Биосенсорные системы на основе бактерий-деструкторов -капролактама и их применение для экологического контроля и биотехнологических исследований
На правах рукописи
РОССИНСКАЯ ИРИНА ВЛАДИМИРОВНА БИОСЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИЙ-ДЕСТРУКТОРОВ -КАПРОЛАКТАМА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ И БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ 03.00.23 – биотехнология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
МОСКВА – 2008
Работа выполнена на кафедре химии естественно-научного факультета Тульского государственного университета.
кандидат химических наук, доцент
Научный консультант:
Понаморева Ольга Николаевна доктор химических наук,
Официальные оппоненты:
профессор Каплун Александр Петрович доктор биологических наук, старший научный сотрудник Зякун Анатолий Маркович Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН
Ведущая организация:
Защита диссертации состоится 29 сентября 2008 г. в 15 ч на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московской Государственной Академии тонкой химической технологии имени М.В.Ломоносова по адресу 119571 Москва, пр. Вернадского 86.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В.Ломоносова по адресу: 119571 Москва, пр. Вернадского 86. С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте www.mitht.ru Автореферат разослан 24 июня 2008 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук, старший научный сотрудник А.И.Лютик
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы:
-Капролактам является сырьем для получения полимерных материалов (капрон, найлон-6), применяемых в различных областях промышленности, сельского хозяйства, медицины, быта. Обратимость процесса получения поликапроамида приводит к тому, что продукты полимеризации всегда содержат определённое количество низкомолекулярных фракций олигомеров как линейных, так и циклических. Отходы производств капролактама и полимерных материалов в настоящее время подвергаются захоронению или сжигаются, что нецелесообразно с экономической и экологической точек зрения. Кроме того, широкое применение поликапроамида вместе с его низкой биодоступностью создаёт проблему утилизации капроновых изделий, пришедших в негодность. В связи с этим необходимо уделять внимание разработке экспресс-метода контроля, ориентированного на детекцию опасного уровня загрязнения и разрабатывать методы утилизации капролактама и его полимеров и олигомеров.
В настоящее время перспективными считаются методы биохимической диагностики загрязнения, в частности, биосенсорные методы, сочетающие чувствительность методов биотестирования и операционные характеристики физико-химических сенсоров. Первый подход к созданию биосенсора для детекции капролактама в водных средах представлен в работе Риделя, где показана принципиальная возможность получения аналитических сигналов сенсора кюветного типа, основанного на иммобилизованных клетках штамма - деструктора Pseudomonas putida К14 и кислородном электроде, при добавлении капролактама в измерительную ячейку [Riedel K., 1989]. Способность к окислению капролактама у большинства штаммов бактерий рода Pseudomonas контролируется конъюгативными плазмидами биодеградации капролактама - CAP-плазмидами. К настоящему времени описан ряд CAP-плазмид, которые отличаются по характеру детерминируемой ими способности к утилизации капролактама и его интермедиатов. Находясь в одном и том же бактериальном хозяине, они в значительной степени различаются по характеру регуляции процесса трансформации указанного ксенобиотика.
Использование микроорганизмов в биосенсорных системах предполагает предварительный отбор наиболее активных в отношении исследуемых субстратов штаммов. Ранее немецкими исследователями была показана возможность проведения скрининга микроорганизмов-деструкторов ксенобиотиков при помощи биосенсорных технологий (на основании оценки их дыхательной активности в присутствии потенциальных субстратов) [Beyersdorf-Radeck B., 1998].
Биосенсорный подход для экспресс-оценки окислительной активности штаммов микроорганизмов, в том числе с разным сочетанием «бактериальный хозяин – плазмида», является перспективным для исследований в области биотехнологии защиты окружающей среды.
Вопрос о биотрансформации олигомеров капролактама изучен в меньшей степени. В литературе описан ряд бактерий, утилизирующих линейные и циклические олигомеры капролактама, показана принципиальная возможность деградации найлона-6 лигнинразрушающими грибами. Однако возможность применения микроорганизмов для биологической очистки сточных вод и отходов производств, содержащих олигомеры капролактама, а также для создания биосенсорных систем в настоящее время только исследуется.
Работа выполнялась при частичной поддержке гранта РФФИ 04-04- «Изучение процессов окисления ксенобиотиков бактериальными штаммами на основе их дыхательной активности»;
в рамках проекта ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники 2002- годы» (Госконтракт 02.438.11.7021.), проекта аналитической программы «Развитие научного потенциала высшей школы» (РНП 2.1.1.7789). Автор работы является победителем Всероссийского конкурса инновационных проектов «Живые системы» в 2005 г. (г. Киров);
победителем конкурса Программы «Участник молодежного научно-инновационного конкурса», реализуемой Фондом содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере в 2007 г. (г.
Пущино).
Цель работы:
Выявление закономерностей аэробной деградации капролактама и его олигомеров бактериальными штаммами с помощью биосенсорного подхода и разработка макета биосенсора для определения капролактама в водных средах.
Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:
- создать лабораторную модель биосенсорной установки, позволяющую проводить количественную оценку окислительной активности различных бактериальных штаммов – деструкторов капролактама;
- провести сравнительное изучение окислительной активности бактериальных штаммов с различным сочетанием «бактериальный хозяин – САР плазмида» с использованием биосенсорной установки;
- выявить корреляцию между параметрами градуировочных графиков, полученных с помощью биосенсоров на основе штаммов с различным сочетанием «бактериальный хозяин – САР-плазмида», и удельными активностями ферментных систем in vivo этих бактериальных штаммов;
предложить подход для экспресс оценки окислительной активности микроорганизмов;
- на основе наиболее активного штамма – деструктора капролактама разработать макет микробного сенсора (биосенсора проточно-инжекционного типа) для детекции капролактама в водных средах, определить его аналитические и метрологические характеристики;
- применить разработанный макет биосенсорной установки для экспресс оценки содержания капролактама в процессе его биологической утилизации в модельных системах и реальных образцах технологических вод и отходов производств;
- показать возможность применения биосенсорного подхода в сочетании с другими физико-химическими методами для изучения процессов микробиологической трансформации олигомеров.
Научная новизна Впервые показана возможность экспресс-оценки окислительной активности бактериальных штаммов с различными комбинациями «бактериальный хозяин – САР-плазмида» с помощью биосенсорного подхода. Получены значения удельных активностей ферментных систем деградации капролактама in vivo для бактериальных штаммов-деструкторов капролактама. Установлена корреляция между величинами удельной ферментативной активности исследуемых штаммов и параметрами градуировочных зависимостей микробных сенсоров. Выявлено, что процесс утилизации капролактама зависит в первую очередь от выбора штамма бактериального хозяина САР-плазмиды.
Установлено, что селективность биосенсорного определения капролактама при проточно-инжекционном способе регистрации ответов сенсора выше, чем при кюветном способе.
Впервые выявлен механизм трансформации линейных олигомеров бактериальными клетками штамма Pseudomonas putida BS394, содержащего плазмиду биодеградации капролактама pBS268 – окислительное переаминирование до соответствующих дикарбоновых кислот. Установлено, что процесс трансформации линейных олигомеров находится под генетическим контролем САР-плазмиды pBS268.
Практическая значимость Разработан и опробован на реальных образцах макет биосенсора проточно инжекционного типа для анализа содержания капролактама в водных средах.
Разработанный макет биосенсора характеризуется экспрессностью, высокой чувствительностью и селективностью и может быть использован в научных исследованиях, в учебном процессе и как прототип опытного образца прибора.
Оригинальность и практическая значимость разработки подтверждена патентом РФ.
Показана возможность применения биосенсорной системы для быстрого скрининга бактериальных штаммов с различным сочетанием «бактериальный хозяин – САР-плазмида», что может быть использовано при создании эффективных биопрепаратов с высокой способностью к биодеградации капролактама и продуктов его полимеризации.
Выявленные закономерности процесса биодеградации олигомеров капролактама могут использоваться при создании биосенсоров для детекции олигомеров в водных средах и при разработке технологии биологической очистки отходов, содержащих эти соединения.
Апробация работы и публикации Результаты работы докладывались на Четвертом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» в 2007 г. (медаль конкурса);
11-м Московском международном салоне промышленной собственности «Архимед» в 2008 г.;
Международном конгрессе по аналитическим наукам «ICAS-2006» (г. Москва) в 2006 г.;
Всероссийском конкурсном отборе и конференции инновационных проектов аспирантов и студентов по приоритетному направлению «Живые системы» (г. Киров) в 2005 г.
(диплом победителя);
IV Международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий» (г. Томск) в г.;
Российской школе-конференции молодых ученых «Экотоксикология – современные биоаналитические системы, методы и технологии» (г. Пущино) в 2006 г. (диплом лауреата конкурса);
Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2005» (г. Москва) в 2005 г.;
Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – Наука ХХI века» (г. Пущино Московской области) в 2005 г.
По теме диссертации опубликовано 4 статьи, 8 сообщений в тезисной форме и в виде материалов конференций, получен 1 патент РФ.
Структура и объем работы Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, анализа результатов исследований, выводов и списка использованной литературы.
Диссертационная работа изложена на 127 страницах, содержит 47 рисунков и таблицу. Список литературы включает 80 источников.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 1. В первой главе дается анализ научно-технической литературы, посвященной исследованиям в области биодеградации капролактама, его олигомеров, а также полимерных материалов. Изложены основные подходы к биологической обработке стоков, содержащих капролактам и его олигомеры;
проведен краткий обзор физико-химических методов анализа водных сред, содержащих капролактам и олигомеры.
Глава 2. Во второй главе дано описание методов исследования. В работе использованы: штамм Pseudomonas putida BS394, содержащий одну из плазмид деградации капролактама (pBS268, pBS265, pBS276), и штаммы Pseudomonas fluorescens 38a(pBS268) и Pseudomonas chlororaphis PCL1391(pBS268) (Коллекция лаборатории биологии плазмид ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН).
Бактерии выращивали в жидкой и агаризованной синтетической среде Эванса с добавлением источников углерода (капролактам, линейный димер, глюкоза) и цистеина, необходимого для роста ауксотрофных штаммов. Культивирование проводили при 28°С в динамических (круговая качалка, 180 об/мин) и в статических условиях.
В работе применяли высокочувствительный электрохимический метод регистрации окислительной активности биологического материала, позволяющий производить высокоточные измерения в наноамперном диапазоне токов, что дает возможность исследовать свойства микрограммовых количеств биомассы.
Дыхательную активность микроорганизмов регистрировали с помощью кислородного электрода, на рабочей поверхности которого фиксировали иммобилизованные в агаровом геле бактериальные клетки. Электрохимические измерения проводили с помощью гальваностата-потенциостата «IPC2000» (ЗАО «Кронас», Россия) (кюветный способ) и анализатора растворенного кислорода «Биолан» (ЗАО «Кронас», Россия) (проточно-инжекционный способ), интегрированных с персональным компьютером. Ток регистрировали в интервале 0,1 нА – 20 нА, в качестве измеряемого параметра использовали амплитуду и максимальную скорость изменения выходного сигнала биосенсора при добавлении субстратов. Обработку данных проводили с помощью компьютерных программ «Microsoft Excel» и «SigmaPlot 8.0».
Удельную активность ферментных систем деградации капролактама in vivo рассчитывали по убыли субстрата при инкубации бактерий в растворе, содержащем капролактам (начальная концентрация 2 мМ).
Для оценки степени биодеградации капролактама в модельных и реальных объектах проводили инкубацию образцов с исследуемым штаммом P.putida BS394(pBS268) в течение 6 часов, после чего определяли содержание капролактама в культуральной жидкости.
Определение концентрации капролактама проводили с помощью биосенсорного метода, фотометрического метода и метода тонкослойной хроматографии.
Изучение процесса трансформации линейных олигомеров проводили с использованием биосенсорной оценки дыхательной активности иммобилизованных бактерий в присутствии олигомеров;
посредством длительной инкубации бактерий в присутствии олигомеров с последующим анализом культуральной жидкости методом масс-спектрометрии, а также по росту бактериальных клеток на субстрате.
Глава 3. В третьей главе приведены основные результаты работы и их обсуждение.
1. Разработка лабораторной модели биосенсора кюветного типа на основе штаммов-деструкторов капролактама с различными сочетаниями «бактериальный хозяин - CAP-плазмида»;
применение ее для экспресс-оценки окислительной активности бактерий 1.1.Определение параметров градуировочных зависимостей биосенсоров Принцип работы микробного сенсора на основе кислородного электрода основан на том, что при окислении субстрата иммобилизованными на поверхности кислородного электрода микроорганизмами возрастает их дыхательная активность, и в приэлектродном пространстве снижается концентрация кислорода, что регистрируется с помощью электрода (рис.1).
а б Рис. 1. а) схема работы биосенсора кюветного типа;
б) внешний вид лабораторной модели микробного биосенсора кюветного типа В качестве преобразователя использовали гальваностат-потенциостат IPC2000, представляющий собой блок регистрации и обработки данных, позволяющий производить непрерывную регистрацию сигнала, его обработку, оценку основных параметров – амплитуды и начальной скорости изменения сигнала.
При формировании биорецепторных элементов сенсора для определения концентрации капролактама в водной среде использовали: штамм P.putida BS394, содержащий различные плазмиды биодеградации капролактама (pBS268, pBS265, pBS276) и штаммы P.fluorescens 38a и P.chlororaphis PCL 1391, содержащие одну и ту же САР-плазмиду - pBS268. Таким образом, для сравнительного изучения были отобраны, с одной стороны, бактериальные штаммы, относящиеся к разным видам рода Pseudomonas, содержащие одну и ту же плазмиду биодеградации капролактама, с другой стороны, один и тот же штамм - бактериальный хозяин различных САР-плазмид.
Формирование рецепторного элемента проводили иммобилизацией бактериальных клеток в агаровый гель;
все биорецепторные элементы содержали одинаковое количество клеток микроорганизмов, что обеспечивало количественный подход в получении сравнительных оценок окислительной активности штаммов бактерий в отношении различных субстратов. На рис. представлен типичный отклик биосенсора на введение в измерительную ячейку капролактама.
Рис. 2. Отклик биосенсора кюветного типа на добавление в измерительную ячейку капролактама Связь дыхательной активности бактерий с концентрацией субстрата в кювете позволяет получить градуировочные зависимости откликов сенсора от концентрации капролактама для биосенсоров на основе каждого штамма (рис.3).
а б Рис. 3. Градуировочные зависимости микробных сенсоров:
а - на основе штаммов-бактериальных хозяев плазмиды pBS268;
б - на основе штамма P.putida BS394 c разными плазмидами Анализ экспериментальных данных показывает, что полученные зависимости можно аппроксимировать уравнением гиперболы типа Михаэлиса-Ментен, описывающим экспериментальную зависимость начальной скорости потребления кислорода бактериями от исходной концентрации субстрата. Параметры градуировочных зависимостей биосенсоров на основе исследуемых штаммов приведены в таблице 1.
Таблица 1 – Параметры градуировочных зависимостей биосенсоров Коэффициент Эффективная константа Штамм чувствительности b, Михаэлиса К’М, мМ нА/(с*мМ) P.putida BS394(pBS268) 0,12±0,06 0,08±0, P.putida BS394(pBS265) 0,14±0,03 0,11±0, P.putida BS394(pBS276) 0,14±0,05 0,020±0, P.fluorescens 0,6±0,1 0,002±0, 38a(pBS268) P.chlororaphis 0,71±0,06 0,003±0, PCL1391(pBS268) Эффективные константы Михаэлиса для первых трех штаммов ниже, чем для штаммов P.fluorescens 38a(pBS268) и P.chlororaphis PCL 1391(pBS268);
биосенсоры на основе штаммов P.putida BS394(pBS268) и P.putida BS394(pBS265) характеризуются наибольшими коэффициентами чувствительности. Полученные оценки позволяют заключить, что использование штаммов P.putida BS394(pBS265) и P.putida BS394(pBS268) как основы биосенсоров является более предпочтительным.
1.2. Выбор рабочих параметров биосенсора на основе P.putida BS394(pBS268), оценка селективности и определение аналитических и метрологических характеристик лабораторной модели биосенсора В случае биосенсорного анализа селективность – возможность определения каждого компонента анализируемого объекта независимо от других – определяется субстратной специфичностью бактериальных клеток рецепторного элемента, т.е.
изменением дыхательной активности иммобилизованных бактерий в присутствии спектра потенциальных субстратов.
Изменение дыхательной активности иммобилизованных бактерий P.putida BS394(pBS268) при введении в измерительную кювету капролактама более чем в два раза выше, чем при введении промежуточных продуктов его биодеградации (аминокапронат, адипинат), циклогексанола и циклогексанона (рис.4). Следует отметить, что бесплазмидный штамм P.putida BS394 не способен окислять капролактам и его интермедиаты, но проявляет дыхательную активность в присутствии циклогексанола и циклогексанона, окисление которых не зависит от наличия плазмиды деградации в клетке, тогда как штамм P.putida BS394(pBS268) проявляет дыхательную активность в присутствии всех используемых субстратов, в том числе интермедиатов деградации капролактама.
Рис. 4. Субстратная специфичность иммобилизованных клеток в рецепторном элементе биосенсора кюветного типа. Субстраты:
1-капролактам, 2-аминокапронат, 3- адипинат, 4-циклогексанол, 5-циклогексанон. Концентрация субстратов в кювете составляла 1 мМ Таким образом, биосенсоры на основе целых клеток микроорганизмов можно использовать, совместно с другими методами, как один из инструментов установления биохимических путей аэробной деградации органических соединений микроорганизмами.
Для лабораторной модели биосенсора на основе штамма P.putida BS394(pBS268), характеризующейся наилучшей операционной стабильностью, определили рабочие параметры функционирования биосенсора (рН среды измерения, концентрация солей буферного раствора, содержание бактерий в рецепторном элементе). Рабочим считали значение параметра, при котором величина ответа сенсора была максимальной. Рабочие параметры составили: рН среды 7,6;
концентрация солей буферного раствора 33 мМ;
содержание клеток в рецепторном элементе 25 мг (по сырому весу)/мл агарового геля. Было установлено, что использование динамического режима культивирования является предпочтительным по сравнению со статическим при получении биомассы бактерий-деструкторов капролактама – основы рецепторного элемента биосенсора.
Основные аналитические и метрологические характеристики лабораторной модели биосенсора кюветного типа на основе штамма P.putida BS394(pBS268):
длительность единичного измерения 15 минут;
предел обнаружения 0,02 мМ;
операционная стабильность (стандартное отклонение по последовательным измерениям) 9,8%;
долговременная стабильность сенсора более 15 суток (падение активности микроорганизмов на протяжении этого времени составило 25 %).
Таким образом, лабораторная модель биосенсора на основе штамма P.putida BS394(pBS268) характеризуется экспрессностью, чувствительностью и селективностью и может быть использована для определения концентрации капролактама водных средах. В настоящем исследовании разработанная лабораторная модель биосенсора была использована при изучении влияния различных сочетаний «бактериальный хозяин – САР-плазмида» на окислительную активность бактерий-деструкторов капролактама и явилась основой при разработке макета биосенсора проточно-инжекционного типа.
1.3. Определение удельных активностей ферментных систем деградации капролактама бактериальными штаммами с различными сочетаниями «бактериальный хозяин – САР-плазмида» Эффективность работы бактериальной ферментной системы катаболизма капролактама оценивали по скорости его утилизации микроорганизмами.
За удельные активности ферментных систем принимали изменение концентрации субстрата за единицу времени (мин) на единицу сырого веса клеток (мг) (таблица 2).
Таблица 2 – Удельная активность ферментных систем деградации капролактама Удельная активность ферментных Степень деструкции систем деградации капролактама, Штамм капролактама, % мкМ/(мгмин) P.putida 0,17±0,03 BS394(pBS268) P.putida 0,16±0,03 BS394(pBS265) P.putida 0,11±0,03 BS394(pBS276) P.fluorescens 0,09±0,03 38a(pBS268) P.chlororaphis 0,06±0,03 PCL1391(pBS268) Полученные результаты свидетельствуют о том, что перенос плазмиды pBS268 в ризосферные штаммы P.fluorescens 38a и P.chlororaphis PCL приводит к снижению активности ферментной системы деградации капролактама у полученных трансконъюгантов. Удельные активности ферментной системы катаболизма капролактама штамма P.putida BS394 с разными плазмидами биодеградации капролактама - pBS268, pBS265 или pBS276 оказались наиболее высокими и близкими по величине. Следовательно, процесс утилизации капролактама зависит в первую очередь от выбора бактериального хозяина.
Наибольшая степень деструкции капролактама (отношение изменения концентрации капролактама к его исходному содержанию) свойственна штаммам P.putida BS394(pBS268) и P.putida BS394(pBS265).
1.4. Сравнительный анализ величин удельной ферментативной активности исследуемых штаммов с параметрами градуировочных зависимостей биосенсоров Для выявления взаимосвязи активности ферментных систем деградации капролактама бактериальных штаммов и эффективности их функционирования в качестве рецепторного элемента биосенсора была проведена сравнительная оценка величин удельной ферментативной активности пяти выбранных штаммов (таблица 2) с одной стороны с эффективными константами Михаэлиса (Км) и коэффициентами чувствительности (b) градуировочных зависимостей микробного сенсора (таблица 1) с другой стороны. Для количественной оценки взаимосвязи наборов данных рассчитывали коэффициент корреляции между этими величинами, который составил 0,89 и 0,92 (по модулю) соответственно. Оценку активности ферментной системы, отвечающей за деградацию капролактама, для различных бактериальных штаммов предпочтительнее проводить по коэффициенту чувствительности биосенсора (коэффициент корреляции 0,92). Таким образом, биосенсорный подход может быть использован для сравнения способности к утилизации капролактама штаммов-деструкторов с различными комбинациями «бактериальный хозяин – САР-плазмида».
2. Макет микробного сенсора проточно-инжекционного типа для детекции капролактама, его селективность, аналитические и метрологические характеристики Макет биосенсора проточно-инжекционного типа для определения капролактама в водных средах был разработан на базе анализатора растворенного кислорода «Биолан». Прибор «Биолан» создан в рамках программы РАН и Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере «Активизация инновационной деятельности в сфере уникального научного приборостроения»;
разработчики: ТулГУ, ИБФМ РАН (г. Пущино), ООО «Аналитик-ВНИПИМ» (г. Тула), ЗАО «Кронас» (г. Москва) (Госконтракт № р/3859).
В разработанном макете микробного сенсора в качестве измерительного электрода использовали кислородный электрод типа Кларка с иммобилизованными на его поверхности бактериальными клетками – деструкторами капролактама.
Принцип работы такой системы заключается в следующем: в проточно инжекционной системе биосенсорный элемент встроен в канал, по которому постоянно прокачивается буферный раствор. Проба впрыскивается в поток и через определенное время поступает в зону измерительного электрода, где микроорганизмы окисляют субстрат, содержащийся в пробе. При этом в приэлектродном пространстве снижается концентрация кислорода, что регистрируется с помощью электрода Кларка, сопряженного с гальваностатом потенциостатом (рис.5).
а б Рис. 5. а) схема работы проточно-инжекционного биосенсора;
б) внешний вид анализатора растворенного кислорода «Биолан» На монитор компьютера, интегрированного с биосенсорной системой, выводится графическое отображение изменения силы тока, протекающего в системе, во времени (рис.6):
Рис. 6. Отклики биосенсора на различные концентрации капролактама:
1 - 0,05 мМ;
2 - 0,1 мМ;
3 - 1 мМ;
4 - 2 мМ;
5 - 5 мМ В качестве рецепторного элемента биосенсора проточно-инжекционного типа использовали иммобилизованный в агаровый гель бактериальный штамм P.putida BS394(pBS268), показавший наибольшую активность при окислении капролактама.
Градуировочные зависимости ответов биосенсора от концентрации капролактама для нескольких рецепторных элементов приведены на рис.7.
Для биосенсора проточно-инжекционного типа на основе штамма P.putida BS394(pBS268) получены аналитические и метрологические характеристики:
длительность единичного измерения 10 мин;
нижний предел обнаружения 0,005 мМ, что позволяет определять концентрации капролактама ниже ПДК (ПДК капролактама в водоемах составляет 1 мг/л (0,009 мМ));
операционная стабильность 5,3 %;
долговременная стабильность 10 сут. (падение активности клеток составило 31%.).
Рис. 7. Типичные градуировочные зависимости биосенсора на основе штамма P.putida BS394(pBS268) Сравнение селективности определения капролактама при кюветном и проточно-инжекционном способах измерения проводили по ряду субстратов:
капролактам, промежуточные продукты биодеградации капролактама (аминокапронат, адипинат), а также циклогексанон и циклогексанол – вещества, используемые при производстве капролактама, содержание которых в технологических водах предприятий может достигать 4%.
Pис. 8. Селективность биосенсорного определения капролактама при кюветном и проточно-инжекционном способах регистрации ответа. За 100% принимали ответ сенсора на 1 мМ капролактам. Субстраты (концентрация 1 мМ): 1 капролактам, 2-адипинат, 3-аминокапронат, 4-циклогексанол, 5-циклогексанон Для проточно-инжекционного сенсора ответ на капролактам по крайней мере в 20 раз превышал ответы сенсора на интермедиаты капролактама и органические примеси, что позволяет селективно определять концентрацию капролактама в сточных водах. Следует отметить, что специфичность разработанного биосенсора кюветного типа (рис.8) соответствует специфичности описанного в литературе биосенсора [Riedel K., 1989]. В то же время в проточно-инжекционном формате селективность определения капролактама выше. Вероятно, при снижении времени контакта биорецепторного элемента с пробой в проточной системе транспорт субстрата к ферментным системам становится лимитирующим фактором и определяет величину ответа биосенсора.
Разработанный макет биосенсора проточно-инжекционного типа был применен для анализа реальных образцов, содержащих капролактам.
3. Биосенсорный анализ содержания капролактама в реальных образцах В работе использовали два образца, содержащих капролактам. Образец № представлял собой технологические воды цеха предприятия по производству капролактама «Щекиноазот» (г. Щекино, Тульская область), в которых содержатся капролактам, органические примеси - циклогексанон, циклогексанол и сульфат аммония;
образец №2 – капролактам-олигомерный концентрат дистилляции твердые отходы с предприятия по производству полимерных волокон «Химволокно» (г. Щекино, Тульская область), содержащие капролактам и его олигомеры. Результаты анализа содержания капролактама в этих образцах представлены в таблице 3. В качестве референтных использовали метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) и фотометрический метод.
Таблица 3 – Содержание капролактама в образцах Метод определения Образец №1 Образец № Биосенсор проточно-инжекционного типа на 5,2±0,2 % 75±4% основе P.putida BS394(pBS268) ТСХ 5,0±0,5 % 80±8% Фотометрический метод не определяли 5,3±0,2 % Результаты определения содержания капролактама в образцах №1 и № показывают, что макет биосенсора проточно-инжекционного типа можно применять для определения концентрации капролактама в реальных образцах.
Далее исследовали возможность применения разработанного макета биосенсора для мониторинга процесса биологической очистки капролактамсодержащих производственных отходов. Для этого к разбавленным до концентрации капролактама 2 мМ образцам №1 и №2 добавляли клетки штамма деструктора P.putida BS394(pBS268) в количестве 2,3109 КОЕ/мл и определяли содержание капролактама в реакционной смеси в ходе биодеградации. Полученные результаты приведены в таблице 4.
Таблица 4 – Степень утилизации капролактама в реальных объектах при их инкубации со штаммом P. putida BS394(pBS268) Время Концентрация Объект Степень утилизации, % утилизации, ч капролактама, мМ 0 2,00 Образец 1 0,70±0,04 № 6 0,005 0 2,00 Образец 1 0,65±0,03 № 6 0,005 Инкубирование клеток штамма-деструктора с образцами, содержащими капролактам, приводило к уменьшению концентрации капролактама на 65 и 70% в течение часа и к полной его утилизации через 6 часов. В присутствии бесплазмидного штамма P.putida BS394 снижения концентрации субстрата не наблюдали.
Таким образом, разработанный макет биосенсора проточно-инжекционного типа на основе штамма P.putida BS394(pBS268) характеризуется чувствительностью, селективностью и экспрессностью определения капролактама и может быть использован как прототип опытного образца прибора для анализа капролактама в водных средах. Показано, что разработанный макет позволяет проводить мониторинг биологической очистки капролактамсодержащих производственных отходов.
4. Изучение процесса биодеградации линейных олигомеров капролактама с применением биосенсорного подхода Некоторые микроорганизмы характеризуются способностью к одновременной деградации капролактама и его линейных и циклических олигомеров;
кроме того, было показано, что бактерии Flavobacterium sp. KI [Negoro S., 2000] и Pseudomonas aeruginosa PAO1 [Prijambada I., 1995], не проявлявшие изначально катаболической активности по отношению к олигомерам, могли адаптироваться к данным субстратам и приобретать способность к деструкции олигомеров.
В данной работе исследование возможности биодеградации олигомеров штаммом-деструктором капролактама проводили путем культивирования бактерий P.putida BS394(pBS268) на минеральной среде с добавлением димера и тримера капролактама в качестве единственных источников углерода и энергии*. Роста бактериальных клеток на данных субстратах не наблюдали, следовательно, штамм P.putida BS394(pBS268) не способен к биодеградации линейных олигомеров.
4.1.Оценка дыхательной активности бактерий в присутствии олигомеров Отсутствие процесса биодеградации олигомеров бактериальными клетками не исключает возможности трансформации этих субстратов – частичной деструкции, которая существенно изменяет структуру органического вещества, но не приводит к его полной утилизации. Для изучения данного вопроса использовали биосенсорный подход, основанный на измерении дыхательной активности иммобилизованных бактерий в присутствии субстратов. Дыхательная активность штамма-деструктора P.putida BS394(pBS268) увеличивалась в присутствии не только капролактама и его интермедиатов, но и линейных димера и тримера (рис.9), что свидетельствует о способности исследуемого штамма трансформировать линейные олигомеры.
* Экспериментальная работа выполнена в Лаборатории биологии плазмид Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН.
Рис. 9. Субстратная специфичность P.putida BS394(pBS268). За 100% принимали ответ сенсора на 1 мМ капролактам. Субстраты (концентрация 1 мМ):
1-капролактам, 2-димер, 3-тример, 4-аминокапронат, 5-адипинат Для выявления локализации генов (хромосомной или плазмидной), контролирующих трансформацию олигомеров исследуемым штаммом, изучали дыхательную активность штамма P.putida BS394, не содержащего САР-плазмиды.
Откликов биосенсора на основе бесплазмидного штамма P.putida BS394 в присутствии линейного димера, тримера, капролактама и его интермедиатов не наблюдали, следовательно, процесс трансформации линейных олигомеров находится под генетическим контролем плазмиды биодеградации pBS268.
Следует отметить, что изменение дыхательной активности штамма P.putida BS394(pBS268) количественно зависит от концентрации олигомеров в измерительной кювете (в отсутствии капролактама). На рис.10 представлена градуировочная зависимость ответов биосенсора от концентрации димера. Нижний предел обнаружения димера составил 0,02 мМ.
Рис. 10. Градуировочная зависимость биосенсора на основе штамма P.putida BS394(pBS268) Полученные результаты могут явиться основой при разработке биосенсора для детекции олигомеров капролактама в водных средах.
4.2. Трансформация линейных олигомеров бактериальными клетками Для установления возможного пути трансформации олигомеров проводили длительную (до 48 ч) инкубацию штамма-деструктора капролактама P.putida BS394(pBS268) в присутствии линейных димера и тримера с последующей идентификацией содержащихся в культуральной жидкости веществ с помощью метода масс-спектрометрии†.
После инкубации в масс-спектрах культуральной жидкости обнаруживаются пики, отвечающие молекулярным массам 259 и 372, которые совпадают с молекулярными массами продуктов окислительного переаминирования линейного димера и тримера (рис.11). Идентификацию продуктов трансформации проводили по результатам МС/МС-анализа пиков Mr=259 и Mr=372. При инкубации клеток бесплазмидного штамма P.putida BS394 в присутствии линейных олигомеров изменений в составе культуральной жидкости не происходило.
Рис. 11. Схема трансформация димера и тримера Полученные данные позволяют предположить, что бактериальные клетки, содержащие САР-плазмиду, способны к трансформации линейных олигомеров за счет широкой субстратной специфичности двух ферментов биодеградации капролактама: трансаминазы и дегидрогеназы (рис.12).
† Экспериментальная работа выполнена в Секторе масс-спектрометрии Института биохимии и физиологии им.
Г.К.Скрябина РАН.
Рис.12. Схема трансформации линейных олигомеров под действием ферментов биодеградации капролактама Образующиеся в ходе трансформации дикарбоновые кислоты накапливаются в культуральной жидкости.
Биологическая очистка промышленных сточных вод, содержащих капролактам и его олигомеры, затрудняется тем, что в таких объектах оптимальное для микроорганизмов соотношение (БПК):N:P сдвинуто в сторону увеличения содержания азота. Поэтому для полного удаления капролактама биологическими методами прибегают к дополнительному внесению в сточную воду углеродсодержащих веществ или к предварительной химической обработке – дезаминированию. Отщепление NH2-группы от олигомеров с помощью бактериальных клеток, приводящее к снижению содержания азота, может стать альтернативой существующим методам предварительной подготовки капролактам и олигомерсодержащих стоков для дальнейшей биологической очистки.
Выводы 1. Разработана лабораторная модель биосенсора кюветного типа, которая позволяет проводить сравнительную оценку окислительной активности штаммов – деструкторов капролактама. Рабочие параметры биосенсорной модели на основе штамма Pseudomonas putida BS394(pBS268) составили: рН среды 7,6;
концентрация солей буферного раствора 33 мМ;
содержание клеток в рецепторном элементе 25 мг (по сырому весу)/мл агарового геля.
2. Впервые показана возможность применения биосенсорного подхода для быстрого скрининга бактериальных штаммов с различными комбинациями «бактериальный хозяин – САР-плазмида». Выявлено, что на процесс утилизации капролактама большее влияние оказывает выбор бактериального хозяина.
3. Получены значения удельных активностей ферментных систем деградации капролактама in vivo для бактериальных штаммов-деструкторов капролактама.
Наиболее высокую удельную активность наблюдали для штаммов P.putida BS394(pBS268) и P.putida BS394(pBS265): 0,17±0,02 и 0,16±0,02 мкМ/(мгмин) соответственно.
4. Разработан и опробован на реальных образцах макет биосенсора проточно инжекционного типа на основе штамма P.putida BS394(pBS268) для анализа капролактама в водных средах. Основные характеристики биосенсорной системы:
длительность единичного измерения 10 мин;
нижний предел обнаружения 0, мМ;
операционная стабильность 5,3 %;
долговременная стабильность 10 суток.
5. Впервые выявлен механизм трансформации линейных олигомеров капролактама под действием бактериальных клеток, содержащих плазмиду биодеградации капролактама: окислительное переаминирование до соответствующих дикарбоновых кислот. Показана принципиальная возможность создания биосенсора для детекции линейных олигомеров в водных средах.
Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:
1. Россинская И.В., Есикова Т.З., Понаморева О.Н., Решетилов А.Н.
Биосенсорная оценка катаболической активности штаммов-деструкторов капролактама с различными сочетаниями «САР-плазмида – бактериальный хозяин» // Биотехнология. 2008. №4. С. 44-47.
2. Россинская И.В., Понаморева О.Н., Есикова Т.З., Власова Ю.А., Алферов В.А., Решетилов А.Н. Детекция капролактама двумя типами микробных биосенсоров // Вода: Химия и Экология. 2008. №1. С. 30-38.
3. Россинская И.В., Понаморева О.Н., Алферов В.А., Есикова Т.З., Кошелева И.А., Решетилов А.Н. Сравнительная оценка окисляющей активности ферментных систем бактерий-деструкторов капролактама и эффективности функционирования этих штаммов в качестве биорецеторного элемента биосенсора // Известия ТулГУ. Серия «Химия». Тула: Изд-во ТулГУ. 2005.
Вып.5. С.78-88.
4. Россинская И.В., Понаморева О.Н., Алферов В.А., Есикова Т.З..
Характеристика биохимического поведения штамма Pseudomonas putida BS394(pBS268) биосенсорным методом в условиях естественного и электрокаталитического окисления субстратов // Известия ТулГУ. Серия «Химия». Тула: Изд-во ТулГУ 2006. Вып.6. C. 161- 5. Патент №70661 Российская Федерация, МПК C12N 1/00 (2006.01).
Устройство для определения -капролактама / Понаморева О.Н., Россинская И.В., Есикова Т.З., Решетилов А.Н.;
заявитель и патентообладатель Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН. - № 2007128608/22;
заявл. 26.07.2007;
опубл. 10.02.2008, Бюл.№4. – 3 с.
6. Россинская И.В., Алферов В.А., Понаморева О.Н., Решетилов А.Н., Кошелева И.А. Изучение путей деградации ксенобиотиков с помощью микробного сенсора // Материалы II Международной научной конференции «Ксенобиотики и живые системы». Мн.: БГУ. Минск, 11-15 ноября 2003 г. С.
36-40.
7. Россинская И.В., Понаморева О.Н., Алферов В.А. Микробный биосенсор для детекции -капролактама // Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2005».
Секция «Химия», т.1. М.:2005. Москва, 12-15 апреля 2005 года. С. 42.
8. Россинская И.В., Понаморева О.Н., Алферов В.А., Есикова Т.З., И.А.
Кошелева. Биосенсоры на основе бактериальных клеток как инструмент изучения процессов биодеградации ксенобиотиков // Материалы IV международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий». Том 2. Томск: изд-во ТПУ. Томск, 11-16 сентября 2006. С. 428-429.
9. Россинская И.В. Понаморева О.Н. Биосенсорная система для экспресс характеристики штаммов-деструкторов ксенобиотиков и детекция капролактама в водных средах. // Материалы Четвертого Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Часть 3. М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии». Москва, 12- марта 2007. С. 13.
10. Россинская И.В. Аэробная деградация ксенобиотиков иммобилизованными бактериями рода Pseudomonas // 9-я Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука 21 века» (Пущино), 18-22 апреля 2005 г.: Тезисы докладов. С. 362.
11. Россинская И.В. Биосенсор для детекции капролактама на основе плазмидсодержащих бактерий-деструкторов ксенобиотиков // Всероссийский конкурс инновационных проектов «Живые системы» (Киров), 24-26 ноября 2005 г.: Тезисы докладов С. 241-245.
12. Rossinskaya I.V., Ponamoreva O.N., Alferov V.A., Kosheleva I.A., Esikova T.Z.
Reshetilov A.N. Biosensor for detection of -caprolactam // International Congress on Analytical Sciences ICAS-2006 (Москва), 25-30 июня 2006 г. Сборник тезисов. Т.1. С.368.
13. Россинская И.В., Алферов С.В., Денисова А.А., Петрухина И.А. Разработка условий культивирования микроорганизмов для получения биокаталитических материалов с заданными свойствами // Материалы I Всероссийской научно-практической конференции «Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии, медицины и биоиндустрии:
фундаментальные и прикладные аспекты» (Пущино), 24-25 мая 2007 г. С. 57