Молекулярно-генетическое исследование генов клеточного цикла (тр53, brca1) и системы биотрансформации ксенобиотиков при онкопатологии
На правах рукописи
ГАЛИКЕЕВА ГУЗЕЛЬ ФАНИЛЕВНА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНОВ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА (ТР53, BRCA1) И СИСТЕМЫ БИОТРАНСФОРМАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ ПРИ ОНКОПАТОЛОГИИ 03.02.07 – генетика
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Уфа – 2012
Работа выполнена в центре молекулярно-генетических исследований при кафедре генетики ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный педагогический университет им. М.Акмуллы» Горбунова Валентина Юрьевна
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор
Официальные оппоненты:
Ким доктор биологических наук, профессор Александр Иннокентьевич кафедры генетики Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова Бермишева кандидат биологических наук, Марина Алексеевна старший научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики человека Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН Казанский (Приволжский) федеральный
Ведущая организация:
университет
Защита диссертации состоится 29 мая 2012 г. в «_» часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.133.01 при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, просп. Октября, 71, ИБГ УНЦ РАН
С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, просп. Октября, 71 и на сайте ИБГ УНЦ РАН: ibg.anrb.ru/dissov.html, e-mail: [email protected].
Автореферат разослан «_» _2012 г.
Бикбулатова С.М.
Ученый секретарь диссертационного совета
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Основой канцерогенеза, независимо от Актуальность проблемы.
локализации опухоли, является злокачественная трансформация клетки в результате нарушения клеточного цикла и угнетения апоптоза (Татосян, 2004;
Logan et al., 2004). Молекулярный патогенез онкологических заболеваний включает множество генетических и эпигенетических событий, ведущих к активации онкогенов и инактивации генов опухолевой супрессии (Ляхович и др., 2004;
Payne, Kemp, 2005;
Croce, 2008;
Залетаев, 2008;
Лихтенштейн, 2009).
Одними из ключевых генов-супрессоров опухолевого роста являются гены TP53 и BRCA1, белковые продукты которых осуществляют реализацию широкого спектра клеточных процессов, регуляцию клеточного цикла, индукцию апоптоза, постоянный надзор за состоянием генома и злокачественной трансформацией клеток (Phillips, 1999;
Vousden, Lane, 2007;
Копнин, 2008;
Желтухин, Чумаков, 2010). Нарушение функциональной активности этих белков может провоцировать генетическую нестабильность, нарушение их транскрипционной, сигнальной и митохондриальной функций (Чумаков, 2007).
В то же время, модифицирующее влияние на функционирование генов онкосупрессоров могут оказывать такие системы, как гены ферментов биотрансформации ксенобиотиков, ответственные за метаболизм и инактивацию широкого класса эндо- и экзобиотиков, в том числе канцерогенов (Копнин, 2006;
Имянитов, Хансон, 2007).
С другой стороны, реализация онкогенеза является результатом совместного действия многих систем организма. В работе R.E. Ellis с соавторами (2002) показано, что при некоторых новообразованиях цитокины способны влиять на рост опухолевых клеток, изменяя экспрессию белков про- и антиапоптотического действия, различных онкогенов и маркеров пролиферативной активности клеток.
В частности, нарушение баланса про- и противовоспалительных сывороточных цитокинов способствует развитию патологических процессов, в том числе, злокачественных новообразований (Oppenheim, 1996;
Тугуз, 2008;
Бережная, 2009).
В связи с этим, комплексный подход, включающий: проведение молекулярно-генетического анализа генов клеточного цикла и генов инактивации ксенобиотиков, а также оценку цитокинового статуса при выявлении предрасположенности к онкозаболеваниям, является наиболее перспективным и актуальным направлением изучения механизмов злокачественной трансформации клетки.
Цель настоящего исследования заключается в анализе взаимодействия различных аллельных состояний генов, регулирующих онкосупрессию, биотрансформацию ксенобиотиков и функционирование цитокиновой системы при онкопатологии.
Задачи исследования:
Оценить распределение частот аллелей и генотипов полиморфных 1.
вариантов генов систем онкосупрессии (rs1042522 (G/C), rs1625895 (G/A), DUP16ВР гена TP53;
rs80357629 (G/A) и rs1799966 (A/G) гена BRCA1) и биотрансформации ксенобиотиков (large deletion в генах GSTM1 и GSTT1;
rs (A/G) гена GSTP1;
rs 1001179 (C/T) гена CAT;
rs1800566 (С/T) и rs1131341 (C/T) гена NQO1) у здоровых, а также больных раком молочной железы и индивидов, страдающих злокачественными новообразованиями желудочно-кишечного тракта.
Провести анализ ассоциаций аллельных вариантов генов онкосупрессии 2.
(ТР53, BRCA1) с показателями спонтанной продукции цитокинов в сыворотке крови у больных раком молочной железы.
Проанализировать распределение частот сочетаний генотипов полиморфных 3.
локусов генов (rs80357629 (G/A) и rs1799966 (A/G) гена BRCA1;
large deletion в генах GSTM1 и GSTT1;
rs1695 (A/G) гена GSTP1;
rs 1001179 (C/T) гена CAT;
rs1800566 (С/T) и rs1131341 (C/T) гена NQO1) у здоровых индивидов, носителей нормальных аллелей гена ТР53 и больных онкологичекими заболеваниями.
Оценить роль межгенных взаимодействий полиморфных локусов генов 4.
онкосупрессии и биотрансформации ксенобиотиков в развитии онкопатологии.
Провести типирование генов системы онкосупрессии (ТР53 и BRCA1) ДНК, 5.
выделенной из лейкоцитов периферической крови и опухолевой ткани больных раком молочной железы.
Провести генетический анализ наследования аллелей генов системы 6.
онкосупрессии (TP53 и BRCA1), локализованных на 17 хромосоме.
Научная новизна исследования: впервые обнаружены нуклеотидные замены в генах ТР53 (rs1625895 G/A, DUP16ВР) и BRCA1 (rs80357629, G/A;
rs1799966, A/G), произошедшие в опухолевой ткани у больных раком молочной железы, причем при реверсии аллеля в опухоли наблюдается мозаицизм в ткани с большим количеством очагов нормальных клеток, что подтверждается гистологическими исследованиями. Установлена взаимосвязь полиморфных локусов генов системы онкосупрессии с показателями спонтанной продукции цитокинов. Выявлен дисбаланс сывороточных цитокинов крови про- и противовоспалительного ряда у больных раком молочной железы. Определены межгенные взаимодействия полиморфных локусов в генах BRCA1 (rs80357629, G/A;
rs1799966, A/G), GSTP1 (rs1695, A/G), NQO1 (rs1800566, C/T;
rs1131341, C/T), являющихся рисковыми в отношении онкопатологии: у больных со злокачественными новообразованиями желудочно-кишечного тракта это – сочетание генотипов GA/AG/AG/CC/CT, а у больных раком молочной железы GA/AG/AG/CC/CT и GA/AА/AG/CC/CT по полиморфным локусам rs (G/A), BRCA1 / rs1799966 (A/G), BRCA1 / rs1695 (A/G), GSTP1 / rs1800566 (C/T), NQO1 / rs1131341 (C/T), NQO1, соответственно. При генеалогическом анализе выявлена соматическая мутация в гене ТР53 (rs1042522, G/C) у пробанда, которая не идентифицирована ни у ее матери, ни у детей. Установлено, что сочетание генотипов CC/CT/AG (rs1800566 (C/T), NQO1 / rs1131341 (C/T), NQO1 / rs является рисковым в отношении возможного развития (C/T), GSTP1) онкопатологии, даже у носителей протективных гаплотипов аллелей генов ТР53 и BRCA1, расположенных на 17 хромосоме.
Научно-практическая значимость. Полученные данные вносят вклад в понимание роли мутаций в генах, определяющих онкогенез и онкосупрессию, мутагенами для которых могут являться продукты неполной эвакуации из организма ксенобиотиков. Это относится к генетическому профилю, приводящему к неэффективной детоксикации ксенобиотиков и цитокинового статуса, включающего в себя более трех-четырех рисковых аллелей. Результаты этой части работы внедрены на кафедре онкологии и хирургии ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России при исследовании генетической предрасположенности к развитию возможной онкопатологии. Основные положения работы включены в лекционные курсы дисциплин биологического цикла: общая генетика, биохимия, иммунология, генетика человека, экологическая генетика, генетический контроль клеточного цикла, составляющих учебную программу подготовки специалистов-генетиков и магистрантов по направлению «Биология», программа «Генетика» на базе ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный педагогический университет им.
М.Акмуллы». Материалы диссертации могут быть использованы при проведении лекций для студентов биологических факультетов университетов.
Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на ежегодной международной конференции Европейского общества генетиков человека 2010), Международной школе молодых ученых (Гётеборг, II «Эмбриология, генетика и биотехнология» (Уфа, 2007), на республиканской молодежной научно-практической конференции «Инновационный потенциал молодежной науки» (Уфа, 2008), V Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГИС, Москва, 2009), IV Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы экологии Южного Урала» (Оренбург, 2009), 14-ой Пущинской международной школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2010), VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на Дону, 2010), II Всероссийской школе-конференции молодых ученых «Биомика – наука XXI века» (Уфа, 2011), на международном Конгрессе нанотехнологий круглый стол «Нанотехнологии в медицине» (Уфа, 2011), I Международной Школе-конференции молодых учёных «Спорт: медицина, генетика, физиология, биохимия, педагогика, психология и социология» (Уфа, 2011), на Всероссийских молодежных инновационных форумах «Селигер - 2010» и «Селигер - 2011».
Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе, 3 статьи в журналах из Перечня ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 159 листах машинописного текста, включает обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты исследований и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа иллюстрирована 23 таблицами и 29 рисунками. Список цитируемой литературы включает 215 источников.
Связь работы с научными программами. Работа поддержана грантами:
РФФИ «Исследование мобильного генома на примере человека и дрозофилы» на 2008-2010 гг.;
РГНФ «Молекулярно-генетические и средовые факторы в развитии когнитивных способностей человека» на 2010-2011 гг.;
Грантом Министерства образования РФ: Тематический план на 2009/2010, 2010/2011 и 2012/2014 гг.
«Молекулярно-генетическое исследование здоровья и адаптационных возможностей человека»;
Грантами БГПУ им. М.Акмуллы: по направлению 10. «Фундаментальные и прикладные исследования и инновационные образовательные проекты молодых ученых (до 35 лет)» «Изучение нормы реакции организма в зависимости от молекулярно-генетических особенностей и экологических условий среды обитания» на 2010 г.;
по направлению12. Фундаментальные и прикладные исследования в области физико-математических, технических и естественных наук для молодых ученых (до 35 лет) «Молекулярно генетическое исследование адаптационных механизмов регуляции клеточного цикла при онкопатологии» на 2012 г.;
Грантом Республики Башкортостан для государственной поддержки молодых ученых и молодежных научных коллективов «Технология комплексной оценки состояния здоровья: молекулярно-генетические и физиолого-биохимические аспекты» на 2011 г.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы исследования. В работе использованы образцы ДНК человек в возрасте от 18 до 72 лет (медиана 30.57), проживающих в Республике Башкортостан (РБ). Среди них: 1016 здоровых индивидов без отягощенного онкологического анамнеза и 164 онкологических больных, находившихся на стационарном лечении в Республиканском клиническом онкологическом диспансере МЗ РБ., из них, 88 обследованным поставлен диагноз - рак молочной железы (РМЖ), у 76 выявлены злокачественные новообразования желудочно кишечного тракта. В исследование включены индивиды с различными стадиями заболевания, соответствующих по клинико-морфологической (TNM) классификации опухолей: T1-3N0-2M0-1. У 15-ти женщин из числа больных РМЖ проведено исследование образцов ДНК опухолевой ткани.
Методы исследования. Выделение ДНК из цельной венозной крови проводили стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew, 1984). Выделение ДНК из опухолевой ткани проводили с использованием наборов фирмы «Fermentas». Генотипирование полиморфных локусов исследуемых генов проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР) и рестрикционным анализом с последующим электрофорезом фрагментов ДНК в 7% полиакриламидном геле. Окрашивание гелей проводили раствором этидия бромида (1%), последующую визуализацию с помощью видеогель документирующей системы (Gel Imager). Концентрацию цитокинов в сыворотке крови здоровых индивидов и больных раком молочной железы (стадии T1-3N0-2M0) измеряли иммуноферментным методом с использованием реактивов ЗАО «Вектор бест» (Новосибирск). Сыворотка крови взята до проведения операции по удалению опухоли и через 14 дней после проведения операции.
Проведены генеалогический и генетический анализ наследования аллелей генов онкосупрессоров ТР53 и BRCA1 (Курчанов, 2006). Общая схема эксперимента представлена на рис. 1.
Рис. 1. Схема эксперимента полученных данных проводили с Статистическую обработку использованием критерия Стьюдента. Различия между параметрами считались статистически достоверными при p0,05. Для определения статистических параметров использовались программы MS Excel и Statistica 6.0, анализ сцепления проводили с использованием программы 2 LD (Zapata C, 2001), гаплотипический анализ – с помощью программы EH (Xiex, 1993). Однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) проводили с использованием статистического пакета SPSS (версия 13.0) (Юнкеров, 2002). При анализе межгенных взаимодействий использовали метод моделирования ген-генных и ген-средовых взаимодействий с помощью непараметрической программы MDR - Multifactor-Dimensionality Reduction (Lou, 2007).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Анализ распределения частот генотипов и аллелей полиморфных локусов исследуемых генов у здоровых индивидов и в группе с онкопатологией TP53. Поскольку, сравнительный анализ распределения частот генотипов и аллелей гена ТР53 (rs1042522, G/C;
rs1625895, G/A;
DUP16bp) не показал достоверных различий между группами больных РМЖ и раком ЖКТ, они составили одну группу - онкобольные (n=164).
Анализ распределения частот аллелей и генотипов по полиморфному локусу в гене ТР53 выявил достоверное повышение частоты rs1042522 (G/C) гетерозиготного генотипа GC в группе здоровых индивидов (р=0,005, 2=8,30), а в группе онкобольных достоверно чаще встречался гомозиготный генотип GG (р=0,023, 2=5,22). Согласно литературным данным, аллель *G кодирует белок с меньшей антистрессовой активностью (Campisi, 2003).
В распределении частот генотипов и аллелей по полиморфному локусу DUP16BP гена TP53 у здоровых индивидов и онкобольных достоверных различий обнаружено не было (рис. 2).
Рис. 2. Распределение частот генотипов и аллелей по полиморфным локусам гена ТР53 у онкобольных с различной локализацией опухоли и здоровых индивидов При анализе распределения частот генотипов и аллелей по полиморфному локусу rs1625895 (G/A) в гене ТР53 выявлено, что генотипы wm и mm, а также аллель *m достоверно чаще встречались в группе онкобольных (р=0,0005, 2=100,03;
р=0,0014, 2=11,59;
р=0,0005, 2=95,49 соответственно). Тогда как, в группе здоровых индивидов преобладал генотип ww и аллель *w (р=0,0005, 2=117,36;
р=0,0005, 2=95,49 соответственно). По мнению Wu et al. (2002), полиморфные варианты в интронных (rs1625895 (G/A), DUP16BP) последовательностях гена ТР53 приводят к снижению эффективности экспрессии гена и, как следствие, к снижению и апоптотического индекса ДНК.
Группа сравнения для анализа распределения частот генотипов и аллелей генов BRCA1 (rs803357629, G/A;
rs1799966, A/G), GSTM1(large deletion), GSTT (large deletion), GSTP1 (rs1695, A/G), CAT (rs 1001179, C/T), NQO1 (rs1800566, C/T;
rs1131341, C/T) была сформирована из числа здоровых индивидов без семейного онкологического анамнеза и только носителей «нормальных» аллелей гена ТР53 (n=180).
BRCA1. Сравнительный анализ распределения изученных полиморфных локусов (rs803357629, G/A;
rs1799966, A/G) в гене BRCA1 у больных с расположением опухоли в разных органах, показал при РМЖ наличие достоверно высоких значений частот генотипов GA (rs80357629, G/A) и GG (rs1799966, A/G), имеющих аллели с нуклеотидной заменой (рис. 3).
Рис. 3. Распределение частот генотипов и аллелей полиморфных локусов гена BRCA1 у онкобольных с различной локализацией опухоли и здоровых индивидов Выявлено достоверное повышение частоты гомозиготного генотипа GG и аллеля *G в группе здоровых индивидов по сравнению с общей группой 2=49,40;
р=0,0005, 2=66,10 соответственно) по онкобольных (р=0,0005, полиморфному локусу rs803357629 (G/A) в гене BRCA1. Гомозиготный генотип АА выявлен только у онкобольных с частотой 32±4% (р=0,0005, 2=66,31 ).
Анализ распределения частот генотипов и аллелей по полиморфному локусу rs1799966 (A/G) в гене BRCA1 выявил достоверно значимые различия между больными и здоровыми индивидами. Так, гомозиготный генотип GG и аллель *G достоверно чаще встречались в группе онкобольных (р=0,0005, 2=96,48;
р=0,0005, 2=98,14 соответственно). Тогда как, в группе здоровых индивидов преобладали генотипы AA и AG, а также аллель *A (р=0,0005, 2=75,46;
р=0,006, 2=7,85;
р=0,0005, 2=98,14 соответственно).
Таким образом, оба полиморфных локуса в гене BRCA1 (rs803357629, G/A;
rs1799966, A/G) могут приводить к злокачественному перерождению клеток в любых тканях, что дает возможность объединить всех онкобольных для проведения сравнительного анализа по данному гену с контрольной выборкой.
Это объясняется тем, что продукт гена BRCA1 участвует в регуляции клеточного цикла, нарушение которого приводит к трансформации клетки.
GSTP1. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов по полиморфному локусу rs1695 (A/G) в гене GSTP1 выявил достоверно высокие частоты гомозиготного генотипа GG (р=0,009, 2=6,96) и гетерозиготного генотипа AG (р=0,02, 2=5,14), а также аллеля *G (р=0,0005, 2=18,36) в группе больных РМЖ. В группе здоровых индивидов гомозиготный генотип АА встречался с частотой 39%, а аллель *А с частотой 65%, что достоверно выше, чем в группе больных РМЖ (р=0,0005, 2=19,96;
р=0,0005, 2=18,36 соответственно).
NQO1. Анализ распределения частот аллелей и генотипов по полиморфному локусу гена NQO1 (rs1131341, C/T) показал достоверные различия между группой здоровых индивидов и больных РМЖ: у здоровых индивидов чаще детектируется гомозиготный генотип СС (р=0,003, 2=9,62) и аллель *С (р=0,006, 2=7,86). У больных - достоверно высокая частота генотипов CT и TT (р=0,009, 2=6,90;
р=0,005, 2=8,37 соответственно), а также аллеля *T (р=0,0008, 2=14,37).
В распределении частот генотипов и аллелей по полиморфным локусам rs1800566 (C/T) гена NQO1, rs 1001179 (C/T) гена CAT, large deletion в генах GSTM1 и GSTT1 у здоровых индивидов и онкобольных достоверных различий не обнаружено.
Таким образом, нарушение работы системы онкосупрессии играет ключевую роль в развитии онкопатологии независимо от локализации опухоли. В свою очередь, сбои в системе биотрансформации ксенобиотиков оказывают существенное влияние на развитие РМЖ.
2. Анализ наследования аллелей генов системы онкосупрессии (ТР53, BRCA1) Белки онкосупрессоры р53 и BRCA1 кодируются генами, локализованными на разных плечах хромосомы 17 (17р13.1 и 17q21 соответственно). Согласно National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov), физическое расстояние между генами составляет 33505449 п.н., что соответствует 33,5 Mb или 33,5 сМ.
Анализ сцепления полиморфных локусов в генах ТР53 (rs1625895, rs1042522, DUP 16bp) и BRCA1 (rs80357629, rs1799966) выявил высокое сцепление между полиморфными вариантами генов ТР53 (rs1625895) и BRCA (rs80357629) (D'=0,99). Между локусами ТР53 (rs1042522) и BRCA1 (rs80357629) D'-коэффициент составил 0,64. Также определено слабое сцепление между ТР53(rs1625895)/BRCA1(rs1799966) ТР53(DUP локусами и которых составил 0,35 и 0, 16bp)/BRCA1(rs1799966), D'-коэффициент соответственно. В группе онкобольных выявлено незначительное сцепление ТР53(rs1042522)/BRCA1(rs80357629), ТР53(rs1625895)/ между локусами BRCA1(rs1799966) и ТР53(DUP16bp)/BRCA1(rs1799966).
Гаплотипический анализ показал, что в группе здоровых индивидов достоверно чаще встречается гаплотип *G/*w/*D/*G (р=0,0005, 2=133,41), сочетающий только протективные аллели. У онкобольных выявлены гаплотипы *G/*m/*D/*G, *C/*w/*D/*A и *C/*m/*D/*A (rs1042522, ТР53 / rs1625895, ТР53 / DUP 16BP, ТР53 / rs80357629, BRCA1 соответственно), которые в группе сравнения не обнаружены (рис. 4).
Рис. 4. Распределение частот гаплотипов аллелей генов ТР53, BRCA1 (rs80357629) у здоровых индивидов и онкобольных, в % У носителей протективного гаплотипа *G/*w/*D/*G проведен анализ распределения частот сочетаний генотипов полиморфных локусов генов NQO (rs1800566, C/T;
rs1131341, C/T) и GSTP1 (rs1695, A/G). Обнаружено, что у онкобольных достоверно чаще встречается сочетание генотипов CC/CT/AG (р=0,006, 2=7,73), включающее два рисковых аллеля в полиморфных локусах этих двух генов (рис.5). У здоровых индивидов чаще выявляется сочетание генотипов CT/CC/АА (rs1800566 (C/T) / rs1131341 (С/Т) гена NQO1 / rs1695 (A/G) гена GSTP1;
р=0,01, 2=5,97), в которое входит только один рисковый аллель. Возможно, генетически обусловленное снижение ферментативной активности двух белков второй фазы биотрансформации ксенобиотиков (NAD(P)H-хиноноксидоредуктазы и глутатион-S-трансферазы), является фактором неблагоприятного прогноза в отношении риска развития онкопатологии.
Рис. 5. Распределение частот сочетаний генотипов полиморфных локусов генов GSTP1 и NQO1 у носителей протективного гаплотипа ТР генов и BRCA (rs80357629), в % Анализ распределения частот гаплотипов полиморфных локусов rs1042522, rs1625895, DUP 16bp, гена ТР53 и rs1799966 (A/G) гена BRCA1 показал существенные различия между группами (рис. 6). Гаплотип *G/*w/*D/*А, сочетающий нормальные аллели по изученным локусам, в группе здоровых индивидов встречался достоверно чаще (р=0,0005, 2=135,03). В группе онкобольных достоверно выше была частота гаплотипов *G/*m/*D/*А, *G/*m/*D/*G, *C/*w/*D/*G и *C/*m/*D/*G (rs1042522, ТР53 / rs1625895, ТР53 / DUP 16bp, ТР53 / rs1799966, BRCA1 соответственно), в составе которых входят рисковые аллели.
Рис. 6. Распределение частот гаплотипов аллелй генов ТР53, BRCA1 (rs1799966) у здоровых индивидов и онкобольных, в % Гаплотипический анализ выявил онкобольных носителей (17%), протективного гаплотипа Поэтому был проведен анализ *G/*w/*D/*А.
распределения частот сочетаний генотипов полиморфных локусов генов GSTP (rs1695, A/G) и NQO1 (rs1800566, C/T;
rs1131341, C/T), который показал, что 44% индивидов из данной группы являются носителями сочетания генотипов CC/CT/AG, включающего два рисковых аллеля (рис. 7). При сравнении со здоровыми носителями протективного гаплотипа были обнаружены достоверные различия (р=0,014, 2=6,02). У здоровых индивидов выявлены два сочетания генотипов: CT/CC/AA и CT/CT/AA (rs1800566 (C/T) / rs1131341 (С/Т) гена NQO1 / rs1695 (A/G) гена GSTP1 соответственно) с частотой 17,6% каждый, тогда как у онкобольных эти сочетания не обнаружены. (р=0,058, 2=3,36;
р=0,058, 2=3,56, соответственно;
рис. 7).
Рис. 7. Распределение частот сочетаний генотипов полиморфных локусов генов GSTP1 и NQO1 у носителей протективного гаплотипа ТР генов и BRCA (rs1799966), в % Проведен генеалогический анализ родословных 18 семей, включающих человек. При анализе семьи №5 у индивида II.6 обнаружена соматическая мутация в локусе rs1042522 (G/C) гена ТР53 (рис. 8).
Рис. 8. Наследование генов TP53 и BRCA1 в семье № Возможно, данная нуклеотидная замена произошла в кроветворных органах.
Анализ наследования этих генов, проведенный относительно индивида II.6 дает возможность предположить, что гаметы (яйцеклетки) не содержали мутации, поэтому у дочери пробанда аллель *C в генотипе не выявлен.
3. Типирование полиморфных локусов генов системы онкосупрессии ТР53 и BRCA1 в ДНК, выделенной из периферической крови и из опухолевой ткани у больных раком молочной железы При генотипировании полиморфных локусов rs1042522, rs1625895, DUP 16bp, гена ТР53 и rs80357629, rs1799966 гена BRCA1 в образцах ДНК лейкоцитов периферической крови и опухолевой ткани у больных РМЖ в семи из пятнадцати биоптатов выявлены изменения генотипов (табл. 1). В образце ткани № выявлен гомозиготный генотип ww (rs1625895) в гене ТР53. Гистологическое описание опухолевой ткани соответствовало признакам доброкачественности новообразования (Ганцев, Горбунова и др., 2012). Возможно, генетическая конституция wm по гену ТР53, предрасполагающая к развитию онкопатологии, способствовала злокачественному перерождению клетки, но реверсия аллеля гена ТР53 (wmww) в опухоли определила наличие большого количества островков нормальной ткани.
В двух образцах (№ 3, 4) обнаружены несовпадения генотипов по четырем локусам из пяти. Индивидуальный анализ показал, что данные пациентки имели II стадию заболевания без метастаз (T2N0M0). Гистологические исследования опухоли идентифицировали стадию инфильтрирующей протоковой карциномы (Ганцев, Горбунова и др., 2012).
Таблица Нуклеотидные замены в полиморфных локусах генов TP53 и BRCA1, обнаруженные в опухолевой ткани больных РМЖ Генотипы: кровь опухоль Классификация Образец BRCA1 BRCA ТР53 ТР53 ТР TNM rs1625895 rs80357629 rs rs1042522 DUP16BP DI DD 1 T2N1M wm ww 2 T1N0M DI DD wm ww AG GG 3 AAGA T2N0M DD DI wm mm GG AG 4 AAGA T2N0M ww wm 5 T3N2M 6 AAGA T2N2M 7 AAGA T2N1M У пациентки №3 идентифицируются пять рисковых аллелей по генам ТР53 и BRCA1, способных запустить пролиферацию клеток. Персонифицированный анализ цитокинового профиля показал, что концентрация противовоспалительного цитокина IL-10 была значительно повышена, что свидетельствует о напряженной работе иммунной системы. В пользу такого заключения говорят следующие факты: метастазы не выявлены;
два аллеля в гене ТР53 восстановились до «нормального» (табл. 1). Следует учесть, что эти пациентки не подвергались дооперационной химио- и радиотерапии.
4. Исследование роли межгенных взаимодействий в формировании предрасположенности к онкозаболеваниям В основе генетической предрасположенности к многофакторным заболеваниям лежат сложные взаимосвязи различных генетических систем. С целью выявления особенностей совместной работы генов, было проведено моделирование ген-генных взаимодействий для пяти полиморфных локусов в генах системы онкосупрессии и биотрансформации ксенобиотиков. В результате анализа межгенных взаимодействий полиморфных вариантов генов BRCA (rs80357629, rs1799966), GSTP1 (rs1695), NQO1 (rs1800566, rs1131341) выявлены достоверные двух-, трех- и пятилокусные модели (табл. 2).
Таблица Модели межгенных взаимодействий при онкопатологии Tr.Bal. Test.Bal.
p (2) Se. Sp. CVC Pre.
Группа Acc. Acc.
NQO1 (rs1800566)/NQO1 (rs1131341)/GSTP1 (rs1695) 0,6943 0,5920 0,0003 (13,14) 0,8710 0,5065 10/10 0, BRCA1 (rs80357629)/BRCA1 (rs1799966) больные раком 0,6891 0,6439 0,0001 (24,79) 0,3878 0,9833 10/10 0, ЖКТ NQO1 (rs1800566)/NQO1 (rs1131341)/GSTP1 (rs1695)/BRCA (rs80357629)/BRCA1 (rs1799966) 0,9036 0,7116 0,0001 (46,01) 0,8519 0,9524 10/10 0, NQO1 (rs1800566)/NQO1 (rs1131341)/GSTP1 (rs1695) 0,7545 0,6940 0,0001 (34,12) 0,7143 0,7922 10/10 0, BRCA1 (rs80357629)/BRCA1 (rs1799966) больные 0,6897 0,6897 0,0001 (20,71) 0,7126 0,6667 10/10 0, РМЖ NQO1 (rs1800566)/NQO1 (rs1131341)/GSTP1 (rs1695)/BRCA (rs80357629)/BRCA1 (rs1799966) 0,9166 0,6850 0,0001 (62,99) 0,8704 0,9512 10/10 0, NQO1 (rs1800566)/NQO1 (rs1131341)/GSTP1 (rs1695) 0,7070 0,6545 0,0001 (27,40) 0,6552 0,7532 10/10 0, BRCA1 (rs80357629)/BRCA1 (rs1799966) все 0,7991 0,7991 0,0001 (60,61) 0,6148 0,9833 10/10 0, больные NQO1 (rs1800566)/NQO1 (rs1131341)/GSTP1 (rs1695)/BRCA (rs80357629)/BRCA1 (rs1799966) 0,9630 0,7963 0,0001 (99,65) 0,9259 1,0000 10/10 1, Примечание: Tr.Bal. Acc. – тренировочная сбалансированная точность, Test.Bal. Acc. – тестируемая сбалансированная точность, Sign Test (P) – тест на значимость, 2 - критерий значимости различий популяций по распределению частот генотипов, Se. – чувствительность, Sp. – специфичность, CVC – повторяемость результата, Pre. (Precision) – точность модели.
Анализ пятилокусной модели взаимодействия генов при злокачественных новообразованиях желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) выявил несколько рисковых комбинаций. У больных со злокачественными новообразованиями ЖКТ рисковым является сочетание генотипов GA (rs80357629, BRCA1) / AG (rs1799966, BRCA1) / AG (rs1695, GSTP1) / CC (rs1800566, NQO1) / CT (rs1131341, NQO1).
Комплементарное усиление неспособности к обезвреживанию активных метаболитов при биотрансформации ксенобиотиков выявлено при взаимодействии генов NQO1 (rs1800566) и GSTP1 (rs1695) (12,41%, рис. 9), а при генотипе АА гена BRCA1 (rs80357629, G/A) накопление генотоксических аддуктов из-за снижения ферментативной активности глутатион-S-трансферазы приводит к злокачественной трансформации клетки.
Рис. 9. Графическое отображение результатов анализа взаимодействий между генами при BRCA1, NQO1, GSTP злокачественных новообразованиях желудочно кишечного тракта Примечание (здесь и далее на рис.
10) на вершинах многогранника представлена информационная ценность каждого маркера, на ребрах информационная – ценность взаимодействия пары генов У больных раком молочной железы рисковыми являются сочетания аллелей в следующих генотипах GA (rs80357629, BRCA1) / AG (rs1799966, BRCA1) / AG (rs1695, GSTP1) / CC (rs1800566, NQO1) / CT (rs1131341, NQO1) и GA (rs80357629, BRCA1) / AА (rs1799966, BRCA1) / AG (rs1695, GSTP1) / CC (rs1800566, NQO1) / CT (rs1131341, NQO1). Выявлено существенное дублирующее взаимодействие между непротективными аллелями генов BRCA1 (rs80357629, G/A) и NQO1(rs1800566, С/Т;
rs1131341, С/Т). При РМЖ, наблюдается усиление непротективного взаимодействия гетерозиготных генотипов по локусам rs80357629 и rs гена BRCA1 (-12,35%, рис. 10).
Рис. 10. Графическое отображение результатов анализа взаимодействий между генами BRCA1, NQO1, GSTP при раке молочной железы.
5. Анализ ассоциаций аллелей генов онкосупрессии (ТР53 и BRCA1) с показателями концентраций цитокинов в сыворотке крови Анализ содержания основных про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови у больных РМЖ показывает достоверное изменение их уровня по сравнению со здоровыми индивидами (табл. 3).
Выявлено достоверное понижение провоспалительного цитокина IL-2 у больных раком молочной железы. Известно, что IL-2 является индуктором апоптоза (Кадагидзе, 2003).
Таблица Цитокиновый статус у больных РМЖ до операции и здоровых индивидов, пг/мл (CRP-мг/л) Больные РМЖ Здоровые Показа- n n р ±m ±m Тели IL-1 (0-11) 44 2,5±0,21 1,4 56 3,8±0,28 2,1 0, IL1RA (50-1000) 44 1031,43±75,71 502 56 215±23,8 178 0, IL2 (0-10) 44 1,26±0,06 0,4 56 9,6±0,6 4,5 0, IL4 (0-4) 44 1,3±0,09 0,6 56 1,8±0,06 0,5 0, IL6 (0-10) 44 25±1,96 13 56 11,3±0,52 3,9 0, IL10 (0-20) 44 22,8±1,85 12,3 56 10,3±0,6 4,5 0, -TNF (0-6) 44 3,62±0,22 1,5 56 1,86±0,09 0,7 0, CRP (0-5) 44 1,2±0,18 0,3 56 2,6±0,12 0,9 0, Примечание: в скобках приведены значения клинической нормы, n-количество индивидов У больных РМЖ обнаружено повышение продукции провоспалительного цитокина IL-6. Установлено, что IL-6 обладает большим влиянием на регуляцию иммунного ответа: он стимулирует пролиферацию и дифференцировку В-клеток, усиливает образование антител, участвует в продукции мультипотентных колониеобразующих факторов и мегакариоцитов, может подавлять апоптоз нейтрофилов (Кадагидзе, 2003). Помимо этого, IL-6 выступает в качестве триггера канцерогенеза, включающего самоподдерживающуюся цепь, обуславливающую инициацию и поддержание злокачественного состояния в клетках молочной железы (Rokavec et al., 2012). Некоторые авторы относят IL-6 к цитокинам, ингибирующим апоптоз, что способствует росту и ангиогенезу опухоли (Yamamoto et al, 1995;
Carpi, 2009;
Sangaletti et al, 2010).
Концентрации других провоспалительных цитокинов находились на уровне минимальных значений физиологической нормы (табл. 3), что может объясняться слабой иммунореактивностью.
Иммуноферментный анализ содержания цитокинов в сыворотке крови больных РМЖ, проведенный в послеоперационный период не выявил изменений концентраций цитокинов про- и противовоспалительного ряда.
У здоровых индивидов концентрации про- и противовоспалительных цитокинов находились в физиологичном соотношении согласно их функциональным взаимосвязям.
Однофакторным дисперсионным анализом (ANOVA) у больных раком молочной железы выявлена ассоциация пониженной концентрации IL-2 c аллелем *m (rs1625895) гена TP53 (p0,001) и ассоциация низких значений IL-10 с аллелем BRCA1*A ( rs80357629, р=0,038;
рис. 11).
Рис. 11. Ассоциация аллелей генов ТР53 и BRCA1 со средними концентрациями цитокинов IL-2 и IL- Следовательно, нарушение работы генов клеточного цикла совместно с дисбалансом соотношений сывороточных цитокинов, принимающих участие в индукции апоптоза, является фактором неблагоприятного прогноза в отношении развития РМЖ.
*** Таким образом, полученные результаты позволяют говорить о ключевой роли аллельного состояния генов системы онкосупрессии (ТР53 и BRCA1) и биотрансформации ксенобиотиков (GSTP1 и NQO1) в формировании риска злокачественной трансформации клетки. В патогенетическую связь между наследственной предрасположенностью к злокачественным новообразованиям и их клинической манифестацией включены цитокины, осуществляющие регуляцию межклеточных взаимосвязей. Показано, что патофизиологическую роль в возникновении опухоли играет как высокая продукция интерлейкина–6, рецепторного антагониста интерлейкина–1 и интерлейкина–10, так и низкая продукция интерлейкина–2, что в итоге приводит к дисбалансу цитокиновой регуляторной сети, который, в свою очередь, ингибирует апоптоз и угнетает иммунный ответ. Изменения функционирования цитокиновой регуляции в тандеме с носительством рисковых аллелей генов ТР53, BRCA1, GSTP1 и NQO являются факторами, обуславливающими развитие онкологического заболевания.
ВЫВОДЫ:
У онкобольных выявлено достоверное повышение частоты генотипов 1.
GG (rs1042522), wm, mm и аллеля *m (rs1625895) гена ТР53 и гомозиготных генотипов AA (rs80357629) и GG (rs179996) гена BRCA1, являющихся онкосупрессорами.
Показано, что протективными являются гаплотипы, сочетающие 2.
только нормальные аллели генов-онкосупрессоров ТР53 и BRCA1, расположенных на 17 хромосоме. Рисковые: *G/*m/*D/*G, *C/*w/*D/*A, *C/*m/*D/*A [rs (G/C) / rs1625895 (G/A) / DUP16BP гена ТР53 / rs80357629 (G/A) гена BRCA1], *G/*m/*D/*А, *G/*m/*D/*G, *C/*w/*D/*G и *C/*m/*D*G [rs1042522 (G/C) / rs1625895 (G/A) / DUP16ВР гена ТР53 / rs1799966 (A/G) гена BRCA1].
Установлено, что сочетание генотипов CC/CT/AG [rs1800566 (С/Т) / 3.
rs1131341 (С/Т) гена NQO1 / rs1695 (A/G) гена GSTP1] является рисковым в отношении развития онкопатологии, даже у носителей протективных аллелей в гаплотипах генов-онкосупрессоров ТР53 и BRCA1.
Обнаружены ассоциации аллеля *m (rs1625895) гена TP53 с 4.
пониженной концентрацией IL2 и аллея *A (rs80357629) гена BRCA1 с пониженной концентрацией IL-10, являющихся индукторами апоптоза Генеалогический анализ родословной семьи выявил носителя 5.
нуклеотидной замены в полиморфном локусе rs1042522 (G/C) гена ТР53, произошедшей в онтогенезе.
Установлены достоверные двух-, трех- и пятилокусные модели 6.
межгенных взаимодействий, детерминирующие развитие онкологических заболеваний. У больных со злокачественными новообразованиями желудочно кишечного тракта рисковыми являются сочетания генотипов GA/AG/AG/CC/CT, а у больных раком молочной железы - GA/AG/AG/CC/CT и GA/AА/AG/CC/CT [rs80357629 (G/A), BRCA1 / rs1799966 (A/G), BRCA1 / rs1695 (A/G), GSTP1 / rs1800566 (C/T), NQO1 / rs1131341 (C/T), NQO1, соответственно].
Обнаружены несовпадения генотипов в полиморфных локусах генов 7.
ТР53 (rs1625895, G/A;
DUP16ВР) и BRCA1 (rs80357629,G/A;
rs1799966, A/G) в образцах ДНК опухолевой ткани больных РМЖ по сравнению с их образцами ДНК лейкоцитов периферической крови.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Галикеева Г.Ф., Васильева Э.М., Каюмова Л.Р., Гумерова О.В., Воробьева Е.В., 1.
Горбунова В.Ю. Анализ полиморфных вариантов генов биотрансформации ксенобиотиков (GSTM1и ТР53) у больных раком молочной железы // Вестник Оренбургского государственного университета. 2009, № 10. С. 252-258.
Васильева Э.М., Галикеева Г.Ф., Гумерова Г.Р., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю.
2.
Анализ пяти полиморфных локусов трех генов системы биотрансформации ксенобиотиков (СУР2Е1, EPHX1, NQO1) в республике Башкортостан // Вестник Оренбургского государственного университета.. 2009, № 10. С. 429-431.
Васильева Э.М., Гумерова Г.Р., Галикеева Г.Ф., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю.
3.
Генетический мониторинг населения: изучение полиморфных вариантов генов цитохромоксидазной системы и цитокинового комплекса // Аграрная Россия. 2009, Специальный выпуск. С. 118.
Ганцев Ш.Х., Горбунова В.Ю., Галикеева Г.Ф., Воробьева Е.В., Васильева Э.М., 4.
Рустамханов Р.А. Функционирование генов онкосупрессии (ТР53, BRCA1) и их взаимодействие с цитокинами при раке молочной железы. // Креативная онкология и хирургия. Электронный научно-практический журнал. Апрель 2012. 23099 знаков.
url:http:/eoncosurg.com/?p=2273.
Галикеева Г.Ф., Николаев И.В., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Молекулярно 5.
генетическое исследование полиморфных вариантов в гене ТР53 и Alu-элементов подсемейства AluYa при онкологических заболеваниях // Медицинская генетика. 2010, Материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков. С. 43.
Галикеева Г.Ф., Васильева Э.М., Каюмова Л.Р., Гумерова Г.Р., Гумерова О.В., 6.
Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Распределение частот генотипов и аллелей генов регуляторов ферментных систем первой фазы биотрансформации ксенобиотиков CYP1A1, CYP2E1 // Эмбриология, генетика и биотехнология. – Материалы II международной школы молодых ученых Уфа, 2007. С. 35-37.
Васильева Э.М., Галикеева Г.Ф., Гумерова Г.Р., Каюмова Л.Р., Гумерова О.В., 7.
Воробьева Е. В., Горбунова В. Ю. Изучение полиморфизма генов I фазы биотрансформации ксенобиотиков цитохрома Р-450: СУР1А1 и СУР2Е1 в группах людей, различающихся по экологическим условиям проживания // Инновационный потенциал молодежной науки:
материалы республиканской научно-практической конференции. Т.1. Уфа, 2008. С. 16-20.
8. Галикеева Г. Ф., Васильева Э.М., Гумерова Г.Р., Каюмова Л.Р., Гумерова О.В., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Распределение частот генотипов и аллелей «генов внешней среды» IL-1Ra и IL-1B и гена-супрессора опухолевого роста ТР53 // Инновационный потенциал молодежной науки: материалы республиканской научно-практической конференции. Т.1. Уфа, 2008. С. 26-30.
Васильева Э.М., Галикеева Г.Ф., Гумерова Г.Р., Гумерова О.В., Воробьева Е.В., 9.
Горбунова В.Ю. Исследование полиморфных вариантов генов цитохромоксидазной системы и генов цитокинового комплекса в Республике Башкортостан // Материалы съезда генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина (V Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров). Т. 2. Москва, 2009. С. 151.
Галикеева Г.Ф., Васильева Э.М., Гумерова Г.Р., Каюмова Л.Р., Гумерова О.В., 10.
Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Исследование распределения частот генотипов и аллелей гена-супрессора опухолевого роста TP53 в Республике Башкортостан // Материалы съезда генетиков и селекционеров, посвященный 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина (V Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров). Т. 2. Москва, 2009. С. 156.
Васильева Э.М., Галикеева Г.Ф., Гумерова Г.Р., Каюмова Л.Р., Воробьева Е.В., 11.
Горбунова В.Ю. Изучение генетических маркеров устойчивости к генотоксическим эффектам среды обитания человека // Современный педагогический университет как центр интеграции науки и образования. Материалы внутривузовской научно-практической конференции, проводимой в рамках Дней науки БГПУ им. М. Акмуллы. Уфа, 2009. С.25-28.
Васильева Э.М., Галикеева Г.Ф., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Исследование 12.
полиморфных вариантов генов, участвующих в инактивации ксенобиотиков // Труды Всероссийской конференции, посвященной 10-летию кафедры генетики БГПУ им.
М.Акмуллы, приуроченной к ежегодным Вавиловским чтениям «Инновационные и молекулярно-генетические исследования живых систем». Уфа, 2009. С. 159-165.
Галикеева Г.Ф., Васильева Э.М., Тимкова А.В., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю.
13.
Исследование распределения частот генотипов и аллелей полиморфных вариантов гена онкосупрессора ТР53// Материалы международной научно-практической конференции «Роль классических университетов в формировании инновационной среды регионов». Уфа. 2009.
С. 61-64.
Галикеева Г.Ф., Васильева Э.М., Николаев И.В., Кильдиярова И.Ф., Воробьева Е.В., 14.
Горбунова В.Ю. Анализ полиморфных вариантов гена ТР53 в группах лиц, проживающих в условиях с различной экологической нагрузкой // Материалы Всероссийской научно практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной науки и образования». Т.II. Уфа, 2010. С. 157-161.
Галикеева Г.Ф. Молекулярно-генетическое исследование генов системы 15.
биотрансформации ксенобиотиков у жителей республики Башкортостан // Материалы всероссийской конференции «Ломоносов - 2010». Москва, 2010. С. 81.
Галикеева Г.Ф., Васильева Э.М., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Молекулярно 16.
генетическое исследование генов антиоксидантной защиты при онкопатологии // Сборник тезисов. Биология – наука XXI века: 14-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых. Пущино, 2010. С. 124.
17. Galikeeva G., Vasilyeva E., Vorobyeva E., Gorbunova V. Molecular genetic study of genes biotransformation of xenobiotics // European Human Genetics Conference. Gothenburg, 2010.
Abst. P08.13.P. 203-204.
Васильева Э.М., Галикеева Г.Ф., Воробьева Е.В., Имельбаева Э.А., Батретдинова 18.
Р.Т., Горбунова В.Ю. Исследование корреляционной зависимости между продукцией цитокинов и генами цитокинового каскада у здоровых индивидов // Материалы II Всероссийской школы-конференции молодых ученых «Биомика – наука XXI века». Уфа, 2011. С.23-24.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ РМЖ рак молочной железы интерлейкин-1 бета IL- ЖКТ желудочно-кишечный тракт антагонист рецептора IL1RA интерлейкина- BRCA1 brest cancer каталаза CAT TP53 Tumor protein глутатион S-трансфераза тета 1 -TNF фактор некроза опухоли альфа GSTT глутатион S-трансфераза мю 1 критерий значимости различий GSTМ популяций по распределению глутатион S-трансфераза пи GSTP1 частот генотипов СRP С-реактивный белок р вероятность