Эколого-функциональная характеристика гидролитических бактерий термальных и щелочных водных систем забайкалья
На правах рукописи
РАДНАГУРУЕВА Арюна Арсалановна ЭКОЛОГО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ ТЕРМАЛЬНЫХ И ЩЕЛОЧНЫХ ВОДНЫХ СИСТЕМ ЗАБАЙКАЛЬЯ 03.02.08 – экология (биологические наук
и) 03.02.03 – микробиология (биологические науки)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан – Удэ - 2012 2
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН (ФГБУН ИОЭБ СО РАН)
Научный консультант: кандидат биологических наук Лаврентьева Елена Владимировна Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Дунаевский Яков Ефимович
Официальные оппоненты: Семенов Александр Михайлович – доктор биологических наук, доцент, ведущий научный сотрудник Биологического факульте та МГУ им. М.В. Ломоносова Буянтуева Любовь Батомункуевна кандидат биологических наук, доцент ФГБОУ ВПО БГУ
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт микробиоло гии им. С.Н. Виноградского РАН
Защита состоится «26» марта 2012 г. в 11.30 ч. на заседании Диссерта ционного совета Д 212.022.03 в Бурятском государственном университете по адресу: 670000, Улан-Удэ, ул. Смолина, 24а, Биолого-географический факультет, конференц-зал Факс: (3012) E-mail: [email protected] [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Бурятского государст венного университета.
Автореферат разослан «» февраля 2012 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Шорноева Н.А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы В последние десятилетия микробные сообщества термальных и щелоч ных местообитаний находятся в центре внимания исследователей (Brock, 1978;
Бонч-Осмоловская, 1999;
Заварзин, 2004;
Жилина, 2005;
Горленко, 2004;
Намсараев, 2006;
Кевбрин, 2007). Изучение микроорганизмов из этих сообществ на молекулярном уровне позволило выявить новые мета болические пути и механизмы биохимической адаптации, что значительно обогатило современную фундаментальную микробиологию.
Термофильные и алкалофильные гидролитические бактерии представ ляют одну из наиболее обширных и активно изучаемых групп микроорга низмов и являются источником новых ферментов и метаболитов для про мышленности и медицины. Ha данный момент известно большое число термо-/ алкалофильных микроорганизмов, осуществляющих гидролиз по лимерных субстратов - амилолитики (Krishnan и Chandra, 1983;
Gupta et al., 2003), целлюлозолитики (Bergquist et al., 1999, Uhl и Daniel, 1999, Andrade et al., 2001, Kozina et al., 2009 и др.) и протеолитики. Большинство протео литиков растут и используют в качестве источника углерода и энергии пептиды, благодаря наличию внеклеточных пептидаз, активных в широких диапазонах значений рН и температур (Klingeberg et al., 1995;
Ward et al., 2002). В целом, в природных местообитаниях гидролитики занимают нишу первичных деструкторов, благодаря способности гетеротрофно расти на биополимерах различной природы (Кубланов, 2011).
Распространение аэробных органотрофных бактерий в водных систе мах Забайкалья ранее изучалось эпизодически (Храпцова и др., 1984;
Нам сараев, 2003;
Nazina et al., 2004;
Зайцева, 2004). Знания о видовом разнооб разии и функциональной активности представителей аэробного микробно го сообщества щелочных термальных источников и содово-соленых озер Забайкалья были недавно пополнены (Базаржапов, 2005;
Бабасанова, 2007;
Шагжина, 2007;
Митыпова, 2007).
Вместе с тем, к началу нашей работы изучены гидролитические фер менты только ограниченного числа микроорганизмов водных систем За байкалья. Очевидно, что их разнообразие и метаболические свойства ис следованы недостаточно, а биотехнологический потенциал микроорганиз мов раскрыт далеко не полностью. Это делает актуальным проведение но вых исследований, связанных с распространением, разнообразием и функ циональной активностью бактерий в термофильных и алкалофильных микробных сообществах экстремальных водных систем Забайкалья.
Цель работы: изучить гидролитические бактерии и их функциональ ную роль в термальных и щелочных водных системах Забайкалья.
Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи:
Изучить распространение аэробных гидролитических бактерий в донных осадках и микробных матах термальных источников и содово соленых озер;
Выделить чистые культуры гидролитических микроорганизмов и определить их таксономическое положение;
Изучить экофизиологические и биохимические свойства чистых культур;
Выделить пептидазы гидролитических бактерий и изучить их свойства;
Изучить функциональную роль гидролитических бактерий в мик робном сообществе.
Научная новизна и практическая значимость. С помощью микро биологических и молекулярно-генетических методов выявлено распро странение аэробных алкалотермофильных органотрофных бактерий продуцентов пептидаз семейства Bacillaceae и Paenibacillaceae в термаль ных источниках Байкальского региона.
Выделен и детально охарактеризован предположительно новый вид алкалотермофильной факультативно анаэробной органотрофной бактерии «Anoxybacillus sp. nov.». Показано, что данная бактерия является активным продуцентом термостабильной сериновой субтилизин-подобной пептида зы, имеющей оптимум активности при 500С и pH 11,1.
Изученные пептидазы (сериновые субтилизин-подобного типа) алка ло-/термофильных гидролитических бактерий обладают высокой темпера турной (от 23 до 60 °С) и рН стабильностью (от 6,3 до 11,4).
Впервые получены очищенные препараты пептидаз из источников За байкалья, изучены их важнейшие физико-химические свойства. Впервые представлены данные по наличию ингибиторной активности пептидаз у бактерий содово-соленых озер Забайкалья.
Полученные результаты расширяют представления о разнообразии и экологическом значении гидролитических бактерий в экстремальных ме стообитаниях. Полученные очищенные препараты пептидаз могут найти практическое применение в биотехнологии, как ферменты устойчивые к высоким значениям температуры и рН. Результаты исследований могут быть использованы в учебном процессе при изучении микробиологии и экологии и подготовке учебно-методических пособий.
Апробация работы. Основные положения диссертации были пред ставлены на VI Международной научной конференции «Современное со стояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008);
Молодежной школе-конференции с международным уча стием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2008, 2010);
Всероссийском симпозиуме с международным участием «Совре менные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганиз мов» (Москва, 2009);
I International conference “Survey of Mongolian aquatic ecosystems in a changing climate: Results, new approaches and future outlook” (Ulaanbaatar, Mongolia, 2010);
XVII Международной конференции студен тов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2010);
Между народной конференции «Экология и геохимическая деятельность микро организмов экстремальных местообитаний» (Улан-Удэ – Улан-Батор, 2011).
Публикации. По результатам исследований опубликовано 18 печатных работ.
Место проведения работы. Работа выполнена в лаборатории микро биологии Института общей и экспериментальной биологии СО РАН. Мо лекулярно-биологическая часть работы проводилась в Центре «Биоинже нерия» РАН г. Москва. Работа по изучению внеклеточных пептидаз про водилась в НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова под руководством д.б.н. Дунаевского Я.Е.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, списка сокращений, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела экспериментальных исследований и обсуждения результатов, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на _ страницах машинописного текста, включает _ таблиц, _ рисун ков. Библиография содержит _ наименований, в т.ч. _ - зарубежных авторов.
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность за общее научное руководство научному руководителю к.б.н. Е.В. Лаврентьевой и научному консультанту д.б.н., проф. Я.Е. Дунаевскому.
Автор выражает благодарность за помощь в работе и поддержку заве дующему лабораторией микробиологии ИОЭБ СО РАН д.б.н., проф. Б.Б.
Намсараеву и всем сотрудникам лаборатории, заведующему лабораторией белков растений д.б.н., проф. М.А. Белозерскому и всем сотрудникам НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, а также к.б.н. Б.Б.
Кузнецову (Центр «Биоинженерия» РАН).
Диссертационная работа выполнена при финансовой поддержке гран тов РФФИ № 10-04-90798_моб_ст, № 10-04-93169_Монг_а, МО РФ РНП 2.1.1/2165.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 1. Обзор литературы В обзоре литературы приведены сведения по разнообразию микробного сообщества термальных источников и содово-соленых озер, рассмотрены общие свойства гидролитиков и их гидролаз, приведена современная клас сификация гидролитических ферментов (пептидаз) по базе данных MEROPS, представлены современные данные о роли внеклеточных пепти даз в прокариотной клетке и функционировании микробного сообщества в экстремальных местообитаниях, особое внимание уделено механизмам адаптации микроорганизмов к высоким температурам и рН, а также пред ставлены данные о биотехнологическом применении внеклеточных пепти даз микроорганизмов.
Глава 2. Объекты и методы исследований Объектами исследования являлись термальные источники Алла, Ум хэй, Гарга, Сеюя, Гусиха, Уро и Горячинск, расположенные в Курумкан ском, Баргузинском и Прибайкальском районах республики Бурятия. Тем пература воды на выходах термальных источников варьировала в широких пределах (39 - 740С). Наиболее высокотемпературными были источники Уро (69,10С), Алла (700 С), Гусиха (720С) и Гарга (740 С). Воды имели ще лочную реакцию, значения рН варьировали от 8,1 до 9,7. Температура и рН в термальных водах снижалась по мере удаления от излива.
Для исследования были отобраны пробы воды, донных осадков и мик робных матов в летне-осенний период с 2008 по 2010 годы.
Предметом исследований служили гидролитические бактерии: (табл.
1): Ur-6к, Br-2-2к, Ga-9-2к, Al-9-1к и Se-1к, выделенные из микробных ма тов и донных осадков термальных источников Бурятии (Бабасанова и др., 2006) и 5 культур SK1к, K5к, K6к, Ц3к и Nuк, выделенные из донных отло жений и воды содово-соленых озер Соленое и Нухэ-Нур (Забайкалье) (Митыпова и др., 2005). Все штаммы получены из коллекции лаборатории микробиологии ИОЭБ СО РАН, г. Улан-Удэ.
Таблица Физико-химическая характеристика местообитаний гидролитических бактерий Объект выделе- Т, 0С Вид pH Штамм ния пробы пробы пробы Ga-9-2к Гарга мат 57,4 8, Al-9-1к Алла мат 61,5 9, Ur-6к Уро мат 62,0 8, Br-2-2к Большая речка мат 51,5 9, Se-1к Сеюя мат 49 9, SK1к Соленое д.ос.
22 9, K5к « д.ос.
22 9, K6к « д.ос.
22 9, Ц3к « д.ос 22 9, Nuк Нухэ-Нур вода 27 9, Примечание: д.ос. – донные осадки;
к – коллекционные культуры ИОЭБ СО РАН Физико-химические методы исследования гидротерм Определение физико-химических параметров воды, донных осадков в местах отбора проб проводили общепринятыми методами (Намсараев и др., 2006).
Содержание органического углерода (Сорг) в пробах определяли по ме тоду Тюрина в модификации Никитина (Аринушкина, 1980). Определение содержания белка проводили по методу Лоури (Практикум по микробио логии, 2005). Оптическую плотность измеряли на фотоэлектроколоримет ре КФК-20 (Россия) и спектрофотометре CECIL-1021 (Великобритания).
Методы учета численности и выделения накопительных и чистых культур гидролитических бактерий. Учет численности и выделение аэробных алкалотермофильных гидролитических бактерий проводили ме тодом предельных разведений и высева на агар на среде Пфеннига сле дующего состава (г/л): NH4Cl – 0,3;
KH2PO4 – 0,3;
MgCl2 – 0,3;
CaCl2 – 0,3;
дрожжевой экстракт – 0,5;
раствор микроэлементов по Липперту, Витману – 1 мл. В качестве субстратов вносили (в %): для протеолитиков – пептон (1,5);
для амилолитиков – крахмал (1,5);
для целлюлолитиков – полоску фильтровальной бумаги (1);
для липолитиков – твин-80 (1,5). рН25С среды доводили бикарбонатно-карбонатным буфером до 8,5–9,5, температура инкубации для культур из содово-соленых озер составляла 37С, для куль тур из термальных источников - 50С.
Морфотипы бактерий, размеры, подвижность и спорообразование изу чали микроскопированием препаратов с помощью светового микроскопа AxioStar Plus (Karl Zeiss) в фазовом контрасте и на окрашенных препара тах при 100-кратном увеличении объектива (общее увеличение 1000) и ультратонких срезах в электронном микроскопе Jeol JEM-100C (Япония).
Молекулярно-биологические методы. Выделение ДНК проводили из биомассы бактерий (Булыгина и др., 2002). Для проведения полимеразной цепной реакции и дальнейшего секвенирования ПЦР-фрагментов гена 16S рРНК была использована универсальная праймерная система (Lane, 1991).
Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 2% геле агарозы при напряженности электрического поля 6 В/см.
Выделение и очистку продуктов ПЦР проводили из легкоплавкой ага розы с применением набора реактивов Wizard PCR Preps (Promega, США).
Секвенирование полученных ПЦР-фрагментов генов, кодирующих 16S рРНК, проводили по методу Сэнгера с соавт. (Sanger at al, 1977) с помо щью набора реактивов Big Dye Terminator v.3.1 (Applied Biosystems, Inc.,USA) на автоматическом секвенаторе ABI PRIZM 3730 (Applied Bio systems, Inc.,USA). Первичный анализ сходства нуклеотидных последова тельностей генов 16S рРНК изучаемых штаммов проводили с помощью программного пакета BLAST (Camacho at al., 2009).
Построение филогенетического древа производили с помощью пакета программ TREECON (Van de Peer and De Wachter, 1994).
Метагеномный анализ проведен на пиросеквенаторе Roche 454 GS-FLX Titanium (Южная Корея). Оценку таксономической сложности сообщества проводили с помощью пакета программ CLcommunity (ver 2.58).
Анализ жирных кислот. Состав жирных кислот анализировали на хроматографе Шерлок (Microbial Identification System, MIDI Inc, USA).
Исследования выполнены в Национальном университете, Чанчон, Южная Корея.
Изучение физиолого–биохимических свойств гидролитических культур. Температурные диапазоны развития бактерий устанавливали в градиентном термостате от 20 до 80С. Диапазон рН25С устанавливали с разными концентрациями бикарбоната и карбоната натрия (от 6,0 до 11,0).
Способность к использованию различных источников углерода проверяли на минеральной среде, в которую вносили испытуемые источники углеро да в концентрации 0,5 – 1 % от объема среды. Биомассу бактерий опреде ляли по изменению оптической плотности культуры при длине волны нм. Биохимические свойства бактерий, удельную скорость роста опреде ляли общепринятыми методами (Практикум по микробиологии, 2005).
Определение общей активности пептидаз проводили на белковых субстратах: азоказеин и желатина. Для определения субстрат-специфичной активности использовали синтетические 20 мМ п-нитроанилидные суб страты, специфичные для определенных групп пептидаз – GlpAALpNa для субтилизин-подобных, GlpFpNа – химотрипсин-подобных, BAPA – трип син-подобных, GlpFApNa – цистеиновых, R-pNa, L-pNa, F-pNa, Y-pNa – аминопептидаз (Erlanger et al., 1961). Для выяснения природы функцио нальных групп активного центра использовали ингибиторы, специфичные для различных классов пептидаз: EDTA и о-фенантролин для металлопеп тидаз, PMSF для сериновых пептидаз, IAA для цистеиновых пептидаз. Оп тимум активности в зависимости от рН25С определяли в 0,5M универсаль ном буфере в диапазоне рН 2,4 – 12. Температурный оптимум фермента определяли, измеряя активность фермента при значениях температуры от 23 до 800С.
Выделение и очистка ферментов культур Se-1-10 и Gor-10s проводи ли из препаратов культуральной жидкости бактерий методами диализа, ионообменной хроматографии на колонке Mono Q в режиме FPLC. Опре деление молекулярных масс ферментов проводили методом гель хроматографии на Superdex 75.
Методы математического анализа. Все расчеты были проведены с использованием Excel2003 и пакета программ MathLabR2010a для Win dows.
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение Исследование химического состава нативных проб Важным фактором, влияющим на активность и жизнедеятельность микробного сообщества, является качественный и количественный состав органического вещества в среде обитания.
В донных осадках оз. Соленое и Нухэ-Нур обнаружено высокое содер жание Сорг (10,0-15,4 %). Основными источниками ОВ в изученных содо вых озерах является фитопланктон и прибрежная растительность. Содер жание белка было относительно низким (от 0,1 до 0,23 мг/см3) (Митыпова, 2007).
Общее содержание органического углерода в пробах исследованных термальных источников варьировало в пределах от 0,3% до 6,03% и зави село от вида пробы. Максимальные значения (5,57 и 6,03%) были отмече ны в микробных матах гидротерм Гарга и Сеюя (табл. 2). Количество бел ка в исследуемых пробах составило от 1,1 (ист. Горячинск) до 4,36 мг/см (ист. Умхэй). В целом, отмечено, что концентрация органического вещест ва в микробных матах была выше, чем в донных осадках.
Таблица Физико-химическая характеристика проб Содержание углерода ОВ, Вид Белок, Сорг, % на мине Источник рН t,oC пробы мг/см3 ральную % часть навес ки д.ос. 52 9,3 1,1 0,3 4, Горячинск д.ос. 46 9,28 2,74 0,42 20, м.м 52,3 9,3 2,15 2,0 97, м.м н.о 61 8,5 3,44 0, Гарга м.м 35 8,2 1,21 5,57 1362, Сеюя м.м 50 9,77 2,96 6,03 2711, м.м 40 9,64 4,36 1,61 36, Умхэй д.ос. 40 9,64 2,02 0,46 19, Примечание: д.ос. – донные осадки;
м.м – микробный мат;
н.о – не определено Сравнительный анализ содержания Сорг и белка микробных матов и донных осадков термальных источников показал, что удельное содержа ние ОВ выше в микробных матах, что может быть объяснено высокой ин тенсивностью продукционных процессов в матах в отличие от донных осадков (Jorgensen, Nelson, 1988;
Navarrete et al., 2000;
Заварзин, 1993, 2003).
Основные экологические параметры воды термальных источников За байкалья были проанализированы с использованием метода главных ком понент (Geladi, 1989;
Gorban, Zinovyev, 2010), что позволило определить наиболее важные факторы для функционирования системы.
Были определены четыре главные компоненты (PC – Principal Compo nent), которые объясняют 94% наблюдаемых вариаций. РС1 объясняет 61% наблюдаемых параметров представляет собой рН и количество белка в нативных пробах. Наибольший вклад во вторую компоненту РС2 - 25% наблюдаемых изменений в среде, оказывают численность протеолитиков и тип пробы, состоящий из микробных матов и донных осадков. РС3 (мине рализация и содержание органического вещества) и РС4 (температура) имеют меньшее значение, объясняя 4,2% и 3,78% изменений, соответст венно.
Анализ показал, что функционирование гидролитического микробного сообщества в первую очередь, регулируется такими факторами, как рН и содержание белка в пробах.
Численность гидролитических бактерий термальных и щелочных водных систем Забайкалья В естественных местообитаниях гидролитические бактерии занимают нишу первичных деструкторов органического вещества.
Таблица Численность аэробных протеолитических бактерий термальных источ ников, lg кл/см Протеолитики Амилолитики Т,0С рH Объект пробы пробы д.ос. м.м.
д.ос. м.м.
Гарга 55 8,67 4 6 3 70 8,5 4 - 2 Алла 70 9,44 3 4 2 65 9,2 - 5 - 45 8,33 5 5 2 40 9,19 5 - 3 Уро 43 8,8 5 - 2 46 9,19 - 4 - 63 9,04 - 5 - Умхей 40 9,64 4 5 3 Горячинск 52 9,3 5 6 4 46 9,28 5 - 3 42,1 9,41 5 - 5 Сеюя 50 9,77 4 7 - Соленое 22 9,9 8* - 6* Нухэ-Нур 27 9,84 6* - 6* Примечание: «-» - нет данных;
*- данные Митыповой Т.Н.
Численность протеолитических бактерий в донных осадках и микроб ных матах варьировала в пределах от 1000 до 100 млн. кл/см3 (табл. 3).
Наибольшее число микроорганизмов обнаружено в поверхностном мик робном мате источника Сеюя и в матах Гарги и Горячинск (до 10 млн.
кл/см3) и в донных осадках оз. Соленое и Нухэ-Нур (до 100 млн. кл/см3).
Максимальное число бактерий (10 тыс. кл/см 3), использующих в каче стве основного субстрата – крахмал, зафиксировано в донных осадках и микробных матах источника Горячинск, оз. Соленое и Нухэ-Нур. Обнару жено, что численность аэробных протеолитиков и амилолитиков превыша ет численность липолитиков и ЦРБ в среднем на 2-4 порядка. Так макси мальное количество липолитиков и целлюлозолитиков (анаэробы) дости гало 100 кл/см3.
Таким образом, высокая численность разных физиологических групп бактерий указывает на широкое распространение первичной деструкцион ной ветви микробного сообщества. Отмечено, что вследствие высоких концентраций белка и ОВ, численность бактерий-деструкторов выше в микробных матах, чем в донных осадках.
Выделение и характеристика гидролитических бактерий термальных водных систем Забайкалья Из проб микробных матов и донных осадков термальных источников Бурятии: Гарга, Алла, Умхей, Сеюя и Горячинск было выделено 28 штам мов гидролитических бактерий (табл. 4).
Таблица Характеристика штаммов, выделенных из термальных источников Забайкалья Физиологическая Штамм Источник Вид пробы группа Se-1- Протеолитик Сея- А Сеюя м.м. Амилолитик А Л Липолитик Л м.м.
Um-09m Умхей Протеолитик Um-09s д.ос.
Um-09s А11 д.ос.
Амилолитик А м.м.
Л12 Алла Л13 д.ос. Липолитик Л15 м.м.
д.ос. Протеолитик Gor-10s Gor-10- Горячинск м.м.
Gor-10-1m Gor-10- Продолжение табл. Протеолитик Га- м.м.
А Гарга Амилолитик А Л10 Липолитик А1 песок Амилолитик А Л2 м.м.
Уро Липолитик Л А5 Амилолитик д.ос.
Л5 Липолитик Примечание: жирным шрифтом выделены штаммы с известным филогенетическим по ложением Морфология. Клетки бактерий представлены различными спорообра зующими грамположительными палочками, размеры которых варьировали в пределах от 0,5-4,96 х 1,1-16,6 мкм. Размеры спор составляли 1,13 – 1, мкм.
Экофизиология. Исследование экофизиологии, выделенных культур протеолитиков из термальных источников, показало, что они способны развиваться в широком диапазоне температур (23-60°С) и рН (7,6-10,0), проявляя свойства алкало- и термотолерантности. В соответствии с имею щимися классификациями бактерий в отношении температуры и рН, изу ченные штаммы распределились следующим образом:
Штаммы бактерий-деструкторов (SK1к, K5к, K6к, Ц3к и Nuк), вы деленные из содово-соленых озер Забайкалья, характеризуются как мезо филы с оптимумом роста в диапазоне от 23 до 30°С и оптимумом рН от 7, до 10;
Большая группа штаммов (Gor-10-3, Сея-09, Um-09s1, Um-09s2, Gor-10-1m, Um-09m, Га-35 и Gor-10s), выделенных из термальных источ ников, характеризуются как термоалкалотолерантные, с оптимумом разви тия в диапазоне от 40 до 45°С и оптимумом рН от 7,5 до 9,5;
Штаммы бактерий (Gor-10-2, Ur-6к, Br-2-2к, Ga-9-2к, Al-9-1к и Se к 1 ), выделенные из термальных источников, характеризуются как термоал калофильные, с оптимумом роста в диапазоне от 50 до 60°С и оптимумом рН от 8,0 до 8,5.
Генотипическая характеристика. Методом пиросеквенирования по гену 16S рРНК микробного мата получены данные, характеризующие со став микробного сообщества.
В сообществе микробного мата, развивающегося при рН 9,47 и темпе ратуре 67оС в источнике Алла (2402 н.п., 80 ОТЕ), доминируют филы Dei nococcus - Thermus (45%) и Nitrospirae (36%). Proteobactеria и Firmicutes составляют 3 и 2%, соответственно. Cloroflexi и Cyanobacteria – формооб разующие компоненты микробных матов, в структуре данного сообщества занимают 3% и 0,37%, соответственно. Произведен анализ графиков, ил люстрирующие зависимость числа детектированных филотипов (т.е. числа кластеров) от числа проанализированных последовательностей (Марданов, 2010). Проведенная оценка таксономической сложности сообщества по зволила показать разнообразие 83 видов бактерий.
Изучение видового разнообразия выделенных бактерий молекулярно генетическим методом показало, что выделенные культуры относятся к родам Bacillus, Anoxybacillus и Paenibacillus.
Для анализа гена 16S рРНК было отобрано 3 штамма (Um-09m, Га-35 и Gor-10s). В результате было показано, что штамм Um-09m имеет 99,8 % сходствa с Bacillus licheniformis штамм BPRIST006. Наибольшее сходство у культур Га-35 и Gor-10s выявлено с Paenibacillus dendritiformis штамм P411 (100%).
Внеклеточная протеолитическая активность в нативных пробах Изучение биохимических параметров нативных образцов показало, что наиболее высокая общая внеклеточная протеолитическая активность при использовании в качестве субстрата желатины обнаружена в источнике Сеюя – от 0,13 до 1,02 ед. в донных осадках и от 0,36 до 1,09 ед. в микроб ных матах. Высокая ферментативная активность, вероятно, обусловлена тем, что в местах отбора проб, зафиксированы наибольшие количества органического вещества (до 6,03%) и численности гидролитических бакте рий (от 10 тыс. до 10 млн. кл/см 3). Активное разложение желатины было отмечено также в образцах источников Гусиха (0,12 – 0,51 ед.) и Алла (0,22 – 0,49 ед.). Пробы из источника Гарга имели незначительную актив ность по желатине (0,13 – 0,24 ед.), т.к. точки отбора проб находились на выходе источника и характеризовались низкими значениями Сорг (0,27%) и численности (до 10 тыс. кл/см3).
В образцах источников Алла, Умхей, Сеюя обнаружена трипсин подобная активность. Значения активности варьировали от следовых до 0,65 ед. Образцы источников Гарга и Гусиха характеризовались низкими значениями активности по данному субстрату (0,12 ед.).
Таким образом, показана высокая вариабельность в распределении ак тивности пептидаз в зависимости от типа образца. Высокие значения суб тилизин-подобной активности обнаружены в микробных матах. Макси мальные величины трипсин-подобной активности были определены, как в микробных матах, так и в донных осадках. Проведенные исследования показали высокую степень участия внеклеточных ферментов в нативных образцах в деструкции органического вещества в термальных источниках.
Внеклеточная протеолитическая активность гидролитических бактерий В качестве источников секретируемых внеклеточных пептидаз исполь зовали культуральные жидкости 9 алкало-термофильных штаммов Gor-10 3, Сея-09, Gor-10-2, Um-09s1, Um-09s2, Gor-10-1m, Um-09m, Га-35 и Gor 10s, выделенных из микробных матов и донных осадков термальных ис точников Забайкалья и 10 органотрофных культур, предоставленных из коллекции ИОЭБ СО РАН (табл. 5).
Таблица Краткая характеристика органотрофных культур Место выде ления/ ис- Таксономическая принад- Отношение № Штамм lim/ NaClопт точник вы- лежность* к О деления Из содово-соленых озер оз. Нухэ- Sanguinoglea alkalitolerans 0-7,5/ 0,5 Nuк 1 SA Нур/ вода gen. nov., sp. nov. 1, оз. Соленое/ Lyalikoviella elongate gen.
SK1к донные 2 SA 0-7,5/3, nov., sp. nov.
осадки Ц3к » 3 Bacillus krulwichae (100%) FAn 0-20,0/10, К5к » 4 Bacillus saliphilus (100%) FAn 0-20,0/ 3-7, Halomonas aquamarina 0-20,0/ К6к » 5 FAn (99%) 7,5-10, Из термальных источников Уро/ Вacillus hemicellulosolyticum Ur-6к микробный 6 FAn 0-50/ C-11 (99 %) мат Большая Вacillus licheniformis Br-2-2к речка/ мик 7 Fan 0-50/ BBDC6 (97 %) робный мат Гарга/ Anoxybacillus flavithermus Ga-9-2к микробный 8 FAn 0-20/ DSM 2641 (Z26932) (95 %) мат Алла/ Anoxybacillus pushchinoensis Al-9-1к донные 9 FAn 0-20/ AT-2 (AB234214) (96%) осадки Сеюя/ Anoxybacillus pushchinoensis Se-1к донные 10 FAn 0-50/ AT-2 (AB234214) (95%) осадки Примечание: *Таксономическая принадлежность оценена на основании анализа последова тельности гена 16S рРНК, в скобках указан % гомологии с ближайшим родственным орга низмом;
SA – строгий аэроб;
FAn – факультативный анаэроб.
Наиболее важным фактором определяющим активность внеклеточных ферментов является наличие в питательной среде оптимального субстрата в процессе роста культур. Нами проведено сравнительное изучение секре ции внеклеточных пептидаз в зависимости от источника азота (триптон, пептон, казеин, неорганический источник азота) и времени культивирова ния (от 12 до 96 ч). Установлено, что максимальная активность по азока зеину у штаммов Um-09m, Га-35 и Gor-10s проявляется на среде с трипто ном на 48-60 ч культивирования.
Максимальная активность для трипсин-подобных пептидаз по субстра ту ВАРА обнаружена на 84 и 60 ч культивирования у штаммов бактерий SK1к и Nuк, соответственно. У штаммов К5к, К6к и Ц3к обнаружены следовые активности по данному субстрату. Изучение пептидазной активности на специфичном для субтилизин-подобных пептидаз субстрате – GlpAALpNa показало наличие у штамма Ц3к и Ur-6к наиболее высокой внеклеточной протеолитической активности, которая составила 4,3 ед/мг белка (96 ч) и 3,24 ед/мг белка (12 ч). Максимум активности по этому же субстрату выявлены в штаммах Um-09m, Га-35 и Gor-10s (7,1;
3,7 и 12, ед/мг белка, соответственно). Полученные данные свидетельствуют о том, что существенный вклад в пептидазную активность культур Ц3к, Ur-6к, Um-09m, Га-35 и Gor-10s, по-видимому, вносят пептидазы с субтилизин подобной специфичностью. Показано, что культуры не гидролизуют субстраты, специфичные для химотрипсин-подобных и цистеиновых пептидаз, независимо от времени культивирования и источников органического азота.
Анализ внеклеточной протеолитической активности изученных штам мов свидетельствует о различной субстратной специфичности пептидаз у изученных штаммов бактерий.
С помощью использованных методов диализа и ионообменной хрома тографии в условиях FPLC на колонке Mono Q (табл. 6) удалось частично очистить фермент с молекулярной массой 19-20 кДа, выделенный из куль туральной жидкости Paenibacillus dendritiformis штамм Gor-10s. Получен ные активные фракции использовали для дальнейшей характеристики пеп тидазы.
Таблица 6.
Стадии очистки пептидазы, выделенной из культуральной жидкости Paenibacillus dendritiformis штамм Gor-10s Удельная Общий Общая актив- Степень Выход, Стадия очистки активность, белок, мг ность, ед очистки % ед./мг белка Культуральная 20,56 150,4 7,32 1,0 жидкость Диализ 9,53 119,8 12,57 1,7 58, Ионообменная 0,402 69,94 173,9 23,8 4, хроматография Ни ионообменная хроматография, ни гель-хроматография не выявили в культуральной жидкости присутствие еще какой-либо пептидазы со сход ной активностью.
Исследования физико-химических свойств ферментов были проведены на очищенном препарате сериновой пептидазы Paenibacillus dendritiformis штамм Gor-10s и в культуральных жидкостях штаммов SK1к, Nuк, К5к, К6к, Ц3к, Ur-6к, Br-2-2к, Ga-9-2к, Um-09m и Га-35 (рис. 1).
Рисунок 1. рН оптимум и ста бильность активности пептидаз изученных штаммов - диапазон стабильности ( пептидаз;
в скобках даны оптимумы тем пературы) Анализ полученных результатов показал, что максимальная активность ферментов по гидролизу синтетического субстрата GlpAALpNa наблюда ется для пептидаз штаммов Ur-6к, Br-2-2к, Ga-9-2к, Um-09m и Gor-10s при рН от 11,0 до 11,3, для пептидаз штаммов SK1к, Nuк, Ц3к и Га-35 при рН от 8,0 до 9,8. Все ферменты стабильны в широком диапазоне рН от 6,6 до 11,4. Температурные оптимумы пептидаз колеблются от 30 до 60°С. Полу ченные нами данные указывают на то, что секретируемые пептидазы изу ченных бактериальных штаммов имеют оптимум рН в щелочной области и рН стабильность, вполне покрывающую диапазон рН, свойственный мес там их обитания.
Анализ функциональных групп активного центра показал, что в препа ратах культуральной жидкости исследованных штаммов бактерий пре имущественно содержатся пептидазы, относящиеся к классу сериновых пептидаз субтилизин-подобного типа, кроме штамма Um-09m, в культу ральной жидкости которого содержится, по-крайней мере, два фермента, относящихся к классам сериновых и металлопептидаз.
Среди исследованных нами культур бактерий у штаммов SK1к и Nuк, растущих на различных источниках азота, обнаружены высокие внекле точные активности, ингибирующие субтилизиновые и цистеиновые пепти дазы.
Рисунок 2. Внеклеточная ингибиторная активность субтилизиновых (а) и цистеиновых пептидаз (б) у культур SК1к Так, субтилизин-ингибирующая активность у культуры SK1к (рис. 2) ярко выражена на средах с казеином (до 84% ингибирования), пеп тон+казеин (до 69%) и пептоном до (59%), на среде с неорганическим ис точником азота ингибирующая активность была слабая и не превышала 9%. Культура Nuк также показала высокую ингибирующую активность, но, в отличие от SK1к, на среде с пептоном активности не обнаружено. Низкий процент ингибирования обнаружен на среде с неорганическим источником азота только в первые часы культивирования.
Отличительной особенностью цистеин-ингибирующей активности у культур SK1к и Nuк от субтилизин-ингибирующей являлась высокая ак тивность на средах с неорганическим источником азота (73 и 81%). При чем высокий уровень ингибирования оставался практически неизменным в течение всего времени культивирования.
Обнаруженные нами высокие ингибиторные активности по отношению к сериновым и цистеиновым пептидазам у штаммов SK1к и Nuк, возможно, защищают сами бактерии и их белковые субстраты от атаки экзогенных пептидаз, как в случае внеклеточного пептидазного ингибитора B. brevis (Shiga et al., 1995).
Определение молекулярных масс ингибиторов посредством гель хроматографии показало, что исследованный препарат культуры Nuк со держит, по меньшей мере, два ингибитора с молекулярными массами 60 и менее 10 кДа.
Новая факультативно-анаэробная органотрофная культура Se-1- Anoxybacillus sp. nov.
Из пробы поверхностного мата горячего источника Сеюя с температу рой 50°С и значением рН 9,3 была выделена факультативно анаэробная грамположительная спорообразующая культура Se-1-10.
Морфология. Клетки представляют собой прямые палочки, грамполо жительные, спорообразующие (рис. 3). Образующиеся эллипсоидальные споры располагались в материнской клетке терминально, несколько рас ширяя ее. Размер клеток 0,39 x 1,07 мкм. При росте на твердой среде обра зуют колонии 2-4 мм в диаметре, желтовато-молочного цвета. Факульта тивные анаэробы.
в а б г д Рисунок 3. Морфология клеток (а) и ультратонкое строение (б, в, г – деле ние клетки;
д – начало процесса спорообразования) микрофотографии (масштаб - 1 µm) штамма Se-1-10.
Физиологические свойства. Штамм Se-1-10 активно и стабильно разви вается при различных значениях температуры и рН. Культура является факультативным алкалофилом, растущим в области рН от 6,05 до 10,3 с оптимумом 9,5-10,0, умеренным термофилом с оптимумом роста при температуре 50°С.
Состав жирных кислот. Доминирующие жирные кислоты штамма Se 1-10 были C14:0 (2,20%);
iso-C15:0 (66,77%);
anteiso-C15:0 (5,72%);
C15:1w5c (1,63%);
iso-C16:0 (3,23%);
C16:0 (4,96%);
iso-C17:0 (7,90%);
anteiso-C17: (4,19%).
Генотипическая характеристика. Результаты анализа сиквенса гена 16S рРНК (1517 нуклеотидов) показали, что уровень сходства последова тельностей исследуемого штамма Se-1-10 и типовых штаммов Anoxybacil lus flavithermus strain DSM 2641 (Z26932) и Anoxybacillus eryuanensis E (GQ153549) составили 98,4 и 98,9%, соответственно (табл. 7).
Таблица Сходство последовательностей штамма Se-1-10 с ближайшими гомологами Anoxybacillus Anoxybacillus Штамм eryuanensis flavithermus Se-1-10 E112 DSM 2641T (GQ153549) (Z26932) Штамм Se-1-10 ID 0,989 0, Anoxybacillus eryuanensis E 0,989 ID 0, (GQ153549) Anoxybacillus flavithermus DSM 0,989 0,984 ID 2641 (Z26932) Полученные данные позволяют предположить, что штамм Se-1-10 мо жет являться представителем нового вида рода Anoxybacillus sp. nov.
Anoxybacillus sp. SW (FJ842661) Anoxybacillus sp. PGDW06 (FJ527831) Anoxybacillus sp. SK3-3 (GQ184212) 0.01 Anoxybacillus eryuanensis E112T (GQ153549) Se-1- Anoxybacillus pushchinensis k-1T (AJ010478) 59 Anoxybacillus tengchongensis T11T (FJ438370) Anoxybacillus kestanbolinensis K4T 76 53 Uncultured Anoxybacillus sp. clone LNE-3 (AY531640) 84 Anoxybacillus flavithermus DSM 2641T (Z26932) Anoxybacillus ayderensis AB04T (AF001963) Anoxybacillus gonensis G2TT (AY122325) Anoxybacillus salavatliensis A343T (EU326496) 94 Anoxybacillus kamchatkensis JWVK-KG4T (AF510985) Anoxybacillus bogrovensis NBIMCCT (AM409184) Anoxybacillus contaminans LMG 21881T (AJ551330) Anoxybacillus amylolyticus MR3CT (AJ618979) 91 Anoxybacillus voinovskiensis TH13T (AB110008) Anoxybacillus rupiensis DSM 17127T (AJ879076) Bacillus subtilis DSM10T (AJ276351) Рисунок 4. Дендрограмма филогенетического положения штамма Se-1- На основании проведенных физиолого-биохимических и молекулярно генетических исследований показано, что штамм Se-1-10 отличается от ранее описанных видов рода Anoxybacillus (размеры клеток, окраска коло ний, способность к использованию лактозы, мальтозы, целлобиозы и по профилю жирных кислот). Определение содержания Г+Ц пар и ДНК-ДНК гибридизация находятся на стадии исследования.
Внеклеточная протеолитическая активность штамма Se-1- Изучена динамика накопления внеклеточной протеолитической актив ности фермента в процессе роста культуры Se-1-10. Показано, что макси мальное накопление фермента в культуральной жидкости происходит в фазе замедления роста (48-60 ч). Штамм показал высокую активность 18, ед/мг белка, по специфичному для субтилизин-подобных пептидаз суб страту GlpAALpNa и белковому субстрату азоказеину.
Одним из наиболее важных факторов, определяющих активность вне клеточных ферментов, является наличие в питательной среде оптимально го субстрата (Дунаевский и др., 1995). В присутствии легко метаболизи руемых источников углерода: глюкоза, фруктоза, лактоза, ксилоза, рамно за, синтез пептидаз резко снижался. При росте культуры на средах с труд но усваиваемыми источниками углерода и азота: дрожжевой экстракт, целлобиоза, триптон, активность, определяемая по гидролизу GlpAALpNa, была выше и достигала 0,44 ед.
В результате последовательной очистки фермента методами диализа и ионообменной хроматографии в условиях FPLC на колонке Mono Q вне клеточная пептидаза штамма Se-1-10 была очищена в 42,7 раз. Выход со ставил около 1%.
Значения температуры и рН являются одними из важнейших факторов, влияющих на функционирование микробного сообщества Рисунок 5. рН и температурные оптимумы и стабильности пептидазы Se-1- Как следует из приведенных данных, температурный оптимум пепти дазы штамма Se-1-10 Anoxybacillus sp. nov. составляет 50°С, оптимум рН активности исследуемого штамма находится в щелочной области и состав ляет 8,0 – 11,4, с максимумом при рН 11,0, что, по-видимому, отражает адаптацию ферментативного аппарата штамма Se-1-10 Anoxybacillus sp.
nov. к обитанию в щелочных условиях.
Анализ функциональных групп активного центра пептидаз показал, что специфический ингибитор сериновых пептидаз PMSF полностью подавлял активность очищенного фермента штамма Se-1-10. Специфические инги биторы металлопептидаз (EDTA и о-фенантролин) и цистеиновых пепти даз (IАА) не влияли на активность пептидазы. Эти данные позволяют предположить отсутствие остатков цистеина в белковой глобуле, что явля ется характерным для классических субтилизинов бацилл (Балабан и др., 2007). Таким образом, по типу ингибирования выделенная пептидаза штамма Se-1-10 Anoxybacillus sp.nov. относится к семейству субтилизин подобных ферментов класса сериновых пептидаз.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Известно, что микробные сообщества термальных и щелочных водных систем Забайкалья являются полноценными функциональными системами, эффективно осуществляющие круговорот веществ в процессах продукции и деструкции органического вещества. (Солоноватые …, 2009;
Геохимиче ская деятельность…, 2011). Наличие органических и минеральных ве ществ, высокие значения температуры и рН в водной толще, донных от ложениях и микробных матах способствует широкому распространению гидролитических термо- и алкалофильных микроорганизмов.
Результаты исследования показали, что в экстремальных водных сис темах Байкальского региона при температурах от 22 до 700С и pH от 8,0 до 9,7 широко распространены аэробные органотрофные бактерии. Домини рующими физиологическими группами, как в донных осадках, так и в микробных матах были протеолитические бактерии (до 100 млн. кл/см3).
Выделенные и изученные нами алкалотолерантные гидролитические бактерии способны развиваться в широком диапазоне температур от 23 до 600С и рН от 7,6 до 10,0. Полученные результаты показали границы при способляемости и функционирования выделенных бактерий в экстремаль ных условиях гидротерм Бурятии. Среди определенных с помощью моле кулярно-генетических методов бактерий выявлены представители родов Bacillus, Anoxybacillus и Paenibacillus. По совокупности фенотипических и генотипических признаков штамм Se-1-10 отличается от ранее описанных видов рода Anoxybacillus, что позволяет отнести выделенный штамм к но вому виду. Выделенные культуры в микробном сообществе занимают функциональное положение первичных деструкторов, осуществляющих гидролиз различных органических соединений.
Анализ активности микробного сообщества от экологических факторов в термальных источниках позволил выявить главные факторы (рН и со держание белка), влияющие на функционирование системы. Исследование пептидазной активности в пробах in situ показало, что микробное сообще ство обладает различным спектром внеклеточных пептидаз, максимально адаптированных к условиям обитания микроорганизмов, что отражает экологические и метаболические особенности микробного сообщества в термальных системах.
Полученные результаты по изучению внеклеточных пептидаз свиде тельствуют о том, что исследованные штаммы обладают различной суб стратной специфичностью. Изученные пептидазы алкалофильных и тер мофильных штаммов показали высокую рН и температурную стабиль ность, что возможно позволяет им активно функционировать в условиях термальных источников и содово-соленых озер Забайкалья. Проведенные исследования показали присутствие в этих системах активных и разнооб разных термофильных и алкалофильных протеолитиков, способных гид ролизовать биополимеры (белковые соединения). Пептидазы этих бакте рий по своим биохимическим характеристикам могут быть рекомендованы для применения в биотехнологии.
ВЫВОДЫ 1. В щелочных термальных источниках Забайкалья широко распро странены гидролитические бактерии, численность которых составляет от 10 до 100 млн. клеток/см3.
2. По результатам пиросеквенирования в микробном сообществе гид ротермы Алла доминируют представители филумов Deinococcus-Thermus, Nitrospiraе, Proteobactеria, Firmicutes и Cloroflexi. Выделенные культуры гидролитических факультативно-анаэробных бактерий принадлежат к се мействам Bacillaceae/Paenibacillaceae.
3. Из термального источника Сеюя выделен и описан предположитель но новый вид алкалотермофильной органотрофной бактерии с 98,4% сход ства с Аnoxybacillus flavithermus и 98,9% с Anoxybacillus eryuanensis, спо собной к росту при pH 6,0-10,3 и температуре 37-600С.
4. По результатам анализа функциональных групп активного центра, физико-химических свойств и субстратной специфичности показано, что секретируемые ферменты относятся к сериновым пептидазам семейства субтилизина. Анализ очищенных препаратов пептидаз показал, что иссле дуемые ферменты отличаются высокой рН (6,5-11,5) и температурной ста бильностью (23-60оС), что позволяет им в природе осуществлять деструк цию ОВ при смене экологических условий в экосистеме.
5. Штаммы бактерий из содово-соленых озер Соленое и Нухэ-Нур об ладают высокой ингибирующей активностью пептидаз, в отличие от тер мофильных бактерий.
6. Функциональная роль исследованных бактерий определяется суб стратной специфичностью гидролитических ферментов и высокой метабо лической активностью в отношении используемых субстратов.
Список работ, опубликованных по материалам диссертации Статьи в рецензируемых журналах:
Лаврентьева Е.В., Дунаевский Я.Е., Козырева Л.П., Раднагуруева А.А., 1.
Намсараев Б.Б. Внеклеточная протеолитическая активность бактерий, выделенных из содово-соленых озер Забайкалья // Прикладная биохимия и микробиология, 2010. Т. 46. №6. С. 630-636.
Лаврентьева Е.В., Раднагуруева А.А., Намсараев Б.Б. Протеазная актив 2.
ность Bacillus hemicellulosolyticum // Вестник Бурят. госунивер., 2010. Вып. 4.
«Биология, география». С. 99-101.
Раднагуруева А.А., Лаврентьева Е.В., Намсараев Б.Б., Дунаевский Я.Е.
3.
Взаимодействие протеаз с синтетическими химическими субстратами у термо фильной бактерии Se-1-10 // Вестник Бурят. госунивер., 2010. Вып. 3. «Химия, физика». С. 5-7.
Раднагуруева А.А., Лаврентьева Е.В., Намсараев Б.Б., Дунаевский Я.Е.
4.
Биохимическая характеристика культуры Um-09m // Вестник Бурят. госунивер., 2011. Вып. 3. «Химия, физика». С. 94-97.
Лаврентьева Е.В., Бабасанова О.Б., Раднагуруева А.А., Намсараев Б.Б.
5.
Гидрохимические и биохимические характеристики гидротерм Баргузинской до лины // Вестник Бурят. госунивер., 2008. Вып. 3. «Химия, физика». С. 19-24.
Раднагуруева А.А., Лаврентьева Е.В., Дунаевский Я.Е. Протеолитическая 6.
активность алкалофильных микроорганизмов водных систем Забайкалья. Вестник Бурят. госунивер., 2009. Вып. 4. «Биология, география». С. 98- 101.
Лаврентьева Е.В., Раднагуруева А.А., Намсараев Б.Б., Дунаевский Я.Е.
7.
Биохимические характеристики микроорганизмов щелочных гидротерм Прибайка лья // Вестник Бурят. госунивер., 2009. Вып. 3. «Химия, физика». С. 11-14.
Раднагуруева А.А., Лаврентьева Е.В. Внеклеточная протеазная активность 8.
в природных образцах термальных источников Прибайкалья // Известия Иркутско го госунивер., 2009. Сер. «Науки о Земле». Т. 2. №2. С. 162-166.
Монографии:
Лаврентьева Е.В., Дунаевский Я.Е., Раднагуруева А.А. Внеклеточная про 9.
теолитическая активность гало-алкалофильных бактерий // Солоноватые и соленые озера Забайкалья: гидрохимия, биология, 2009. Изд-во Бурят. госунивер.. С. 157 166.
Тезисы:
10. Лаврентьева Е.В., Раднагуруева А.А., Дунаевский Я.Е. Внеклеточная про теазная активность алкалофильных и алкалотолерантных бактерий содово-соленых озер Забайкалья // Материалы 6 Международной научной конференции «Совре менное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии».
Минск: Изд-во «МикроБио», 2-6 июня 2008. Т. 1. С. 326-328.
11. Лаврентьева Е.В., Раднагуруева А.А. Внеклеточная протеазная активность алкалотолерантных бактерий, выделенных из содово-соленых озер Забайкалья // Материалы 4 молодежной школы-конференции с международным участием «Ак туальные аспекты современной микробиологии». Москва: Изд-во ООО «МАКС Пресс», 20-22 октября 2008. С. 29-30.
12. Раднагуруева А.А., Лаврентьева Е.В. Внеклеточная протеазная активность в природных образцах термальных источников Прибайкалья // Материалы Всерос сийского симпозиума с международным участием «Современные проблемы фи зиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов». Москва: Изд-во ООО «МАКС Пресс», 24-27 декабря 2009. С. 156.
13. Lavrentieva E.V., Radnagurueva A.A., Namsaraev B.B Characteristics of pro teolitic bacteria from hydrothermal vent of Tsenkher (Central Mongolia) // 1 Internation al conference “Survey of Mongolian aquatic ecosystems in a changing climate: Results, new approaches and future outlook”. Ulaanbaatar. Mongolia, 7-10 april 2010. Р. 21.
14. Раднагуруева А.А., Лаврентьева Е.В. Биохимическая характеристика культуры Se-1-10, выделенной из термального источника Сея // Материалы всерос сийской конференции с международным участием «Современные проблемы мик робиологии Центральной Азии». Улан-Удэ: Изд-во Бурят. госунивер., 27-28 мая 2010. С. 153.
15. Раднагуруева А.А., Лаврентьева Е.В., Намсараев Б.Б. Внеклеточная про теазная активность микроорганизмов гидротерм Байкальской рифтовой зоны // Материалы 17 Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». Москва: Изд-во ООО «МАКС Пресс», 12-15 апреля 2010. С.
167.
16. Раднагуруева А.А., Лаврентьева Е.В., Намсараев Б.Б. Протеазная актив ность культуры Bacillus sp., выделенной из термального источника Сея (Северное Прибайкалье) // Актуальные аспекты современной микробиологии: материалы VI молодежной школы-конференции с международным участием. Москва: Изд-во ООО «МАКС Пресс», 2010. С. 56-58.
17. Лаврентьева Е.В., Раднагуруева А.А., Дунаевский Я.Е. Гидролитическая активность микроорганизмов горячих источников Байкальской рифтовой зоны // Материалы международной конференции «Экология и геохимическая деятель ность микроорганизмов экстремальных местообитаний». Улан-Удэ и Улан-Батор:
Изд-во Бурят. госунивер., 5-16 сентября 2011. С. 118-119.
18. Раднагуруева А.А., Лаврентьева Е.В. Алкалотермофильные бактерии из горячих источников Байкальской рифтовой зоны // Материалы международной конференции «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстре мальных местообитаний». Улан-Удэ и Улан-Батор: Изд-во Бурят. госунивер., 5- сентября 2011. С. 152-153.