Морфофункциональное состояние тканевых базофилов при сахарном диабете на фоне имплантации островковых клеток поджелудочной железы
На правах рукописи
Чубик Максим Петрович Морфофункциональное состояние тканевых базофилов при сахарном диабете на фоне имплантации островковых клеток поджелудочной железы 03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Томск – 2002
Работа выполнена в Сибирском государственном медицинском университете
Научный консультант:
доктор медицинских наук, профессор Красноженов Е.П.
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Козлов Ю.А.
кандидат медицинских наук Васильев Н.В.
Ведущая организация – Новосибирская государственная медицинская акаде мия
Защита состоится «11» октября 2002 г. в 10 ч. на заседании диссертационного совета Д 208.096.03. в Сибирском государственном медицинском универси тете (634050, г. Томск, Московский тракт, 2)
С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке Сибирского государственного медицинского университета (г.Томск, пр. Ле нина, 107)
Автореферат разослан «9» сентября 2002 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Герасимов А.В.
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. Сахарный диабет (СД) является одной из самых актуальных проблем современного здравоохранения. Количество больных диабетом увеличивается во всех странах. По данным ВОЗ в настоящее время в мире насчитывается более 150 млн. больных [Балаболкин М.И. и соавт., 1999]. Большая социальная значимость СД состоит в том, что он приводит к ранней инвалидизации и летальности, которая чаще всего обусловлена нали чием поздних сосудистых осложнений диабета: микро- и макроангиопатий [Балаболкин М.И., 2000;
Молитвословов А.Б., 1996]. В Российской Федера ции ежегодно выполняются ампутации нижних конечностей по поводу диа бетической гангрены у 3-5 % больных СД [Дедов И.И. и соавт., 1998]. Эта операция, травматичная как для самого больного, так и для его семьи, имеет значительные экономические последствия для общества.
В настоящее время все большее распространение получают трансплан тационные методы лечения СД: трансплантация поджелудочной железы на сосудистых связях и свободная трансплантация панкреатических островков [Шумаков В.И. и соавт., 1998]. Продолжают совершенствоваться методы компенсации диабета I и II типов посредством трансплантации островковой части аллогенной и ксеногенной поджелудочной железы [Shapiro А. е.а., 2000]. Основным результатом трансплантации культур островковых клеток является предотвращение или торможение прогрессирования поздних диабе тических осложнений. [Блюмкин В.Н. и соавт., 1998]. Профилактика и тор можение прогрессирования вторичных диабетических осложнений, дости гаемые с помощью регулярных повторных трансплантаций, могут дать не только медицинский, но и существенный социально-экономический эффект, предотвращая или отодвигая наступление инвалидности у больных диабетом и увеличивая продолжительность их жизни [Шумаков В.И. и соавт., 1998].
В качестве параметра, характеризующего влияние имплантированных островковых клеток на патологический процесс, нами использовалось мор фофункциональное состояние тканевых базофилов (ТБ, тучных клеток), представляющих собой особую функционально-лабильную группу клеток, обнаруживающуюся в коже, тимусе, лимфоидной ткани, матке и в других органах [Проценко В.А. и соавт., 1987;
Томилов Ф.А., 1985;
Blair R.J. е.а., 1997;
Fernex M., 1986]. Важнейшей особенностью этих клеток является большое разнообразие продуктов секреции, что и обуславливает их поли функциональность. Данным об участии ТБ в различных физиологических и патологических процессах, о роли их многочисленных биологически актив ных продуктов посвящено много научных публикаций, обобщенных в обзо рах и монографиях [Адо А.Д., 1980;
Гущин И.С., 1983;
Красноженов Е.П., 1996;
Успенский В.И. и соавт., 1980;
Чернух А.М., 1979;
Dumitrascu D., 1996;
Ponvert C. е.а., 1993]. Показано, что ТБ играют важную роль в регуляции микроциркуляции, трофики тканей, а также в размножении, миграции и функции клеток. Поэтому они рассматриваются как регуляторы тканевого гомеостаза малого радиуса действия [Евтеева М.С. и соавт., 1999;
Королев Ю.Н., 1997;
Юрина Н.А и соавт., 1990] и, в целом как своеобразный индика торы напряженности органа или ткани чутко реагирующий на изменение внутренней среды организма [Проценко В.А. и соавт., 1987].
К настоящему времени еще не до конца разработаны показания к вы полнению имплантации островковых клеток, программы специальной подго товки больных, критерии оценки клинической эффективности и влияния на течение самого диабета, а также на развитие и прогрессирование поздних ос ложнений. Нуждаются в уточнении и вопросы, связанные с повторной транс плантацией, ее сроками и эффективностью [Ахметов А.С., 1998]. В связи с этим всестороннее исследование реализации механизмов трансплантацион ной терапии СД представляет значительный научный и практический инте рес.
Цель исследования.
Изучить морфофункциональное состояние тканевых базофилов при са харном диабете до и после имплантации островковых клеток поджелудочной железы свиньи на носителе из никелида титана.
Задачи исследования.
1. Оценить количественное содержание и морфофункциональный ста тус тканевых базофилов при экспериментальном аллоксановом диабете.
2. Исследовать характер изменения морфофункционального состояния тканевых базофилов при экспериментальном аллоксановом диабете на фоне ксенотрансплантации островковых клеток поджелудочной железы.
3. Определить количественное содержание и морфофункциональное состояние тканевых базофилов у больных с диабетическими ангиопатиями нижних конечностей.
4. Изучить динамику показателей морфофункционального состояния тканевых базофилов у больных с диабетическими ангиопатиями нижних ко нечностей в разные сроки после имплантации им островковых клеток поджелудочной железы свиньи.
5. Провести исследование биохимических и иммунологических показа телей, характеризующих тяжесть течения изучаемой патологии, до и после имплантации островковых клеток.
6. Провести сравнительный анализ показателей количественных, мор фологических, функциональных характеристик тканевых базофилов и пока зателей, отражающих тяжесть течения заболевания у обследованных лиц.
Научная новизна работы.
В результате проведенных исследований:
- впервые, используя комплекс морфофункциональных методов, проведен динамический анализ изменений реакции ТБ на фоне имплантации островко вых клеток поджелудочной железы свиньи пациентам с диабетическими ан гиопатиями нижних конечностей;
- впервые установлены изменения показателей количественных, морфоло гических и функциональных характеристик ТБ после имплантации больным с осложнениями сахарного диабета искусственной поджелудочной железы, выращенной на пористой конструкции из никелида титана и островковой части поджелудочной железы свиньи;
- впервые показаны различия в морфофункциональных характеристиках ТБ в организме здоровых крыс, крыс с экспериментальным аллоксановым диа бетом и диабетических животных после ксенотрансплантации им островко вых клеток.
Практическая значимость.
Результаты исследований доказывают существование выраженных из менений показателей морфофункционального статуса ТБ у лиц с осложне ниями сахарного диабета на фоне пересадки им островковых клеток подже лудочной железы свиньи.
Предложена возможность использования морфологических параметров и функциональных характеристик ТБ как критериев оценки при определении сроков проведения повторной имплантации.
Полученные результаты открывают перспективы целенаправленного воздействия на продолжительность и эффективность трансплантационной терапии диабета путем искусственной регуляции функциональной активно сти ТБ.
Положения, выносимые на защиту.
При экспериментальном аллоксановом диабете морфофункциональное состояние ТБ характеризуется стойким угнетением количественного содер жания, секреторной активности и показателя генеза, сопровождающимся возрастанием значений показателя функциональной активности.
У лиц с осложнениями сахарного диабета (диабетическими ангиопа тиями нижних конечностей) после проведенной им имплантации искусст венной поджелудочной железы ТБ реагируют значительным возрастанием показателей функциональной и секреторной активности, увеличением их численности и количества молодых форм клеток. Реакция ТБ достигает сво его пика к 2 мес после имплантации.
Реакция ТБ сопровождается снижением концентрации глюкозы и воз растанием концентраций С-пептида, антител к инсулину и некоторых показа телей гуморального иммунитета у больных с диабетическими ангиопатиями нижних конечностей на фоне имплантации островковой части ксеногенной поджелудочной железы.
Апробация работы.
Основные положения работы докладывались и обсуждались на научно практической конференции «Актуальные вопросы экспериментальной мор фологии», посвященной 70-летию со дня рождения профессора Рыжова А.И.
(Томск, 1999), научно-практической конференции «Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологиче ских состояниях» (Челябинск, 2000), научно-практической конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической морфологии», по священной 150-летию со дня рождения профессора Догеля А.С. (Томск, 2002), на научных семинарах кафедры микробиологии Сибирского государ ственного медицинского университета (1999-2002).
Объем и структура работы.
Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и со стоит из введения, обзора литературы, характеристики материала и методов исследований, описания результатов и их обсуждения, выводов, списка ис пользованной литературы. Работа иллюстрирована 19 таблицами и 11 рисун ками. Содержит 1 приложение. Список литературы включает 106 отечест венных и 76 зарубежных источников.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ СОБСТВЕННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ Исследования проводились на базе кафедры микробиологии Сибирского государственного медицинского университета, Госпитальной клиники СГМУ и ЦНИЛ СГМУ.
Обследовали 57 больных с осложнениями сахарного диабета типа (диабетические ангиопатии нижних конечностей), в возрасте от 40 до 73 лет.
В том числе 23 мужчины и 34 женщины.
Все обследованные были разделены на группы:
1) больные с осложнениями сахарного диабета до имплантации искусственной поджелудочной железы, выращенной на пористой конструкции из никелида титана и островковой части поджелудочной железы свиньи;
2) пациенты с осложнениями сахарного диабета в разные сроки после имплантации искусственной поджелудочной железы, выращенной на пористой конструкции из никелида титана и островковой части поджелудочной железы свиньи (табл. 1).
В качестве доноров ксеноргана использовали молодых поросят, прошедших тщательную ветеринарную и санитарно-гигиеническую проверку. Свиную поджелудочную железу обрабатывали по методике, разработанной в НИИ трансплантологии и искусственных органов [Шумаков В.И. и соавт., 1995]. Культивированная на подложке из пористого никелида титана островковая часть поджелудочной железы свиньи [Дамбаев Г.Ц. и со авт., 1996;
Шумаков В.И. и соавт., 1995] имплантировалась в прямую мышцу живота с помощью троакара под местной анестезией (Разрешение комитета по новой медицинской технике;
протокол № 11 заседания комиссии по инструментам, приборам, аппаратам и материалам, применяемым в общей хирургии от 23.12.99).
Для решения поставленных задач в рамках данной работы проводилось биохимическое и иммунологическое исследование сыворотки крови. Опре деляли концентрацию глюкозы (глюкозооксидазным методом), С-пептида и антител к инсулину (методом радиоиммунологического анализа), иммуног лобулинов A, G, M (методом радиальной иммунодиффузии в геле по Манчини).
Объектами для исследования служили сыворотка крови и фрагмент кожи с подкожной клетчаткой весом 5-10 г.
Таблица Характеристика групп обследованных по полу и возрасту Группы Количество Возраст, Количество Количество обследованных человек лет мужчин женщин До имплантации 44 40-73 19 1 мес после 12 40-61 5 имплантации 2 мес после 10 42-73 2 имплантации 3-6 мес после 7 41-64 4 имплантации 6-12 мес после 15 48-72 4 имплантации 1-2 года после 3 45-56 1 имплантации Кроме клинических исследований были проведены эксперименты на лабораторных крысах с аллоксановым диабетом. Опыты выполнялись на взрослых беспородных крысах-самцах массой 180-220 г. Для моделирования аллоксанового диабета у животных использовали 4% раствор аллоксангидрата ("Лахема-Хемапол", Чехословакия), который вводили подкожно однократно в дозе 400 мг/кг [Сапрыкина Э.В. и соавт., 1999].
Искусственную поджелудочную железу имплантировали в мышцы живота крыс, которых предварительно усыпляли эфиром. Имплантацию островковых клеток свиньи на носителе из пористого никелида титана проводили спустя 7 сут после введения 4% раствора аллоксангидрата крысам с подтвержденной гипергликемией. Исследуемым материалом являлись кожа, брыжейка, перитонеальная жидкость, периферическая кровь. Материал для исследования забирали на 7, 15, 30, 45, 60 и 90 сут после имплантации островковых клеток (группа из 30 животных), параллельно изучалась группа с аллоксановым диабетом, без имплантации (25 крыс) и группа интактных животных (5 крыс).
Парафиновые срезы кожи и пленочные препараты брыжейки окрашивали 0,1% раствором толуидинового синего. Перитонеальную жидкость - 0,3% раствором нейтрального красного. При проведении количе ственной оценки функциональной активности ТБ кожи также применяли 0,3% раствор нейтрального красного.
Используя гистологические методы, мы изучали морфофункциональ ные характеристики ТБ. Оценивалось количественное содержание, индекс активности (отношение числа дегранулированных клеток к количеству всех интактных) и индекс созревания (отношение количества молодых к числу зрелых форм ТБ), показатель степени дегрануляции ТБ в ответ на стимуля цию активатором секреции пирогеналом.
Статистическую обработку данных проводили с помощью t-критерия Стьюдента и определяли значимость различий (р). Разницу двух сравнивае мых величин (фоновых и контрольных, фоновых и опытных, контрольных и опытных значений) считали достоверной при р0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Результаты проведенного нами исследования продемонстрировали, что ТБ реагируют на диабетическое состояние изменением количественного содержания, морфологических и функциональных признаков. Так, получен ные данные свидетельствуют, что ТБ кожи крыс реагировали на эксперимен тальный аллоксановый диабет уменьшением численности в среднем на 40 60% и незначительным повышением функциональной активности. Результа ты изучения морфофункционального статуса ТБ брыжейки у крыс при вве дении аллоксана показали, что количественное содержание ТБ достоверно уменьшалось в течение всего эксперимента на 35-70%. Показатель функцио нальной активности мезентериальных ТБ в группе экспериментальных диа бетических животных превышал фоновые данные на 5-10% в течение всего опыта. Содержание ТБ перитонеальной жидкости крыс достоверно снижа лось относительно нормы в среднем на 45%.
У диабетических крыс наблюдалось снижение секреторной активности по сравнению с интактными животными в среднем 10% (рис. 1). Максималь ное угнетение показателя дегрануляции ТБ в ответ на стимуляцию пирогена лом выявлено на 30 сут опыта (на 25% ниже исходных значений;
р0,001).
Значения индекса созревания ТБ кожи у крыс с аллоксановым диабетом были существенно снижены относительно нормального уровня (на 35-50%) в тече ние всего опыта. Аналогичная динамика соотношения молодых и зрелых форм ТБ отмечалась при изучении брыжейки и перитонеальной жидкости.
Необходимо отметить, что уже через 7 сут после введения аллоксана у животных развивался отчетливо выраженный СД. Уровень гликемии нато щак в эти сроки составлял 207% (р0,001) от фоновых показателей (рис.1).
Из 55 крыс, использованных в эксперименте с индукцией аллоксанового диа бета, за первые семь суток после введения аллоксана погибло 7 животных и, соответственно, смертность при «недельном СД» составила 13%, что свиде тельствует о серьезности метаболических расстройств при развитии экспе риментального СД. Максимальная концентрация глюкозы в крови аллокса новых крыс наблюдалась на 60 сут от начала эксперимента и составляла 306% (р0,001) относительно уровня глюкозы в крови здоровых животных.
Таким образом, состояние ТБ в группе диабетических крыс характери зовалось стойким угнетением показателей морфофункционального статуса на фоне незначительного повышения функциональной активности в начальные сроки после инъекции аллоксана. Понижение значений, характеризующих тучноклеточную реакцию при экспериментальном СД, сопровождалось вы раженной гипергликемией (рис.1).
Вероятно такая картина морфофункционального состояние ТБ в значи тельной степени опосредуется дефицитом инсулина в организме эксперимен тальных животных, индуцированном применением аллоксана, вызывающем резкое подавление функции инсулярной системы.
% # # # # # 250 # # # # фон # # # процент дегрануляции тканевых базофилов концентрация глюкозы 0 7 15 30 45 60 Сроки исследования, сут Рис.1. Динамика секреторной активности тканевых базофилов в перитонеальной жидкости и концентрации глюкозы в крови при экспериментальном аллоксановом диабете у крыс.
Примечание: здесь и далее в рисунках символом # обозначена достоверность различий при сравнивании с фоновыми значениями;
символом * обозначена достоверность различий, полученная при сравнении опытных и контрольных групп.
Практически во всех тканях организма инсулин влияет на обмен угле водов, жиров, белков и электролитов, увеличивая транспорт глюкозы, белка и других веществ через мембрану клетки [Балаболкин М.И., 2000;
Лейкок Д.Ф.
и соавт., 2000;
Потемкин В.В., 1999;
Taylor S.I. е.а., 1996]. К этому гормону чувствительны все ткани организма, кроме нервной, хрусталика, сетчатки и эритроцитов [Потемкин В.В., 1999]. Своё биологическое действие на уровне клетки инсулин осуществляет через соответствующий рецептор. Взаимодей ствие инсулина с рецептором приводит к повышению активности протеин киназы С, к стимуляции специфической фосфолипазы С, к гидролизу глико зилфосфатидилинозитола и образованию двух вторичных мессенджеров:
инозитолтрифосфата (ИТФ) и диацилглицерола (ДАГ). ИТФ высвобождает кальций из эндоплазматического ретикулума. ДАГ действует на кальмодулин и протеинкиназу С, которая фосфорилирует различные субстраты, приводя к изменению активности клеточных систем [Балаболкин М.И., 1998;
Лейкок Д.Ф. и соавт., 2000].
Ключевой особенностью ТБ является способность к активному секреторному процессу с выделением медиаторов в результате дегрануляции.
Дегрануляция ТБ индуцируется иммунологическими и неиммунологически ми факторами [Красноженов Е.П., 1996;
Проценко В.А. и соавт., 1987;
Peachele P.T. е.а., 1987]. Важная роль в передаче сигнала от рецептора к ме ханизмам клетки, которые ведают секреторной дегрануляцией, отводится гуанинсодержащим белкам мембраны. При участии этих белков из фосфоли пидов клеточной мембраны образуются две регуляторных молекулы, выпол няющие функцию вторичных мессенджеров: ИТФ и ДАГ [Маянский Д.Н. и соавт., 1997]. ИТФ высвобождает ионы кальция из эндоплазматической сети, тогда как ДАГ действует, активируя протеинкиназу С. Под влиянием проте инкиназы С, которая фосфорилирует различные субстраты, начинается сек реторная дегрануляция.
Таким образом, связывание молекулы инсулина со специфическим рецептором приводит к образованию двух регуляторных молекул посредников: ИТФ и ДАГ, опосредующих основное действие инсулина – усиление транспорта глюкозы через мембрану клетки. Эти же две молекулы мессенджеры опосредуют секрецию медиаторов из ТБ. Ключевым звеном указанных процессов является активация протеинкиназы С. При недостатке инсулина в результате развития экспериментального СД, вполне закономерно угнетение показателя дегрануляции ТБ в ответ на раздражение стимулятором пирогеналом, выявленное в наших исследованиях (рис. 1).
Кроме того, дегрануляция ТБ находится под контролем циклических нуклеотидов [Маянский Д.Н. и соавт., 1997]. Один из них циклический гуа нозинмонофосфат (цГМФ) усиливает, в то время как его антипод - цикли ческий аденозинмонофосфат (цАМФ), напротив, тормозит секрецию ме диаторов ТБ. Инсулин, в свою очередь, понижает концентрацию цАМФ в клетках-мишенях, а так же, предположительно, повышает концентрацию цГМФ [Лейкок Д.Ф. и соавт., 2000;
Потемкин В.В., 1999], взаимодействуя с рецептором на мембране клетки. Соответственно дисбаланс циклических нуклеотидов при дефиците инсулина в организме может играть определен ную роль в депрессии секреторной активности ТБ.
В данной работе в качестве иммунологического критерия состояния больных с диабетическими ангиопатиями нижних конечностей до и после имплантации им искусственной поджелудочной железы использовалось ко личество иммуноглобулинов разных классов в сыворотке крови.
При анализе показателей гуморального иммунитета у больных с ис следуемой патологией установлено, что количество IgG и IgM в сыворотке крови больных СД не выходит за рамки нормальных значений [71], не значи тельно превышая нижний порог. В то время как уровень IgA в крови обсле дованных на 75% выше средних значений нормы для данного класса имму ноглобулинов. Повышение содержания IgA, по видимому, связанно с им мунным ответом на введение экзогенного инсулина при инсулинотерапии [Хаитов Р.М. и соавт., 1992], а также может объясняться повышенным инфи цированием больных с диабетическими ангиопатиями нижних конечностей, склонных к развитию местных инфекционно-воспалительных заболеваний [Бондарь И.А., 1997].
Значения показателей гуморального иммунитета в группе лиц с диабе тическими ангиопатиями нижних конечностей после имплантации искусст венной поджелудочной железы свидетельствовали о возрастании концентра ций IgG и gM в сыворотке крови до верхних пределов нормы в период 1- мес после проведенной пересадки островковых клеток. Повышение концен траций IgG и IgM сопровождалось достоверным снижением уровня IgA в крови на 37% к 2 мес (р0,01), и на 47% (р0,001) к 6 мес после импланта ции. Начиная с 6 мес после выполнения имплантации отмечалось незначи тельное повышение содержание IgA.
В качестве показателя, характеризующего тяжесть течения изучаемой патологии, нами использовался уровень С-пептида, представляющего собой молекулу, образующуюся в ходе созревания и секреции инсулина [Блюмкин В.Н. и соавт., 1998;
Потемкин В.В., 1999]. При исследовании сыворотки кро ви группы пациентов с диабетическими ангиопатиями нижних конечностей нами было отмечено снижение концентрации С-пептида на 14% по сравне нию с нижним порогом нормы [Потемкин В.В., 1999], что свидетельствует о инсулиновой недостаточности в организме обследованных больных (рис. 2).
нг/мл * # #* 1, 1, # 1,4 # # # # # 1, 0, 0, 0, 0, 1 мес 2 мес 3-6 мес 6-12 мес 1-2 года норма до имплантации после имплантации Рис. 2. Концентрация С-пептида в сыворотке крови больных с осложнениями сахарного диабета в разные сроки после ксенотрансплантации им культур островковых клеток Полученные значения концентрации С-пептида в крови больных с ос ложненным СД после имплантации искусственной поджелудочной железы демонстрировали достоверное возрастание (р0,05) уровня С-пептида (на 22%) спустя 2 мес после проведенной имплантации по сравнению с кон трольной группой (до имплантации). В период 3-6 мес после пересадки ост ровковых клеток было отмечено незначительное снижение уровня С пептида, но при этом значения данного параметра не опускались ниже порога нормы. Начиная с 6 мес после выполнения имплантации показано снижение концентрации С-пептида в крови обследованных лиц (рис. 2). Динамика дру гого показателя, отражающего уровень продукции инсулина в организме содержание антител к инсулину в сыворотке крови, была следующей: у больных с изучаемой патологией после имплантации им островковых клеток концентрация антител к инсулину достоверно повышалась (р0,05) в период 2-6 мес после пересадки в среднем на 26%, относительно группы диабетиче ских больных, обследованных до имплантации культур островковых клеток.
Особый интерес представляют данные, характеризующие динамику концентрации глюкозы в сыворотки крови обследованных лиц (рис. 3). Уже спустя 1 мес после имплантации островковых клеток выявлена тенденция к нормализации уровня глюкозы. Достоверное снижение концентрации сахара в крови больных с изучаемой патологией относительно концентрации глюко зы у контрольной группы пациентов выявлено на период 3-6 мес после ксе нотрансплантации островковых клеток (на 37%). Минимальные значения данного показателя регистрировались на 6-12 мес после пересадки (на 40% ниже по сравнению с группой пациентов, обследованных до имплантации).
Таким образом, полученные нами значения показателей, отражающих тяжесть течения осложненного СД, наряду с результатами клинических на блюдений свидетельствуют о том, что имплантация культур островковых клеток оказывает стабилизирующее влияние на течение СД, способствует уменьшению тяжести гипергликемических состояний и снижению потребно сти в экзогенном инсулине.
Комплексный анализ количественных, морфологических и функцио нальных характеристик ТБ у больных с изучаемой патологией до и после ксенотрансплантации им островковых клеток поджелудочной железы выявил изменение всех параметров морфофункционального статуса после проведен ной пересадки. Так, показано, что общее количество ТБ до имплантации ост ровковых клеток составляло в среднем 38 клеток в 30 полях зрения и досто верно отличалось от такового в группах больных, обследованных в разные сроки после имплантации, кроме группы изученной спустя 1 мес после пере садки (рис. 4). Содержание ТБ в коже к 2 мес после имплантации превышало исходные показатели на 50%, и к 3 мес достигало максимальных значений в 1,8 раза выше исходных. Начиная с 6 мес после имплантации, количест венное содержание ТБ стабилизировалось.
Значения показателя функциональной активности у больных СД спустя 2 мес после имплантации было на 90% достоверно (р0,05) выше по сравне нию со значением аналогичного показателя в контрольной (до имплантации) группе. Достоверных различий при сравнении с другими группами не на блюдалось, но в целом была выявлена тенденция возрастания ИА в течение первых 6 мес после проведения ксенотрансплантации. Начиная с 6 мес отме чались снижение значений до уровня исходных и стабилизация показателя соотношения числа дегранулированных и интактных базофилов.
% * * * контроль * * * 1 мес 2 мес 3-6 мес 6-12 мес 1-2 года степень дегрануляции тканевых базофилов концентрация глюкозы Рис. 3. Динамика секреторной активности тканевых базофилов в коже и концентрации глюкозы в крови больных с осложнениями сахарного диабета в разные сроки после ксенотрансплантации им культур островковых клеток Показатель степени дегрануляции ТБ кожи на активатор секреции пи рогенал у пациентов с диабетическими ангиопатиями нижних конечностей спустя 1 мес после имплантации искусственной поджелудочной железы поч ти в двое превышал контрольные значения. К 2 мес секреторная активность ТБ в коже достигала своего максимума - на 209% выше исходных значений (рис.3). На период 3-6 мес после пересадки показатель степени дегрануляции ТБ был еще достоверно (р0,001) в 1,7 раза выше доимплантационных зна чений. Затем отмечалось постепенное снижение этого показателя.
Динамика индекса созревания тучных клеток, определяющегося соот ношением количества молодых к числу зрелых форм базофилов, в организме больных с изучаемой патологией после имплантации островковых клеток была следующей: к 1 мес после пересадки ИС достоверно (р0,05) повышал ся на 70% относительно контрольной группы;
значения этого показателя ос тавались существенно повышенными в течение всего периода исследований и достигали максимума к 2 мес после имплантации искусственной поджелу дочной железы, в 2,4 раза превышая значение в контрольной группе. Стаби лизация ИС регистрировалась, начиная с 6 мес. На период 6-12 мес после ксенотрансплантации этот показатель составлял 182%, а на период 1-2 года после пересадки – 173% относительно фоновых значений.
Изучение морфофункционального статуса ТБ лабораторных крыс при экспериментальном аллоксановом диабете на фоне имплантации искусствен ной поджелудочной железы выявило схожую динамику всех исследованных показателей. Так, например, уже на 7 сут опыта числовой показатель секре торной активности ТБ перитонеальной жидкости взятой от аллоксановых животных после пересадки им островковых клеток достоверно повышался на 85% относительно группы крыс с диабетом, изученных до имплантации культур островковых клеток, а к 45 сут достигал максимальных значений, превышая контрольные показатели более чем в 2 раза. Затем значения пока зателя дегрануляции ТБ нормализовались. Отличия от данных полученных в клинических исследованиях заключались в том, что в эксперименте, прове денном на крысах с аллоксановым диабетом, реакция ТБ достигала своего пика на 5-6 недели после пересадки островковых клеток, тогда как значения морфофункциональных параметров ТБ в материале взятом у больных с диа бетическими ангиопатиями нижних конечностей были максимальны на мес после проведенной имплантации.
% * * * * * контроль 1 мес 2 мес 3-6 мес 6-12 мес 1-2 года количество тканевых базофилов индекс активности тканевых базофилов Рис. 4. Динамика количества и функциональной активности тканевых базофилов в коже больных с осложнениями сахарного диабета в разные сроки после ксенотрансплантации им культур островковых клеток Таким образом, в первые месяцы после трансплантации островковой части ксеногенной поджелудочной железы наблюдалось выраженное повы шение функциональной и секреторной активности, сопровождаемое некото рым повышением количества ТБ у лиц с осложнениями СД. Реакция ТБ дос тигала пика к 2 мес недели после имплантации, все морфофункциональные параметры кроме численности значительно превышали контрольные показа тели. Количество ТБ было максимально в период 6-12 мес после импланта ции островковых клеток. Такая задержка динамики роста количественных показателей ТБ связана с высокой функциональной напряженностью базофи лов в ранние сроки после имплантации и, как следствие, снижением количе ства ТБ в результате длительной и активной дегрануляции (рис. 4). Достиг нув пика, активность ТБ постепенно снижалась, приближаясь к контрольным значениям;
начиная с 6 мес после имплантации, морфофункциональные па раметры ТБ стабилизировались, что сопровождалось значительным сниже нием концентрации глюкозы в крови больных с осложнениями сахарного диабета (рис. 3). Индекс созревания оставался несколько повышенным на пе риод 1-2 года после проведенной имплантации островковых клеток, что сви детельствует о продолжающейся стимуляции генеза ТБ.
Необходимо отметить, что в нашей работе проводился комплексный морфофункциональный анализ ТБ кожи, взятой из области хирургического разреза у пациентов с диабетическими ангиопатиями нижних конечностей до и после пересадки ксеногенной части поджелудочной железы. Однако при сравнении данных разных авторов оказалось, что при СД кожа различных областей претерпевает в целом сходные изменения [Удовиченко О.В. и со авт., 2001].
Выявленная в наших исследованиях динамика морфофункционального состояния ТБ у больных с осложненным СД после пересадки им ксеногенной поджелудочной железы обусловлена, по-видимому, прежде всего секрецией инсулина -клетками имплантированных культур островковых клеток. Пока зано, что взаимодействие инсулина с рецептором приводит к повышению ак тивности протеинкиназы С через образование двух вторичных мессенджеров:
ИТФ и ДАГ [Лейкок Д.Ф. и соавт., 2000;
Потемкин В.В., 1999;
Flatt Р.R. е.а., 1991]. Эти же две регуляторные молекулы, активируя протеинкиназу С, опо средуют секрецию медиаторов из ТБ [Маянский Д.Н. и соавт., 1997]. Дегра нуляция ТБ так же находится под контролем циклических нуклеотидов [Ма янский Д.Н. и соавт., 1997]: цГМФ, который усиливает дегрануляцию и цАМФ, который, напротив, тормозит секрецию медиаторов ТБ. Инсулин, в свою очередь, понижает концентрацию цАМФ в клетках-мишенях, а так же, предположительно, повышает концентрацию цГМФ [Лейкок Д.Ф. и соавт., 2000;
Потемкин В.В., 1999], взаимодействуя с рецептором на мембране клет ки.
Имеются отдельные литературные данные, подтверждающие эти пред положения. Показано, что при обработке диабетических крыс инсулином со кратительная реакция изолированных трахей существенно повышалась и бы ла сопоставима с таковой у здоровых животных [Casaco А. е.а., 1991]. Инъ екция крысам с аллоксановым диабетом инсулина восстанавливала основные параметры ТБ [Diaz B.L. е.а., 1996;
Diaz B. е.а., 2001] и нормализовала функ циональное состояние тучных клеток [Дыгай А.М. и соавт., 1992], а введение инсулина нативным животным значительно повышало численность ТБ в плевральной полости крыс [Diaz B.L. е.а., 1996;
Diaz B. е.а., 2001].
Возможно играет определенную роль и способность инсулина к инги бированию свободнорадикального окисления. Он может реагировать с пере кисными радикалами липидов, прерывать цепную реакцию окисления [По темкин В.В., 1999] и, соответственно, влиять на процессы ПОЛ, активирую щиеся при СД [Балаболкин М.И., 2000;
Бондарь И.А., 1997;
Завершхановский Ф.А. и соавт., 1987;
Потемкин В.В., 1999;
Смирнова О.М. и соавт., 1999] и способствующие увеличению «жесткости» мембранного бислоя, дестабили зации цитоплазматических мембран и нарушению инсулинсвязывающей ак тивности в мембранах клеток [Косенко Е.А. и соавт., 1999;
Микаэлян Н.П. и соавт., 1999].
Стабилизацию и активацию тучноклеточной реакции после импланта ции инсулинпродуцирующих клеток может опосредовать и нормализация метаболических процессов в клетке, регулируемых инсулином - стимуляция транспорта глюкозы, аминокислот, жирных кислот через мембрану клетки;
стимуляция синтеза РНК и ДНК;
стимуляция синтеза белка;
активация липо генеза и синтеза жирных кислот [Лейкок Д.Ф. и соавт., 2000;
Потемкин В.В., 1999;
Taylor S.I. е.а., 1996]. Имеются данные о том, что инсулин непосредст венно участвует в процессе роста и дифференциации тканей [Балаболкин М.И., 2000].
При развитии раневого процесса на фоне СД возникающие метаболи ческие изменения вызывают несвоевременное наступление апоптоза, нару шая соотношение фаз раневого воспалительного процесса и в конечном итоге препятствуя заживлению [Мохорт Т.В. и соавт., 2000]. Этот факт имеет осо бенное значение в нашем случае, поскольку, пациенты с диабетическими ан гиопатиями нижних конечностей исследуемой группы демонстрировали склонность к развитию язвенно-некротических процессов и гангрены. Экзо генное введение ростовых факторов, например, инсулиноподобного фактора роста, которые стабилизировали пролиферативно-метаболические взаимоот ношения в клетке, давало антиапоптогенный эффект [Ortiz A. е.а., 1997;
Zhang W. е.а., 1997]. Инсулиноподобные ростовые факторы, оказывающие протективное действие на развитие ИЗСД, вызывают прямое регулирующее воздействие на гемопоэз, лимфопоэз и функционирование иммунной систе мы [Панков А. Ю., 2000]. Можно предположить, что и инсулин обладает спо собностью стимулировать генез клеток, в том числе ТБ. Так, обнаружено, что введение инсулина нативным крысам значительно повышало численность ТБ в организме лабораторных животных [Diaz B.L. е.а., 1996;
Diaz B. е.а., 2001].
Эффекты пересадки островковых клеток не объясняются только секре цией инсулина пересаженными -клетками [Блюмкин В.Н. и соавт., 1998].
Существует предположение, согласно которому под влиянием пересадки происходят мобилизация пролиферативного пула эпителиальных клеток соб ственной поджелудочной железы больных ИЗСД и эшелонированная диффе ренцировка клеток-предшественников в -клетки [Блюмкин В.Н. и соавт., 1998;
Скалецкий Н. Н. И соавт., 1996]. Возможно, что определенную роль в стабилизации течения лабильного ИЗСД и снижении потребности реципиен та в экзогенном инсулине играет увеличение после трансплантации числа ин сулиновых рецепторов в периферических тканях [Подшивалин А. В., 1993].
Показано, что при введении С-пептида больным ИЗСД или животным с экс периментальным ИЗСД наблюдается в основном такое же антидиабетическое действие, как после алло- или ксенотрансплантации островковых клеток больным. В таком случае действие свободной трансплантации островковых клеток на клетки и ткани организма можно объяснить и "С - пептидным" эффектом [Блюмкин В.Н. и соавт., 1998;
Скалецкий Н.Н. и соавт., 1996].
Интересными представляются данные, свидетельствующие о дисфунк ции всех звеньев иммунной системы при СД [Новицкий В.В. и др.,1997;
Удо виченко О.В. и соавт., 2001] в свете известных фактов о наличии взаиморегу лирующих эффектов между ТБ и иммунокомпетентными клетками, в первую очередь Т-лимфоцитами [Дыгай А.М. и соавт., 1992;
Красноженов Е.П., 1996;
Маянский Д.Н. и соавт., 1997;
Amon E.U., 1991;
Cavallo M. е.а., 1994;
Freund M. е.а., 1994;
Yurt R. е.а., 1990]. Так, например, интерлейкин-4, секретируе мый как ТБ, так и Т-лимфоцитами, стимулирует В-клеточную пролифера цию, синтез IgG и IgE, активирует Т-хелперы и может проявлять себя как фактор роста для ТБ [Суворова К.Н., 1998]. Показано, что гистамин, лейкот риены, простагландины и другие медиаторы ТБ вызывают модуляцию функ ции лимфоцитов [Enestrom S. е.а, 1997;
Marone G., 1988].
Для СД характерно снижение Т-лимфоцитов, изменение субпопуляций иммунокомпетентных клеток и нарушение функции лимфоцитов и макрофа гов [Бондарь И.А., 1997;
Новицкий В.В. и др.,1997]. Можно предположить, что причиной снижения численности тучноклеточной популяции и угнетения морфофункционального статуса ТБ в целом при СД, наряду с прочими, яв ляется нарушение цитокинного стимулирования со стороны других клеток организма, в частности Т-лимфоцитов, содержание которых при СД снижа ется, а параллельно страдает их функциональная способность. В целом, про грессирование поздних осложнений СД определяется развитием сложных метаболический нарушений и тканевой гипоксии, которые приводят к глубо ким изменениям внутриклеточного метаболизма и проявляются изменением функции иммунокомпетентных клеток и нарушение продукции цитокинов [Бондарь И.А., 1997]. В тоже время имплантация островковых клеток спо собствует нормализации клеточных и гуморальных факторов иммунной сис темы [Воробьева Е.А., 1992;
Дамбаев Г.Ц. и соавт, 1996;
Скалецкий Н.Н. и соавт., 1996]. Возможно, что выявленное в первые месяцы после трансплан тации островковой части ксеногенной поджелудочной железы повышение функциональной и секреторной активности ТБ (рис. 3), сопровождаемое не которым повышением их количества, у лиц с диабетическими ангиопатиями нижних конечностей, а также стимуляция генеза ТБ на период 1-2 года после проведенной имплантации связаны с нормализацией регулирующего воздей ствия со стороны цитокинов иммунокомпетентных клеток.
Следует отметить, что нарушение всех видов обмена ведет при СД к ос лаблению иммунных свойств организма и понижению сопротивляемости инфекциям [Бондарь И.А., 1997;
Потемкин В.В., 1999]. Выявленное в нашей работе снижение уровня IgA в крови обследованных лиц на период 2-6 мес после имплантации может свидетельствовать о нормализации местного гу морального иммунитета и, как следствие, понижении вероятности развития инфекционных осложнений у больных с диабетическими ангиопатиями по сле ксенотрансплантации культур островковых клеток. Возрастание концен траций IgG и IgM в сыворотке крови до верхних пределов нормы в период 1 12 мес после пересадки островковых клеток демонстрирует, по-видимому, то что проведенная имплантация не вызывает серьезных иммунологических сдвигов, способных усугубить течение диабетических осложнений. Это свя зано со степенью иммунотолерантности, которой удалось достичь в отноше нии имплантированной ткани благодаря использованию носителя из нике лида титана, обладающего наиболее оптимальными физико-химическими и биомедицинскими свойствами [Gunther V.E. e.a., 2000], делающими его “не видимым“ для гомеостатических систем организма.
Результаты представленной работы открывают новые перспективы це ленаправленного воздействия на продолжительность и качество трансплан тационной терапии СД путем искусственной регуляции функциональной ак тивности ТБ. О возможности воздействия на различные патологические про цессы через влияние на функциональное состояние тучных клеток свиде тельствуют данные, приведенные в работе Красноженова Е.П. (1996). В связи с этим особую важность представляют литературные источники в которых показано участие тучноклеточных продуктов в развитии осложнений СД.
Так факты полученные Колесниковой А.А. (1999) демонстрируют, что при менение пирогенала способно приводить к снижению чувствительность жи вотных к диабетогенному действию аллоксана и благоприятно влиять на те чение экспериментального СД, в частности, вызывать снижение гиперглике мии. По мнению Симоненкова А.П. и соавт. (1998), для профилактики и ле чения диабетических ангиопатий необходимо применять серотонин, по скольку обнаружено, что при осложненном СД, кроме недостатка инсулина, возникает также недостаточность еще одного эндогенного вещества, проду цируемого ТБ, — серотонина. Установлено, что гепарин, являясь практиче ски единственным из известных антикоагулянтов прямого действия живот ного происхождения, при пероральном введении оказывает выраженное ан тидиабетогенное действие [Ульянов А.М. и соавт., 1999].
ВЫВОДЫ 1. Тканевые базофилы включаются в реакцию организма после имплантации островковых клеток поджелудочной железы свиньи больным с диабетиче скими ангиопатиями нижних конечностей. Реакция тканевых базофилов проявляется в виде изменения количественного содержания, морфологи ческих признаков и секреторной активности.
2. Тканевые базофилы реагировали на экспериментальный аллоксановый диабет стойким снижением значений показателей морфофункционального статуса на фоне незначительного повышения функциональной активности в начальные сроки после инъекции аллоксана. Угнетение морфофункцио нальных параметров сопровождалось ростом концентрации глюкозы в крови животных.
3. В ранние сроки после имплантации островковой части ксеногенной под желудочной железы больным с осложнениями сахарного диабета наблю далось выраженное повышение функциональной и секреторной активно сти, увеличивалось количество молодых форм клеток по сравнению со зрелыми. Реакция тканевых базофилов достигала максимума к 2 мес по сле пересадки и постепенно снижалась, приближаясь к исходным значе ниям к 6-24 мес после имплантации.
4. Динамика морфофункционального статуса тканевых базофилов после проведенной пересадки островковых клеток однотипна у больных с ос ложнениями сахарного диабета и животных с экспериментальным аллок сановым диабетом.
5. Активация показателей морфофункционального состояния тканевых ба зофилов, выявленная в группе лиц с диабетическими ангиопатиями ниж них конечностей после имплантации искусственной поджелудочной желе зы, сопровождалась возрастанием уровня С-пептида и содержания анти тел к инсулину на фоне снижения концентрации глюкозы в сыворотке крови обследованных.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Препараты бактериального происхождения как индукторы дегрануляции тучных клеток / В соавторстве с Красноженовым Е.П., Бочкаревой О.П. // Актуальные вопросы экспериментальной морфологии. - Томск, 1999. – С.
61-62.
2. Оценка степени устойчивости организма к раздражителям различной при роды по модуляции показателей морфофункционального статуса ткане вых базофилов / В соавторстве с Красноженовым Е.П., Бочкаревой О.П. // Материалы межрегиональной научной конференции Сибири и Дальнего Востока, посвященной 150-летию со дня рождения академика И.П. Павло ва. - Томск, 1999. – С. 197-198.
3. Роль тканевых базофилов в процессе инфекции / В соавторстве с Красно женовым Е.П., Карповой М.Р. // Сибирский медицинский журнал. - 2000, №1. – С. 21-24.
4. Участие клеточной системы «тканевой базофил» в обеспечении клеточной защиты организма от патогенных факторов / В соавторстве с Красножено вым Е.П., Бочкаревой О.П. // Материалы международной конференции «Естествознание на рубеже столетий». – М., 2001. – С. 80.
5. Морфофункциональное состояние тканевых базофилов у мышей различ ных инбредных линий / В соавторстве с Красноженовым Е.П., Агафоно вым В.И. // Бюлл. экспериментальной биологии и медицины. Приложение 1, 2001. – С. 95-96.
6. Реакция тканевых базофилов при трансплантационной терапии сахарного диабета / В соавторстве с Бочкаревой О.П., Ждановой О.С. // Материалы III конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке». Томск, 16-17 мая 2002. – С. 195-196.
7. Морфофункциональное состояние дермальных базофилов у больных с ос ложнениями сахарного диабета до и после имплантации островковых кле ток / В соавторстве с Красноженовым Е.П. // Актуальные вопросы экспе риментальной и клинической морфологии. - Томск, 2002, Вып. 2. – С. 228 229.
8. Морфофункциональный статус тканевых базофилов при эксперименталь ном аллоксановом диабете на фоне имплантации островковых клеток поджелудочной железы свиньи / В соавторстве с Красноженовым Е.П. За гребиным Л.В. // Актуальные проблемы медицинской биологии. - Томск, 2002. – С. 53-54.
• Заявка № 2002112380/14 (012 908) на изобретение «Способ количествен ной оценки функциональной активности тучных клеток кожи» с приори тетом от 7.05. 2002.