Рнк-полимераза e.coli: экспресс-метод выделения высокочистых препаратов; новые возможности структурно-функциональных исследований

На правах рукописи

ХОДАК Юлия Александровна РНК-ПОЛИМЕРАЗА E.coli: ЭКСПРЕСС-МЕТОД ВЫДЕЛЕНИЯ ВЫСОКОЧИСТЫХ ПРЕПАРАТОВ;

НОВЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 03.01.03 молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва 2011

Работа выполнена в отделе химии нуклеиновых кислот НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Научные кандидат химических наук руководители: Друца Валерий Львович кандидат химических наук Королёва Ольга Николаевна Официальные доктор биологических наук оппоненты: Вейко Наталия Николаевна кандидат биологических наук Скурат Евгений Владимирович

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии им.

В.А.Энгельгардта РАН.

Защита состоится 28 октября 2011 года в 12 часов на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д.1, строение 40, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова, аудитория 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан сентября 2011 года.

Учёный секретарь Совета, кандидат биологических наук И.А.Крашенинников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы.

Транскрипция - совокупность реакций, в результате которых происходит синтез РНК копий на ДНК-матрице. Этот процесс играет ключевую роль в метаболизме клетки, поэтому исследования его механизмов и способов регуляции чрезвычайно важны для молекулярной биологии, биотехнологии и медицины. Транскрипцию катализируют ферменты ДНК-зависимые РНК-полимеразы (РНКП). Их строение и функции активно изучают на протяжении последних десятилетий, однако некоторые структурные особенности данных белков и отдельные механизмы осуществляемых ими каталитических реакций окончательно не ясны.

Среди многосубъединичных РНК-полимераз наиболее изученным ферментом является РНК-полимераза E. coli. Её минимальный фермент (кор-фермент), способный осуществлять элонгацию и терминацию транскрипции, состоит из пяти субъединиц (2'). В результате присоединения к кор-ферменту -субъединицы образуется холофермент, способный к специфическому узнаванию сигналов инициации транскрипции (промоторов). Поскольку основные принципы структурной организации и функционирования РНК-полимеразы E. coli известны, она является удобным модельным объектом для более детальных исследований процесса транскрипции.

Для изучения тонких механизмов транскрипции используются новые высокоточные физические, физико-химические и молекулярно-биологические методы, а также методы белковой инженерии. Правильная интерпретация результатов исследований зависит от чистоты и качества используемых препаратов РНКП: крайне важно, чтобы структура изучаемых ферментов максимально соответствовала структуре функционирующих в клетке молекул РНКП. Кроме того, в случае использования мутантных вариантов фермента важным фактором является отсутствие в препарате примеси белков природной формы, наличие которой может исказить результаты экспериментов. Проблема получения препаратов с указанными свойствами до сих пор остаётся актуальной. Использование методов аффинной хроматографии может быть одним из подходов к её решению. Высокая селективность, отличающая аффинные методы выделения, позволяет получать препараты высокой степени чистоты в «мягких», приближённым к физиологическим, условиях.

Введение в целевой белок дополнительных аминокислотных последовательностей (технических модулей) является распространённым приёмом, упрощающим процедуру выделения и позволяющим получать препараты мутантных форм белков, в которых отсутствуют примеси соответствующих белков природной структуры. Однако наличие подобных технических модулей в конечном препарате нежелательно, поскольку их присутствие может влиять на структуру и функциональную активность целевого фермента.

Таким образом, разработка новых методов получения чистых препаратов кор- и холофермента РНКП E. coli является актуальной проблемой, являющейся ключом к изучению тонких механизмов процесса транскрипции и его регуляции.

Цель работы.

Основной целью данной работы была разработка метода получения высокочистых препаратов РНКП E. coli и её компонентов, удовлетворяющего следующим требованиям:

1) выделение должно проходить в мягких, приближённых к нативным, условиях;

2) вероятность контаминации целевых белков белками природной структуры должна быть сведена к минимуму;

3) конечный продукт не должен содержать нехарактерные для целевого белка дополнительные технические модули, используемые для аффинного выделения. В качестве возможного решения данной проблемы был предложен подход, основанный на использовании IMPACT-технологии (NEB, США), характеристики которой удовлетворяют заданным условиям.

В работе решались следующие задачи: 1) исследовать возможности IMPACT технологии для получения как отдельных рекомбинантных субъединиц, так и самого фермента РНКП E. coli, 2) расширить возможности данной технологии для проведения с её помощью структурно-функциональных исследований указанного фермента.

Научная новизна и практическая ценность.

Впервые использованы возможности IMPACT-технологии для получения препаратов РНКП, выделенных с помощью технологических модулей, слитых с различными субъединицами данного фермента. Показано, что три основные субъединицы РНКП (, и ’) с модулем интеин-CBD на С-конце полипептидной цепи, гетерологично экспрессированные с искусственных плазмидных оперонов, способны специфически взаимодействовать с соответствующими природными субъединицами непосредственно в цитоплазме клеток, образуя белковые комплексы, которые после отщепления технологического модуля представляют собой функционально активный фермент РНКП, в то время как -субъединица выделяется в виде чистого индивидуального белка. Новая система выделения РНКП позволяет легко получать ферменты как природной структуры, так и мутантные варианты, содержащие изменения в одной из субъединиц.

Впервые продемонстрировано, что РНКП E. coli способна образовывать устойчивые комплексы с полинуклеотидфосфорилазой pnp in vitro.

Впервые изучено влияние растворов свободных аминокислот различной природы на процесс инициации транскрипции. Показано, что растворы свободных аминокислот, оказывающих наиболее эффективное действие на процесс инициации транскрипции, могут быть использованы в качестве модуляторов транскрипции in vitro. Исследовано влияние на процесс инициации транскрипции коротких (2-4 а.о.) пептидов и подтверждена возможность их использования в качестве инструментов для изучения транскрипции in vitro.

Показано, что растворы некоторых аминокислот и пептидов способны специфически дестабилизировать комплексы -субъединицы с кор-ферментом. Разработан способ получения чистых препаратов кор-фермента путём введения дополнительных промывок иммобилизованных на аффинном носителе молекул РНКП растворами веществ, специфически дестабилизирующих взаимодействия -субъединицы с кор-ферментом.

Разработан новый способ получения препаратов природной и мутантных форм холофермента, стехиометрическое соотношение кор-фермента и -субъединицы в которых равно 1:1.

Исследованы свойства мутантных форм холофермента, имеющих изменения в малоизученной N-концевой области и неконсервативном районе (NCR) -субъединицы.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано четыре статьи. Результаты работы представлены на международных конференциях студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов» (Москва, 2003, 2004 и 2007 гг.), международной конференции «Сonference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to the golden jubilee of the double helix of the DNA and 30 anniversary of the Institute of molecular biology and genetics NAS of Ukraine» (Киев, 2003), 9-й международной пущинской школы-конференции молодых учёных «Биология наука XXI века» (Пущино, 2005) и международном форуме «Korea-Russia Science and Technology Forum» (Москва, 2010).

Структура и объём работы. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и их обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Материал проиллюстрирован рисунками, схемами и таблицами. Список литературы включает _ источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

.

Клонирование генов субъединиц РНКП и изучение особенностей их экспрессии в IMPACT-системе.

Первая часть работы посвящена клонированию генов субъединиц холофермента РНКП в экспрессионные векторы, предназначенные для выделения белков по IMPACT технологии, изучению особенностей экспрессии субъединиц РНКП с использованием полученных генно-инженерных конструкций и исследованию свойств полученных белков.

Конструирование векторов для экспрессии субъединиц холофермента РНКП E.coli.

Конструирование экспрессионных плазмид для получения слитых с технологическим модулем рекомбинантных субъединиц РНКП осуществляли на основе коммерческого экспрессионного вектора pCYB4 (NEB, США), предназначенного для получения белков по IMPACT-технологии. При клонировании генов субъединиц РНКП Е.coli использовали стратегию, позволяющую избежать появления в них нежелательных нуклеотидных замен (мутаций): это использование термостабильных ДНК-полимераз, обладающих корректирующей 3’5’ нуклеазной активностью (Pfu-полимераза и др.), наработка продукта за минимально возможное количество циклов ПЦР и субклонирование длинных нуклеотидных последовательностей в виде нескольких фрагментов. Во всех случаях идентичность последовательностей плазмид в областях, кодирующих субъединицы РНКП или их фрагменты, соответствующим последовательностям природных генов подтверждали секвенированием.

Первичная структура праймеров, использованных для клонирования субъединиц РНКП Е.coli и их фрагментов, была выбрана на основе нуклеотидной последовательности генома E. coli, (код доступа NC_000913). Схема конструирования приведена на рис. 1.

Рис. 1. Схема конструирования экспрессионных плазмид pC4-a, pC4-b, pC4-c и pC4-d, содержащих гены субъединиц,, ' и РНКП E. coli. Указаны использованные для обработки ДНК ферменты и последовательность встраивания генов и их фрагментов.

Ген rpoA, кодирующий -субъединицу (984 п.н.), получали в виде одного ПЦР фрагмента и клонировали в векторе pCYB4 с получением экспрессионной плазмиды pC4 a.

Ген rpoD, кодирующий -субъединицу (1839 п.н), был предварительно субклонирован в плазмиду pUC18. Сборку экспрессионной плазмиды pC4-d проводили в два этапа.

Сначала в вектор pCYB4 по сайтам рестрикции NcoI и SmaI встраивали ПЦР-фрагмент, содержащий 3'-концевой участок гена rpoD, а в полученную промежуточную плазмиду по сайту NcoI встраивали субклонированный 5'-концевой участок гена rpoD.

Копии генов больших субъединиц rpoB и rpoC (4026 п.н. и 4221 п.н. соответственно) получали в виде трёх перекрывающихся ПЦР-фрагментов. Сборку экспрессионных плазмид pC4-b и pC4-c проводили в три этапа. Сначала в вектор pCYB4 встраивали ПЦР фрагмент, содержащий 5'-концевой участок гена rpoB или rpoC, далее в первую промежуточную плазмиду встраивали ПЦР-фрагмент, содержащий 3'-концевой участок соответствующего гена, а затем во вторую промежуточную плазмиду встраивали центральный участок гена.

Особенности экспрессии субъединиц РНКП E.coli, слитых с техническим модулем интеин-CBD.

Экспрессию и выделение целевых белков осуществляли в штамме E. coli ER 1821 по стандартной методике, применяемой в IMPACT-системе. Выделяемые с помощью данной технологии субъединицы РНКП E. coli по своей структуре полностью идентичны природным аналогам. Чистоту полученных препаратов белков анализировали методом электрофореза в Ds-Na-ПААГ (рис. 2).

Рис. 2. Электрофоретический анализ белков в 8% Ds-Na-ПААГ. а. Белковые препараты, выделенные на хитинсодержащей колонке из осветленных гомогенатов клеток с плазмидами pC4 a (3), pC4-b (4), pC4-c (5) и pC4-d (6), экспрессирующих субъединицы РНКП,, ' и с модулем интеин-CBD. б. Более продолжительный электрофорез для разделения - и '-субъединиц РНКП в препаратах, представленных на дорожках 3 (7), 4 (8) и 5 (9). в. Сравнительный анализ прошедшего концентрирование ультрафильтрацией препарата РНКП из клеток с плазмидой pC4-a до (10) и после (11) дополнительной очистки на гепарин-агарозе. Дорожки: 1 – белки-маркеры, 2 – коммерческий препарат холофермента РНКП. Стрелки сбоку – положение субъединиц РНКП;

цифры слева – молекулярные массы белков-маркеров, кДа Из осветленных центрифугированием гомогенатов клеток, экспрессирующих плазмиды pC4-a и pC4-d, по IMPACT-технологии можно извлечь значительные количества как -, так и -субъединиц. -субъединицу выделяли в виде чистого индивидуального белка (рис. 2, дорожка 6). В случае субъединицы, электрофоретический анализ белков, элюированных с хитинсодержащей колонки после отщепления технологического модуля, показал наличие помимо основного продукта (собственно -субъединицы), еще небольших, но вполне заметных, количеств субъединиц, ' и (рис. 2, дорожка 3).

Согласно данным литературы, большие субъединицы и ' (150,6 и 155,2 кДа соответственно) склонны к агрегации и при гетерологичной экспрессии могут практически полностью уходить в тельца включения. Такими же свойствами потенциально могут обладать и соответствующие модульные полипептиды.

Действительно, осадки, полученные в результате центрифугирования гомогенатов клеток, несущих плазмиды pC4-b и pC4-c, и солюбилизированные в растворе 8 М мочевины, содержали большое количество белков с молекулярными массами около 205 и 210 кДа (оценка по электрофоретической подвижности), соответствующими молекулярным массам субъединиц и ' с «довеском» интеин-CBD (рис. 3, дорожки 3 и 4). В осветленных центрифугированием гомогенатах клеток с плазмидами pC4-b и pC4-c также были обнаружены значительные количества белков, способных специфически связываться с хитинсодержащей смолой. Оказалось, что по IMPACT-технологии в обоих случаях из осветленных гомогенатов клеток извлекаются все четыре –,, ' и субъединицы РНКП E. coli, в молярном соотношении, близком к характерному для холофермента (рис. 2, дорожки 4 и 5), причём в случае препаратов из клеток с плазмидами pC4-b и pC4-c преобладания рекомбинантной субъединицы практически нет.

Рис. 3. Электрофоретический анализ в 8% Ds Na-ПААГ белковых препаратов, выделенных из дебриса клеток с плазмидами: pC4-а (2), pC4-b (3), pC4-с (4) и pUC18 (5). 1 – Коммерческий препарат холофермента РНКП. Стрелки сбоку – положение субъединиц РНКП Полученные данные свидетельствуют о том, что все три основные субъединицы РНКП (, и ') с модулем интеин-CBD на С-конце полипептидной цепи, гетерологично экспрессированные с искусственных плазмидных оперонов, способны специфически взаимодействовать с соответствующими природными субъединицами непосредственно в цитоплазме клеток, образуя белковые комплексы, весьма схожие с природной РНКП.

Исследование свойств полученных препаратов РНКП E. coli.

Для исследования способности выделенных препаратов РНКП образовывать открытые промоторспецифические комплексы использовали метод торможения в геле. В качестве матрицы использовали дуплекс, содержащий консенсусный промотор.

Результаты экспериментов, приведенные на рис. 4, свидетельствуют о присутствии в выделяемых по IMPACT-технологии препаратах правильно сформированных молекул полимеразы, которая в значительной степени представлена холоферментом.

Рис. 4. Радиоавтограф электрофоретического разделения в 4% неденатурирующем ПААГ комплексов дуплекса 5'-32P-p661:412 с белковыми препаратами из клеток с плазмидами pC4-a (2–4), pC4-b (5–7), pC4-c (8–10), pC4-d (11 и 12), а также с коммерческими препаратами холофермента (13 и 14) и кор-фермента РНКП (15 и 16). Дорожка 1 –исходный 5'-32P-p661:412.

дуплекс Сбоку обозначены положения дуплекса 5'-32P p661:412 (Д) и его комплекса с РНКП (К). Знаками «+» и «–» указаны условия формирования комплексов: предварительное насыщение РНКП -субъединицей и/или добавление в реакционную смесь гепарина (для выявления промоторспецифических комплексов).

Тестирование транскрипционной активности у выделенных препаратов проводили на матрице, представляющей собой фрагмент, содержащий два дивергентных консенсусных промотора. Представленные на рис. 5 результаты экспериментов свидетельствуют, что все выделенные по IMPACT-технологии препараты обладают ярко выраженной способностью специфически инициировать транскрипцию, то есть содержат функционально активный холофермент РНКП.

Рис. 5. Радиоавтограф электрофоретического разделения в 8% денатурирующем ПААГ продуктов транскрипции in vitro на матрице с дивергентными промоторами. Реакции проводили после насыщения -субъединицей (+) или без него (–) в присутствии (+) или в отсутствие (–) гепарина с использованием коммерческих препаратов кор-фермента (2–4) и холофермента (5) РНКП, а также белковых препаратов из клеток с плазмидами pC4-a (6– 8), pC4-b (9–11), pC4-c (12–14), и pC4-d (15 и 16). Дорожка 1 –олигодезоксирибонуклеотиды 5'-32P-p412 и 5'-32P-p661. Цифры слева – длина P-полинуклеотидов.

Согласно результатам экспериментов, приведённым на рис. 2, 4 и 5 препарат выделенной по IMPACT-технологии -субъединицы представляет собой чистый функционально активный белок без примеси кор-фермента РНКП. Следует отметить, что в случае препаратов из клеток с плазмидами pC4-a и pC4-c добавление -субъединицы или проведение реакции в присутствии гепарина не меняют существенно общую картину транскрипции, что свидетельствует о том, что препарат в значительной степени представлен холоферментом РНКП. В то же время, в случае препарата из клеток с плазмидой pC4-b предварительное насыщение -субъединицей заметно повышает уровень специфической транскрипции (ср. дорожки 9, 10 и 11 на рис. 5), из чего следует, что значительная доля данного препарата представлена кор-ферментом РНКП.

Несмотря на то, что чистота полученных препаратов РНКП высока, при их электрофоретическом анализе иногда наблюдают незначительные примеси, не удаляемые путём дополнительных промывок аффинной колонки такими растворами, как 2М NaCl, 2% Triton X-100, 2М мочевина, 20% этанол и 20% ацетонитрил (все растворы в ТЕ буфере). Очистить препарат до практически гомогенного состояния можно с помощью стандартных приёмов, например, используя хроматографию на гепарин-агарозе (рис. 2в).

Некоторые наиболее ярко выраженные полосы примесей были исследованы методом масс-спектрометрии. Наиболее интенсивные полосы идентифицировали как продукты протеолиза исходного химерного белка. Однако были найдены полосы, не являющиеся продуктами распада рекомбинантного белка (рис. 6). Мигрирующая быстрее субъединицы полоса была идентифицирована как белок dnaK, выполняющий функции шаперона. Полоса с несколько меньшей подвижностью была идентифицирована как полинуклеотидфосфорилаза pnp. Согласно данным литературы, этот белок участвует в гидролизе мРНК и, как было показано для других бактериальных РНКП, способен взаимодействовать с -субъединицей (Verma et al., 2007). Полученные данные свидетельствуют о том, что РНКП E. coli in vitro способна образовывать устойчивый комплекс с полинуклеотидфософрилазой. Можно выдвинуть предположение, что выделенные в комплексе с РНКП белки также могут находиться в ассоциированном состоянии in vivo.

Рис. 6. Электрофоретический анализ в 8% Ds-Na-ПААГ препаратов РНКП, выделенных из клеток с плазмидой pС4-b по стандартной IMPACT-технологии без добавления субъединицы (1) и с добавлением 0,05 мкг (2), 0,25 мкг (3) и 0,5 мкг (4) -субъединицы.

Дорожки: М – белки-маркеры;

5 – субъединица. Справа указано положение субъединиц РНКП и белковых примесей (pnp и DnaK);

цифры слева – молекулярные массы белков-маркеров, кДа Таким образом, было показано, что с помощью IMPACT-технологии посредством «нагруженных» технологическим модулем субъединиц, или ' можно получать значительные количества сформированной в нативных условиях функционально активной РНКП. Выходы очищенных препаратов варьируют и могут достигать 0,5–1,0 мг с литра культуры, что соответствует обычному уровню наработки гетерологично экспрессируемой РНКП. В нашей работе удалось получить функционально активную РНКП при гетерологичной экспрессии лишь одной из -, - или '-субъединиц с присоединенным модулем интеин-CBD. Этот путь открывает возможность реконструкции фермента в нативных условиях in vivo и быстрого выделения любых мутантных форм РНКП, полностью свободных от примесей фермента природной структуры.

Получение препарата кор-фермента с использованием индуцируемой низкомолекулярными лигандами диссоциации холофермента.

Вторая часть работы посвящена проблеме получения чистых препаратов кор-фермента РНКП и исследованию влияния низкомолекулярных лигандов на процесс инициации транскрипции и взаимодействие кор-фермента с -субъединицей.

В полученных по IMPACT-технологии препаратах РНКП значительную долю составляет холофермент. Поэтому для получения препаратов чистого кор-фермента методику выделения необходимо было модифицировать.

Новая стратегия получения чистых препаратов кор-фермента: использование способствующих диссоциации холофермента низкомолекулярных веществ для удаления -субъединицы.

В качестве основной стратегии предполагалось введение дополнительных стадий промывки хитиновой колонки с иммобилизованной РНКП растворами, способными стимулировать диссоциацию -субъединицы. Контакты между кор-ферментом и субъединицей гораздо слабее, чем взаимодействия между другими субъединицами РНКП, что позволяло надеяться на выявление веществ, способных вызвать диссоциацию холофермента на -субъединицу и кор-фермент, и не влияющих при этом на функциональную активность РНК-полимеразы. В препаратах РНКП, выделенных по IMPACT-технологии из клеток с плазмидой pC4-b, содержание -субъединицы значительно ниже, чем в препаратах клеток с плазмидами рС4-a и рС4-с (см. рис. 4, 5).

Именно этот вариант выделения, предполагающий использование модифицированной субъединицы, представлялся наиболее перспективным для дальнейшего совершенствования методики получения чистого кор-фермента. После промывок «диссоциирующими» растворами препараты РНКП отщепляли стандартной обработкой дитиотреитолом и анализировали в Ds-Na-ПААГ. Остаточные количества -субъединицы в выделенных белках определяли по активности препаратов РНКП в реакции однораундной (в присутствии гепарина) транскрипции in vitro.

Попытки удалить -субъединицу растворами солей различной концентрации, в частности, 0,5-2,0 М NaCl в ТЕ-буфере, водным раствором гепарина (5 и 50 мкг/мл), а также хаотропными реагентами (Тритон-Х100 в ТЕ-буфере и др.) в некоторых случаях позволяли заметно (до 5-10%) снизить содержание -субъединицы в конечных препаратах. Однако, получить чистые препараты кор-фермента с помощью отмывок неспецифическими агентами не удалось, поэтому было решено осуществить поиск веществ, способных селективно влиять на взаимодействия -субъединицы с кор ферментом. Для этого был проведён анализ данных литературы о веществах, способных разрушать белок-белковые взаимодействия.

В литературе есть указания на то, что свободные аминокислоты и их смеси способны оказывать влияние на функциональную активность РНК-полимеразы. В частности, гидрофобные аминокислоты Leu и Phe в низких концентрациях (2,5-10 мМ) стимулируют диссоциацию холофермента РНКП на кор-фермент и -субъединицу, специфически нарушая контакты между указанными белками (Maitra et al., 2002). Глутамат-ион (в виде нейтральной соли) является регулятором транскрипции как in vitro, так и in vivo, предположительно влияя на взаимодействие -субъединиц с кор-ферментом (Gralla et al., 2008). Таким образом, некоторые аминокислоты и их смеси потенциально способны селективно стимулировать диссоциацию -субъединицы от иммобилизованного на хитиновом носителе кор-фермента. Исследование влияния аминокислот на процесс инициации транскрипции - первый этап поиска веществ, способных эффективно удалять примесь -субъединицы из препаратов РНКП в процессе их выделения по IMPACT технологии.

Влияние свободных аминокислот на процесс транскрипции.

Для выявления аминокислот, которые могли бы способствовать диссоциации субъединицы от холофермента, использовали систему транскрипции in vitro. Была проведена серия экспериментов, различающихся этапом добавления тех или иных аминокислот в реакционную смесь: аминокислоты добавляли до и после формирования открытого комплекса, а также одновременно с добавлением рибонуклеозидтрифосфатов.

Таким образом осуществляли поиск лигандов, эффект действия которых на инициацию транскрипции наиболее выражен.

На первом этапе исследовали влияние на инициацию транскрипции аминокислот различной природы (кислых, основных, нейтральных). Концентрацию каждой из аминокислот в реакционной смеси варьировали в диапазоне 1-10 мМ. Основная тенденция, которую наблюдали практически во всех случаях, заключалась в том, что эффективность транскрипции существенно снижалась при предварительной инкубации РНКП с аминокислотами (до добавления промоторсодержащей ДНК) (табл. 1). В то же время, инкубация уже образованного комплекса РНКП-промотор с аминокислотами не только не приводила к снижению выхода полноразмерного транскрипта, но даже несколько его повышала (на 20-50%). Снижение эффективности транскрипции при добавлении аминокислот (5-7,5 мМ) до образования открытого комплекса и её повышение при добавлении аминокислот после формирования открытого комплекса является косвенным указанием на то, что аминокислоты оказывают влияние именно на белок белковые взаимодействия и не влияют на контакты между РНКП и промоторсодержащей ДНК. По-видимому, исследованные аминокислоты влияют на взаимодействия между субъединицей и кор-ферментом в случае свободной РНКП, но не открытого промоторного комплекса. На этапе инициации транскрипции присутствие аминокислот, вероятно, способствует переходу фермента в стадию элонгации за счет ослабления взаимодействий между -субъединицей и РНКП Аминокислоты, наиболее эффективно влияющие на процесс инициации транскрипции, предположительно можно использовать для диссоциации -субъединицы и её последующей отмывки от иммобилизованной на колонке РНКП.

5 мМ 7,5 мМ Лиганд I II I II Gly 1,11±0,11 1,05±0,21 1,01±0,05 1.00±0, Ala 0,9±0,18 1,03±0, His 1,03±0,35 1,26±0,22 0,78±0,24 1,15±0, Lys 0,84±0,26 1,25±0,24 0,80±0,10 0,88±0, Arg 0,82±0,23 1,17±0,24 0,679±0,09 0,93±0, Asp (pH 5.0) 0,70±0,22 0,91±0,26 0,87±0,2 1,26±0, Asp (pH 8.3) 1,00±0,23 1,25±0,3 1,02±0,32 0,45±0, Glu (pH 5.0) 0,31±0,22 1,03±0,30 0,29±0,14 0,48±0, Glu (pH 8.3) 1,01±0,34 1,62±0,34 0,82±0,33 1,54±0, Leu 0,44±0,17 1,05±0,3 0,44±0,05 1,34±0, Ile 0,54±0,12 1,10±0,21 0,30±0,13 1,13±0, Phe 0,39±0,14 1,18±0,26 0,37±0,05 1,03±0, Смеси аминокислот Gln+Glu 0,82±0,24 0,80±0,25 0,89±0,25 1,65±0, Leu+Ile 0,42±0,08 1,27±0,23 0,49±0,20 1,16±0, Phe+Leu 0,30±0,15 1,32±0,27 0,39±0,01 1,22±0, Leu+Ile+Gln+Glu 0,59±0,26 1,07±0, Пептиды Gly-Gly 0,66±0,04 1,37±0,11 0,62±0,08 1,14±0, Gly-Phe 0,47±0,07 1,22±0,11 0,45±0,13 1,38±0, Gly-Leu 0,54±0,08 1,45±0,26 0,38±0,08 1,48±0, Leu-Ile 0,29±0,09 0,92±0,18 0,18±0,08 0,99±0, Gln-Glu (pH 8,3) 0,62±0,10 1,08±0,20 0,61±0,15 1,19±0, Leu-Ile-Gln-Glu (pH 5.0) 0,45±0,17 0,86±0,24 0,22±0,07 0,44±0, Leu-Ile-Gln-Glu (pH 8.3) 0,40±0,07 1,10±0,22 0,14±0,03 0,68±0, Табл. 1. Отношение уровня транскрипции в экспериментах с добавлением лигандов (аминокислот, их смесей или пептидов) к уровню транскрипции в контрольном эксперименте (без добавления лигандов). 5 мМ и 7.5 мМ – концентрация лигандов в реакционной смеси. I – серии экспериментов с добавлением лигандов до формирования открытого комплекса. II – серии экспериментов с добавлением лигандов после формирования открытого комплекса Жирным шрифтом выделены лиганды, оказывающие наиболее заметное воздействие на процесс инициации транскрипции.

Характер влияния аминокислот на транскрипцию зависит от их природы. Большинство аминокислот оказывают незначительное или умеренное действие (табл. 1). В присутствии ряда гидрофобных аминокислот (Phe, Leu и Ile) эффективность инициации транскрипции в первой серии экспериментов снижается в несколько раз. Более сложную картину наблюдали в случае глутаминовой кислоты, присутствие которой в растворе вызывает некоторое изменение pH среды, которое может оказывать влияние на каталитическую активность РНКП, результатом чего является снижение уровня транскрипции во всех трех сериях экспериментов. Однако, в данной серии экспериментов наибольшее снижение уровня транскрипции опять же наблюдали при инкубации аминокислот до образования открытого комплекса, что свидетельствует о специфичности действия глутаминовой кислоты.

При использовании смеси аминокислот (Phe+Leu) их влияние на транскрипцию более выражено, что говорит об аддитивности их действия.

Таким образом, показано, что наибольший эффект на инициацию транскрипции оказывают гидрофобные аминокислоты Phe, Leu и Ile, а также Glu. Данные аминокислоты и их смеси могут быть использованы в качестве модуляторов для изучения транскрипции in vitro.

Влияние коротких пептидов на процесс транскрипции.

Согласно данным литературы, пептиды, аминокислотная последовательность которых соответствуют области консервативных районов 2.1 и 2.2 70-субъединицы, являются эффективными ингибиторами транскрипции in vitro, предположительно конкурируя с субъединицей за районы взаимодействия с холоферментом, а возможно даже вытесняя субъединицу из уже сформированного комплекса (Sharp et al., 1999). Поэтому было решено осуществить поиск коротких пептидов (в том числе в указанной области), способных эффективно стимулировать диссоциацию -субъединицы. При дизайне пептидов учитывали результаты, полученные при исследовании влияния аминокислот на процесс транскрипции, а также взятые из литературных источников сведения о структуре областей контактов кор-фермента и -субъединицы.

Согласно существующей в настоящее время пространственной модели холофермента РНКП, несколько участков в составе -субъединицы вовлечены во взаимодействие с кор ферментом. Характер этого взаимодействия меняется в зависимости от стадии инициации транскрипции. Наиболее сильные контакты осуществляются между районами 2.1-2. (аминокислотные остатки 373-416) -субъединицы и так называемым доменом “coiled coil” ’-субъединицы (аминокислотные остатки 260-309), а также районами 4.1-4.2 субъединицы и доменом “flap” -субъединицы (аминокислотные остатки 873-918) (рис. 7).

В данных областях находится большое количество гидрофобных аминокислотных остатков, а также остатков Glu, Gln и Arg. Таким образом, результаты, полученные в экспериментах по влиянию аминокислот на транскрипцию, хорошо согласуются с представленной моделью.

Рис. 7. Схема взаимодействий кор-фермента с -субъединицей. а. Общая модель взаимодействия кор-фермента и -субъединицы согласно (Hudson et al.2009) (аминокислотные остатки -субъединицы обозначены красным цветом, -субъединицы – синим, ’-субъединицы зелёным.) б. Увеличенные фрагменты областей взаимодействия -субъединицы с -субъединицей (левая вставка) и с ’-субъединицей (правая вставка) в. Схема областей взаимодействия кор фермента с -субъединицей. Высококонсервативные остатки обозначены двойным подчёркиванием (консервативность более 80%), консервативные (60-80%) - одинарным. Остатки, замены в которых нарушают взаимодействия кор-фермента с -субъединицей, обозначены звёздочками. Сближенные аминокислотные остатки выделены тёмным цветом. Контакты между аминокислотными остатками обозначены чёрными и оранжевыми линиями.

Было высказано предположение, что пептиды, структура которых соответствует консервативным последовательностям в составе районов 2.1 и 2.2 -субъединицы, а именно LI, QE и LIQE, потенциально способны разрушать контакты между кор ферментом и -субъединицей. Влияние на инициацию транскрипции указанных пептидов исследовали в том же диапазоне концентраций, что и в экспериментах с аминокислотами (1-10 мМ). Кроме того, в качестве контроля был использован пептид GG (табл. 1). При добавлении пептидов LI, QE и LIQE на разных стадиях транскрипционного цикла наблюдали эффекты, аналогичные действию свободных аминокислот и их смесей. В большинстве случаев присутствие пептида в реакционной смеси оказывало больший эффект, чем сумма составляющих его аминокислот. Наиболее выраженный эффект наблюдали в экспериментах с добавлением пептидов LI и LIQE. Полученные результаты свидетельствуют о том, что короткие пептиды также оказывают влияние на инициацию транскрипции и могут быть использованы в качестве инструмента для исследования транскрипции in vitro.

Получение чистого препарата кор-фермента РНКП.

Результаты экспериментов по изучению влияния на процесс инициации транскрипции свободных аминокислот, их смесей и коротких пептидов, были использованы при разработке методики получения свободного от примеси холофермента кор-фермента РНКП.

Для промывки аффинной колонки с иммобилизованной РНКП был опробован ряд индивидуальных аминокислот: нейтральных (Phe, Leu, Gly и Gln), «кислых» (Glu и Asp), «основных» (Lys и Arg), а также различные смеси (например, Phe+Leu, Phe+Leu+Gly, Phe+Leu+Gln и Phe+Leu+Lys). Суммарную концентрацию аминокислот варьировали в диапазоне 2,5-50 мкМ. В ряде случаев (например, смесей Phe + Leu и Phe + Leu + Gln) наблюдали заметное уменьшение содержания -субъединицы в конечных препаратах РНКП (до 1-2%). Однако наилучшие результаты получали при использовании растворов глутаминовой кислоты. Так, выдерживание хитинсодержащего носителя с иммобилизованной РНКП в растворе 5–10 мМ Glu (в транскрипционном буфере при значении pH = 5,0–5,5) в течение 30 мин при 37° с последующей промывкой тем же раствором позволяет получать препараты кор-фермента полностью свободные от субъединицы (рис. 8). Такой препарат был выделен и тестирован на активность в нескольких системах. Результаты экспериментов, по комплексообразованию с промоторсодержащей ДНК и реакции однораундной транскрипции (рис. 8) свидетельствуют о том, что РНКП, выделенная с дополнительной промывкой раствором глутаминовой кислоты, представляет собой чистый кор-фермент. Удельная активность выделяемого таким методом препарата РНКП сопоставима с удельной активностью коммерческих препаратов фирмы «Epicenter Technologies» (1,5–2,5 ед.акт/мкг).

В качестве селективных агентов для получения чистых препаратов кор-фермента также были использованы пептиды LI, QE и LIQE. Опыты по промывке колонок с иммобилизованным на аффинном носителе ферментом растворами соответствующих пептидов дали неплохие результаты по снижению количества -субъединицы (до 1%).

Эти данные свидетельствуют о том, что указанные пептиды действительно влияют на взаимодействия -субъединицы с кор-ферментом, причём эффект от промывок растворами пептидов более выражен, чем от промывки смесями соответствующих аминокислот. Поиск пептидов, способных более эффективно стимулировать диссоциацию -субъединицы, представляется перспективным подходом как для исследований инициации транскрипции, так и для получения кор-фермента.

Рис. 8. Влияние дополнительных промывок различными реагентами аффинной колонки с иммобилизованным препаратом РНКП на содержание -субъединицы в конечных препаратах:

а. радиоавтограф электрофоретического разделения в 8% денатурирующем ПААГ продуктов однораундной транскрипции in vitro. Реакции проводили с использованием препаратов РНКП, выделенных аффинной хроматографией на хитинсодержащей колонке по стандартной методике (дорожки 4, 8) или с дополнительными промывками колонки 5 мМ Glu (дорожки 1, 5), смесью мМ Phe и Leu (дорожки 2, 6) или 0,5 М NaCl (дорожки 3, 7) после насыщения -субъединицей (+) или в ее отсутствие (–). Концентрация ДНК – 30 нМ, РНКП – 10 нМ;

б. результаты количественного анализа радиоавтографа, приведённого на электрофореграмме а.

в. радиоавтограф электрофоретического разделения в 4% неденатурирующем ПААГ комплексов ПЦР-фрагмента ДНК, содержащего консенсусный промотор, с препаратами РНКП, выделенными аффинной хроматографией на хитинсодержащей колонке по стандартной методике (дорожки 4, 8) или с дополнительными промывками колонки 5 мМ Glu (дорожки 1, 5), смесью мМ Phe и Leu (дорожки 2, 6) или 0,5 М NaCl (дорожки 3, 7) после насыщения -субъединицей (+) или в ее отсутствии. Стрелками указано положение дуплекса (Д) и его комплексов с РНКП (К).

Концентрация ДНК – 10 нМ, РНКП – 50 нМ;

г. результаты количественного анализа радиоавтографа, приведённого на электрофореграмме в.

Следует упомянуть, что дополнительные промывки различными аминокислотами (гидрофобными, глутаминовой, а также смесями аминокислот) и короткими пептидами заметно снижают содержание белковых примесей в конечном препарате (ср. дорожки 1 и 2, рис. 9). Возможно, это свойство растворов аминокислот универсально и свободные аминокислоты различной природы и их смеси могут быть использованы для дополнительной очистки иммобилизованных на носителе рекомбинантных белков от ассоциированных с ними примесей. Разработанный метод выделения кор-фермента РНКП E.coli обладает рядом преимуществ по сравнению с ранее описанными в литературе подходами, применяемыми для получения указанного белка (реконструкции in vitro из отдельных субъединиц или хроматография на колонке Mono-Q).

Рис. 9. Электрофоретический анализ в 8% Ds-Na-ПААГ препаратов РНКП, выделенных из клеток с плазмидой pС4-b по стандартной IMPACT-технологии (1, 4), с дополнительной промывкой колонки 5 мМ раствором глутаминовой кислоты (2) или раствором, содержащим субъединицу (5). Дорожки: М – белки-маркеры;

(3, 6) – -субъединица. Справа указано положение субъединиц РНКП;

цифры слева – молекулярные массы белков-маркеров, кДа В нашем случае сборка РНКП происходит в нативных условиях in vivo. Аффинное выделение и очистку кор-фермента осуществляют посредством простой процедуры обработки колонки реагентами, не нарушающими структуру белка, с получением в итоге чистых высокоактивных препаратов кор-фермента. Эта технология пригодна как для получения кор-фермента РНКП природной структуры, так и его мутантных вариантов.

Получение чистого препарата холофермента РНКП.

В настоящее время препараты холофермента, в состав которых входят мутантные формы -факторов, получают путём насыщения раствора кор-фермента или смеси кор- и холофермента избытком -субъединицы. Избыток -субъединицы в препарате может быть нежелателен для проведения целого ряда экспериментов.

В рамках данного исследования была продемонстрирована возможность получения холофермента РНКП путем насыщения аффинной колонки с иммобилизованным кор ферментом раствором, содержащим -субъединицу (рис. 9, дорожка 5) и последующей отмывки её избытка. Поскольку с кор-ферментом могут взаимодействовать только правильно сформированные молекулы -субъединиц, в конечном препарате будут гарантированно присутствовать только функционально активные молекулы холофермента, в котором кор-фермент и -субъединица находятся в правильном стехиометрическом соотношении (1:1).

Таким образом, разработан способ получения препаратов холофермента РНКП E. coli, обладающих свойствами, которых невозможно добиться с использованием альтернативных методов выделения. Полученные препараты были использованы в дальнейших исследованиях.

Использование полученных с использованием IMPACT-технологии препаратов кор-фермента и 70-субъединицы.

Третья часть работы иллюстрирует применение разработанного метода выделения РНКП E.coli и её компонентов в экспериментах по изучению функций N-концевой области 70-субъединицы.

N-концевая область, включающая районы 1.1 (аминокислотные остатки 1-100) и 1.2 (аминокислотные остатки 101-126), а также неконсервативный район между доменами 1 и 2 (аминокислотные остатки 127-370), является наименее изученной областью 70-субъединицы, поэтому получение новых данных о её функциональных свойствах является актуальной задачей. Был получен ряд мутантных форм субъединицы для исследования функций отдельных районов N-концевой области:

D1 ( 1-73) - удаление N-концевого фрагмента района 1.1, D2 ( 1-100) - удаление всего консервативного района 1.1, и D4 ( 74-100) (рис. 10а). Комплексы кор-фермента с выделенными белками были протестированы на способность формировать специфические (открытые) комплексы с промоторсодержащей ДНК и осуществлять специфическую промоторзависимую инициацию транскрипции.

В обоих случаях матрицы содержали консенсусный промотор. Данные, представленные на рис. 11а, 11б свидетельствуют о том, что эффективность всех мутантных РНК-полимераз в реакции однораундной транскрипции снижена по сравнению с активностью природного холофермента, причём наибольшее падение уровня транскрипции наблюдали в случае мутанта D2, то есть при удалении всего района 1.1.

Рис. 10. Электрофоретический анализ в 8% Ds-Na-ПААГ препаратов -субъединицы: а. c делециями D1 (1-73), D2 (1-100), D4 (74-100) б. с соответсвующими точечными мутациями в неконсервативной области NCR.

Эффективность транскрипции, осуществляемой с линейной матрицы во всех случаях ниже, чем в случае использования плазмидной ДНК. Поскольку плазмидная ДНК имеет отрицательные супервитки, способствующие расплетанию ДНК, можно предположить, что различие в уровне транскрипции, осуществляемой с плазмид и линейных матриц, объясняется тем, что у мутантных белков затруднён переход из закрытого комплекса в открытый.

Рис.11 а, б: Радиоавтограф электрофоретического разделения в 8% ПААГ продуктов транскрипции, катализируемой холоферментами РНК-полимеразы, реконструированными с участием природной (дорожки Nat) или мутантных -субъединиц D1, D2 и D4 на плазмиде pMPR (а), и на линейной матрице PR(T) (б). Справа приведены результаты количественного анализа радиоавтографа. в, г: Радиоавтограф электрофоретического разделения в 4% неденатурирующем ПААГ продуктов комплексообразования меченного 32P двуцепочечного фрагмента ДНК PR(T) (в) и одноцепочечного фрагмента ДНК (5'-32P-p53(Т)) (г) с холоферментами РНК-полимеразы, реконструированными с участием природной (Nat) или мутантных (D1, D2 и D4) -субъединиц, в присутствии гепарина. Сбоку указано положение комплексов (К) и свободной ДНК (Д). Справа приведены результаты количественного анализа радиоавтографа.

Данные экспериментов по комплексообразованию с промоторсодержащими матрицами (одно- и двуцепочечными) также свидетельствуют, что район 1.1 влияет на одну из стадий, предшествующих «открыванию» промотора (рис. 11в).

Эксперименты по «насыщению» кор-фермента -субъединицей (данные не приведены) показали, что делеции в районе 1.1 не влияют на взаимодействие субъединицы с кор-ферментом.

Роль другого участка N-концевой области -субъединицы – неконсервативного района NCR также до недавнего времени оставалась неизвестной. Для изучения функций NCR в настоящей работе был получен ряд мутантов, содержащих точечные замены аминокислотных остатков в указанной области, а именно остатки His180, His Thr179 и Ser241. Электрофоретический анализ полученных мутантных белков представлен на рис. 10б. Препараты холоферментов, полученных реконструкцией кор фермента с соответствующими мутантными -субъединицами, были протестированы в реакциях однораундной транскрипции, (рис. 12).

Рис. 12. Радиоавтограф электрофоретического разделения в 8% ПААГ продуктов транскрипции, катализируемой холоферментами РНК полимеразы, реконструированными с участием природной (дорожка К) или мутантных субъединиц: 1 – S241G, 2 – H242E, 3 - H242A, 4 – H242K, 5 - H242T, 6 – Т179G, 7 – H189L, 8 – H180T, 9 – H180A, 10 – H180E Результаты свидетельствуют, что мутации по указанным позициям по-разному влияют на эффективность транскрипции: в ряде случаев наблюдается её снижение, однако выявлены случаи повышения уровня транскрипции.

ВЫВОДЫ 1. Показано, что с помощью IMPACT-технологии посредством «нагруженных» технологическим модулем субъединиц, или ' можно получать значительные количества функционально активной РНК-полимеразы E. coli, сформированной в полностью нативных условиях. Выделенные по IMPACT-технологии препараты природной и мутантных -субъединиц представляют собой функционально активные индивидуальные белки. Разработанная методика открывает возможность быстрого выделения сформированных in vivo любых мутантных форм РНК-полимеразы, полностью свободных от примесей фермента природной структуры.

2. Обнаружена способность РНК-полимеразы E. coli образовывать in vitro устойчивый при выделении комплекс с полинуклеотидфософрилазой pnp. Возможно, эти белки находятся в ассоциированном состоянии и in vivo.

3. Исследовано действие свободных аминокислот на процесс инициации транскрипции in vitro. Их влияние различно и обусловлено природой и способом добавления в реакционную смесь, что позволяет использовать их в качестве инструмента исследования транскрипции. Выявлены аминокислоты - Phe, Leu, Ile и Glu, оказывающие наиболее сильное влияние на инициацию транскрипции.

4. Показано, что короткие пептиды, моделирующие область контактов кор-фермента и -субъединицы, в частности, LI и LIQE, способны эффективно влиять на инициацию транскрипции. Действие таких пептидов заметно сильнее действия смеси соответствующих свободных аминокислот, и они также могут быть использованы в качестве модуляторов транскрипции.

5. Предложен способ получения чистого препарата кор-фермента РНК-полимеразы E.

coli путём промывок иммобилизованной РНК-полимеразы раствором глутаминовой кислоты, вызывающей полную диссоциацию -субъединицы. Этот подход позволяет также получать холофермент путём насыщения иммобилизованного чистого препарата кор-фермента -субъединицей с последующим удалением её избытка.

6. С помощью полученных новым способом чистых препаратов РНК-полимеразы исследованы некоторые свойства мутантных форм -субъединицы, содержащих делеции в консервативном районе 1 и точечные замены в неконсервативной области NCR. Показано, что неконсервативная область NCR 70-субъединицы E. coli, возможно выполняет функции модулятора транскрипции.

Основное содержание работы

изложено в следующих публикациях:

1. Ходак Ю.А., Королева О.Н., Друца В.Л. Система для гетерологичной экспрессии и выделения РНК-полимеразы E.coli и ее компонентов.// Биохимия. – 2007 - T. 72 - C.212 222.

2. Ходак Ю.А., Королева О.Н., Друца В.Л. Аффинное выделение минимального фермента РНК-полимеразы E.coli.// Биохимия. - 2010 - T.75 – C.868-877.

3. Мешалкина Л.Е., Соловьёва О.Н., Ходак Ю.А., Друца В.Л., Кочетов Г.А. Выделение и некоторые свойства транскетолазы человека. // Биохимия. – 2010 –Т.75 – С.992-999.

4. Khodak Yu.A., Koroleva O.N., Drutsa V.L. Study of convergent transcription.// Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to the golden jubilee of the double helix of the DNA and 30 anniversary of the Institute of molecular biology and genetics NAS of Ukraine, Kiev, 2003, v. 1, P.80.

5. Ходак Ю.А., Королева О.Н., Друца В.Л. Особенности транскрипции, инициируемой с конвергентных промоторов.// Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам “Ломоносов – 2003”. – 2003 – Сборник тезисов - Секция биология - Т.9 - С.54-55.

6. Ходак Ю.А., Королёва О.Н., Друца В.Л. Клонирование генов субъединиц РНК полимеразы E. coli с использванием IMPACT-системы.// IX международная Пущинская школа-конференция молодых учёных "Биология-наука XXI века" – 2005 – Сборник тезисов - Секция молекулярной биологии – С.60.

7. Ходак Ю.А., Королева О.Н., Друца В.Л. Получение природной и мутантных РНК полимераз E.coli в системе IMPACT.// Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых “Ломоносов-2007” – 2007 – Сборник тезисов - Секция Биоинформатики и биоинжененрии - С. 8. Koroleva O.N., Khodak Yu.A., Davydova N.K., Drutsa V.L. Site-specific influence of aminoacids and peptides on protein-protein interactions.// Korea-Russia Science and Technology Forum. –

Abstract

Book - 28-29 October 2010 – С.17.