Способы культивирования, штаммовое разнообразие, антибиотическое и противоопухолевое действие базидиального гриба lentinus edodes (berk.) sing.

На правах рукописи

СОБОЛЕВА Наталья Юрьевна СПОСОБЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ, ШТАММОВОЕ РАЗНООБРАЗИЕ, АНТИБИОТИЧЕСКОЕ И ПРОТИВООПУХОЛЕВОЕ ДЕЙСТВИЕ БАЗИДИАЛЬНОГО ГРИБА Lentinus edodes (Berk.) Sing.

Специальность 03.02.12 – микология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2010

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе РАМН

Научный консультант:

Краснопольская Лариса Михайловна доктор биологических наук

Официальные оппоненты:

Сидорова Ирина Ивановна доктор биологических наук, профессор Горшина Елена Сергеевна кандидат биологических наук

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН

Защита состоится 12 марта 2010 года в 15 час. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.46 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу:

119992, Москва, ГСП-2, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, ауд. М-1, тел./факс (495) 939-39-

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова Автореферат разослан февраля 2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета, М.А. Гусаковская кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время ведутся активные поиски биологически активных соединений базидиомицетов. Lentinus edodes (Berk.) Sing. [син. Lentinula edodes (Berk.) Pegler] – пилолистник съедобный, сиитаке или шиитаке, один из наиболее известных съедобных базидиальных грибов, используемый в лечебных целях с давнего времени. Интенсивные исследования последних десятилетий привели к выявлению биологически активных метаболитов L. edodes, обладающих иммуномодулирующими, противоопухолевыми, гиполипидемическими, гипогликемическими, противовирусными и др. свойствами (Chihara et al., 1969;

Chibata et al., 1969;

Kamiya et al., 1969;

Chihara, 1970;

Kaneko et al., 1989;

Breene, 1990;

Jong, Birmingham, 1993;

Komemushi et al., 1995;

Wasser et al., 1997;

Hatvani, 2001;

Ishikawa et al., 2001;

Rowan et al., 2003;

Hassegawa et al., 2005;

Lo et al., 2007;

Wu, Hansen, 2008). Изучению антибиотической активности L. edodes посвящено значительно меньше работ. В то же время известно, что по сравнению с другими видами базидиомицетов L. edodes проявляет более выраженные антибиотические свойства (Краснопольская и др., 1997).

Погруженное культивирование, по сравнению с другими методами выращивания базидиомицетов, представляет собой наиболее целесообразный способ получения их биологически активных метаболитов. Современные способы культивирования базидиомицетов, разработанные для конкретных штаммов, предусматривают проведение процессов выращивания в строго контролируемых стерильных условиях, обеспечивающих стабильность химического состава получаемой продукции и воспроизводимость биологических эффектов. На сегодня существует значительный разрыв между исследованием биологической активности и изучением штаммового разнообразия L. edodes. Наличие у L. edodes широкого спектра биологической активности позволяет предположить существование штаммов, являющихся активными продуцентами не одного, а двух или более хозяйственно ценных метаболитов, различающихся направленностью и механизмом своего действия и накапливающих целевые соединения, как в биомассе, так и в культуральной жидкости. Выявление таких штаммов и использование их в биотехнологии приведет к повышению эффективности и конкурентоспособности способов получения биологически активных метаболитов.

Скрининг штаммов L. edodes с широким спектром биологической активности и высокой продуктивностью является составной частью исследования штаммового разнообразия этого вида, в которое также должно входить изучение морфологических, физиологических и морфометрических особенностей штаммов L. edodes.

Цель и задачи исследования. Цель исследования состояла в комплексном изучении штаммового разнообразия L. edodes на вегетативной и генеративной стадиях, в проведении отбора штаммов L. edodes, сочетающих высокую антибиотическую активность с противоопухолевыми свойствами, и разработку способа погруженного культивирования наиболее перспективного штамма.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Изучение морфолого-физиологических характеристик штаммов L. edodes при росте на плотных питательных средах.

2. Изучение микроморфологических признаков штаммов L. edodes при росте на плотных питательных средах и при погруженном культивировании.

3. Получение и морфометрическое изучение плодовых тел штаммов L. edodes.

4. Изучение антибиотического действия штаммов L. edodes, выделение и идентификация действующих веществ.

5. Изучение процессов погруженного культивирования штаммов L. edodes, накопления биомассы и содержания эндополисахаридов.

6. Отбор штаммов, сочетающих высокую антибиотическую активность с интенсивным накоплением биомассы и эндополисахаридов в условиях погруженной культуры.

7. Выявление противоопухолевого действия отобранного штамма L. edodes в опытах in vivo.

8. Разработка способа погруженного культивирования отобранного штамма L. edodes, включая оптимизацию состава ферментационной среды методами математического планирования.

Научная новизна. В результате проведенного исследования описаны морфолого физиологические характеристики 15 штаммов L. edodes. Составлены морфологические описания колоний изученных штаммов при росте на четырех плотных питательных средах различного состава. Предложен новый метод определения интенсивности развития мицелия L. edodes, основанный на определении отношения массы сухого мицелия к единице площади колонии. Разработан новый экспресс-метод для сравнительной оценки длительности процессов погруженного культивирования штаммов L. edodes.

Изученные штаммы были разделены на две группы по форме шляпки: одни – образовывали базидиомы с конусообразной формой шляпки, другие – с распростертой.

Показано, что антибиотические свойства L. edodes более ярко выражены на вегетативной стадии развития, чем на генеративной. Штаммы различаются по спектру антибиотического действия и степени активности. В качестве основного компонента антибиотического комплекса L. edodes идентифицирован лентинамицин В. Впервые показана антибиотическая активность в отношении грибов-дерматофитов. Выявлены штаммы, способные к образованию эритаденина.

Выявлены штаммы, обеспечивающие высокий выход эндополисахаридов в условиях погруженной культуры. Показано противоопухолевое действие порошка воздушно-сухой биомассы, водного экстракта мицелия и суммарной фракции водорастворимых полисахаридов мицелия штамма 15 L. edodes при пероральном введении. Сочетание экстракта мицелия L. edodes и циклофосфамида в низкой терапевтической дозе 50 мг/кг, угнетающей супрессоры, резко усиливало противоопухолевый эффект.

Отобран штамм L. edodes, сочетающий высокую антибиотическую активность с противоопухолевыми свойствами. При этом антибиотически активные метаболиты накапливаются преимущественно в культуральной жидкости, а противоопухолевые полисахариды входят в состав клеточной стенки погруженного мицелия.

Показано штаммовое разнообразие L. edodes и предложена система скрининга штаммов L. edodes, обладающих высоким выходом биомассы и выраженными антибиотическими и противоопухолевыми свойствами.

Обнаружен штамм L. edodes, способный накапливать до 42 % липидов в погруженном мицелии.

Практическая значимость. На основании результатов изучения штаммового разнообразия L. edodes разработана «Методика проведения испытаний на отличимость, однородность и стабильность (ООС) Шиитаке (пилолистник съедобный) (Lentinus edodes (Berk.) Sing.)» RTG/1078/1 № 12-06/21, утвержденная ФГУ «Государственной комиссией Российской Федерации по испытанию и охране селекционных достижений» 21.09.2009 г. Для проведения исследований штаммового разнообразия на вегетативной стадии развития L. edodes рекомендована среда Чапека-Докса с добавлением дрожжевого экстракта (Serva), обеспечивающая проявление специфических морфологических черт отдельных штаммов L. edodes.

Выявлены штаммы L. edodes с высокой антибиотической активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, дрожжей, мицелиальных грибов, в том числе грибов-дерматофитов. Антибиотик лентинамицин В получен в хроматографически чистом виде.

Отобраны штаммы, сочетающие выраженное антибиотическое действие и высокий выход эндополисахаридов, из числа которых штамм 15 оказался одним из наиболее перспективных.

Разработан биотехнологический метод погруженного культивирования отобранного штамма 15, обеспечивающий двукратное увеличение выхода биомассы (до 18-20 г/л) по сравнению с исходным уровнем на 6 сутки. Метод апробирован в условиях биореактора геометрическим объемом 0,5 м3.

В результате опытов получены экспериментальные образцы суммарной фракции водорастворимых полисахаридов погруженного мицелия штамма 15 L. edodes, проявившие противоопухолевую активность в экспериментах in vivo в отношении Т-лимфомы EL-4 и лимфомы P388.

Получен патент РФ № 5091 на штамм Lentinus edodes (Berk.) Sing. Шиитаке 15 и подана заявка на патент РФ на способ получения средства, обладающего противоопухолевой активностью, регистрационный № 2009148354.

Апробация работы. Результаты исследования были доложены на конференции молодых ученых ГУ НИИНА им. Г.Ф. Гаузе РАМН (Москва, 2004), на 7-й школе конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2003), на втором Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2004). Материалы работы были представлены на первом, втором, третьем, четвертом и пятом Всероссийских конгрессах по медицинской микологии (Москва, 2003, 2004, 2005, 2006, 2007), на первой и второй Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Суздаль, 2005;

Рязань, 2007).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 137 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной материалам и методам исследования, главы «Результаты и обсуждение», заключения, выводов, списка литературы, включающего 232 источника, из них 188 – зарубежных, двух приложений. Работа содержит 32 рисунка и 27 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы Объекты исследования – 15 штаммов L. edodes коллекции лаборатории биосинтеза биологически активных соединений ГУ НИИНА им. Г.Ф. Гаузе РАМН.

Культивирование на плотных средах. Изучение морфологии колоний и скорости роста вегетативного мицелия штаммов L. edodes проводили на 4-х плотных средах:

пшеничном агаре с кукурузным экстрактом (ПАК), картофельно-глюкозном агаре (КГА), сусло-агаре (СА), среде Чапека-Докса с дрожжевым экстрактом (ЧДД) на чашках Петри при температуре 26 C. Опыты ставили в трех повторностях. Микроморфологию мицелия изучали с помощью светового микроскопа Olympus BX41 (объективы 8, 40).

Погруженное культивирование проводили в колбах объемом 750 мл с объемом среды 100 мл на ротационной качалке при 220 об/мин при температуре 26 С. Составы сред включали различные источники углерода, азота, а также минеральные соли. В опытах определяли содержание воздушно-сухой биомассы весовым методом, значения рН фильтрата культуральной жидкости с помощью ионометра ЭВ-74. Опыты ставили в трех повторностях.

Количественный состав сред для погруженного культивирования L. edodes оптимизировали с использованием методов математического планирования: метода полного факторного эксперимента и метода крутого восхождения (Максимов, Федоров, 1969).

Получение плодовых тел L. edodes проводили на блоках c зерновым субстратом (Przybylowicz, Donoqhue, 1991;

Stamets, 2000). Подготовленный зерновой субстрат инокулировали погруженной культурой гриба из расчета 3 %.

Морфологию плодовых тел L. edodes изучали по таким показателям как форма шляпки, общая масса плодового тела, масса шляпки и ножки в отдельности, высота плодового тела, максимальная толщина шляпки, высота и расположение ножки, диаметр шляпки и ножки. Использовали не менее 10 типичных базидиом каждого изучаемого штамма. Статистическую обработку данных проводили при помощи программы Microsoft Exel.

Изучение антибиотического действия экстрактов культурального фильтрата и погруженного мицелия штаммов L. edodes проводили методом диффузии в агар из бумажных дисков (Герольд, 1966). В отдельных случаях упаренный экстракт культурального фильтрата в количестве 1 % вносили в среду для тест-организмов.

Тест-организмами служили грамположительные и грамотрицательные бактерии, дрожжи и мицелиальные грибы, включая грибы-дерматофиты.

Изучение антибиотических комплексов штаммов L. edodes. Для разделения компонентов антибиотического комплекса использовали тонкослойную хроматографию (ТСХ), применяли биоавтографическое проявление, проявление в перманганате калия и в УФ-свете при длине волны 254 нм. UV-VIS-спектры снимали на спектрофотометрах Shimadzu 1601C и Hitachi U-2000. Масс-спектры выделенных антибиотиков регистрировали на приборе VISION методом MALDI-TOF в режиме положительных ионов. Лазер – азот, 337 nm, матрица – DHB. Полученные результаты использовали для идентификации выделенных антибиотиков с помощью компьютерной базы данных (BNPD) проф. Я. Берди.

Определение содержания полисахаридов в водных экстрактах мицелия и плодовых тел L. edodes проводили с использованием фенол-сернокислотного метода (Dubois et al., 1956).

Определение моносахаридного состава суммарной фракции водорастворимых полисахаридов мицелия L. edodes проводили в лаборатории растительных полисахаридов ИОХ им. Н.Д. Зелинского РАН под руководством профессора, д.х.н. А.И. Усова. Полисахариды, осажденные из водного экстракта этанолом, подвергали полному гидролизу 2М трифторуксусной кислотой в присутствии в качестве внутреннего стандарта инозитола в течение 8 часов при 100 С. Качественный и количественный состав моносахаридов, полученных в результате гидролиза, определяли с помощью метода газожидкостной хроматографии на хроматографе HP 5790A.

Изучение противоопухолевого действия L. edodes проводили в лаборатории фармакологии и химиотерапии ГУ НИИНА им. Г.Ф. Гаузе РАМН под руководством д.м.н. В.М. Бухмана на моделях перевиваемых опухолей: солидной Т-лимфоме EL-4 и солидном Т-клеточном лимфолейкозе Р388. Опухоли прививали подкожно гибридным мышам (C57Bl/6J DBA/2)F1. Противоопухолевое действие порошка воздушно-сухой биомассы, водного экстракта погруженного мицелия и суммарной фракции водорастворимых полисахаридов мицелия изучали при пероральном введении.

Торможение роста опухоли (ТРО) рассчитывали по формуле:

ТРО (%) = (Mк-Mо)/(Mк)100, где Mк и Mо – средняя расчётная масса опухоли (РМО) в контроле и опыте, соответственно.

Результаты и обсуждение Морфолого-физиологическое изучение штаммов L. edodes Макроморфология штаммов L. edodes на плотных средах. С целью изучения макроморфологических признаков колоний коллекционных штаммов L. edodes их выращивали на 4-х плотных средах – КГА, ЧДД, ПАК и СА. Было выявлено 4 типа текстур колоний. Большинство штаммов формировало колонии с ворсистой или войлочной текстурой. На среде ЧДД была зафиксирована мучнистая текстура колонии у штаммов 10 и 15. Творожистую текстуру колонии формировал штамм 4 на среде КГА.

Колонии изученных штаммов различались по наличию концентрических зон и радиальной исчерченности, интенсивности развития воздушного мицелия (табл. 1). Все колонии имели белую окраску и обладали ровным, прижатым краем.

Согласно общепринятой визуальной трехбальной системе оценки изученные среды обеспечивали высокую или среднюю интенсивность развития воздушного мицелия L. edodes. На всех изученных средах высокую интенсивность развития мицелия показывали штаммы 1, 2, 8 и 12, среднюю - штаммы 11 и 13.

Таблица Частота проявления морфологических признаков колоний штаммов L. edodes (%) при росте на плотных питательных средах Плотные питательные среды Признак КГА ЧДД ПАК СА Текстура ворсистая 53,3 53,3 40,0 86, колонии войлочная 40,0 33,3 60,0 13, мучнистая 0 13,4 0 творожистая 6,7 0 0 Концентрическая зональность 60,0 13,3 13,3 26, Радиальная исчерченность 26,7 13,3 0 Интенсивность средняя, 26,7 20,0 66,7 40, развития 2 балла воздушного высокая, 73,3 80,0 33,3 60, мицелия 3 балла Визуальный метод оценки интенсивности развития воздушного мицелия носит приблизительный и субъективный характер. В связи с этим нами был предложен новый метод определения интенсивности развития мицелия, основанный на расчете массы сухого мицелия, приходящейся на единицу площади колонии. Мицелий отделяют от питательного агара путем плавления его в воде при 70 С и сушки при 60 С.

Чувствительность весового метода оказалась заметно выше чувствительности визуального метода. Так, интенсивность развития мицелия штаммов 7 и 12 по результатам весового метода различается практически в два раза, в то время как результаты визуальной оценки объединяют их в одну группу. Штаммы 4 и 12 по результатам весового метода имеют незначительные различия по интенсивности развития мицелия, однако на основании визуальной оценки они отнесены в разные группы (табл. 2).

Таблица Интенсивность развития воздушного мицелия шести штаммов L. edodes на плотной питательной среде ЧДД, определенная двумя методами Штаммы Интенсивность развития воздушного мицелия Весовой метод, мг/см Визуальный метод, баллы 7 1,14 ± 0,10 3 балла 3 1,04 ± 0,14 3 балла 15 0,78 ± 0,11 3 балла 8 0,73 ± 0,10 3 балла 12 0,64 ± 0,11 3 балла 4 0,59 ± 0,03 2 балла Скорость роста колонии изученных штаммов L. edodes при выращивании на плотных средах существенно различалась. Полное зарастание чашек Петри происходило на 8-12 сутки. Зависимость скорости роста колонии штаммов от состава сред носила штаммоспецифичный характер. Наибольшие скорости роста были зафиксированы у штаммов 3 и 7 при выращивании на СА.

Микроморфология мицелия штаммов L. edodes. Общим для всех изученных культур, выращенных на плотных средах и в погруженной культуре, было наличие на гифах регулярно присутствующих пряжек и перегородок (рис. 1а). У штаммов L. edodes, хранившихся при температуре 2-4 С в течение 4-6 недель, было отмечено появление интеркалярных хламидоспор (рис. 1б).

По количеству образующихся хламидоспор штаммы были разделены на три группы. Большое количество спор образовывали шесть штаммов L. edodes (3, 4, 5, 8, 12, 15), промежуточное положение заняли четыре штамма L. edodes (1, 2, 6, 9), пять штаммов L. edodes (7, 10, 11, 13, 14) формировали единичные споры.

а) б) Рисунок 1. Структуры вегетативного мицелия L. edodes: а) пряжка на гифе штамма 15, б) интеркалярная хламидоспора штамма 7, увеличение x 400.

Получение и макроморфология плодовых тел штаммов L. edodes. Для выявления штаммовых различий L. edodes на генеративной стадии были получены плодовые тела шести штаммов 3, 4, 7, 8, 12, 15. По форме шляпки изученные штаммы были разделены на две группы (табл. 3).

Таблица Морфометрические показатели плодовых тел штаммов L. edodes Группа I Группа II Конусообразная форма шляпки Распростертая форма шляпки Показатель Штамм 3 Штамм 4 Штамм 12 Штамм 7 Штамм 8 Штамм Масса плод. тела, г 21,0±3,0 29,0±5,4 24,1±14,6 22,3±4,2 17,5±2,9 20,2±2, Масса шляпки, г 14,0±2,2 18,0±2,7 14,7±7,9 17,5±3,6 11,5±1,9 15,8±1, Масса ножки, г 7,0±1,6 11,0±3,1 9,4±6,8 4,7±1,0 6,0±1,5 4,4±1, Высота плод. тела, мм 80,2±11,0 94,0±10,4 81,5±17,7 60,4±3,2 68,5±8,8 76,4±8, Толщина шляпки, мм 14,6±1,7 17,1±2,2 14,7±3,5 10,5±1,4 11,5±1,0 10,2±1, Высота ножки, мм 65,6±10,5 76,9±9,5 66,8±14,4 47,7±4,5 56,0±9,2 58,7±9, Расположение ножки* ц ц/э ц ц/э ц ц Диаметр шляпки, мм 50,9±2,5 56,2±3,1 50,6±6,4 57,4±3,1 49,6±2,8 57,9±2, Диаметр ножки, мм 14,7±1,0 16,3±1,2 14,6±1,7 15,4±6,0 14,9±1,2 14,4±1, * – расположение ножки относительно шляпки: ц – центральное;

ц/э – центральное, изредка встречается эксцентрическое.

Штаммы 3, 4 и 12 формировали конусообразные шляпки с влажной матовой поверхностью бурого или темно-бурого цвета преимущественно без чешуек (рис. 2, а).

Штаммы 7, 8 и 15 образовывали распростертые шляпки с сухой поверхностью темно бурой окраски и ярко выраженными чешуйками по краю (рис. 2, б). Толщина шляпок была больше у штаммов с конусообразной формой шляпок. Для всех штаммов L. edodes была характерна светло-бурая сплюснутая ножка, преимущественно центральная. Более высокие ножки были характерны для штаммов с конусообразной формой шляпки. У этих штаммов, в целом, был ниже показатель отношения массы шляпок к массе ножек.

Самые крупные базидиомы были отмечены у штамма 4, самые мелкие – у штамма 8.

а) штамм 12 б) штамм Рисунок 2. Плодовые тела L. edodes с конусообразной (а) и распростертой (б) формами шляпки.

Отбор штаммов L. edodes с высоким выходом погруженной биомассы, антибиотической и противоопухолевой активностью Схема отбора штаммов L. edodes с антибиотической активностью и высоким выходом погруженной биомассы.

Для осуществления скрининга штаммов L. edodes с выраженными антибиотическими и противоопухолевыми свойствами была предложена следующая схема. Пятнадцать штаммов оценивали по двум критериям: по способности ингибировать рост тест-микроорганизмов и по накоплению погруженного мицелия.

Поскольку в мицелии базидиомицетов содержание водорастворимых полисахаридов – потенциальных противоопухолевых агентов варьирует в ограниченных пределах, определяющим фактором их выхода является уровень накопления биомассы, которую, в связи с этим, целесообразно использовать в качестве критерия в предварительном отборе продуцентов противоопухолевых полисахаридов. Сопоставление результатов отбора по обоим направлениям первичного скрининга позволяло выбрать культуры с искомыми свойствами.

Изучение антибиотической активности штаммов L. edodes показало, что штаммы способны образовывать метаболиты, ингибирующие рост грамположительных и грамотрицательных бактерий, дрожжей и мицелиальных грибов (табл. 4). Вещества, способные подавлять рост тест-микроорганизмов, содержались как в мицелии, так и в фильтрате культуральной жидкости. Полученные спектры антибиотической активности были штаммоспецифичны как по широте спектра действия, так и выраженности ингибирующего эффекта. Все изученные штаммы L. edodes были активны в отношении Bacillus subtilis, B. cereus subsp. mycoides. Выявлены штаммы, активные в отношении Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Aspergillus niger.

Результаты позволили выявить восемь штаммов L. edodes (3, 4, 5, 7, 8, 12, 14, 15), наиболее активных в отношении использованных тест-микроорганизмов. Штаммы 3, 4, 5, 8, 12 и 15 накапливали антибиотики преимущественно в культуральной жидкости, штамм 14 – в погруженном мицелии.

Для штамма 15 была подобрана среда (L21), обеспечивающая его наибольшую антибиотическую активность. Пик антибиотической активности штамма 15 приходился на 6-е сутки погруженного культивирования.

Сравнительное изучение антибиотических свойств L. edodes на вегетативной и генеративной стадиях развития было проведено с использованием штаммов 4 и 15.

Исследовали действие экстрактов культуральных фильтратов, шляпок и ножек. Было показано, что в условиях опыта у базидиом в отличие от культурального фильтрата практически отсутствует антибиотическая активность. Следовая активность была обнаружена только у ножек в отношении B. subtilis. Выявленная закономерность проявления антибиотической активности, по-видимому, связана с тем, что с конкурирующей за субстрат микро- и микобиотой контактирует преимущественно мицелий L. edodes.

Таблица Антибиотическое действие экстрактов культуральной жидкости и погруженного мицелия штаммов L. edodes Диаметр зоны ингибирования роста тест-культуры, мм Штамм Экстраги B. B. cereus S. aureus P. C. A.

руемый материал subtilis subsp. aeruginosa albicans niger mycoides 1 кж 12 15 0 0 0 м 0 следы 0 0 20 2 кж 20 следы 0 9 0 м 14 следы 0 следы 0 кж 20 следы 0 9 0 3* м 17 10 8 следы 20 кж 23 10 30 9 следы м 16 10 7 0 12 кж 26 следы 10 11 0 м 7 0 19 9 0 6 кж 20 14 9 8 0 м 8 10 8 8 следы кж 20 10 9 8 0 м 8 11 8 8 0 кж 30 12 следы следы 0 м 11 9 следы 0 0 9 кж 18 12 следы 0 0 м 0 следы 0 0 0 10 кж 15 18 8 7 0 м 0 8 следы следы 7 11 кж 17 13 следы следы 0 м 27 16 8 следы 0 Следы кж 26 10 13 11 0 Следы м 19 9 0 следы 0 13 кж 23 16 следы 0 0 м 0 8 0 0 7 кж 27 13 8 следы 0 м 23 16 0 0 0 Следы кж 45 16 16 0 0 м 30 18 0 0 11 кж – экстракт культуральной жидкости;

м – экстракт погруженного мицелия;

* – жирным шрифтом указаны отобранные восемь штаммов L. edodes.

В экспериментах, проведенных в ГУ НИИНА им. Г.Ф. Гаузе в секторе к.б.н.

А.С. Тренина, с использованием бактериальной культуры Halobacterium salinarum, было показано, что экстракт фильтрата культуральной жидкости штамма 15 L. edodes обладает способностью к подавлению биосинтеза стеролов, т. е. проявляет гиполипидемическую активность.

Выделение и идентификация биологически активных веществ штаммов L. edodes. Методом ТСХ на силикагеле в сочетании с биоавтографическим проявлением на B. subtilis и А. niger проводили разделение экстрактов культуральных фильтратов шести штаммов L. edodes (3, 4, 7, 8, 12 и 15). Было показано, что антибиотические комплексы штаммов 7, 8, 12 содержат по 4 компонента, штамма 15 – 3 компонента, штаммов 3 и 4 – 2 компонента. Основным антибиотиком является компонент А (рис. 3).

D A C B Штаммы 7, 8, 12 Штамм 15 Штаммы 3, X / ТСХ на пластинках “Silufol” (Чехия) в системе хлороформ – бензол – метанол (30:20:7) на тест-культуру B. subtilis (зоны подавления роста).

Рисунок 3. Схема хроматографической подвижности биологически активных компонентов, образуемых штаммами L. edodes.

Для изучения физико-химических свойств компоненты А и В были выделены в хроматографически чистом виде из экстракта культуральной жидкости штамма L. edodes. Результаты определения R f, УФ-спектров и молекулярных масс компонентов А и В, а также их биологических свойств были использованы для проведения их идентификации с помощью компьютерной базы данных природных биологически активных веществ (BNPD), разработанной профессором Я. Берди (Венгрия) и данных литературы (Bew et al., 1966;

Kamiya et al., 1972;

Ishikawa et al., 2001). Было показано, что компонент А соответствует лентинамицину В, а компонент В – эритаденину (табл. 5).

Таблица Физико-химические свойства индивидуальных компонентов А и В экстракта культуральной жидкости штамма 15 L. edodes Свойства УФ-спектр, нм MW, Rf а.е.м.

Компоненты A 0,67 EtOH max = 209, 236, 248, 262, B 0,33 EtOH max = 261 - Lentinamycin B* MeOH max = 209, 235, 249, 262, С9Н8О Eritadenin** 253, max HCl = 259, C 9 H 11 N 5 O 4 max HOH = 261, * – Данные литературы (Bew et al., 1966;

Ishikawa et al., 2001) ** – Данные литературы (Kamiya et al., 1972) Компонент А (лентинамицин В) имеет брутто-формулу C 9 H 8 O и относится к группе алифатических спиртов с двойными и тройными связями (рис. 4, а). В наших опытах он идентифицирован у шести изученных штаммов L. edodes.

Компонент В (эритаденин) имеет брутто-формулу C 9 H 11 N 5 O 4 и представляет собой 2(R),3(R)-дигидрокси-4-(9-аденил)-масляную кислоту (рис. 4, б). Наличие эритаденина установлено у четырех штаммов (7, 8, 12, 15) из шести.

NH N N N N H 2C HO C H HO C H COOH HС С – С С – СH = С = СH – СH2 – СH2 - OH а) б) Рисунок 4. Химические формулы лентинамицина В (а) и эритаденина (б).

Концентрирование антибиотиков штамма 15 привело к проявлению ранее не выявленной активности в отношении Micrococcus luteus и Fusarium bulbigenum.

Расширение спектра тест-культур выявило ингибирующее действие этого штамма в отношении грамотрицательных бактерий Escherichia coli и Commamonas terrigena, грамположительной бактерии Streptococcus pneumonia, мицелиальных грибов Trichoderma harzianum и Verticillum albo-atrum, грибов-дерматофитов Microsporum canis, Trichophyton mentagrophytes v. gypseum, Scopulariopsis sp.

Накопление погруженной биомассы и содержание водорастворимых полисахаридов в мицелии и плодовых телах штаммов L. edodes.

Выявление штаммов, перспективных для получения полисахаридов с противоопухолевыми свойствами, проводили по следующей схеме. Вначале определяли выход воздушно-сухой биомассы изучаемых штаммов в погруженной культуре, оценивали содержание и выход водорастворимых полисахаридов мицелия и подтверждали противоопухолевые свойства водорастворимых полисахаридов отобранного штамма.

Изучение характера накопления и выхода погруженной биомассы L. edodes.

Для сравнительной оценки длительности процессов погруженного культивирования и накопления биомассы штаммов L. edodes был предложен экспресс метод, согласно которому определение содержания биомассы проводили на 6, 7 и сутки процесса погруженного культивирования. Для разделения штаммов на группы по скорости роста вычисляли суточные изменения содержания биомассы с шестых на седьмые ( 6-7) и с седьмых на восьмые ( 7-8) сутки процесса. Медленнорастущие штаммы (1, 7, 8, 9, 11, 13, 14, 15) характеризовались 7-8. Штаммы с 6- промежуточными значениями скорости роста (2, 4, 5, 6, 10) постепенно снижали ежесуточный прирост биомассы, приближаясь к максимальному накоплению биомассы, при этом 6-7 7-8. Содержание биомассы быстрорастущих штаммов (3, 12) достигало максимума к 7-м суткам и оставалось без изменений, либо начинало снижаться, при этом 7-8 0 (рис. 5).

Изменение содержания биомассы, г/л 2 6-7 сутки процесса 7-8 сутки процесса 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 - - Штаммы Рисунок 5. Суточные изменения содержания воздушно-сухой биомассы штаммов L. edodes на 6-7 и 7-8-е сутки процесса погруженного культивирования.

На 7-е сутки содержание биомассы у разных штаммов варьировало в широких пределах: от 4,2 до 14,2 г/л. Наибольший выход биомассы показали штаммы 3, 7 и 12, наименьший – штамм 5.

Сопоставление результатов изучения антибиотической активности штаммов L. edodes с результатами настоящего раздела работы, прежде всего с показателями накопления погруженной биомассы послужило основанием для отбора шести наиболее перспективных штаммов - 3, 4, 7, 8, 12, 15. Штамм 5 был исключен из дальнейшей работы из-за низкого выхода биомассы при погруженном культивировании.

Штамм 14 – из-за того, что вещества с антибиотической активностью накапливаются преимущественно в мицелии, так же как и полисахариды, что затруднит работы по выделению и химической очистке целевых метаболитов.

Содержание водорастворимых полисахаридов в мицелии и плодовых телах штаммов L. edodes. При неоптимизированных условиях культивирования содержание водорастворимых полисахаридов в погруженном мицелии отобранных штаммов варьировало в пределах 4,4 – 8,1 %. Выход водорастворимых полисахаридов мицелия составил 490 – 860 мг на литр культуральной среды. Наибольшее количество водорастворимых полисахаридов содержал мицелий штамма 15. Этот же штамм обеспечивал наибольший выход водорастворимых полисахаридов мицелия в расчете на литр культуральной среды, превосходя по данному показателю штаммы, образующие наибольшее количество биомассы.

Суммарная фракция водорастворимых полисахаридов штамма 15 L. edodes была передана в лабораторию растительных полисахаридов ИОХ им. Н.Д. Зелинского РАН под руководством профессора, д.х.н. А.И. Усова для определения моносахаридного состава. Суммарная фракция в преобладающем количестве содержала глюкозу – 36,83 %, промежуточное положение занимали галактоза и манноза – 12,30 % и 9,78 %, соответственно, наименьшее процентное содержание имели арабиноза и ксилоза – 1,89 % и 0,86 %, соответственно.

Противоопухолевые свойства погруженного мицелия штамма 15.

Изучали противоопухолевое действие порошка воздушно-сухой биомассы, водного экстракта погруженного мицелия и суммарной фракции водорастворимых полисахаридов мицелия штамма 15 L. edodes при их пероральном введении.

Противоопухолевую активность порошка воздушно-сухой биомассы оценивали на мышах-гибридах B6D2F1 с перевиваемым солидным Т-клеточным лимфолейкозом Р388. Суточная доза введения порошка биомассы составляла 50 мг/кг. Лечение начинали на 3 день после прививки опухоли и продолжали 10 суток. На 14 сутки эксперимента (2 сутки после окончания лечения) торможение роста опухоли составило 46 %. Различия между ростом опухоли в опытной группе и группе контроля роста опухоли (без лечения) были статистически недостоверны.

Из погруженного мицелия L. edodes был приготовлен водный (полисахаридный) экстракт с содержанием сухих веществ 7,2 мг/мл, противоопухолевые свойства которого изучали на мышах-гибридах B6D2F1 с перевиваемой солидной Т-лимфомой EL-4. Приготовленный экстракт вводили ежедневно в течение 14 суток, начиная с 7-го дня после имплантации опухоли в дозе 1,8 мг сухих веществ/мышь в сутки. Анализ результатов, показал, что экстракт погруженного мицелия обладал самостоятельным статистически достоверным противоопухолевым действием, торможение роста опухоли на 15 сутки эксперимента составило 79 % (рис. 6). Сочетание экстракта мицелия L. edodes и циклофосфамида в малой дозе 50 мг/кг, угнетающей супрессоры, резко усиливало противоопухолевый эффект. Торможение роста опухоли при сочетанном применении и водного экстракта погруженного мицелия и ЦФ на 18 сутки опыта составило 98,8 %.

Рисунок 6. Эффективность водного полисахаридного экстракта погруженного мицелия штамма 15 L. edodes при лечении мышей с лимфомой EL-4 после М асса оп ухоли, м г антисупрессивной обработки циклофосфамидом.

К – контроль роста опухоли 800 (без лечения);

ВЭЛ+ЦФ – водный экстракт погруженного мицелия L. edodes в сочетании с циклофосфамидом;

11 15 18 ЦФ – циклофосфамид;

Сутки опыта ВЭЛ – водный экстракт погруженного мицелия L. edodes.

К ВЭЛ+ЦФ ЦФ ВЭЛ Суммарную фракцию водорастворимых полисахаридов штамма 15 L. edodes получили путем осаждением этанолом из водного экстракта мицелия, выращенного на оптимизированной среде. Противоопухолевое действие фракции изучали на модели солидного Т-клеточного лимфолейкоза Р388, подкожно привитого мышам-гибридам B6D2F1. Водорастворимые полисахариды вводили перорально в суточной дозе 2 мг/кг в виде водного раствора в течение 10 суток, начиная с 3 суток после прививки опухоли.

Торможение роста опухоли под влиянием водорастворимых полисахаридов мицелия штамма 15 L. edodes на 14 сутки опыта (2 сутки после окончания лечения) достоверно составило 81 %.

Таким образом, было доказано самостоятельное противоопухолевое действие препаратов из погруженного мицелия штамма 15 L. edodes.

Разработка метода погруженного культивирования L. edodes. На основании совокупности приведенных выше результатов для дальнейшей работы был выбран штамм 15 L. edodes, характеризующийся высокими показателями антибиотической активности и содержания водорастворимых полисахаридов, а также наличием выраженных противоопухолевых свойств. В целях создания условий для активного роста и развития штамма 15 L. edodes в погруженной культуре установлена зависимость накопления воздушно-сухой биомассы культуры от качества и количества посевного материала, от качественного состава и количественного соотношения ингредиентов ферментационных сред и от длительности процесса культивирования.

Подготовка посевного мицелия. На основании сравнения 8 жидких посевных сред разного состава предложена наиболее эффективная для накопления погруженной биомассы на среде L21.

Разработка состава жидкой питательной среды для погруженного культивирования штамма 15 L. edodes была проведена в два этапа. На первом этапе изучали зависимость выхода биомассы и содержания в ней водорастворимых полисахаридов от качественного состава источников питания, на втором проводили оптимизацию количественного соотношения источников питания, отобранных на первом этапе.

Отбор ингредиентов жидких сред проводили с использованием различных источников углерода (глюкоза, крахмал, растительное масло, сахароза, меласса, тростниковый сахар) и азота (соевая мука, соевый пептон, кукурузный экстракт, казеиновый пептон, дрожжевой экстракт, пшеничная мука). Наибольшую продукцию мицелия штамма 15 L. edodes и наивысшее содержание в нем водорастворимых полисахаридов (21,7 %) обеспечивала среда L21, содержащая в своем составе глюкозу, растительное масло, соевую муку и минеральные соли.

Оптимизация количественного состава жидкой питательной среды L21 была проведена с использованием методов математического планирования эксперимента (Максимов, Федоров, 1969). Варьируемыми факторами в полном факторном эксперименте служили глюкоза, соевая мука, растительное масло и дигидрофосфат калия. Общее число комбинаций варьирующих факторов равнялось 24. Длительность процесса культивирования составляла 6 суток. Критерием оценки служил выход воздушно-сухой биомассы.

На основании полученных в ПФЭ данных были поставлены два опыта по методу крутого восхождения, в которых осуществляли изменения концентраций соевой муки и дигидрофосфата калия по алгоритму, рассчитанному в соответствии с величинами коэффициентов регрессии.

В результате проведенной оптимизации был подобран состав среды для погруженного культивирования L. edodes, обеспечивающий практически двукратное увеличение выхода биомассы (18-20 г/л) по сравнению с исходным уровнем (10,9 г/л) на 6-е сутки. Процесс оптимизации питательной среды можно охарактеризовать зависимостью выхода процесса (y) от изучаемых факторов (х1, х2, х3, …, хn) в виде поверхности отклика в трехмерном пространстве (рис. 7).

Биомасса, г/л Биомасса, г/л Ди ги др оф л ос, г/ фа ука т м ка ая ли оев я, С г /л Рисунок 7. Выход биомассы штамма 15 L. edodes в зависимости от концентраций соевой муки и дигидрофосфата калия.

Разработанная методом математического планирования среда обеспечивала стабильность периодического процесса культивирования L. edodes, что выражалась в воспроизводимости выходов биомассы, значения конечного рН культуральной жидкости и длительности процесса, а также в морфологической однородности мицелия, которая отсутствовала при использовании исходных сред.

Изучение длительности процесса погруженного культивирования штамма L. edodes изучали предварительно на неоптимизированной среде, затем на оптимизированной среде. Максимум накопления воздушно-сухого мицелия приходился на 6-7 сутки процесса (рис. 8).

Рисунок 8. Накопление биомассы штамма 15 L. edodes в Биомасса, г/л процессе погруженного культивирования на оптимизированной среде и 2 3 4 5 6 7 8 9 10 неоптимизированной.

Сутки опыта Оптимизированная среда Неоптимизированная среда Оптимизированная среда показывала снижение выхода биомассы после фазы стационарного роста, что является типичным для периодической культуры, в отличие от неоптимизированной. Таким образом, оптимизация состава среды привела не только к увеличению выхода воздушно-сухой биомассы, но и к существенному сокращению длительности процесса культивирования.

На завершающем этапе работы было подтверждено наличие антибиотической и противоопухолевой активности штамма 15, выращенного на оптимизированной среде.

Методами ТСХ с биоавтографическим проявлением на B. subtilis и A. niger было показано, что состав антибиотического комплекса остался без изменений. Результаты изучения противоопухолевого действия суммарной фракции водорастворимых полисахаридов мицелия, полученного в результате погруженного культивирования согласно предложенным условиям, приведены в разделе “Противоопухолевые свойства погруженного мицелия штамма 15”. Была проведена пробная накопительная ферментация биомассы мицелия с использованием оптимизированной среды объемом 100 л в биореакторе геометрическим объемом 0,5 м.

ВЫВОДЫ 1. При выращивании 15 штаммов L. edodes на 4 плотных средах установлены типа текстур колоний, наибольшая частота встречаемости отмечена у ворсистой и войлочной. Штаммы различались по наличию концентрических зон, радиальной исчерченности, интенсивности развития воздушного мицелия, скорости линейного роста. Проявлению наибольшего разнообразия морфологических признаков колоний способствовало выращивание на картофельно-глюкозном агаре. Предложен количественный метод определения интенсивности развития мицелия на плотных средах.

2. На гифах воздушного и погруженного мицелия 15 штаммов L. edodes выявлены интеркалярные хламидоспоры, формирующиеся по мере старения культуры.

3. По форме шляпки – конусообразной или распростертой базидиомы штаммов L. edodes разделены на две группы. Базидиомы разных групп различаются также по отношению массы шляпок к массе ножек, которое выше у базидиом с распростертой формой шляпки.

4. Экстракты культуральной жидкости и погруженного мицелия штаммов L. edodes проявили антибиотическое действие в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, дрожжей, мицелиальных грибов. Антибиотическая активность носила штаммоспецифичный характер. Погруженная культура штаммов L. edodes обладала более высокой антибиотической активностью по сравнению с их плодовыми телами. Впервые показана способность антибиотического комплекса L. edodes подавлять рост грибов-дерматофитов M. canis, T. mentagrophytes v. gypseum, Scopulariopsis sp. В качестве основного метаболита L. edodes, отвечающего за антибиотические свойства, был идентифицирован лентинамицин В.

5. Выход воздушно-сухой биомассы изученных штаммов L. edodes на 7-ые сутки погруженного культивирования варьировал от 4,2 до 14,2 г/л. С использованием предложенного экспресс-метода оценки длительности периодического процесса погруженного культивирования штаммы L. edodes разделены на быстрорастущие, медленнорастущие и штаммы с промежуточными значениями скорости роста.

6. На основании сопоставления совокупности полученных результатов отобраны шесть штаммов L. edodes, сочетающие высокую антибиотическую активность с интенсивным накоплением биомассы. Из них наиболее высокий выход водорастворимых эндополисахаридов и их наибольшее содержание в мицелии были выявлены у штамма 15.

7. Установлены самостоятельная достоверная противоопухолевая активность водного экстракта погруженного мицелия и суммарной фракции водорастворимых полисахаридов мицелия штамма 15 L. edodes при пероральном введении в системе in vivo. Наибольшее торможение роста опухоли (81 %) было отмечено при использовании суммарной фракцией водорастворимых полисахаридов. Показано усиление противоопухолевого эффекта при совместном применении полисахаридного экстракта мицелия штамма 15 L. edodes с одноразовым введением низкой дозы циклофосфамида, торможение роста опухоли при сочетанном лечении достигало 98,8 %.

8. Разработан способ погруженного культивирования штамма 15 L. edodes.

С применением методов математического планирования эксперимента разработана композиция состава жидкой питательной среды для погруженного культивирования, обеспечивающая двукратное увеличение выхода биологически активной биомассы отобранного штамма до 18-20 г/л на 6-е сутки процесса.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Антимонова А.В., Соболева Н.Ю., Львова Н.А., Федорова Г.Б., Гарибова Л.В., Белицкий И.В., Краснопольская Л.М. Штаммовые различия ксилотрофных базидиальных грибов по морфологическим и биосинтетическим признакам. // В сб.: Методологические основы познания биологических особенностей грибов продуцентов физиологически активных соединений и пищевых продуктов. Материалы II Международной конференции.

Донецк. 2002. С. 77-79.

2. Краснопольская Л.М., Антимонова А.В., Белицкий И.В., Соболева Н.Ю., Гарибова Л.В. Получение биомассы лекарственных грибов трутовика лакированного Ganoderma lucidum (Curt.:Fr.) P.Karst и шиитаке Lentinus edodes (Berk.) Sing. в погруженной культуре. // В сб.: Успехи медицинской микологии. Материалы первого всероссийского конгресса по медицинской микологии. Москва. 2003. Том I. С. 281-283.

3. Соболева Н.Ю. Культивирование и антибиотические свойства съедобного гриба Lentinus edodes. // Биология – наука XXI века. 7-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых. Сборник тезисов. Пущино. 14-18 апреля 2003 г. С. 131.

4. Соболева Н.Ю., Краснопольская Л.М., Федорова Г.Б., Катруха Г.С.

Антибиотические свойства и рост в погруженной культуре штаммов лекарственного базидиального гриба Lentinus edodes. // В сб.: Успехи медицинской микологии. Материалы II Всероссийского конгресса по медицинской микологии. Москва. 2004. Т. III. С. 240-242.

5. Соболева Н.Ю., Либензон А.В. Морфолого-физиологические характеристики и биологическая активность штаммов лекарственно-съедобного базидиомицета Lentinus edodes (Berk.) Sing. // В сб. Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов “Окружающая среда и здоровье”. 19-22 мая 2005 г.

Суздаль. С. 195-197.

6. L. Krasnopolskaya, I. Belitsky, A. Avtonomova, N. Soboleva, A. Usov, E. Isakova, A. Libenson, V. Bukchman. Screening system for medicinal basidiomycetes antitumor extracts. // International Journal of Medicinal Mushroom. 2005. Vol. 7. P. 423-425.

7. Соболева Н.Ю., Краснопольская Л.М., Федорова Г.Б., Катруха Г.С.

Антибиотические свойства штаммов базидиального гриба Lentinus edodes. // Антибиотики и химиотерапия. 2006. Т. 51. № 7. С. 3 - 8.

8. Соболева Н.Ю., Белицкий И.В., Федорова Г.Б., Катруха Г.С., КраснопольскаяЛ.М.

Штаммы Lentinus edodes: морфолого-физиологические признаки на вегетативной и генеративной стадиях развития. // Успехи медицинской микологии. Материалы четвертого всероссийского конгресса по медицинской микологии. Москва. 2006. Т. VII. С. 307-309.

9. Соболева Н.Ю., Автономова А.В., Белицкий И.В., Федорова Г.Б., Катруха Г.С., Исакова Е.Б., Бухман В.М., Краснопольская Л.М. Скрининг штаммов Lentinus edodes с антибиотическими и противоопухолевыми свойствами // В сб.: Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты. Москва: изд. РАЕН. 2007. В. 16. С. 84-89.

10. Бухман В.М., Трещалина Е.М., Краснопольская Л.М., Исакова Е.Б., Седакова Л.А., Автономова А.В., Леонтьева М.И., Соболева Н.Ю., Белицкий И.В., Баканов А.В. Получение и биологические свойства водных экстрактов и их композиций из мицелия базидиомицетов. // Антибиотики и химиотерапия. 2007. Т. 52. № 1-2. С. 4-9.

11. Тренин А.С., Соболева Н.Ю., Автономова А.В., Цвигун Е.А., Федорова Г.Б., Катруха Г.С., Исакова Е.Б., Бухман В.М., Краснопольская Л.М. Анализ антибиотических свойств штаммов Lentinus edodes: выявление антимикробной, гиполипидемической и противоопухолевой активности. // Иммунология, аллергология, инфектология (Труды междисциплинарного микологического форума, 23-24 апреля 2009 г.), 2009. № 2. С. 216.

Методика проведения испытаний на отличимость, однородность и стабильность 12.

(ООС) Шиитаке (пилолистник съедобный) (Lentinus edodes (Berk.) Sing.) RTG/1078/ № 12-06/21. 21.09.2009 // Интернет-ресурс http://www.gossort.com/mtd_dus.html Патент РФ на селекционное достижение № 5091. Lentinus edodes (Berk.) Sing.

13.

Шиитаке 15. Краснопольская Л.М., Соболева Н.Ю. Зарегистрировано 19.01.2010.

Приоритет 27.12.2007.