Функциональное состояние саркоплазматического ретикулума кардиомиоцитов на фоне действия амиодарона и нибентана
На правах рукописи
ЛУКАВСКАЯ ИРИНА АНАТОЛЬЕВНА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА КАРДИОМИОЦИТОВ НА ФОНЕ ДЕЙСТВИЯ АМИОДАРОНА И НИБЕНТАНА 03.00.13 - физиология 14.00.06 - кардиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Томск – 2003
Работа выполнена в Сибирском государственном медицинском университете и НИИ кардиологии Томского научного центра СО РАМН Научные руководители академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Медведев Михаил Андреевич доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Афанасьев Сергей Александрович
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Баскаков Михаил Борисович доктор медицинских наук Максимов Иван Вадимович Ведущая организация НИИ физиологии СО РАМН (г. Новосибирск)
Защита состоится «_» 2003 г. в _ часов на заседании диссерта ционного совета Д 208.096.01 при Сибирском государственном медицинском университете по адресу: 634050, г. Томск, Московский тракт, 2.
С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке Сибир ского государственного медицинского университета (634050, г. Томск, пр. Лени на, 107).
Автореферат разослан « » 2003 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Бражникова Н.А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Изменения, протекающие в организме на внутри клеточном уровне в результате адаптивных процессов [Мацкевич А.А. с соавт., 1999], могут существенно влиять на кинетику употребляемых больным лекарственных средств, а в ряде случаев приводить к парадоксальным эффектам действия препаратов.
Вышесказанное в полной мере относится и к медикаментозной коррекции нарушений электрической стабильности сердца, тем более, что подавляющее большинство извест ных на сегодня антиаритмических препаратов в определенных условиях могут оказы вать проаритмогенное действие [Кушаковский М. С., с соавт., 1998].
В последние годы возросло внимание кардиологов к разработке и изучению ан тиаритмических препаратов (ААП) III класса, основным механизмом действия которых является ингибирование К+-каналов, приводящее к увеличению длительности потен циалов действия (ПД) в разных отделах сердца [Майков Е.Б. с соавт., 1996;
Богданов К.Ю. с соавт., 1997;
Федоров В.В. с соавт., 2000]. Наряду с высокой эффективностью в лечении угрожающих жизни аритмий, препараты этого класса способствуют снижению смертности от желудочковых нарушений ритма и положительно влияют на выживае мость больных, перенесших инфаркт миокарда [Wichter T et al, 1990;
Katritsis D et al, 1991;
Camm AJ et al, 1992;
Руда М.Я. с соавт, 1995;
Шубик Ю.В. с соавт, 1999].
В тоже время, данные о действии наиболее популярного ААП III класса – амио дарона – на внутриклеточном уровне недостаточны. В единичных исследованиях с амиодароном на эндотелиальных клетках легочной артерии человека показано дозоза висимое увеличение концентрации внутриклеточного Са+2 за счет влияния этого пре парата на плазматическую мембрану клетки [Powis G. et al., 1990]. Имеются также не многочисленные сообщения об ингибирующем действии амиодарона и его метаболита, деэтиламиодарона, на способность саркоплазматического ретикулума (СПР) кардио миоцитов (КМ) крысы и эндоплазматического ретикулума эндотелиальных клеток ле гочной артерии человека аккумулировать Са+2 [Powis G. et al., 1990;
Weinstein L. et al., 1991]. Сведения о механизмах внутриклеточного воздействия отечественного анти аритмического препарата III класса нибентана в отечественной и зарубежной научной литературе отсутствуют.
С представленных позиций исследование физиологических феноменов, проис ходящих на уровне саркоплазматического ретикулума в результате взаимодействия адаптивных процессов в миокарде и используемых в лечении сердечных аритмий фар макологических веществ, представляется важным шагом в решении проблемы эффек тивной терапевтической помощи кардиологическим больным, страдающим наруше ниями сердечного ритма.
Цель работы: Изучить функциональное состояние саркоплазматического рети кулума клеток здорового и патологически измененного миокарда на фоне действия ан тиаритмических препаратов III класса амиодарона и нибентана.
Задачи исследования 1. Исследовать функциональное состояние СПР КМ при обработке интактного мио карда крысы антиаритмическими препаратами III класса амиодароном и нибентаном.
2. Изучить роль СПР КМ в поддержании внутриклеточного гомеостаза ионов кальция на фоне действия амиодарона.
3. Провести сравнительное исследование влияния блокатора К+-каналов тетраэтилам мония хлорида и антиаритмических препаратов амиодарона и нибентана на функцио нальное состояние СПР кардиомиоцитов.
4. Исследовать особенности инотропной функции изолированного миокарда больных ИБС на фоне действия амиодарона.
Научная новизна. С использованием электрофизиологических методов впервые дана оценка функционального состояния СПР КМ интактного миокарда крысы на фоне ААП III класса амиодарона и нибентана. Обнаружено усиление способности СПР КМ «удерживать» ионы кальция в результате действия амиодарона и нибентана.
Впервые на изолированном перфузируемом миокарде больных ИБС выявлено два типа реакций мышечных полосок на ритмоинотропные воздействия. Показано, что адаптивные изменения функционального состояния СПР КМ при хронической коро нарной недостаточности оказывают влияние на эффекты амиодарона.
Практическая значимость. В результате проведенного исследования получены сведения, расширяющие понимание механизмов действия антиаритмических препара тов III класса амиодарона и нибентана. Полученные данные позволят лучше представ лять процессы, происходящие на субклеточном уровне в миокарде больных ИБС под влиянием лекарственных препаратов. Выявленная в работе связь эффектов амиодарона с реализацией адаптивных механизмов в СПР КМ способствует назначению адекват ной антиаритмической терапии больным с хронической коронарной недостаточностью.
Апробация диссертации. Основные положения и результаты научных исследо ваний были доложены на II-ом конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, СГМУ, 2001);
на V-ой ежегодной сессии Научного центра сердечно сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН (Москва, НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН, 2001);
на школе по интервенционной аритмологии (Томск, НИИК РАМН, 2001);
на IV-ом съезде физиологов Сибири с международным участием (Новосибирск, НИИФ СО РАМН, 2002).
Публикации. По результатам проведенного исследования опубликовано 10 ра бот в центральной (4) и местной печати (6).
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 123 страницах машино писного текста и состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных наблюдений, обсуждение полученных результатов), заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована рисунками и 19 таблицами. Библиографический указатель включает 180 источников, из них 56 отечественных и 124 иностранных.
Основные положения, выносимые на защиту:
Влияние амиодарона и нибентана на функцию СПР КМ проявляется в увеличе нии Са+2-аккумулирующей способности саркоплазматического ретикулума и не зави сит от локализации кардиомиоцитов и используемой частоты регулярных стимулов.
Адаптивные изменения, происходящие в организме на уровне саркоплазматиче ского ретикулума в результате протекающих в миокарде больных ИБС патологических процессов, существенно влияют на проявление эффектов антиаритмических препара тов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Первую часть исследования проводили на 145 мышечных препаратах (предсер дия и папиллярные мышцы левого желудочка), полученных из сердец здоровых крыс самцов линии Вистар массой 200-250 г. Вторую часть работы выполняли на 29 мышеч ных полосках, выделенных из ушка правого предсердия больных с диагнозом хрониче ская коронарная недостаточность, стенокардия напряжения III-IV класса по NYHA, с мультисосудистым поражением коронарных артерий. Средний возраст пациентов со ставлял 50,6±2,4 лет. Все пациенты обследованы и прооперированны в отделе сердеч но-сосудистой хирургии НИИ кардиологии ТНЦ СО РАМН, руководимом профессо ром В.М. Шипулиным.
В эксперименте использовали мышечные препараты с параллельным ходом мы шечных волокон, имеющие длину 4-5 мм и поперечное сечение не более 1 мм, способ ные развивать к концу 60-й минуты адаптационного периода усилие не менее 1/2 ка либровочного сигнала, равного 1В.
Перфузию мышечных препаратов осуществляли при температуре 36±0,50С фи зиологическим раствором Кребса-Хейзелайта следующего состава (в мМ): NaCl – 120;
KCl – 4,8;
CaCl2 – 2,0;
MgSO4 – 1,2;
KH2PO4 – 1,2;
NaHCO3 – 20,0;
глюкоза – 10,0 (ХЧ или ЧДА). Для оксигенации раствора использовали газовую смесь – карбоген (О2 – 95%, СО2 – 5%). Стимуляцию мышц проводили электрическими импульсами прямо угольной формы длительностью 5 мс, подаваемыми на два массивных серебряных электрода, размещенных в перфузионной камере. Базовая частота стимулирующих им пульсов составляла 0,5 Гц.
После адаптации мышц к режиму перфузии, проводили регистрацию их исход ной реакции на тестовые электрические импульсы. Следующие 15 мин мышцы перфу зировались физиологическим раствором, содержащим биологически активное вещест во, после чего воздействие тестовых электрических импульсов повторяли.
Исследуемые биологически активные вещества:
Амиодарон – фирмы «Sanofi Phama» (Франция) - 1 мкМ/л.
Нибентан – экспериментальное производство медико-биологических препаратов Рос сийского кардиологического научно-производственного комплекса (г. Москва) - в кон центрациях 2,5 и 25 мкМ/л.
Тетраэтиламмония хлорид (ТЭА) – блокатор К+-каналов клеточной мембраны - про изводства «Реахим» - 6 мкМ/л.
Кофеин – фирмы «Sigma» (США) - 2,6 мМ/л.
Сократительную функцию мышечных препаратов оценивали по изменениям кривой развиваемого мышцей напряжения. Определяли следующие показатели: макси мально развиваемое напряжение – Tmax;
максимальную скорость повышения напря жения – +dT/dt;
максимальную скорость понижения напряжения – -dT/dt, длитель ность одиночного сокращения – t.
Моделирование ритмоинотропных эффектов Стационарная связь интервал-сила (СИС). Стационарную связь интервал сила определяли как зависимость между частотой стимулирующего сигнала и соответ ствующей амплитудой регулярных сокращений [Мархасин В.С. с соавт., 1987;
Соловь ева О.Э. с соавт., 1999].
Внеочередное (экстрасистолическое) воздействие. Одиночный внеочередной стимул наносили на фоне базовой стимуляции. Внеочередной электрический стимул имел те же характеристики, что и импульсы базовой стимуляции [Marengo F.D. et. al., 1999]. Экстрасистолический (ЭС) интервал, время от начала регулярного импульса до начала внеочередного импульса, изменяли от 0,2 с до 1,5 с. Строили зависимость ам плитуды внеочередного сокращения от ЭС интервала. Из полученной зависимости ин тервал-сила вычисляли t1(T50) – ЭС интервал, соответствующий внеочередному сокра щению с амплитудой, равной половине амплитуды регулярного сокращения. Коэффи циент t1(T50) использовали для оценки времени транспортировки ионов кальция внутри СПР кардиомиоцитов от мест захвата к местам выброса [Yue DT et al, 1985;
Wu S.N. et.
al., 1996] и реактивации Са2+-каналов [Wu S.N. et. al., 1996;
Ravens U et al, 1996].
Постэкстрасистолическую (ПЭС) потенциацию определяли как превышение постэкстрасистолического сокращения над регулярным [Мархасин В.С. с соавт., 1987;
Marengo F.D. et al., 1999].
Потенциацию покоем (POST-REST) получали в ответ на возобновление сти муляции после периода покоя. Продолжительность периода покоя изменяли в интерва ле от 2 до 60 с. Кривую механической реституции получали как зависимость между длительностью интервала покоя и амплитудой первого после периода покоя сокраще ния к базовому сокращению [Wu S.N. et al., 1996;
Ravens U. et al., 2000].
Из полученной реституционной кривой вычисляли t2(T50) - время покоя, соответ ствующее первому после периода покоя сокращению с приростом амплитуды, состав ляющим 50% от максимального прироста. Коэффициент t2(T50) использовали для оцен ки скорости захвата Са2+ СПР КМ [He H. et al., 1997].
Расчет фракции рециркуляции внутриклеточного Са2+ производили, используя коэффициент спада силы сокращений, потенцированных интервалом покоя 60 с [Wu S.N. et al., 1996;
Ravens U. et al., 1996]. Для этого по оси ординат откладывали величину амплитуды n-го сокращения, а по оси абсцисс - n+1-го. Угол наклона полученной таким образом линейной регрессии представлял собой коэффициент спада силы сокращений.
Данные обрабатывали на персональном компьютере с использованием пакета прикладных программ STATISTICA 5.0. Достоверность различий в выборках оценива ли, используя непараметрические методы (Вилкоксона и Манна-Уитни).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Полученное в наших экспериментах уменьшение амплитуды сокращения здоро вого миокарда крысы и патологического миокарда человека на фоне действия амиода рона (рис. 1) согласуется с наличием слабого отрицательного инотропного эффекта у группы ААП III класса [Машковский М.Д., 1998]. Подобный эффект может являться следствием уменьшения пула Са+2 в миоплазме КМ во время сокращения в результате угнетающего воздействия препарата на Са2+-каналы L-типа клеточной мембраны [Ка верина Н.В.,1994;
Kodama I. et. al., 1997, 1999].
Нибентан не обладает способностью ингибировать медленный Са+2-ток и тем самым уменьшать количество входящего в клетку Са2+. Основным механизмом дейст вия нибентана является угнетение выходящего К+-тока замедленного выпрямления и увеличение продолжительности ПД различных отделов сердца за счет избирательного удлинения 2 и 3 фаз реполяризации [Богданов К.Ю. с соавт., 1997;
Федоров В.В., 2000].
Кроме того, в литературе описано влияние нибентана на К+-ток замедленного выпрям ления, зависимое от дозы используемого препарата. Согласно данным, полученным Богдановым К.Ю. с соавт. (1997) на изолированных кардиомиоцитах крысы, увеличе ние концентрации нибентана в 10 раз вызывало усиление его ингибирующего влияния на К+-ток почти в два раза. Удлинение фазы реполяризации должно способствовать увеличению количества Са2+, входящего через Са+2-каналы сарколеммы и возрастанию амплитуды регулярных сокращений [Earm YE et al, 1994;
Matsuhsita T et al, 2000], что мы и наблюдали в экспериментах с ТЭА, при действии которого прирост амплитуды регулярных сокращений составлял в среднем 32,2±11,68%. Однако в наших экспери ментах зависимость влияния нибентана на амплитуду сокращения сердечной мышцы от используемой концентрации этого препарата не обнаружена (рис. 1). Следовательно, можно предположить, что снижение амплитуды регулярных сокращений на фоне дей ствия нибентана в концентрации 25 мкМ/л не является результатом его ингибирующе го влияния на величину выходящего К+-тока мембраны кардиомиоцитов крысы.
Наблюдаемое нами значительное ослабление силы мышечного сокращения мио карда крысы на фоне действия кофеина (рис. 1) связано с ингибированием захвата Са2+ из миоплазмы в СПР [Weber A. et al., 1968;
De Mello W.C, 1977] и увеличением утечки % ** ** 100 * * * * * ** * * * * 90 ** ** ** * ** ** ** ** 3 3 3 3 3 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 2 1 1 1 1 1 1 1 13 1 1 1 1 1 III 1 3 5 I7 9 11 13 15 17 19 II 21 23 25 27 29 31 33 35 37 - Нибентан 2,5 мкМ/л - Нибентан 25 мкМ/л - Амиодарон - Амиодарон на фоне эффекта кофеина - Кофеин Рисунок 1. Влияние биологически активных веществ на параметры цикла сокращение-расслабление сердечной мышцы.
По оси ординат – параметры сокращения в %. I – амплитуда сокращения, II – максимальная скорость повышения напряжения, III – максимальная скорость понижения напряжения. 1 – папиллярная мышца крысы, 2 – миокард предсердия крысы, 3 – мио кард больных ИБС. * - достоверность различий р0,05;
** - р0,01.
Са2+ из СПР между сокращениями [Шевчук В.Г. с соавт., 1994;
Капелько В.И., 2000].
Эти механизмы направлены, в конечном итоге, на уменьшение вклада Са2+, депониро ванного в СПР КМ в сокращение. Поскольку в сердечной мышце крысы сокращение в значительной мере зависит от Са2+, выбрасываемого из СПР КМ [Fabiato A, 1982], снижение функциональной способности СПР, связанной с аккумуляцией Са2+, является причиной ослабления мышечной контрактильности на фоне действия кофеина.
При ступенчатом изменении частоты стимулирующих импульсов в диапазоне от 0,5 до 4 Гц в условиях контроля происходило снижение амплитуды сокращения папил лярных мышц крысы до 65,1±2,31%, что согласуется с данными других исследовате лей [Орлов Р.С. с соавт., 1971;
Brixius K. et al., 1999]. Наблюдаемая нами негативная амплитудно-частотная характеристика может быть связана с тем, что процесс сокраще ния миокарда крысы обеспечивается главным образом Са2+, поступающим в миоплазму из СПР КМ [Fabiato A, 1982]. В этих условиях, по данным Bers D.M. (1985) и Matsushita T. (2000), с укорочением интервалов между стимулами, время на транспортировку Са2+ от мест его захвата к местам выброса из СПР КМ сокращается, и к моменту очередного сокращения не весь Са2+ достигает терминальных цистерн.
На фоне амиодарона снижение амплитуды сокращения с увеличением частоты стимулирующих импульсов было менее выражено и достигало на частоте 4 Гц 76,8±3,24% (n=14, р0,05). Поскольку известно, что СПР КМ играет значимую роль в проявлении зависимости частота-сила сердечной мышцы крысы [Mill J.G et al., 1994], влияние ААП, ведущее к увеличению значений амплитуды сокращения по сравнению с контролем, возможно, связано с воздействием амиодарона на функциональное состоя ние СПР КМ.
Влияние нибентана в концентрации 25 мкМ/л на амплитудно-частотную харак теристику (65,5±3,84% на частоте стимуляции 4 Гц, n=12) не имело достоверного раз личия с контролем.
Работа систем, ответственных за поддержание гомеостаза Са2+ внутри КМ, оце нивалась нами по результатам воздействия на мышечные полоски внеочередными (экс трасистолическими) стимулирующими импульсами. Как видно из таб. 1, с увеличением продолжительности интервала между регулярным и ЭС сигналами возрастает ампли туда ЭС сокращения. Механизм этого явления принято связывать с тем, что ЭС стиму лирующий импульс, в зависимости от ЭС интервала, приходится на разные фазы ПД кардиомиоцитов. В этой связи можно высказать предположение, что БАВ, оказываю щие свое воздействие на структуру трансмембранного ПД и влияющие тем самым на процесс электромеханического сопряжения, будут изменять инотропное проявление ЭС воздействия. Действительно, в проведенных нами экспериментах обработка папил лярных мышц крысы амиодароном снижала амплитуду ЭС сокращения по сравнению с контролем (таб. 1).
Таблица 1. Влияние биологически активных веществ на амплитуду экстрасистоличе ского сокращения папиллярной мышцы крысы (M±m).
Серии Время экстрасистолического интервала, секунды экспери- n 0,225 0,25 0,5 0,75 1 1,25 1, ментов Контроль 57 31,3±1,9 43,8±1,5 60,4±1,1 66,8±1,0 71,8±0,9 74,1±0,9 75,4±1, Амиодарон 12 25,6±1,9 36,1±1,6* 54,2±0,9** 61,6±0,9* 67,1±1,0* 70,5±1,0* 72,6±0, Кофеин 16 54,9±7,6* 58,9±6,3** 72,2±4,5** 79,7±3,2** 84,0±2,9** 85,5±2,4** 87,0±2,6** Амиодарон на фоне 16 52,1±7,6* 60,4±6,8** 70,0±4,7* 79,8±4,7 84,7±4,4 88,1±4,6* 87,7±4, кофеина Нибентан 28 31,0±1,2 35,7±1,7* 52,4±1,6* 59,6±1,8 64,7±1,7* 68,1±1,7* 71,4±1,9* 2,5 мкМ/л Нибентан 28 31,1±1,0 32,8±1,4** 48,7±1,7** 54,7±1,4** 60,6±1,6** 63,3±1,5** 65,2±1,3** 25 мкМ/л 10 – – ТЭА 49,9±3,4 64,3±3,2 69,5±3,3 72,5±3,1 72,9±3, Примечание. Все величины выражены в процентном отношении к соответствующим параметрам регулярного цикла. * – р0,05 достоверность различия с контролем, ** – р0,01.
Показано, что транспорт Са2+ внутри СПР КМ от мест захвата к местам выброса [Yue DT et al, 1985;
Wu S.N. et. al., 1996] и время реактивации Са2+-каналов [Wier WG et al, 1986;
Ravens U et al, 1996] оцениваются с помощью коэффициента t1(T50). Поскольку в наших экспериментах с амиодароном значение t1(T50) достоверно увеличивалась с 0,42±0,022с до 0,50±0,023с, можно высказать предположение о влиянии исследуемого ААП на один или оба эти механизма.
В наших экспериментах, проведенных на папиллярных мышцах крысы, действие нибентана на амплитуду ЭС сокращения носило дозозависимый характер (таб. 1). Со ответственно, изменение величины t1(T50) в опытах с нибентаном тоже зависело от концентрации препарата в перфузионном растворе.
В опытах с кофеином уменьшение захвата Са2+ в СПР КМ и увеличением утечки Са2+ из СПР между сокращениями привело к возрастанию зависимости процесса со кращения от входящего из экстрацелюллярного пространства Са2+. В результате этого, амплитуда ЭС сокращения на фоне действия кофеина стала в процентном отношении значительно больше, чем в контроле (таб. 1). Следует заметить, что добавление амио дарона в перфузионный раствор на фоне развившегося эффекта кофеина не оказало влияния на величину ЭС ответа папиллярной мышцы крысы (таб. 1). Поскольку из вестно, что кофеин не оказывает влияния на структуру трансмембранного ПД клеток миокарда [Машковский М.Д., 1989], объяснением наблюдаемому явлению может слу жить разнонаправленное с кофеином воздействие амиодарона на функциональное со стояние СПР КМ.
В экспериментах, проведенных с блокатором К+-каналов - ТЭА, обнаружено от сутствие инотропной реакции папиллярной мышцы крысы в ответ на ЭС воздействие, нанесенное через 0,2 с и 0,225 с от начала очередного стимула. Данный факт может быть связан с попаданием ЭС импульса в фазу абсолютной рефрактерности ПД клеток сердца крысы в результате действия ТЭА на К+-токи реполяризации. Однако на осталь ных ЭС интервалах амплитуда внеочередного сокращения на фоне ТЭА не имела су щественных отличий от контрольных значений (таб. 1). Из этого можно предположить, что влияние БАВ на К+-токи клеточной мембраны не является причиной снижения ам плитуды ЭС сокращений миокарда крысы.
В опытах на папиллярных мышцах крысы изменение частоты регулярных им пульсов с 0,5 Гц на 0,1 Гц вызвало снижение (в процентном отношении) амплитуд ЭС сокращений на соответствующих ЭС интервалах в среднем на 3,5%. Данный факт сви детельствует о влиянии частоты стимуляции на продолжительность ПД в результате уменьшения времени между стимулами [Орлов Р.С. с соавт., 1971] и попадании ЭС импульса в фазу меньшей возбудимости миокарда. Следует заметить, что оказываемое негативное действие амиодарона на амплитуду ЭС сокращения не зависело от частоты регулярных стимулов. Полученные нами в экспериментах на миокарде предсердия крысы данные позволяют сделать вывод о независимости этого влияния и от локализа ции кардиомиоцитов.
В качестве инструмента, позволяющего исследовать изменения функционально го состояния СПР, используется ПЭС тест [Urthaler F et al, 1988;
Vassallo DV et al, 1995]. При этом эффект ПЭС потенциации инотропного ответа сердечной мышцы свя зывается с поступлением в миоплазму дополнительного Са2+ из внеклеточного про странства во время ПД внеочередного сокращения [Marengo F.D. et. al., 1999]. Вошед ший в кардиомиоцит Са2+ депонируется в СПР, что увеличивает вклад СПР в первом после экстрасистолы цикле сокращение-расслабление (таб. 2). Считается [Mill J.G. et al, 1994;
Marengo F.D. et. al., 1999], что эффект ПЭС потенциации отражает способность СПР КМ аккумулировать дополнительное количество Са2+.
Данные, полученные нами в экспериментах на папиллярных мышцах крысы, об работанных ТЭА, подтверждают это положение. Действительно, в опытах с ТЭА вне очередные импульсы через 0,2 с и 0,225 с от начала регулярного сокращения не спо собствовали появлению внеочередного потенциала действия, вход дополнительного количества Са2+ из внеклеточного пространства не осуществлялся и эффект ПЭС по тенциации отсутствовал (таб. 2). Максимальная величина ПЭС потенциации в кон трольных экспериментах соответствовала ЭС интервалам 0,2 с и 0,225 с.
Усиление ПЭС потенциации после обработки папиллярных мышц крысы амио дароном демонстрирует наличие дополнительного количества Са2+, запасенного в СПР по сравнению с контролем (таб. 2), и может быть обусловлено увеличением способно сти СПР КМ аккумулировать ионы кальция в результате действия амиодарона.
Таблица 2. Влияние биологически активных веществ на амплитуду постэкстрасисто лического сокращения папиллярной мышцы крысы (M±m).
Серии Время экстрасистолического интервала, секунды экспери- n 0,2 0,225 0,25 0,5 0,75 ментов Контроль 45 123,3±1,6 123,8±1,5 115,3±1,2 103,7±0,8 98,9±0,8 96,2±0, Амиодарон 12 136,0±1,5** 135,7±2,6** 119,6±2,0 106,3±1,0 100,4±0,8 96,9±1, Кофеин 16 115,1±3,9 111,6±3,4** 107,1±2,3** 102,2±1,2 101,5±1,4 102,8±1,1* Амиодарон на фоне 16 119,8±5,4 120,3±6,0 112,4±4,3* 106,6±2,0 105,2±1,3 102,0±1, кофеина Нибентан 131,0±2,8** 133,5±2,6** 119,7±1,7** 104,1±1,1* 97,4±0,9 93,7±1, 2,5 мкМ/л Нибентан 133,2±2,8** 135,3±3,1** 121,0±2,0** 103,6±1,2 96,2±1,2 92,3±1, 25 мкМ/л 10 98,2±1,8** 100,2±2,2** 106,4±3,4* 105,0±2,9 104,8±3,7 99,4±2, ТЭА Примечание. Все величины выражены в процентном отношении к соответст вующим параметрам регулярного цикла. * – р0,05 достоверность различия с контро лем, ** – р0,01.
В наших экспериментах с нибентаном, проведенных на папиллярных мышцах крысы, также наблюдалось характерное увеличение амплитуды ПЭС сокращения (таб.
2). Следует заметить, что влияние нибентана на величину потенциации ПЭС сокраще ния не имело существенной зависимости от концентрации ААП в перфузионном рас творе. Более того, полученные в опыте с нибентаном данные сопоставимы с данными экспериментов с амиодароном, что может свидетельствовать о достижении порога на сыщения СПР КМ под действием используемых нами доз амиодарона и нибентана.
Добавление кофеина в перфузионный раствор уменьшало вклад СПР КМ в ПЭС сокращение папиллярных мышц крысы, что связано с нарушением процесса аккумуля ции Са2+ СПР в результате действия кофеина [De Mello WC, 1977;
Marengo F.D. et. al., 1999]. Однако, последующая обработка мышечных препаратов амиодароном вела к восстановлению эффекта ПЭС потенциации практически до исходных величин (таб. 2), нормализуя функциональное состояние СПР КМ.
Исследование влияния частоты регулярных стимулов на проявление эффекта ПЭС потенциации папиллярных мышц крысы выявило зависимость амплитуды ПЭС сокращения от используемой частоты стимуляции (115,6±1,7%;
123,3±1,6% и 177,1±10,9%;
0,1Гц, 05,Гц и 1,0 Гц, соответственно;
р0,05;
ЭС интервал 0,2 с). Данное явление связано с тем, что уменьшение интервала между регулярными сокращениями является причиной увеличения стационарных концентраций ионов натрия во внутри клеточном матриксе и, снижая трансмембранный градиент Na+, переводит равновесный потенциал Na+/Сa2+–обменника на более негативный уровень [Shattok MJ et al, 1989].
Это может ингибировать выход Сa2+ и/или способствовать входу дополнительного Сa2+ через обменник в течение периода покоя и вести к увеличению количества Са2+ в СПР КМ [Matsushita T et al, 2000].
Согласно полученным нами результатам, эффект ПЭС потенциации на миокарде предсердия крысы был значительно менее выражен по сравнению с миокардом желу дочка (106,5±1,0% и 123,8±1,5%, предсердие и желудочек, соответственно;
р0,01;
ЭС интервал 0,225 с). Данный факт может свидетельствовать о более низком функцио нальном резерве СПР КМ в связи с большей зависимостью сокращения миокарда пред сердия крысы от рециркулирующей составляющей пула Са2+ СПР по сравнению с мио кардом желудочка [Bers D.M. 1991;
Agata, N. et al, 1994], либо является следствием технической невозможности инициировать дополнительный приток Са2+ через сарко лемму в ответ на используемые в наших экспериментах внеочередные импульсы из-за укороченных ПД в предсердиях крысы [Korecky B. et al, 1974;
Asgrimsson H. et al, 1995].
В экспериментах, проведенных нами на миокарде предсердия больных ИБС, ам плитуды ПЭС сокращений (ЭС интервал 0,25 с) в контроле 105,9±2,2% и на фоне амиодарона 123,9±3,6% имели достоверные различия (n=14;
р0,05), что подтверждает наше предположение о влиянии амиодарона на функциональное состояние СПР КМ.
Считается [Mill J.G. et al, 1994;
Wu S.N. et. al., 1996], что инотропный ответ мы шечных полосок на возобновление электрической стимуляции после периода покоя ха рактеризует способность СПР КМ накапливать и удерживать ионы кальция. Наблю даемый феномен прироста амплитуды в ответ на возобновление стимуляции связывают с тем, что период покоя способствует притоку дополнительного количества ионов кальция из саркоплазмы в СПР КМ и увеличению уровня свободного Са2+ в терми нальных цистернах [Соловьева О.Э. с соавт., 1999]. Кроме того, увеличение периода покоя обеспечивает время, необходимое для перемещения Са2+ от мест захвата к мес там его выброса из СПР и возрастанию пула Са2+ в терминальных цистернах, высвобо ждающемуся во время первого после периода покоя сокращения [Bers DM, 1985;
Mat sushita T et al, 2000]. Поскольку для реактивации Са2+-каналов СПР КМ требуется вре мя, увеличение продолжительности интервала покоя может способствовать возраста нию активированных Са2+-каналов клеточной мембраны и мембраны СПР, обеспечивая большее количество Са2+, входящего в цитозоль из терминальных цистерн СПР и вне клеточного пространства [Bers DM, 1991].
В экспериментах, проведенных нами на папиллярных мышцах крыс, амплитуда первого после периода покоя сокращения превышала базовый уровень амплитуды не зависимо от длительности используемых интервалов покоя. При этом с увеличением длительности периода покоя величина потенциации росла, а скорость прироста ампли туды снижалась (рис. 2), что может свидетельствовать о достижении порога насыщения СПР КМ ионами кальция.
% Контроль ** 250 ** Амиодарон ** 210 ** ** Кофеин ** 170 ** ** Амиодарон на фоне 130 ** * * * * * ** * кофеина * * ** * ** ** ** ** ** t, сек 0 10 20 30 40 50 60 Рис. 2. Влияние БАВ на кривые механической реституции папиллярной мышцы крысы.
По оси абсцисс – длительность интервала покоя, по оси ординат – амплитуда сокра щения, выраженная в процентах к базовой амплитуде. * - достоверность различия с контролем р0,05;
** - р0,01.
В наших исследованиях перфузия мышечных полосок амиодароном вызвала усиление эффекта потенциации на всем диапазоне используемых интервалов покоя и увеличение порога насыщения СПР КМ ионами кальция (рис. 2). Однако время t2(Т50), отражающее скорость захвата ионов кальция ретикулумом в период между сокраще ниями [Shattok MJ et al, 1989;
Matsushita T et al, 2000], в контроле и на фоне амиодарона достоверно не различалось (11,56±0,637 с и 10,87±0,761 с, соответственно). Кроме того, не изменилась рециркулирующаяся фракция внутриклеточного Са2+. Полученные дан ные свидетельствуют, что как в контроле, так и после обработки мышц амиодароном до 62% Са2+ из миоплазмы ресеквестируется обратно в СПР КМ, а 38% - выбрасывается во внеклеточное пространство Na+/Ca2+-обменником.
Описанные факты позволяют предположить, что амиодарон способствует более эффективному «удержанию» Са2+ в СПР КМ и не оказывает существенного влияния на способность СПР захватывать Са2+ из миоплазмы. Подтверждением этому может слу жить изменение динамики кривой механической реституции миокарда крысы, полу ченной для кофеина до и после добавления амиодарона (рис. 2). Обработка мышц ко феином снижала амплитуду потенцируемых сокращений, уменьшая наклон восходя щей части реституционной кривой, и способствовала появлению нисходящего участка кривой на длительных интервалах покоя. Объяснение наблюдаемого феномена может заключаться в ингибировании захвата Са2+ транспортными системами СПР КМ [Fucks F., 1969;
De Mello W.C, 1977] и усилении процесса высвобождения ионов кальция из терминальных цистерн СПР во время периода покоя [Weber A. et al., 1968;
Капелько В.И., 2000], а в итоге - уменьшении вклада СПР КМ в процесс сокращения. Исчезнове ние нисходящей части кривой реституции на длительных интервалах покоя (рис. 2) при добавлении амиодарона в перфузионный раствор на фоне действия кофеина свидетель ствует об устранении преобладания тока утечки Са2+ из СПР КМ над его дополнитель ным поступлением в СПР из миоплазмы.
Увеличение частоты регулярных сокращений, как указывалось выше, служит причиной роста концентрации Са2+ во внутриклеточном матриксе [Matsushita T et al, 2000]. Данные, полученные в результате проведенного нами исследования, подтвер ждают это предположение. Так, кривая механической реституции папиллярной мышцы крысы, полученная нами на частоте стимуляции 1,0 Гц, имела более высокие значения на соответствующих интервалах покоя по сравнению с реституционной кривой на час тоте 0,5 Гц. Несмотря на то, что при изменении стационарной частоты стимуляции в контрольных условиях с 0,5 Гц на 1,0 Гц произошло уменьшение амплитуды регуляр ных сокращений на 24,9±1,80%, величина потенциации после 60-и секундного интер вала покоя увеличилась более чем на 90%. Данный факт свидетельствует о возможно сти увеличения порога насыщения СПР КМ вследствие действия внутриклеточных го меостатических механизмов, регулирующих буферные способности СПР КМ и реали зующихся в результате изменения стационарных ионных концентраций внутри клетки [Орлов Р.С. с соав., 1971]. Помимо увеличения функционального резерва СПР КМ, с ростом частоты стимуляции уменьшилось время t2(Т50) с 11,56±0,637 с до 7,79±0,570 с, что также может служить объяснением возросшего вклада СПР КМ в первое после пе риода покоя сокращение.
Согласно полученным нами результатам, добавление амиодарона и нибентана в перфузионный раствор увеличивало амплитуду потенцированного покоем сокращения на частоте стимулирующих импульсов 1,0 Гц (243,6±8,4%;
342,1±22,5%;
322,9±17,3% и 434,2±23,6%;
контроль, амиодарон, нибентан 2,5 мкМ/л и нибентан 25 мкМ/л, соответ ственно, р0,05, интервал покоя 30 с). Соответственно, можно высказать предположе ние о том, что амиодарон и нибентан увеличивают буферную способность СПР КМ не зависимо от используемой частоты регулярных сокращений.
Известно, что процесс сокращения предсердного миокарда в большей степени обеспечивается рециркулирующей составляющей пула Са2+ СПР КМ [Bers D.M. 1991;
Matsushita T. et al., 2000], а скорость захвата ионов кальция СПР КМ предсердия выше [Minajeva A et al, 1997]. Следовательно, функциональный резерв СПР КМ предсердия меньше, чем СПР КМ папиллярной мышцы крысы, а достигается он быстрее. Данные экспериментов, полученные нами на предсердиях крысы, согласуются с этими предпо ложениями. Кривая механической реституции миокарда предсердия крысы носит более сглаженный характер, достигая максимального значения потенциации (141,2±8,5%) на интервале покоя 30 секунд. Кроме того, на длительных интервалах покоя процесс утеч ки ионов кальция из везикул СПР и последующее удаление Са2+ из клетки через Na+/Сa2+-обменник преобладает над пополнением запаса Са2+ в ретикулуме, в результа те чего амплитуда сокращения потенцированного 60-и секундным периодом покоя снижалась (137,1±11,0%) по сравнению с 30-и секундным. Поскольку снижение ампли туды первого после периода покоя сокращения, наблюдаемое нами на фоне действия кофеина (99,7±4,1%), устранялось последующим добавлением амиодарона (172,5±48,9%) в перфузионный раствор в опытах на мышечных полосках предсердия крысы, можно высказать предположение о влиянии амиодарона на буферную способ ность СПР КМ, независимом от локализации кардиомиоцитов.
Данные экспериментов, проведенных нами на миокарде больных ИБС, проде монстрировали наличие двух типов реакций мышечных полосок на возобновление стимуляции после кратковременного периода покоя (таб. 3). Первый тип реакции мы шечных полосок характеризовался резким снижением амплитуд первых после периода покоя сокращений, снижаясь до 37,6±5,47% на одноминутном интервале покоя. Для второго типа падение значений амплитуд первых после периода покоя сокращений не было столь значительным (95,01±12,80%). Кроме того, обнаруженные два типа реакций мышечных полосок отличались по влиянию амиодарона на выраженность кривой ме ханической реституции миокарда больных ИБС (таб. 3). В то время как для миокарда предсердия с I-м типом реакции влияние амиодарона на кривую механической рести туции не являлось существенным. Увеличение вклада СПР КМ в первое после периода покоя сокращение на фоне действия амиодарона в опытах на миокарде предсердия со II-м типом реакции могло свидетельствовать об увеличении буферной способности СПР КМ, связанной с уменьшением потерь Са2+ из СПР во время периода покоя. Изме нение чувствительности мышечных препаратов к влиянию амиодарона может быть следствием разницы в протекании адаптивных процессов, происходящих на уровне мембраны СПР КМ в результате органических изменений в сердце больных ИБС [Сазонтова Т.Г. с соавт., 1989, 1994].
Таблица 3. Влияние амиодарона на амплитуду потенцированного покоем сокращения миокарда предсердия человека (M±m).
Серии Т Время интервала покоя, секунды экспе- и n римен 2 4 6 8 10 16 20 30 тов п Кон- 111,9±3,4 103,1±4,3 88,9±3,8 80,0±4,4 74,0±5,4 66,0±6,5 58,9±7,0 52,3±8,3 37,6±5, троль I Амио- 111,3±5,0 105,2±5,5 92,0±5,6 85,3±6,5 79,7±6,6 70,5±6,1 63,2±5,8 51,4±5,8 42,6±5, дарон Кон- 102,2±0,9 96,6±1,5 96,9±3,0 97,9±4,2 97,0±4,9 99,6±6,0 98,8±7,5 101,2±10,1 95,0±12, троль II Амио- 108,7±1,5 113,9±2,5* 118,1±3,6*124,0±4,4*125,7±4,7*133,7±6,3*139,5±7,4* 148,9±9,9* 161,8±14,8* дарон Примечание. * – р0,05 достоверные различия с контролем.
Выводы 1. На изолированном перфузируемом миокарде крысы амиодарон и нибентан усили вают способность саркоплазматического ретикулума кардиомиоцитов аккумулиро вать ионы кальция. Влияние амиодарона и нибентана на функцию СПР не зависит от локализации кардиомиоцитов и частоты стимулирующих импульсов.
2. В условиях функционального ингибирования СПР КМ изолированного миокарда крысы усиление Са+2-аккумулирующей способности саркоплазматического ретику лума на фоне амиодарона связано с «удержанием» ионов кальция в терминальных цистернах СПР кардиомиоцитов.
3. На изолированном миокарде крысы время транспортировки ионов кальция внутри СПР КМ от мест захвата к местам выброса уменьшается на фоне амиодарона и ни бентана и не изменяется под влиянием блокатора К+-каналов тетраэтиламмония хлорида.
4. Изменение функционального состояния саркоплазматического ретикулума кардио миоцитов больных ИБС проявляется в двух типах инотропных реакций в ответ на возобновление стимуляции после периода покоя 60 секунд. Реакция миокарда I-го типа характеризуется резким падением сокращения на 62,4%, снижение амплитуды сокращения миокарда II-го типа составляет в среднем 5,0%.
5. Влияние амиодарона на амплитуду первого после периода покоя сокращения зави сит от функционального состояния саркоплазматического ретикулума кардиомио цитов больных ИБС. У миокарда I-го типа амплитуда сокращения на фоне амиода рона не изменяется. Амплитуда сокращения миокарда II-го типа под влиянием амиодарона увеличивается по сравнению с контролем.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Функциональное состояние саркоплазматического ретикулума кардиомиоцитов крысы на фоне действия амиодарона// Науки о человеке - сборник статей молодых уче ных и специалистов. – Томск, СГМУ. - 2001. – С. 76.
2. Кордарон: механизмы действия// Бюлл. НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН. Москва 13-15 мая 2001, №3, С. 138 (в соавт. с Афанасьевым C.А., Антонченко И.В., Козловым Б.Н., Поповым С.В.).
3. Кордарон – состояние внутриклеточного гомеостаза Са2+ в миокарде предсердий человека при хронической ИБС// Вестник аритмологии. С-Пб. 7-10 февраля 2002, № (А), С. 52 (в соавт. с Афанасьевым C.А., Нарыжной Н.В., Антонченко И.В., Поповым С.В., Ахмедовым Ш.Д., Козловым Б.Н., Шипулиным В.М.).
4. Исследование функционального состояния саркоплазматического ретикулума при обработке миокарда крысы амиодароном// Бюлл. эксперим. биол. и мед. 2002, Т. 133, №3, С. 244-246 (в соавт. с Афанасьевым С.А., Кандинским М.Л., Медведевым М.А.).
5. Исследование влияния антиаритмического препарата III класса нибентана на функ циональное состояние саркоплазматического ретикулума кардиомиоцитов крысы// Науки о человеке - сборник статей молодых ученых и специалистов. Томск, СГМУ. 2002, C. 112-113.
6. Исследование влияния антиаритмических препаратов III класса на внутриклеточ ный гомеостаз ионов кальция кардиомиоцитов крысы// Тезисы докладов IV съезда фи зиологов. Новосибирск 2002, С. 161 (в соавт. с Угдыжековой Д.С., Аубакировой Г.А., Баталовым Р.Е.).
7. Изменение POST-REST потенциации папиллярной мышцы крысы под влиянием амиодарона и нибентана// Тезисы докладов IV съезда физиологов. Новосибирск 2002, С. 286 (в соавт. с Угдыжековой Д.С., Афанасьевым С.А., Аубакировой Г.А., Баталовым Р.Е.).
8. Влияние антиаритмического препарата III класса нибентана на экстрасистолическое и постэкстрасистолическое сокращение папиллярной мышцы крысы// Бюлл. эксперим.
биол. и мед. 2002, Т. 134, №7, С. 20-23 (в соавт. с Афанасьевым С.А., Угдыжековой Д.С., Поповым С.В., Антонченко И.В., Абубакировой Г.О., Медведевым М.А.).
9. К вопросу о механизме антиаритмического и проаритмогенного действия амиода рона при хронической коронарной недостаточности// Progress in Biomedical Research.
2002, Т. 7, Suppl. А, ноябрь, С. 22-26 (в соавт. с Афанасьевым С.А., Антонченко И.В., Поповым С.В., Козловым Б.Н., Шипулиным В.М.).
10. Изменение внутриклеточного гомеостаза Са2+ в миокарде предсердий человека при хронической коронарной недостаточности под воздействием амиодарона// Физио логия человека. 2003, Т.29, № 2, С.62-66 (в соавт. с Афанасьевым С.А., Нарыжной Н.В., Поповым С.В., Антонченко И.В., Ахмедовым Ш.Д., Козловым Б.Н., Шипулиным В.М.).
Список сокращений ААП – антиаритмические препараты БАВ – биологически активные вещества ИБС – ишемическая болезнь сердца КМ – кардиомиоциты ПД – потенциал действия ПЭС – постэкстрасистолический СПР – саркоплазматический ретикулум ТЭА – тетраэтиламмония хлорид ЭС – экстрасистолический