2±0.6 23.0±0.1 -314.3±0.5 -111.4±0. s+) FLSHAIG_G_ Mab12R (His,Hi 8.0±0.8 -20.5±1.5 -444.6±2.6 22.7±0.4 -310.9±2.3 -114.2±1. L_HAIGIGR s+) _V_SLSLALGI Mab21R (His+) 8.7±0.4 19.9±0.5 -441.9±1.4 22.6±0.1 -305.4±1.5 -113.7±0. L_HA_GIG_ F_LSHALGI Mab22R 8.3±0.0 62.5±3.4 -443.6±0.8 20.8±0.1 -299.5±1.2 -118.7±0. (His) HAI_LGI S_HAI_LGI Обозначения групп низкоэнергетических состояний, полученных при расчете методом МК.

d и - средние значения расстояния (в ) и угла (в град.) между осями -спиралей.

Остатки, найденные на интерфейсе димеризации, обозначены буквой. Серым цветом окрашены а.к. остатки на интерфейсе димеризации, совпадающие с данными мутагенеза [14].

Eполн., Eэлект., Eвдв, Eсольв. – полная энергия, энергия электростатических и ван-дер-ваальсовых взаимодействий, энергия сольватации (ккал/моль), соответственно.

III.2.4. Мутагенез in silico: поиск гомологов ТМ пептида BNIP3, способных к эффективной димеризации.

Пептиды c потенциально улучшенной димеризационной способностью.

Как упоминалось ранее, мотив GxxxG (x - любые остатки последовательности) в последовательностях различных белков способствует образованию плотных димерных упаковок [17]. Методом мутагенеза установлено, что в ТМ сегменте белка BNIP3 важным для димеризации, является мотив, образованный остатками AxxxG [14]. Мы предположили, что замена Ala176 на остаток Gly (также производили замену His173Leu для исключения влияния остатка His173 ) будет способствовать образованию более плотных контактов между -спиралями, и, возможно, повышенной способностью к димеризации.

МК расчет в неявно заданном мембранном окружении показал, что наиболее энергетически выгодный и заселенный класс состояний образуют димерные конформации с правой закруткой (параметры d 6.6, -35.4°) и интерфейсом димеризации VFxxSLxSL173xxG176IxLG180xxIG. Заметим, что на интерфейсе, присутствуют все три остатка Gly, и угол между осями -спиралей несколько увеличился по сравнению с правозакрученной моделью димера для ТМ сегмента белка BNIP3 дикого типа. Мы предполагаем, что такая мутантная форма гомодимера должна обладать более плотной ван-дер-ваальсовой «подстройкой» за счет остатков Gly и более высокой димеризационной способностью по сравнению с ТМ сегментом белка BNIP3 дикого типа.

Моделирование ассоциации ТМ сегмента BNIP3 с мутантом BNIP3A176G в неявно заданном мембранном окружении.

Целью данного этапа работы являлось создание in silico пептида, способного конкурировать за димеризацию с ТМ сегментом белка BNIP3 дикого типа.

Предполагается, что мутантная форма пептида с заменой остатка Ala176Gly будет способна образовывать гетеродимеры с ТМ пептидом BNIP3 дикого типа.

Вычислительный эксперимент показал возможность образования гетеродимерных моделей с протяженным интерфейсом димеризации, где образование плотной упаковки происходит как за счет мутируемого остатка Gly176 мономера А, так и остатка Аla мономера Б дикого типа (серым закрашены остатки, важные для димеризации [14], и мутируемый остаток Gly176):

Мономер А: F_LSHG176IGI_IG_ Мономер Б: _VFSLSLA176LGIG_ Модель гетеродимера обладает более плотной «подстройкой» боковых цепей остатков Ala176, Gly180, Gly184 одного мономера и остатков Gly176, Gly180, Gly184 другого за счет гидрофильных «лощин», образуемых остатками Gly (Рис. 11). Заметим, что более тонкая «подстройка» межатомных контактов может быть осуществлена путем расчетов МД димеров в явно заданных гидратированных липидных бислоях. Расчет свободной энергии ассоциации мономеров мог бы помочь в оценке стабильности межмономерных взаимодействий в различных комплексах. Данная задача носит нетривиальный характер, в настоящее время, она решается в Лаборатории структурной биологии ИБХ РАН. Резюме.

Таким образом, с помощью моделирования in silico показано, что мутантные формы пептида Ala176Gly, His173Leu образуют плотно упакованные димерные структуры с правой закруткой. Мы полагаем, что димеризационная способность этих мутантных пептидов может быть выше, чем в белке дикого типа, за счет более плотных контактов между остатками G176xxxG180xxxG184.

Рисунок 11. Упаковка -спиралей на С - концевом участке ТМ сегмента белка BNIP3 дикого типа (А, модель Mab11R) и гетеродимера (Б). Показаны атомы, образующие наиболее плотные межспиральные контакты. Светло-серым показаны остатки Gly, темно-серым - остатки Ala. Другие детали см. в подписи к Рис.6.

Моделирование показало возможность образования гетеродимеров между ТМ сегментами мутанта Ala176Gly и белка BNIP3 дикого типа. Отметим, что в образовании гетеродимера участвует как G176xxxG180xxxG184, так и A176xxxG180xxxG184 мотив. Мы полагаем, что данный мутантный пептид сможет конкурировать за образование димерных состояний с ТМ пептидом белка BNIP3 дикого типа.

Безусловно, данные предположения должны пройти экспериментальную апробацию. В Лаборатории структурной биологии ИБХ РАН уже ведутся работы по изучению возможности создания de novo пептидов, способных ингибировать или усиливать ассоциацию природных ТМ пептидов. Механизм олигомеризации далек от понимания и в настоящее время лишь начинается создание таких искусственных систем.

В решении этой сложной задачи существенную помощь могут оказать методы молекулярного компьютерного моделирования.

IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В этой главе проведен обзор выполненных исследований и полученных результатов.

Основные результаты.

1. Исследована роль гетерогенной, полярно-неполярной, среды при моделировании белок-белковых взаимодействий в мембране. Вывод: а) Моделирование без учета эффектов среды не позволяет корректно описать поведение как одного, так и двух ТМ спиралей GpA. Расчет методом МК двух мономеров GpA в «вакууме» показывает, что полученные конформации димерных состояний значительно отличаются от установленных в экспериментах. Кроме того, не наблюдается специфичности в образовании межспиральных контактов.

2. Изучены механизмы ассоциации пептидов в гетерогенном мембранном окружении.

Выводы: а) Моделирование пептидов GpA в мембране без приложенного ТМ потенциала показало, что пептиды, сохраняя -спиральную структуру, располагаются в ТМ положении, образуя димеры как в ориентации «голова к хвосту», так и в ориентации «голова к голове». Найдена только одна группа структур с антипараллельной ориентацией пептидов, хорошо коррелирующая с данными мутагенеза (GpAМК);

б) При расчете с мембранами разной толщины наблюдается эффект «подстройки» димера GpAМК под толщину гидрофобного слоя без нарушения межспиральных контактов;

в) Субъединицы в комплексах обладают -спиральной структурой при толщине мембраны D 36, при дальнейшем увеличении толщины мембраны наблюдаются нарушения -спиральной конформации.

3. Проведены исследования формирования димеров GpA в мембране с приложенным ТМ потенциалом. Выводы: а) Пептиды, сохраняя -спиральную конформацию, встраиваются в мембрану в ТМ положении и образуют димеры в ориентации «голова к голове»;

б) Конформации низкоэнергетических состояний хорошо согласуются с данными мутагенеза;

в) Найдена группа состояний с правой закруткой, по параметрам упаковки близкая к экспериментально установленной димерной структуре;

г) Наблюдается группа плотно упакованных димерных структур с левой закруткой, также хорошо согласующихся с данными мутагенеза и удовлетворяющих ограничениям на расстояния, полученным методом спектроскопии ЯМР;

д) Проведен анализ особенностей образования лево- и правозакрученных димерных упаковок, рассмотрено влияние мутаций на упаковку димера и т.д. Таким образом, впервые предложена методика моделирования димерных комплексов в мембранном окружении.

4. Разработанный вычислительный подход применен для моделирования димера с неизвестной пространственной структурой - ТМ сегментов белка BNIP3. Выводы: а) Аb initio поиск низкоэнергетических состояний выявил несколько возможных групп димерных состояний как с правой, так и с левой закруткой. Наблюдается высокая корреляция полученных конформеров с данными мутагенеза;

б) Сделан вывод о роли состояния ионизации остатка His173 в ассоциации -спиралей;

в) Предложены мутантные формы BNIP3 с потенциально более высокой, чем в белке дикого типа, димеризационной способностью.

V. ВЫВОДЫ.

1. Разработана методика моделирования -спиральных димерных комплексов методом Монте-Карло с использованием неявно-заданной модели мембраны. В подходе не используются ограничения на пространственную структуру исследуемых объектов.

2. Установлено, что моделирование без учета эффектов среды не позволяет корректно описать поведение двух ТМ -спиралей GpA. Полученные конформации димерных состояний значительно отличаются от установленных в экспериментах.

3. Образование димерных комплексов, хорошо согласующихся с экспериментальными данными, возможно при следующих условиях: а) Толщина гидрофобной части мембраны должна примерно соответствовать длине гидрофобного участка мономера GpA ( 32 );

б) Необходим учет ТМ потенциала мембраны;

в) Свойства липидного бислоя наилучшим образом аппроксимируются моделью среды «вода-циклогексан-вода».

4. Разработанная методика применена для моделирования димера ТМ сегмента белка BNIP3 с неизвестной пространственной структурой. Полученные модели хорошо согласуются с данными мутагенеза. Показано, что степень ионизации остатка His влияет на характер ассоциации -спиралей.

5. На основании анализа гидрофобных/гидрофильных характеристик ТМ сегментов GpA/BNIP3 и расчетов методом Монте-Карло предложены мутантные формы ТМ пептида BNIP3, потенциально обладающие улучшенной димеризационной способностью.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

.

1. Y.A. Vereshaga, P.E. Volynsky, D.E. Nolde, A.S. Arseniev, R.G. Efremov. Helix interactions in membranes : lessons from unrestrained Monte Carlo simulations. Journal of Chemical Theory and Computation, 2005, v.1, № 6, з.1252-1254.

2. R.G. Efremov, D.E. Nolde, P.E. Volynsky, Y.A. Vereshaga, N.A. Simakov, A.A.

Polyansky. Molecular modeling of membrane peptides and proteins. Fundamental and Clinical Pharmacology, 2004, v. 18, p. 594.

3. R.G. Efremov, P.E. Volynsky, D.E. Nolde, Y.A. Vereshaga, A.G. Konshina, N.A.

Simakov, A.S Arseniev. Membrane proteins: the new insights via computational experiments. Computational structural and functional proteomics. Proceedings of the Fourth International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure (BGRS), Novosibirsk, 2004, p. 255-257, 4. R.G. Efremov, D.E. Nolde, P.E. Volynsky, Y.A. Vereshaga, N.A. Simakov, A.S.

Arseniev. In silico Modeling of Peptides and Proteins in Membranes: Structural, Dynamical, and Functional Aspects. Proceedings of the International Simposium “Peptide-Membrane Interactions”, Namur, Belgium, 2004, p. OL-2.

5. Y.A. Vereshaga, P.E. Volinskii, D.E. Nolde, R.G. Efremov. Helix-helix association in membrane: Monte Carlo simulations of glycophorin A. Proceedings of the international Moscow conference on computational molecular biology, Moscow, 2003, Add.1-2.

6. Р.Г. Ефремов, Д.Е Нольде., П.Е. Волынский, Н.П. Сырцев, Я.А. Верещага, А.Г.

Коншина, Н.А. Симаков, А.С Арсеньев. Белки в мембранах: результаты и уроки вычислительных экспериментов. //Российский симпозиум по химии и биологии пептидов, Москва, 2003 г., тезисы докладов, с. 24.

7. R.G.Efremov, D.E.Nolde, P.E.Volynsky, A.G.Konshina, N.P.Syrtcev, Ya.A.Vereshaga, A.S.Arseniev. Peptides in Membrane-Mimic Media: Molecular Modeling Studies.

Proceedings of the Tenth German-Russian Peptide Symposium, Friedrichroda/Thuringia, Germany, 2003, p. 2.10-5.10.

8. R.G.Efremov, D.E.Nolde, P.E.Volynsky, A.G.Konshina, N.P.Syrtcev, Ya.A.Vereshaga, A.S.Arseniev. Peptides and proteins in membranes: what can we learn via computer simulations? Proceedings of the International Moscow Conference on Computational Molecular Biology, Moscow, 2003, p. 62-63.

9. Я.А. Верещага, П.Е. Волынский, Р.Г. Ефремов. Структурные и энергетические аспекты димеризации гликофорина А в мембранном окружении. //ХV Зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико химической биологии и биотехнологии», Москва, 2003, тезисы докладов, с. 5.

10. Я.А. Верещага, П.Е. Волынский, Д. Е. Нольде, Р.Г. Ефремов. Новый метод молекулярного моделирования олигомеризации белков в мембране. //Первая национальная конференция: «Информационно-вычислительные технологии в решении фундаментальных научных проблем и прикладных задач химии, биологии, фармацевтики, медицины», Москва, 2002, сборник тезисов и докладов, с.

20-21.

11. Я.А. Верещага, П.Е. Волынский, Р.Г. Ефремов. Молекулярное моделирование структуры гидрофобного участка гомодимера гликофорина А в мембране. //ХIV Зимняя международная молодежная научная школа «Перспективы и направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 2002, тезисы докладов и стендовых сообщений, с. 72.

12. Я.А. Верещага, П.Е. Волынский, Р.Г. Ефремов. Моделирование пептид-пептидного взаимодействия в мембране методом Монте-Карло. //Научная сессия МИФИ, Москва, 2002, сборник научных трудов т. 5, с. 35-36.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Harder, T., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., (2003), 358: 863.

2. Ubarretxena-Belandia, I. and Engelman, D.M., Curr. Opin. Struct. Biol., (2001), 11: 370.

3. Liang, J., Curr. Opin. Chem. Biol., (2002), 6: 878.

4. MacKenzie, K.R., Prestegard, J.H. and Engelman, D.M., Science, (1997), 276: 131.

5. Adams, P.D., Engelman, D.M. and Brnger, A.T., Proteins, (1996), 26: 257.

6. Ducarme, P., Thomas, A. and Brasseur, R., Biochim. Biophys. Acta., (2000), 1509: 148.

7. Im, W., Feig, M. and Brooks III, C.L., Biophys. J., (2003), 85: 2900.

8. Efremov, R.G., Volynsky, P.E., Nolde, D.E. and Arseniev, A.S., Theor. Chem. Acc., (2001), 106: 48.

9. Efremov, R.G., Volynsky, P.E., Nolde, D.E., van Dalen, A., de Kruijff, B. and Arseniev, A.S., FEBS Lett., (2002), 526: 97.

10. Lemmon, M.A., Flangan, J.M., Treutlein, H.R., Zhang, J. and Engelman, D.M., Biochemistry, (1992), 31: 12719.

11. Bechinger, B., Mol. Membr. Biol., (2000), 17: 135.

12. Gennis, R.B. Biomembranes. Molecular Structure and Function. Springer-Verlag. New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo, (1989).

13. Efremov, R.G., Nolde, D.E., Vergoten, G. and Arseniev, A.S., Biophys. J., (1999), 76:

2448.

14. Sulistijo, E.S., Jaszewski, T.M. and MacKenzie, K.R., J. Biol. Chem., (2003), 278:

51950.

15. Chen, G., Ray, R., Dubik, D., Shi, L., Cizeau, J., Bleackley, R. C., Saxena, S., Gietz, R.

D., Greenberg, A. H., J. Exp. Med., (1997), 186: 1975.

16. Kubasiak, L.A, Hernandez, O.M., Bishopric, N.H. and Webster, K.A., Proc. Natl. Acad.

Sci. U S A., (2002), 99: 12825.

17. Senes, A., Engel, D.E. and DeGrado, W.F., Curr. Opin. Struct. Biol., (2004), 14: 465.