Екатерина владимировна ранний гаметогенез сиговых рыб р. coregonus в условиях искусственного содержания

На правах рукописи

УДК 597.552.5:591.3:57.044 ЕФРЕМОВА Екатерина Владимировна РАННИЙ ГАМЕТОГЕНЕЗ СИГОВЫХ РЫБ р. COREGONUS В УСЛОВИЯХ ИСКУССТВЕННОГО СОДЕРЖАНИЯ Специальность: 03.02.06 – ихтиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА – 2013

Работа выполнена в Центре экологических исследований и реконструкции биосистем биологического отделения Института математики, естественных наук и информационных технологий ФГБОУ ВПО «Тюменский государственный университет».

Научный консультант: Селюков Александр Германович доктор биологических наук, доцент Тюменский государственный университет

Официальные оппоненты: Бурлаков Александр Борисович доктор биологических наук, профессор Биологический факультет Московского государственного университета (МГУ) имени М.В.Ломоносова, ведущий научный сотрудник Павлов Ефим Димитриевич кандидат биологических наук Институт проблем экологии и эволюции (ИПЭЭ) РАН, научный сотрудник

Ведущая организация: Государственный научно-исследовательский институт озерного и речного рыбного хозяйства (ГосНИОРХ)

Защита состоится 12 апреля 2013 г. в 1100 ч. на заседании диссертационного совета Д 307.004.01 при Всероссийском научно исследовательском институте рыбного хозяйства и океанографии (ФГУП «ВНИРО») по адресу: 107140 г. Москва, ул. Верхняя Красносельская, д. 17.

Факс 8-499-264-91-76, электронный адрес: [email protected]

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института рыбного хозяйства и океанографии.

Автореферат разослан «_» 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук М.А. Седова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Сиговые рыбы (Coregonidae, Salmoniformes) являются важными представителями ихтиофауны озерно-речных систем субарктической и бореальной природно-климатических зон Евразии и Северной Америки. Об их филогении, месте возникновения и путях расселения высказываются спорные и нередко противоположные мнения [Пирожников и др., 1975;

Решетников, 1975, 1980, 2010;

Шапошникова, 1976;

Бодали и др., 1994;

Сендек, 2000;

Боровикова, Махров, 2009;

Политов и др., 2010 и др.].

Вследствие высокой морфо-экологической пластичности, сложной внутривидовой структуры и повышенной межвидовой гибридизации таксономический статус этих рыб по-прежнему остается неясным.

Будучи ценными объектами рыболовства, природные популяции сиговых рыб подвергаются значительному перелову, нарушающему равновесие внутри и межпопуляционного генного разнообразия. Неверно выбранные подходы при разведении снижают рост, плодовитость, устойчивость рыб к болезням и стрессам;

снижение уровня гетерозиготности ведет к низкому темпу эмбриогенеза [Андрияшева, 2011 и др.], а загрязнение окружающей среды подавляет развитие. В эмбриональный и постэмбриональный периоды формируется линия половых клеток, закладываются основы репродукционного потенциала, регулируется дифференцировка пола, происходит становление потенциальной плодовитости [Персов, 1966, 1975;

Чмилевский, 1971, 2000;

Рязанцева, Сакун, 1980;

Lebrun et al., 1982;

Селюков, 1985;

Федоров, Бурлаков, 1993;

Бурлаков, 2002;

Зеленников, 2003;

Arezo et al., 2007;

Gao et al., 2009 и др.].

В Обь-Иртышском бассейне основные нерестилища сиговых рыб расположены в пока еще чистых уральских притоках Нижней Оби;

однако уже в ближайшие годы техногенное давление на них может многократно возрасти вследствие реализации мегапроекта «Урал промышленный – Урал Полярный» [http://www.strategy-center.ru/stock/pics/-Ur prom-Ur polar]. В их воды будут поступать взвеси дражных разработок, каменного угля, тяжелые металлы и другие загрязнители, в т.ч. нефтепродукты и высокотоксичный фенол, что приведет к уничтожению нерестилищ этих видов. Известно, что наиболее уязвимыми у рыб оказываются ранние стадии развития [Данильченко, Строганов, 1975;

Данильченко, 1977;

Моисеева, 1997;

Чмилевский, 1997;

Таликина и др., 1999;

Nguyen et al., 1999;

Руднева, Залевская, 2004;

Bourrachot et al., 2008;

Foekema et al., 2008], когда еще не сформировались механизмы токсикорезистентности. Среди представителей высшего трофического уровня пресноводных экосистем Обь-Иртышского бассейна сиговые рыбы являются наименее устойчивыми к интоксикации. Вследствие чего возникла настоятельная необходимость в установлении возможных рисков и последствий токсикологической нагрузки на ранние стадии развития и формирующуюся репродуктивную систему этих видов и перспективы их существования в условиях постоянной или кратковременной интоксикации.

Ц е л ь ю работы является цитоморфологическая оценка гаметогенеза сиговых рыб рода Coregonus в эмбриональный и постэмбриональный периоды в различных условиях содержания для определения возможных рисков при их развитии в естественных водоемах и в процессе формирования маточных стад при искусственном разведении.

Для достижения поставленной цели решали следующие з а д а ч и :

1. Исследовать и проанализировать межвидовые различия сиговых рыб в эмбриональный период по морфологическим показателям первичных половых клеток (ППК), выявить взаимосвязь и значимость отдельных цитометрических параметров.

2. Установить особенности развития, цитоморфологию ППК и смертность зародышей сига Coregonus lavaretus maraenoides и его гибрида с рипусом Coregonus albula infrsp. ladogensis под воздействием разных концентраций экотоксиканта фенола.

3. Исследовать особенности дифференцировки пола у муксуна C. muksun как длинноциклового вида в регулируемых условиях водной среды.

4. Изучить динамику формирования фонда половых клеток в яичниках сеголеток сиговых рыб с разной продолжительностью жизненного цикла – тугуна C. tugun, муксуна и сига – в условиях установки замкнутого водообеспечения (УЗВ).

Научная новизна. Впервые изучены особенности распределения и соотношение разных состояний первичных половых клеток в эмбриональном периоде у сиговых рыб и с использованием методов многомерной статистики установлено, что среди исследованных цитоморфологических параметров ППК ведущим показателем при оценке межвидовых различий является количество ядрышек. Показано, что в экстремальных условиях содержания, при фенольной интоксикации, наиболее чувствительным показателем при характеристике первичных гоноцитов сиговых рыб в эмбриональный период является состояние ядрышкового аппарата. У муксуна и сига, в отличие от тугуна, в контролируемых условиях УЗВ выявлены низкие темпы дифференцировки гонад и развития репродуктивной системы. Впервые установлены особенности формирования фонда половых клеток у тугуна, муксуна и сига в УЗВ, используемые в качестве модели при создании маточных стад сиговых рыб индустриального типа.

Практическая значимость. Представленные в работе результаты производственных экспериментов с эмбрионами и молодью сиговых рыб в зарегулированных условиях водной среды, направленные на изучение раннего гаметогенеза, характера и динамики пополнения ППК как основы формирования потенциальной плодовитости, могут послужить важным звеном в аналогичных исследованиях других объектов холодноводного рыбоводства в УЗВ. Полученные данные о сроках дифференцировки пола и состоянии фонда половых клеток у сиговых рыб с разной продолжительностью жизненного цикла можно использовать в рыбоводной практике при формировании маточных стад этих ценных видов. Оценка характера и степени влияния ф е н о л а – энзиматического яда с нейротоксическими свойствами – на зародышей сиговых рыб и состояние их первичных гоноцитов необходимы при разработке нормативов в водной токсикологии.

Результаты исследований используются при чтении лекций и проведении практических занятий по спецкурсам бакалавриата «Общая ихтиология» и «Экология рыб», магистратуры «Систематика и филогения рыб», «Антропогенное воздействие на биологические системы» отделения биологии Тюменского государственного университета.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на научно-практической конференции «Пресноводная аквакультура: состояние, тенденции и перспективы развития» (Тюмень, 2008);

X Международном симпозиуме по биологии и биотехнике разведения сиговых рыб (Виннипег, Канада, 2008);

VI Международном форуме по проблемам науки, техники и образования (Москва, 2008);

на конференции молодых ученых «Биосфера Земли: прошлое, настоящее, будущее» (Екатеринбург, Всероссийской научно-практической конференции студентов, 2008);

II аспирантов и молодых ученых «Полевые и экспериментальные исследования биологических систем» (Ишим, 2009);

I конференции молодых ученых NACEE «Вопросы аквакультуры» (Тюмень, 2009);

7 Международном научно производственном совещании по биологии и биотехнике разведения сиговых рыб (Тюмень, 2010);

симпозиуме «Мегагранты окружающей среде России» (Санкт-Петербург, 2012);

I Всероссийской конференции «Физиологические, биохимические и молекулярно-генетические механизмы адаптации гидробионтов» (Борок, 2012), на научно-методологических семинарах кафедры зоологии и эволюционной экологии животных Тюменского университета (2009-2012) и лаборатории качества вод, устойчивости водных экосистем и экотоксикологии Тюменского университета (2011-2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК.

Положения, выносимые на защиту:

1. При характеристике сиговых рыб по морфологическим показателям ППК в эмбриональный период наиболее значимым параметром является число ядрышек;

изменения в структуре ядрышек отражают степень интоксикации.

2. Молодь разных видов сиговых рыб с повышенной интенсивностью соматического роста в контролируемых условиях содержания обладает разным уровнем развития репродуктивной системы, что необходимо учитывать при формировании маточных стад индустриального типа.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, глав обзора литературы, материалов и методов исследования, 3 глав результатов, обсуждения, выводов, списка литературы и приложения. Объем диссертации составляет 150 стр. машинописного текста и 28 стр. приложений, 15 таблиц, рисунков (в том числе 50 микрофотографий). Список цитированной литературы включает 295 источников, в том числе 85 на английском языке.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю Александру Германовичу Селюкову за ценные советы, понимание и всестороннюю помощь на всех этапах подготовки диссертации.

Сердечно благодарит бывшего доцента кафедры зоологии и эволюционной экологии животных к.б.н. Г.Н.Бондаренко, в настоящее время научного сотрудника лаборатории популяционной генетики Института общей генетики имени Н.И.Вавилова РАН, а также аспиранта кафедры Л.А.Шумана – за помощь в сборе и обработке материала. За предоставленный материал автор весьма признателен зав. отделом воспроизводства рыбных запасов Госрыбцентра к.б.н. С.М.Семенченко и зав. сектором лососеводства Н.В.Смешливой.

Глава 1. Обзор литературы Приводится обзор литературы о формировании линии половых клеток в раннем онтогенезе животных. Рассматриваются спорные вопросы происхождения, морфологии и пролиферации первичных половых клеток, их миграции к зачатку гонад и локализации [Персов, 1966, 1975;

Вивьен 1968;

Eddy, 1975;

Рязанцева, Сакун, 1980;

Айзенштадт, 1984;

Захарова, 1984;

Селюков, 1985;

Timmermans, Taverne, 1989;

Божкова и др., 1993;

Yoon et al., 1997;

Чмилевский, Иосифова, 1999;

Braat et al., 1999;

Raz, 2000;

Исаева, Реунов, 2001;

Otani et al., 2002;

Реунов и др., 2004;

Александрова, 2005;

Берекеля и др., 2005;

Fujimoto et al., 2006;

Kurokawa et al., 2006;

Theusch et al., 2006;

Extavour, 2007;

Herpin et al., 2007;

Исаева и др., 2009;

Tran et al., 2012 и др.].

Проанализированы литературные данные о влиянии различных токсикантов на ранние стадии развития рыб и формирование репродуктивной системы [Петухов, Сторожук, 1980;

Костров, Шеханова, 1981;

Таликина 1999, 2000, 2001а;

Руднева и др., 2000;

Руднева, Залевская, 2004 и др.]. Отмечается, что рыбы в раннем онтогенезе, вследствие неполной сформированности защитных и детоксикационных механизмов, в наибольшей степени чувствительны к воздействию ксенобиотиков [Данильченко, 1977;

Nguyen et al., 1999;

Bourrachot et al., 2008;

Foekema et al., 2008;

McIntosch et al., 2010], однако патологические изменения часто проявляются у личинок, ко времени их перехода к мальковому этапу и у сеголеток [Данильченко, Строганов, 1975;

Таликина 1999, 2000, 2001а]. При этом их реакции на интоксикацию видоспецифичны, а степень поражения зависит от природы токсиканта, продолжительности экспозиции и стадии онтогенеза. Отмечен пролонгированный характер интоксикации, в наибольшей степени проявляющийся в различных цитогенетических нарушениях, интерсексуальности, дегенерации гонад.

Приводятся литературные сведения об особенностях гамето- и гонадогенеза в постэмбриональный период у рыб;

о дифференцировке пола, ее регуляции [Федоров и др., 1990;

Федоров, Бурлаков, 1993;

Бурлаков, Федоров, 2001] и формировании фонда половых клеток у разных систематических групп [Персов, 1962, 1975;

Takashima et al., 1980;

Lebrun et al., 1982;

Захарова, 1984;

1997;

Селюков, 1985, 1987;

Strssmann et al., 2002;

Бондаренко, 2003;

Koya et al., 2003;

Meijide et al., 2005;

Arezo et al., 2007;

Vizziano et al., 2007;

Grandi et al., 2008;

Tanaka et al., 2008;

Gao et al., 2009]. Показано, что темп гаметогенеза во многом обусловлен температурным и кормовым режимами при разведении рыб в условиях естественного ареала и при интродукции [Кузьмин, 1967;

Кузьмин, Крупкин, 1976;

Акимова, 1985;

Селюков, 1989;

Павлов, 2011 и др.], замедление темпа гаметогенеза или его ускорение приходятся на гониальный период, период дифференцировки пола, превителлогенез и фазу вакуолизации у самок, сперматогониальный период – у самцов [Казанский, 1956;

Персов, 1966, 1972, 1975;

Кузнецов, 1975;

Кондратьев, 1977;

Селюков, 1987, 2010;

Акимова, 1988, 1992;

Чмилевский, 2000;

Зеленников, 2003 и др.;

Беляев и др. 2004].

Глава 2. Материал и методики Исследования эмбрионов, личинок, мальков и сеголеток муксуна, чира C.

nasus, сига-пыжьяна C. lavaretus pidschian, тугуна и пеляди C. peled проводили в Центре экологических исследований и реконструкции биосистем и на базе полигона водных биотехнологий (УЗВ) биологического факультета Тюменского университета в 2005-2011гг. Морфологические особенности первичных гоноцитов изучали у зародышей во второй половине эмбрионального периода, с начала пигментации глаз до вылупления. У предличинок, личинок и мальков этих видов анализировали половые клетки до их перехода к митозам, т.е. до 30-40 суток.

С января по март 2011г. был поставлен эксперимент по влиянию фенола на эмбриогенез сига и его гибрида с рипусом. Через 30 суток после оплодотворения, в начале органогенеза, зародыши сига и гибрида (по 30 экз. в 3 повторностях на каждый вариант и контрольную партию) были помещены в водные растворы фенола (0.01 мг/л – 1 вариант и 0.02 мг/л – 2 вариант), сменяемые каждые трое суток. После 30-суточной экспозиции подопытные зародыши вновь были переведены в чистую воду. Эксперимент был завершен на 154 сутки.

Исследовали динамику размерно-весовых показателей, дифференцировку пола и начальные этапы формирования фонда половых клеток у сеголеток тугуна, муксуна и сига, выращиваемых в бассейнах УЗВ в 2008-2011гг.

Проводили измерения (по Смитту, мм) и взвешивание молоди (до 0.01г).

Измеряли температуру и содержание кислорода в воде, при помощи ионспецифичного измерителя C205 («Hanna») определяли pH, аммонийный азот, железо, нитриты и нитраты.

Зародышей и личинок сиговых рыб, гонады сеголеток и годовиков фиксировали в смеси Буэна, по 8-10 экз. на каждую дату. Зафиксированный материал обезвоживали в спиртах (начиная с 40%), через бутанол и хлороформ парафин заливали в парафин. Гистологические срезы толщиной 5 мкм готовили на микротоме «МЗП-01 ТЕХНОМ» в режиме замораживания (–18°С), а позднее на автоматизированном ротационном микротоме с системой переноса срезов HM 355S («Microm»). Окрашивали железным гематоксилином по Гейденгайну.

Препараты анализировали на микроскопе AxioImager A1 («Zeiss») и фотографировали с помощью видеокамеры AxioCam MRc5 («Zeiss»), используя лицензионное программное обеспечение AxioVision 4.7.1.

У эмбрионов и личинок учитывали локализацию, количество и размеры первичных гоноцитов, их морфологические особенности. У мальков и сеголеток на фронтальных срезах измеряли гонады, диаметр половых клеток и ядер. Подсчет ППК и гониев производили на всей площади среза. В яичниках подсчитывали соотношение половых клеток разных генераций. Определяли соотношение (%) ооцитов ранней профазы мейоза (зиготена, пахитена, ранняя диплотена), а при появлении превителлогенных ооцитов их подсчитывали на каждом пятом срезе.

Для статистического анализа использовали ППП STATISTICA (v.6) и Ms Excel 2003, 2007;

вычисляли основные статпоказатели, проводили полный дискриминантный и кластерный анализы. В кластерном анализе применяли двухсвязный парногрупповой метод в метрике «1-r Пирсона».

Общий объем материала соответственно для общебиологического и гистологического анализа составил 157 и 198 экз. муксуна, 94 и 103 экз. чира, 77 и 91 экз. сига-пыжьяна, 159 и 85 экз. тугуна, 105 и 88 экз. пеляди, 154 и экз. сига, 90 и 31 экз. гибрида сигрипус. Проанализировано 33065 первичных гоноцитов и других половых клеток на разных стадиях гаметогенеза.

Глава 3. Морфодинамические характеристики первичных половых клеток в эмбриогенезе сиговых рыб Сиговые рыбы рода Coregonus подразделяются на подроды сигов с нижним ртом (Coregonus sensu stricto) и сигов с верхним и конечным ртом (Leucichthys) [Решетников, 1980]. Сиги-бентофаги в водоемах Западной Сибири представлены сигом-пыжьяном и чиром. Сиги-планктофаги – ряпушкой, тугуном, пелядью и омулем;

планктобентофаг муксун – многотычинковый сиг с нижним ртом.

3.1. Цитоморфологические изменения ППК у зародышей сиговых рыб.

В разные годы у м у к с у н а во вторую половину эмбриогенеза, начиная с пигментации глаз до вылупления, цитоплазма первичных гоноцитов имеет низкую оптическую плотность, а количество ядрышек не превышает 2-3. В процессе миграции в зачатки гонад ППК претерпевают морфологические изменения, которые проявляются в полиморфноядерности и сгруппированности в синцитиальные образования (рис. 1а);

встречающиеся при этом митозы очень редки. В течение периода с начала пигментации глаз до пигментации кожных покровов число ППК у зародышей оказывается существенно ниже, чем в более поздние сроки, что может быть обусловлено продолжающимся заселением гонад первичными гоноцитами.

Сходные явления отмечаются в эмбриогенезе ч и р а. Так, число ППК изменяется от 1 до 86, тогда как их среднее значение варьирует слабо;

количество ядрышек в первичных гоноцитах составляет 1-5, изредка достигая 6. К концу эмбрионального периода число полиморфноядерных ППК и их доля в составе синцитиев снижаются, тогда как количество одиночных клеток возрастает.

В эмбриогенезе с и г а - п ы ж ь я н а, начиная со стадии пигментации глаз, отмечена низкая численность ППК;

они имеют овальную форму с неровными краями. В ядре отмечено от 1 до 4 ядрышек, хроматин распределяется по всему объему ядра. Встречаются двухъядерные и множество полиморфноядерных ППК и гоноцитов в составе синцитиев. На разных стадиях Рис. 1. Первичные половые клетки у эмбрионов сиговых рыб.

а – ППК муксуна в составе синцитиального комплекса;

95 суток;

б – ППК тугуна;

141 сутки.

эмбриогенеза соотношение таких клеток и в них ядрышек постоянно варьирует, а при завершении эмбрионального периода снижаются полиморфноядерность и митотическая активность.

У зародышей п е л я д и с начала пигментации глаз количество ППК флуктуирует, но остается на одном уровне до вылупления;

число полиморфноядерных ППК достигает трети от общего числа гоноцитов, в ядре 1-3 ядрышка. К концу эмбриогенеза возрастает доля синцитиев, которые находятся в обратном соотношении с числом митозов. При сравнительно невысоком числе ППК их цитоморфологические характеристики у пеляди отличаются от этих показателей у зародышей других видов сиговых рыб слабо выраженными изменениями в динамике количества, полиморфноядерности и числе клеток в составе синцитиев.

У т у г у н а во вторую половину эмбрионального периода динамика количества и цитоморфологических показателей ППК значительно варьирует;

отмечается различное соотношение полиморфноядерных клеток и число ППК в составе синцитиальных образований (рис. 1б). Доля полиморфноядерных ППК и клеток в составе синцитиев характеризуются обратной зависимостью.

Количество и размеры одиночных ППК возрастают к концу эмбриогенеза, 1- крупных ядрышка располагаются в центре ядра. На этапе вылупления доля ППК в синцитиальных комплексах повышается.

Таким образом, у эмбрионов разных видов сиговых рыб с начала пигментации глаз до вылупления формирование линии половых клеток существенно различается. Эти различия проявляются в количественной динамике ППК, их морфологических характеристиках, межклеточных взаимосвязях и пролиферативной активности. У муксуна и тугуна количество первичных гоноцитов, полиморфноядерных, многоядерных ППК и клеток в составе герминативных синцитиев намного превышает эти показатели у чира, сига-пыжьяна и пеляди.

Оценка межвидовых отношений сиговых рыб по 3.2.

цитометрическим показателям ППК в эмбриональный период. Для установления межвидовых отношений пяти представителей типичных для Обь Иртышского бассейна сиговых рыб на основе цитометрических параметров первичных гоноцитов у эмбрионов в начальный период формирования репродуктивной системы – миграции ППК к зачаткам гонад – и выявления ведущего показателя были использованы дискриминантный и кластерный анализы [Боровиков, 2003].

Дискриминантный анализ показал, что ведущим признаком в разделении видов в эмбриональный период является количество ядрышек в первичных гоноцитах (Nnl). Второе по значению вклада место принадлежит диаметру ядра (Dn), третье – числу одиночно лежащих ППК (Nc), следующие по значимости в разделении видов занимают количество ППК в синцитиях (Ncs) и диаметр первичных гоноцитов (Dc). В соответствии с линейным коэффициентом детерминации, между видами в этот период отмечена слабая связь: от 0. (Nnl) до 0.402337 (Nc). Все исследуемые переменные характеризуются низкой избыточностью, притом наименьшей – число ядрышек, что свидетельствует о независимости данного показателя от всех остальных. Можно видеть (рис. 2), что по первой дискриминантной функции (координата 1) исследуемые виды подразделяются на 3 группы: первая представлена муксуном, который обособлен от других видов, во вторую входят сиг-пыжьян, пелядь и тугун, в третьей находится чир. По второй функции (координата 2) дискриминация Координата - - - - -6 -4 -2 0 2 4 6 Координата Рис. 2. Положение группировок эмбрионов сиговых рыб по 5 параметрам ППК в координатах полного дискриминантного анализа ° Coregonus muksun Coregonus nasus Coregonus lavaretus pidschian Coregonus peled • Coregonus tugun между группами выражена слабее. Сиг-пыжьян, как по первой, так и по второй координатам занимает промежуточное положение, а такие виды как тугун и пелядь слабо различаются по обеим дискриминантным функциям. С использованием квадрата дистанции Махаланобиса виды ранжируются по расстоянию между ними: пелядьтугунсиг-пыжьянчирмуксун (табл. 1).

Таблица 1.Оценка расстояний между классами в дискриминантном анализе Классы С. peled С. muksun С. l. pidschian С. tugun С. nasus С. peled 13.1 5.3 4.3 7. С. muksun 27.4 6.4 14.8 23. С. l. pidschian 11.0 12.2 2.3 8. С. tugun 8.4 26.0 4.1 8. С. nasus 14.0 37.6 12.9 12. Примечание. Над диагональю значения F-критерия при различении классов, под диагональю – квадрат дистанции Махаланобиса.

При вычленении из суммы признаков числа ППК в составе синцитиальных комплексов, по которым виды существенно разделяются, диспозиция видов на диаграмме практически не изменяется, что свидетельствует о низкой значимости данного показателя. Наибольший вес и в этом варианте имеет число ядрышек (Nnl). Для выяснения степени значимости данного признака для разделения видов, он был удален из суммы остальных, после чего наиболее весомым показателем стал диаметр ядра ППК. В результате муксун оказался еще более обособленным от остальных сиговых, тогда как бентофаг-чир «объединился» с планктофагом-тугуном, поменявшись местами с планктофагом-пелядью (рис. 3).

Координата - - - - -6 -4 -2 0 2 4 6 Координата Рис. 3. Положение группировок эмбрионов сиговых рыб в координатах полного дискриминантного анализа (без учета ядрышек).

Дискриминантный анализ, проведенный на этапе вылупления, продемонстрировал отчетливое отделение тугуна от остальных видов (рис. 4).

После выведения тугуна оставшиеся виды перераспределились: чир остается в центре и по первой (координата 1), и по второй (координата 2) дискриминантным функциям, пелядь смещается к периферии, а сиг-пыжьян отличается широким разбросом вариант. Диспозиция повернулась как бы Координата - - - - -8 -6 -4 -2 0 2 4 Координата Рис. 4. Положение группировок предличинок сиговых рыб на этапе вылупления в координатах полного дискриминантного анализа ° Coregonus muksun Coregonus nasus Coregonus lavaretus pidschian Coregonus peled • Coregonus tugun против часовой стрелки на 90о (рис. 5). При этом наибольший вклад в разделение видов вносит диаметр ядра, за которым следует диаметр клетки, тогда как число ядрышек занимает лишь третье место. Однако в разные годы на данной стадии онтогенеза лидировать в разделении видов по цитометрическим параметрам может или диаметр ядра, или количество ядрышек. Исключение из состава показателей числа ядрышек в ППК привело к полному смешению видов (рис. 6), что подтверждает важность этого параметра. При установлении дистанции между видами при исключении числа ядрышек (квадрат дистанции Махаланобиса) отмечается сомнительная, с позиций современной классификации сиговых рыб [Решетников, 2010], межвидовая дивергенция:

наименьшее расстояние между пелядью и муксуном (0.3), пелядью и бентофагом чиром (0.4), а между сигом-пыжьяном и чиром – 4.2, пыжьяном и муксуном – 6.0.

Таким образом, проведенный дискриминантный анализ позволил отчетливо разделить сиговых р.Coregonus (Leucichthys и Coregonus sensu stricto) именно в эмбриональный период, когда наиболее значимым признаком в их Координата - - - - -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 Координата Рис. 5. Положение группировок предличинок сиговых рыб на этапе вылупления в координатах полного дискриминантного анализа (без тугуна) Координата - - - - -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 Координата Рис. 6. Положение группировок сиговых рыб при вылуплении в координатах полного дискриминантного анализа (без учета ядрышек) разделении является число ядрышек, что отражает функциональное назначение этой структуры [Чмилевский, 1971;

Каменева, 1991;

Чмилевский, Каменева, 2001 и др.]. При этом на этапе вылупления данный параметр (Nnl) не всегда играет основную роль в разделении видов. В целом можно выделить три цитометрических параметра ППК, характеризующих различия этих видов как в эмбриональный период, так и на этапе вылупления: количество ядрышек, диаметр ядер и диаметр клеток.

Для установления степени связи между параметрами ППК в раннем онтогенезе разных видов был проведен кластерный анализ. У эмбрионов на стадии пигментации глаз отмечается низкая положительная или отрицательная связь между исследуемыми показателями. Исключением являются высокая корреляция между количеством одиночных первичных гоноцитов и их числом в составе синцитиев у сига-пыжьяна, а у пеляди – между размерами ППК и их ядер.

У предличинок сиговых рыб на стадии вылупления связь цитометрических показателей первичных гоноцитов также изменяется от очень слабой до тесной прямой и обратной. При этом параметры могут группироваться в кластеры по принципу однородности – размеры клеток, ядер, число ядрышек с одной стороны и число одиночных и объединенных в синцитии ППК – с другой, отличаться высокой скоррелированностью (чир). В пределах вида связи между параметрами могут варьировать от высоких положительных до слабых и отрицательных без отчетливой группировки по принципу однородности.

Далее проследим изменения рассмотренных выше цитометрических показателей ППК в эмбриональный период сиговых рыб в ответ на воздействие одного из наиболее токсичных нефтепродуктов – фенола.

Глава 4. Морфофункциональные изменения у эмбрионов сиговых рыб в условиях фенольной интоксикации В наших исследованиях при оценке состояния зародышей сига и гибрида, которые продолжительное время находились в растворах фенола 0.01 мг/л ( ПДК) и 0.02 мг/л (20 ПДК), была выявлена сходная реакция на действие возрастающих концентраций этого токсиканта.

Спустя месяц после перевода эмбрионов сига из раствора фенола повышенной концентрации (10 ПДК), где они содержались в течение месяца, в чистую воду в ядрах ППК снижается число ядрышек, а количество одиночных гоноцитов возрастает вследствие фрагментации. Синцитиальные образования включают полиморфноядерные ППК, у отдельных особей происходит распадение герминативных синцитиев и деструкция половых клеток. В целом, можно отметить парадоксальную зависимость увеличения числа, размеров и темпа формирования первичных половых клеток у зародышей сига от концентрации токсиканта. Очевидно, на данной стадии развития после месячной экспозиции сначала в среде с фенолом, а затем в чистой воде, интоксикация не оказывает существенного влияния на формирование линии половых клеток. Однако после 2-месячного пребывания в чистой воде, в благоприятных условиях аэрации, состояние зародышей ухудшается. При этом на гибрид токсикант оказывает угнетающее воздействие на поздних стадиях эмбриогенеза [Ефремова и др., 2011б]. Дальнейшее развитие зародышей при тех же концентрациях истощает ресурсы организма, и к 128-суточному возрасту большинство из них погибает.

У сига и гибрида происходит изменение соотношения разных состояний первичных гоноцитов, которое усиливается хроническим воздействием фенола.

У зародышей сига при концентрации фенола 0.02 мг/л в некоторых синцитиальных образованиях отмечены дегенерирующие ППК, а сами синцитии распадаются на отдельные клетки. У гибрида отклонения проявляются в снижении цитометрических характеристик половых клеток, и хорошо заметны по состоянию ядрышкового аппарата: можно наблюдать последовательность перехода ядрышек от обычного состояния к многолопастной конфигурации с последующим пикнозом и начальными фазами дезинтеграции, что является специфичным ответом ядрышек на воздействия различных стрессорных факторов [Зацепина, 2007].

Таким образом, у зародышей даже при незначительном повышении содержания фенола в воде нерестилищ и относительно продолжительное время находившихся в этих условиях, при последующем продолжительном освежении воды восстановления функций организма не происходит. Если они выживут и после вылупления попадут в благоприятные условия нагула, отклонения в репродуктивной системе со временем должны привести к ее дегенерации, что показано в опытах с более устойчивыми видами – карповыми [Таликина и др., 1999, 2001а].

Глава 5. Ранний гаметогенез сиговых рыб в искусственных условиях содержания В зарегулированных условиях водной среды (УЗВ) в течение круглого года возможно поддержание необходимого температурного и гидрохимического режима, при котором рост молоди и темп гаметогенеза остаются высокими на протяжении всего периода содержания [Ивойлов и др., 2007]. Нами проведены исследования гаметогенеза тугуна и муксуна при выращивании в УЗВ [Селюков и др., 2010;

Ефремова и др., 2011а].

5.1. Дифференцировка пола у м у к с у н а в условиях искусственного содержания (УЗВ). У мальков в возрасте 31 сут. все половые клетки еще представлены ППК, а в 69 сут. у части особей отмечены первые признаки анатомической дифференцировки гонад по типу яичников: на их латеральной поверхности заметна инвагинация, вблизи которой под герминативным эпителием локализуются гонии (рис. Процесс анатомической 7а).

дифференцировки и накопления гониального фонда у молоди продолжается, но только у 116-суточных сеголеток впервые отмечаются признаки цитологической дифференцировки яичников (рис. 7б). К 153-суточному возрасту структурных изменений гонад не отмечено, увеличивается количество ооцитов стадии пахитены;

у части сеголеток появляются первые признаки анатомической дифференцировки гонад по типу семенников. В 212 суток у отдельных особей отмечены первые группы превителлогенных ооцитов, хотя у большинства продолжается дифференцировка яичников. Только к 283 суточному возрасту выявляются отчетливые признаки дифференцировки семенников, в которых одиночные сперматогонии распределяются по всему объему половой железы.

а б Рис. 7. Дифференцировка пола и формирование фонда половых клеток в раннем онтогенезе муксуна.

а – начало анатомической дифференцировки гонады по типу яичников, гонии вблизи инвагинации (стрелка) герминативного эпителия;

81 сутки;

б – цитологическая дифференцировка по типу яичников;

ооциты стадий зиготены и пахитены;

116 суток.

Таким образом, дифференцировка пола на первом году жизни муксуна даже в условиях благоприятного температурного и кормового режима проходит в замедленном темпе, что позволяет считать и позднее половое созревание следствием его видовых особенностей.

5.2. Формирование фонда половых клеток у сиговых рыб с разной продолжительностью жизненного цикла. Впервые отмеченные у части самок м у к с у н а в возрасте 212 суток, превителлогенные ооциты имеют небольшие размеры и встречаются редко, в сравнении с одновозрастными сигом и тугуном, развивавшихся в сходных условиях, притом, что размерно весовые характеристики муксуна значительно превосходят данные показатели у этих видов (табл. 2, рис. 8а).

Дифференцировка пола у с и г а продолжается длительное время, и еще в 141 сутки у некоторых сеголеток отмечены признаки цитологической дифференцировки гонад по типу яичников: присутствуют оогонии и ооциты стадий зиготены и пахитены. У части особей в этом возрасте в яичниках уже встречаются превителлогенные ооциты. В возрасте 212 сут. у сеголеток увеличиваются размеры гонад и количество превителлогенных ооцитов;

у отдельных особей сформированы яйценосные пластинки (рис. 8б). Размеры яичников, количество и размеры ооцитов старшей генерации превосходят эти генеративные показатели у муксуна. Однако наиболее интенсивным темпом гаметогенеза отличались самки т у г у н а (табл. 2), старшей генерацией Таблица 2. Соотношение половых клеток в яичниках сеголеток сиговых рыб с разным темпом гаметогенеза (212 сут.) Показатели Муксун Сиг Тугун Длина по Смитту, 146.8±5.9 123.3±3.9 111.6±1. Параметры мм 123 – 185 103 – 141 86 – рыб* 35.9±5.8 17.3±1.9 14.1±0. Масса тела, г 14.9 – 80.6 9 – 28.2 5.7 – 20. Площадь гонады на 0.24±0.12 0.80±0.14 2.21±0. фронт. срезе, мм2 0.04 – 0.8 0.35 – 1.08 1.39 – 3. 12.3±1.5(0 – 87) 1.1±0.3(0 – 10) 3.1±0.7(0 – 11) Оогонии*** (53.6%) (27.7%) (32.4%) Генеративные показатели** 2.5±0.7 (0 – 38) 2.1±0.4(0 – 18) 0.7±0.3(0 – 6) Зиготена (11.7%) (40.4%) (6.1%) 9.4±1.3 (0 – 96) 2.2±0.4(0 – 13) 0.4±0.2(0 – 5) Пахитена (33.3%) (27.4%) (2.0%) 0.4±0.1(0 – 4) 0.1±0.04(0 – 2) 5.4±0.8(0 – 19) Ранняя диплотена (1.2%) (1.8%) (25.9%) 0.2±0.1(0 – 3) 1.4±0.1(0 – 5) 12.8±1.6(2 – 31) Превителлогенные (0.2%) (2.7%) (24.0%) 16.2±1.5 (0 – 31) Вакуолизации – – (9.6%) 51.9±0.4 88.8±5.9 247.9±25. Диаметр ОСГ, мкм 51.5 – 52.2 78.3 – 110.2 196.5 – 318. Диаметр ядер ОСГ, 32.0±0.8 47.0±0.9 93.5±2. мкм 24.9 – 37.8 26.6 – 68.2 86.6 – 99. * Количество экземпляров муксуна – 10, сига – 10, тугуна – 13.

** Изучено на 6 особях муксуна, 5 – сига, 5 – тугуна.

*** Приводится число клеток на фронтальном срезе яичника и их доля (%) в гонаде.

половых клеток в которых были ооциты фазы вакуолизации цитоплазмы, а у одной особи яйцеклетки находились в фазе накопления мелкозернистого желтка (рис. 8в,г). В природных условиях тугун также обладает высоким темпом гонадо- и гаметогенеза, но имеет при этом низкие размерно- весовые показатели: по размерам ниже на 38.4% по массе – на 75.2% [Богданов и др., 2006]. Как можно видеть, в условиях зарегулированного режима содержания в бассейнах УЗВ реализовались его соматический и генеративный потенциалы.

а б в г Рис. 8. Состояние яичников у одновозрастной молоди сиговых рыб (212 сут.) а – участок яичника муксуна;

среди ооцитов ранней профазы мейоза встречаются мелкие превителлогенные ооциты;

б – в яичнике сига между превителлогенными ооцитами распределяются многочисленные гнезда ооцитов стадий зиготены и пахитены;

в – в яичнике тугуна между вителлогенными ооцитами встречаются одиночные ооциты периода превителлогенеза;

г – то же увеличено;

вителлогенный ооцит в фазе накопления мелкозернистого желтка.

Таким образом, при содержании в контролируемых условиях молоди сиговых рыб с разным темпом индивидуального развития, при относительно высоком соматическом росте, в сравнении с таковым в условиях естественного ареала, отчетливо проявилась видоспецифичность в уровне развития репродуктивной системы, что необходимо учитывать при формировании маточных стад сиговых рыб индустриального типа.

ВЫВОДЫ 1. Цитоморфологические и цитометрические различия первичных гоноцитов в период эмбрионального развития у разных видов сиговых рыб в идентичных условиях развития обусловлены видовыми особенностями – наибольший диапазон морфофункционального состояния ППК у тугуна, наименьший – у пеляди.

2. При оценке межвидовых различий эмбрионов сиговых рыб по цитометрическим параметрам ППК их значимость снижается в следующем порядке: число ядрышек, диаметр ядра, диаметр клетки, число синцитиальных образований, число ППК;

на этапе вылупления число ядрышек не всегда занимает лидирующее положение.

3. Среди предличинок сиговых рыб тугун и пелядь по совокупности цитометрических параметров ППК отчетливо дискриминируется от муксуна, сига-пыжьяна и чира, что на цитоморфологическом уровне может подтверждать таксономическую подразделенность сиговых рыб рода Coregonus.

4. У сиговых рыб как в эмбриональный период, так и на ранних стадиях постэмбрионального онтогенеза связи большинства цитометрических показателей ППК с числом синцитиальных образований не выявляется.

5. Влияние раствора фенола на эмбрионов сига и его гибрида с рипусом характеризуется пролонгированных эффектом даже после перевода их в чистую воду;

наибольшие патоморфологические изменения проявляются в дегенерации ППК, которая начинается с деструкции ядрышек, в наибольшей степени выявленной у гибрида.

6. Определение пола у муксуна в благоприятных условиях содержания УЗВ продолжается 4-9 месяцев: анатомическая дифференцировка гонад по типу яичников проходит в 70-96 суток, цитологическая – в 115-212 суток;

дифференцировка семенников задерживается до 8-9 месяцев.

7. Уровень развития гонад и темп оогенеза у сеголеток сиговых рыб с разной продолжительностью жизненного цикла при содержании в регулируемых условиях УЗВ существенно возрастает в направлении длинноцикловый муксун среднецикловый сиг короткоцикловый тугун, отражая специфику гонадо- и гаметогенеза этих видов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК 1. Селюков А.Г., Ефремова Е.В. Бондаренко Г.Н. Цитоморфологические преобразования первичных половых клеток в эмбриогенезе муксуна Coregonus muksun (Pallas) // Вестник Тюменского государственного университета.

Тюмень. 2010. №3. Медико-биологические науки. Науки о земле. Химия. С. 45 51.

2. Селюков А.Г., Шуман Л.А., Ефремова Е.В. Применение установок замкнутого водоснабжения для формирования маточных стад сиговых рыб (на примере тугуна) // Вестник Тюменского государственного университета.

Тюмень. 2010. №. 7. Медико-биологические науки. Науки о земле. Химия. С.

122-129.

Ефремова Е.В., Селюков А.Г., Шуман Л.А. Особенности 3.

дифференцировки пола и формирование половых клеток в раннем онтогенезе муксуна Coregonus muksun (Pallas) // Вестник Тюменского государственного университета. Тюмень. 2011. №6. Медико-биологические науки. С. 46-55.

4. Ефремова Е.В., Моисеенко Т.И., Селюков А.Г., Гоголева С.Ю.

Морфо-функциональные нарушения у эмбрионов сиговых рыб в условиях фенольной интоксикации // Вестник Тюменского государственного университета. Тюмень. 2011. №. 12. Экология. С. 38-46.

Публикации в прочих изданиях 5. Selyukov A.G., Efremova E.V., Bespomestnykh G.N. Primordial germ cells proliferation in coregonid embryos // X Intern. Symposium on Biology and Manager of Coregonid Fishes. Canada, Winnipeg. 2008. P. 58.

6. Селюков А.Г., Беспоместных Г.Н., Ефремова Е.В. Проблема пролиферации первичных гоноцитов в эмбриогенезе (на примере сиговых рыб) // Труды Междунар. форума по проблемам науки, техники и образования. М.

2008. Т.3. С.58-60.

7. Селюков А.Г., Беспоместных Г.Н., Ефремова Е.В., Шуман Л.А., Читаева Е.А. Инновации в пресноводной аквакультуре: автоматизированный рыбоводный модуль // Тезисы докл. научно-практич. конф. «Пресноводная аквакультура: состояние, тенденции и перспективы развития». Тюмень. 2008.

С. 93-95.

8. Ефремова Е.В. Формирование линии половых клеток в эмбриогенезе сиговых рыб разных эколого-морфологических групп // Материалы II Всероссийской научно-практич. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых «Полевые и экспериментальные исследования биологических систем».

Ишим. 2009. С. 53-55.

9. Беспоместных Г.Н., Ефремова Е.В., Карасева Т.В., Шуман Л.А.

Оценка состояния репродуктивной системы и печени тугуна (Coregonus tugun) в условиях установки замкнутого цикла // Тезисы докладов I конференции молодых ученых NACEE «Вопросы аквакультуры». Тюмень. 2009. С.3-4.

10. Селюков А.Г., Ефремова Е.В., Беспоместных Г.Н., Симонова А.В.

Пролиферативная активность герминативных стволовых клеток в эмбриогенезе сиговых рыб // Материалы 7 Междунар. научно-производств. совещ. по биологии и биотехн. разведения сиговых рыб. Тюмень. 2010. С. 144-149.

11. Селюков А.Г., Шуман Л.А., Ефремова Е.В., Беспоместных Г.Н.

Применение УЗВ для формирования маточного стада сиговых рыб (на примере тугуна) // Материалы 7 Междунар. научно-производств. совещ. по биологии и биотехн. разведения сиговых рыб. Тюмень. 2010. С.250-254.

12. Ефремова Е.В., Пашина Л.С. Влияние временной фенольной интоксикации на формирование линии половых клеток в эмбриональный период рыб р. Coregonus // Материалы Всеросс. конф. с междунар. участием «Физиологические, биохимические и молекулярно-генетические механизмы адаптаций гидробионтов». Борок. 2012. С. 133-136.