Метанотрофы источников кальдеры вулкана узон, камчатка
На правах рукописи
Тихонова Екатерина Николаевна МЕТАНОТРОФЫ ИСТОЧНИКОВ КАЛЬДЕРЫ ВУЛКАНА УЗОН, КАМЧАТКА Специальность 03.02.03 – микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2013
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук (ИНМИ РАН) доктор биологических наук, член-корреспондент РАН
Научный консультант:
Гальченко Валерий Федорович Официальные Горленко Владимир Михайлович оппоненты: доктор биологических наук, профессор, ИНМИ РАН, заведующий лабораторией экологии и геохимической деятельности микроорганизмов Хмеленина Валентина Николаевна доктор биологических наук, старший научный сотрудник Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, ведущий научный сотрудник Биологический факультет Московского
Ведущая организация:
государственного университета имени М.В.
Ломоносова
Защита состоится 22 апреля 2013 года в часов на заседании диссертационного совета Д002.224.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук по адресу: 117312, г. Москва, пр-т 60-летия Октября, д.7, корп.2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИНМИ РАН
Автореферат разослан «» _ 2013 года
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Хижняк Т.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Метан (СН4) – важнейший энергетический источник, до 30% промышленных запасов которого, по мнению геологов, имеют микробное происхождение. Кроме того, метан вносит существенный вклад в парниковый эффект, что определяет его важную роль в формировании климата Земли. Поэтому изучение микробных процессов окисления метана в биосфере представляет большой интерес для специалистов разного профиля.
Окисление метана является одним из важных звеньев глобального геохимического круговорота углерода. За исключением термокаталитического образования, сжигания и фотохимического окисления, основные процессы трансформации углерода в цикле метана осуществляются исключительно высоко специализированными группами микроорганизмов.
Биогенный метан на Земле образуется метаногенными археями на конечных стадиях разложения органического вещества в анаэробных условиях. В природных экосистемах при высоких значениях температуры возможны абиогенные механизмы образования метана – химические, основанные на реакции Н2 с СО, и физические, когда метан образуется при термических процессах разложения органики [Fiebig et al., 2007]. Содержание метана в геотермальных газах обычно составляет 0,01–1% [Etiope, Klusman, 2002], однако оно может быть гораздо выше. Так, например, имеются сведения о том, что в газах геотермальных систем Новой Зеландии содержание метана составляет 1–11%, а в ряде случаев достигает аномальных значений 27% [Giggenbach, 1995].
Метанотрофы — физиологически и биохимически специализированная группа аэробных прокариот, использующих метан в качестве источника углерода и энергии. Поступление метана в атмосферу из различных экосистем контролируется активностью «метановых фильтров», образуемых метанотрофами. В последние несколько десятилетий весьма основательно исследованы процессы метанокисления и состав метанотрофных сообществ морских и наземных экосистем. Менее изучены метанотрофы биотопов с высокими значениями температуры (выше 40С).
Термальные источники являются экстремальными экосистемами, микробные сообщества которых представляют значительный интерес для фундаментальных исследований и практического применения [Brock et al., 1971].
Поскольку в составе гидротермальных флюидов наряду с СО, Н2S и СО присутствует СН4, высказывались предположения о наличии в этих местообитаниях термофильных/термотолерантных метанотрофов [Giggenbach, 1996]. Растворимость газов в водных растворах падает с повышением температуры, что зачастую считается главным лимитирующим фактором роста метанотрофов при высоких температурах. Однако, известно, что растворимость метана в жидких средах с низкой ионной силой (ниже 100 мM) понижается лишь до 33%, когда температура возрастает с 30С до 60С [Duan et al., 1992]. Это может объяснить наличие процесса окисления метана в биотопах с высокими температурами.
Сведения о метанотрофных бактериях высокотемпературных гидротерм немногочисленны и ограничены работами по выделению термофильных метанотрофов из гидротерм Венгрии и Японии [Bodrossy et al., 1997, 1999;
Tsubota et al., 2005;
Hirayama et al., 2011]. Гидротермальные образования на территории Российской Федерации сосредоточены на Курило-Камчатской островной дуге, а также Прибайкалье и Кавказе. Исследования, проведенные в этих районах, направлены, главным образом, на изучение гидрогенотрофных литотрофов, микроорганизмов с различными типами анаэробного дыхания (серо-, нитрат- и железоредукторов) и использующих оксид углерода II (СО) [Слободкин и др., 2011;
Соколова, Кочеткова, 2011;
Пименов, 2011;
Черных и др., 2011;
Перевалова, 2011;
Прокофьева, 2011;
Кубланов, Подосокорская, 2011]. Активность и состав метанотрофных сообществ гидротерм исследовали эпизодически [Цыренжапова и др., 2007;
Зеленкина и др., 2009].
К началу проведения настоящих исследований сведения о метанокислении и метанотрофных организмах в термальных источниках кальдеры вулкана Узон были весьма ограничены. Так, из кислого горячего источника выделена метанокисляющая веррукобактерия Methylacidiphilum [Islam et al., 2008]. Для ряда источников обнаружены процессы микробного окисления метана с максимальной интенсивностью при 37С и выявлены метанотрофы родов Methylococcus, Methylomonas, Methylosinus, Methylocystis и Methyloacidiphilum [Хмеленина и др., 2011]. В то же время газогидротермальные проявления кальдеры Узона характеризуются большим разнообразием температур и минерального состава, что позволяет предположить существование различных по активности и составу метанотрофных сообществ. В связи с вышеизложенным, исследование состава и активности метанотрофных сообществ гидротерм представляется весьма актуальным.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в обнаружении и изучении разнообразия метанотрофных бактерий в газогидротермах кальдеры вулкана Узон, Камчатка. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. определить in situ основные физико-химические параметры газогидротерм кальдеры вулкана Узон (Камчатка);
2. оценить интенсивность метанокисления в исследуемых гидротермах с применением метода радиоактивных изотопов;
3. с помощью молекулярных методов (ПЦР, ПЦР в реальном времени, FISH) детектировать присутствие метанотрофных бактерий в гидротермах;
4. изучить разнообразие метанокисляющих бактерий в гидротермах на основе анализа последовательностей фрагментов генов pmoA;
5. получить и охарактеризовать накопительные культуры термофильных и термотолерантных метанотрофов;
6. описать филогенетическое разнообразие выявленных в гидротермах метанотрофов на основе последовательностей генов, кодирующих 16S рРНК.
Научная новизна. По единой методике проведены комплексные исследования физико-химических параметров 35 термальных источников кальдеры вулкана Узон (Камчатка). Впервые исследовано разнообразие и определена активность аэробных метанотрофных сообществ газогидротерм Камчатки с температурами выше 40С.
Установлено, что выделенные метанотрофные сообщества включают исключительно метанотрофов I типа (Gammaproteobacteria).
В высокотемпературных гидротермах со слабокислыми и близкими к нейтральным значениями рН обнаружены представители рода Methylothermus, в то время как в источниках с низкими значениями рН и умеренными температурами – организмы, отличающиеся от известных метанотрофов и имеющие отдаленное сходство с представителями родов Methylomonas и Methylobacter.
Практическая значимость. Полученные данные расширяют знания о таксономическом составе метанотрофных сообществ термальных экосистем и создают базу для оценки биогеохимического потенциала микробных сообществ гидротерм, а также обусловливают возможность направленного скрининга и выделения эффективных продуцентов ферментов, биологически активных веществ и других соединений, синтезируемых метанотрофами, для целей биотехнологии.
Расширена база данных нуклеотидных последовательностей генов pmoA термофильных метанотрофных бактерий для использования молекулярно генетических методов детекции этих микроорганизмов.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на следующих международных и российских конференциях: Международная конференция «Экосистемы. Организмы. Инновации-12», Москва, Россия, 2010;
Международная конференция «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний», Улан-Удэ, Россия – Улан-Батор, Монголия, 2011;
VII молодежная школа-конференция с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, Россия, 2011;
European Geosciences Union General Assembly 2012, Вена, Австрия, 2012.
Публикации. Основные результаты, представленные в диссертации, опубликованы в 7 печатных работах: 3-х научных статьях в реферируемых журналах, включенных в список ВАК, и 4-х тезисах конференций.
Работа выполнена в лаборатории выживаемости микроорганизмов ИНМИ РАН с 2009 по 2012 гг. под руководством чл.-корр. РАН, д.б.н. Гальченко В.Ф. при финансовой поддержке проектов РФФИ № 08-04-00164-а, № 09-04-10113-к и № 10 04-10127-к.
Автор выражает глубокую признательность и благодарность своему научному руководителю чл.-корр. РАН, д.б.н. В.Ф. Гальченко за помощь при выполнении работы и обсуждении результатов, к.б.н Кравченко И.К. за полезные советы и поддержку на протяжении всего выполнения исследований, к.б.н. Кизиловой А.К., к.б.н. Менько Е.В. за помощь в освоении молекулярно-биологических методов, к.б.н. Сухачевой М.В. (Центр «Биоинженерия» РАН) и к.б.н. Русанову И.И. за участие в проведении отдельных экспериментов, Кострикиной Н.А. за помощь в освоении методов электронной микроскопии и д.б.н. Сорокину Д.Ю. за научные консультации и помощь в выполнении работы.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 123 листах машинописного текста, включает 11 рисунков и 13 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения и обсуждения результатов, выводов и списка используемой литературы. Список литературы включает работ, из них _ отечественных и _ зарубежных авторов.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1 Материалы и методы исследования 1.1 Объекты исследования Природный материал для исследований получен в серии экспедиций в кальдеру вулкана Узон (Камчатка) с 2008 по 2010 гг. от чл.-корр. РАН Гальченко В.Ф. и отобран автором работы лично при проведении полевых исследований в 2010 г.
Исследованные газогидротермы расположены в различных частях кальдеры, и основная их часть локализована на Восточном поле (17 источников), в районах озера Фумарольное (6 источников) и ручья Извилистый (7 источников). Были также изучены единичные источники на Оранжевом и Северном полях и других термальных участках.
В ходе выполнения работы был применен комплексный подход в исследовании газогидротерм, заключающийся в использовании микробиологических, культуральных, микроскопических, молекулярно-биологических, а также физико химических и биогеохимических методов.
1.2 Физико-химические и биогеохимические методы Температуру, рН и Eh измеряли с помощью портативных приборов (рН-420, «Аквилон», Россия) непосредственно в гидротермах в момент отбора проб.
Концентрации метана в образцах воды и осадков определяли согласно методике [Гальченко, 2001], анализ состава газовой смеси осуществляли на хроматографе «Кристалл 5000.1» («Хроматэк», Россия).
Содержание ионов в образцах воды определяли с помощью ионного хроматографа «СТАЙЕР» («Аквилон», Россия) с кондуктометрическим детектором.
Интенсивность микробного окисления метана определяли в пробах воды и осадков, отобранных непосредственно из гидротерм, модифицированным радиоизотопным методом в экспериментах с краткосрочной инкубацией (20–24 ч) проб в присутствии 14СН4, растворенного в стерильной дегазированной воде [Гальченко, 2001].
1.3 Микроскопические методы Морфологию и ультраструктуру клеток изучали в световом микроскопе с фазовым контрастом «Axio Imager D1» («Carl Zeiss», Германия) при общем увеличении l000, а также электронном микроскопе «JEM-100СХ» («JEOL», Япония) при напряжении 80 кВ, используя негативно-окрашенные препараты (клетки контрастировали 2% раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты) и ультратонкие срезы. При получении ультратонких срезов клеток применяли двойную глютар-осмиевую фиксацию [Миронов и др., 1994]. Для обнаружения капсул использовали цитохимическую реакцию на полисахариды с рутениевым красным [Гайер, 1974]. Обезвоживание клеточного материала осуществляли согласно модифицированной методике [Гальченко, 2001] путем последовательного переноса клеточного материала через растворы этилового спирта и ацетона возрастающей концентрации с последующим заключением образцов в эпоксидные смолы. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме «LKB АВ» («LKB», Швеция) и подвергали двойному последовательному окрашиванию уранилацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу [Уикли, 1975;
Reynolds, 1963].
1.4 Культуральные методы Так как целью настоящей работы являлось обнаружение метанотрофных бактерий в исследуемых гидротермах, при отборе образцов были созданы селективные условия для развития микроорганизмов данной группы. Для этого пробы воды и осадков в количестве 2 мл отбирали непосредственно из центральной части источников там, где проводили определение их физико-химических параметров. Сразу после отбора образцы асептически переносили во флаконы объемом 120 мл, содержащие: а) 20 мл минеральной среды «П» [Гальченко, 1986], разведенной в 5 раз, рН 7, для источников со слабокислыми и близкими к нейтральным значениями рН;
б) 20 мл среды «М3» [Dedysh et al., 1998] с рН 3 для источников с низкими значениями рН. В газовую фазу вносили метан до конечной концентрации 50% по объему и инкубировали в течение 7 сут в источнике Заварзина (56,7С). Полученные обогащенные образцы (первичные накопительные культуры) были использованы для детекции и оценки разнообразия метанотрофов. Выделение ДНК проводили сразу после поступления обогащенных образцов в лабораторию.
Выделение и культивирование микроорганизмов. Для получения накопительных культур метанотрофных бактерий из гидротерм с низкими значениями рН (2,6–3,8) использовали минеральную среду «М3» [Dedysh et al., 1998], следующего состава (г/л): MgSO4 7H2O – 0,1;
CaCl2 2H2O – 0,02;
KH2PO4 – 0,2;
дистиллированная вода – 1 л;
рН среды 2,5 – 3,5.
Для получения накопительных культур метанотрофов из источников со значениями рН 5,2–6,8 использовали среду «П» [Гальченко и др., 1986], разбавленную в 5 раз, содержащую (г/л): KNO3 – 0,2;
MgSO4 7H2O – 0,04;
CaCl2 – 0,004;
Na2HPO4 5H2O – 0,3;
KH2PO4 – 0,14;
дистиллированная вода – 1 л;
рН среды 6,8 – 7,2.
В среды добавляли: а) 1 мл/л среды раствора микроэлементов (мг/л): CuSO 5H2O – 0,1;
FeSO4 7H2O – 2,0;
ZnSO4 7H2O – 0,1;
Na2MoO4 – 0,03;
CoCl2 6H2O – 0,2;
EDTA – 5,0;
MnCl2 4H2O – 0,03;
NiCl2 6H2O – 0,02 [Гальченко и др., 1986];
б) 0,1 мл/л среды раствора витаминов (на 50 мл стокового раствора, мг): тиамин гидрохлорид – 12,5;
никотиновая кислота – 25;
пиридоксамин – 12,5;
р аминбензойная кислота – 12,5;
рибофлавин – 25;
биотин – 1,25;
В12 – 1,25 [Tsubota et al., 2005].
Для получения плотных сред добавляли предварительно отмытый в течение сут агар-агар («Difco», США) в конечной концентрации 2%.
Бактерии культивировали в пробирках Хангейта объемом 16,8 мл, содержащих 6 мл жидкой среды с соотношением газов в газовой фазе CH4 : CO2 : воздух = 80 : : 5. При использовании агаризованных сред инкубирование проводили в эксикаторах с 50% метана и 50% воздуха в газовой фазе.
1.5 Молекулярно-биологические методы Для выделения ДНК из обогащенных образцов и культур применяли коммерческий набор реактивов «Wizard Genomic DNA Purification Kit» («Promega», США).
Полученные препараты тотальной ДНК использовали для амплификации фрагмента рибосомального гена 16S рРНК и функциональных генов метанотрофов (End-point PCR, qPCR) с помощью систем специфических праймеров (табл. 1). Реакционная смесь для проведения ПЦР (25 мкл) содержала:
однократный ПЦР буфер (17мМ (NН4)2SO4;
67 мМ Трис-HCl;
рН 8,8;
2 мМ MgCl2);
50 ммоль dNTP;
25 пмоль каждого из праймеров;
по 0,6 единицы Taq ДНК полимеразы и бычьего сывороточного альбумина (BSA) («Хеликон», Россия).
Для повышения чувствительности метода ПЦР проводили в 2 стадии (nested подход), и для второй стадии были использованы прямой праймер А189F [Muyzer et al., 1993] и обратный праймер mb661R [Dumont, Murrell, 2005], а также амплификат первой стадии в качестве матрицы. В случае дальнейшего разделения ампликонов методом ДГГЭ, для второй стадии использовали прямой праймер А189F (GC – clamp) [Muyzer et al., 1993] и обратный праймер mb661R [Dumont, Murrell, 2005], а также амплификат первой стадии в качестве матрицы (табл. 1).
Анализ продуктов ПЦР проводили в 1,2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия для визуализации ДНК.
ПЦР в реальном времени (qPCR) использовали как более чувствительный вариант метода. Для детекции генов 16S рРНК (все представители домена Bacteria) и pmoA (только метанотрофы) использовали праймеры, аналогичные таковым для End-point ПЦР: 341 F – 907 R – для детекции и определения количества копий генов всех Bacteria [Muyzer et al., 1993], и А189F – A682R – для метанотрофов [Holmes et al., 1995]. qPCR проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 1 ПЦР буфер Б (KCl, ТрисHCl (рН 8,8), 6,25 мМ MgCl2), Taq ДНК – полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты, глицерин, Tween 20, интеркалирующий краситель SYBR Green I и пассивный референсный краситель ROX («Синтол», Россия), пкмоль каждого праймера и ДНК-матрицу.
Таблица 1. Описание систем праймеров и заданных температурно-временных условий ПЦР, использованные в данной работе Группа ПЦР организмов, гены- Температурно-временной профиль Ссылка праймеры мишени 5 мин при 94С;
20 циклов – 1 мин при 94С, 1 мин при 65С с последующим снижением температуры 0,5С каждый новый цикл до 55С, 3 мин при 72С;
15 циклов – 1 мин при Бактерии, 341 F Muyzer et al., 94С, 1 мин при 55С, 3 мин при 72С;
7 мин 16S рРНК 907 R при 72С *активация полимеразы 3 мин при 95C, циклов – 30 с при 95C, 30 с при 56C и мин при 62C 3 мин при 94С;
20 циклов – 30 с при 94С, 30 с при 62С с последующим снижением температуры на 0,5С каждый новый цикл и 45 с при 72С;
15 циклов – 30 с при Метанотрофы, А189F Holmes et al., 94С, 30 с при 52С и 45 с при 72С, pmoA A682R конечная элонгация – 5 мин при 72С *активация полимеразы 3 мин при 95C, циклов – 30 с при 95C, 30 с при 56C и мин при 62C Muyzer et al., Метанотрофы А189F 2 мин при 94С;
25 циклов – 1 мин при 94С, (nested подход, 2 (GC – clamp) 1,5 мин при 55С и 1 мин при 72С и Dumont стадия) pmoA конечная элонгация – 5 мин при 72С mb661R Murrell, *температурно-временной профиль, используемый в qPCR.
Гибридизация in situ с флуоресцентно-мечеными олигонуклеотидными зондами (FISH). Фиксацию материала обогащенных образцов раствором параформальдегида и гибридизацию с зондами проводили при температуре 46С в соответствии с методикой [Stahl, Amann, 1991]. Для специфической детекции метанотрофов II типа использовали зонд М-450 – 5' ATC CAG GTA CCG TCA TTA TC – 3' (30% формамида в гибридизационном буфере), а метанотрофов I типа – смесь зондов М-84 – 5' CCA CTC GTC AGC GCC CGA – 3' и М-705 – 5' CTG GTG TTC CTT CAG ATC – 3' (20% формамида) [Eller et al., 2001]. Для детекции представителей домена Bacteria использовали: смесь универсальных зондов EUB 338mix (EUB-338 I – 5' GCT GCC TCC CGT AGG AGT – 3' для Eubacteria;
EUB- II – 5' GCA GCC ACC CGT AGG TGT – 3' для Planctomycetales;
EUB-338 III – 5' GCT GCC ACC CGT AGG TGT – 3' для Verrucomicrobiales [Diams et al., 1999]. Зонды, меченые флуоресцентным красителем Су3, синтезированы компанией «Синтол» (Москва, Россия).
Метод молекулярного клонирования применяли для анализа состава сообществ накопительных культур метанотрофных бактерий. Очищенные продукты амплификации клонировали с помощью «pGEM-T easy vector system I» («Promega», США) в компетентных клетках E.coli DH10B. Для создания каждой библиотеки клонов случайным образом отбирали по 50 колоний, проявивших положительную реакцию (белые). С материалом колоний ставили ПЦР с универсальными плазмидными праймерами M13F и M13R. Наличие вставки оценивали методом агарозного электрофореза. Генетический материал клонов, содержащих вставки 16S рРНК, был секвенирован в сервисной лаборатории «Синтол» (Москва, Россия).
ДГГЭ анализ обогащенных образцов и накопительных культур проводили с ампликонами pmoA генов метанотрофных бактерий (праймер A189F(GC) (GC – clamp). Использовали гели, содержащие градиент денатурантов 50–80%. ДГГЭ анализ выполняли с использованием прибора «DCode Universal Mutation Detection System» («BioRad», США) при следующих условиях: электрофорез в 6,5 л 0,5 ТАЕ буфере при постоянной температуре 60С в течение 17 ч и напряжении 100 В.
Для визуализации продукта полученные гели окрашивали раствором бромистого этидия и документировали с помощью системы гель-документации «Gel Doc System» («BioRad», США). Фрагменты геля с характерными видимыми полосами вырезали, ДНК из них элюировали, очищали и использовали в качестве матрицы для реамплификации. ПЦР-продукт после реамплификации очищали с помощью набора «QiaQuick Gel Extraction Kit» («Qiagen», США).
Секвенирование проводили в сервисной лаборатории «Синтол» (Москва, Россия) с помощью набора реактивов «Big Dye Terminator v.3» («Applied Biosystems Inc.», США). Нуклеотидные последовательности определяли на автоматическом секвенаторе «ABI Prism 3100» («Applied Biosystems Inc.», США).
Филогенетический анализ. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей фрагментов генов проводили с помощью программного пакета BLAST [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST].
Транслирование нуклеотидных последовательностей фрагментов генов pmoA осуществляли с помощью редактора «BioEdit» [http://jwbrown.mbio.
ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html]. В этой же программе нуклеотидные и транслированные аминокислотные последовательности редактировали и выравнивали с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий.
Филогенетическое дерево строили на основании транслированных аминокислотных последовательностей фрагментов генов pmoA с помощью методов, реализованных в пакете программ «TREECONW» [http://bioc www.uia.ac.be/u/yvdp/treeconw.html].
Депонирование нуклеотидных последовательностей. Полученные в настоящей работе нуклеотидные последовательности фрагментов генов pmoA были депонированы в базе данных «GenBank» [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank] под номерами JQ513935–JQ513944.
2 Основные результаты исследований и их обсуждение 2.1 Характеристика гидротерм Восточное поле – наиболее изученная часть кальдеры Узона, где проводятся многолетние разнообразные исследования, в том числе и микробиологические. Все проанализированные гидротермальные источники Восточного поля характеризовались нейтральной или слабокислой реакцией среды (рН 5,2–6,8), высокой температурой (48,7–86,6С) и слабыми восстановительными условиями (Eh от +24 до -107 мВ) (табл. 2). В воде всех гидротерм присутствовал растворенный метан в количестве 29,9–250,5 мкл/л.
В районе ручья Извилистый было исследовано семь источников с низкими значениями рН (2,6–3,8) и температурами от 40,6 до 69,7С. Источник Гейзеритовый (образец №14) имел несколько отличные характеристики (рН 5,1, 85,7С).
Окислительно-восстановительные условия источников можно охарактеризовать как переходные, с неустойчивым геохимическим режимом и переменным содержанием сероводорода и кислорода. Метан присутствовал во всех гидротермах в концентрациях от 38,9 до 346,4 мкл/л.
Источники третьей группы в районе озера Фумарольное (берег озера и термальное поле Карбонатное) характеризовались слабокислой реакцией среды (рН 5,2–6,6), температурой от 56,1 до 65С, переходными редокс условиями среды и высокими концентрациями метана (56,6–161,8 мкл/л). Один источник этой группы – Рыжик (образец №24), отличался переходными условиями (+43 мВ) и более низкими значениями температуры (39С) и содержания метана (55,6 мкл/л).
Источники, образующие термальный участок у озера Хлоридного, различались по температуре (37 и 64,1С), имели слабокислую/кислую (рН 5,3;
6,2 и 3,4) реакцию среды и переходные редокс условия (+153–+60 мВ). Содержание метана – 221,1;
61,6;
и 361,6 мкл/л.
Единичные источники на Оранжевом и Северном полях были высокотемпературными слабокислыми с восстановительными условиями – температура 65 и 70С и Eh -37 и -2 мВ, соответственно.
Таблица 2. Объекты исследования и их основные параметры Количество Диапазон Содержание Участок исследованных Диапазон рН СН4, мкл/л температур, С источников Восточное поле 17 48,7–86,6 5,2–6,8 29,9–250, Район ручья 7 40,6–85,7 2,6–5,1 38,9–346, Извилистый Район оз.
6 39,0–65,0 5,2–6,6 55,6–161, Фумарольное Термальное поле у 221,1;
61,6;
3 37;
64,1;
64,1 6,2;
5,3;
3, оз. Хлоридное 361, Оранжевое поле 1 65,0 6,0 253, Северное поле 1 70,0 6,0 69, 2.2 Интенсивность микробного окисления метана Проведенные исследования показали наличие во всех исследованных источниках растворенного метана (29,9–361,6 мкл/л), поэтому следующим этапом было определение интенсивности микробного окисления этого газа при помощи радиоизотопного метода. Процесс окисления метана был зарегистрирован в 8-ми из 35 исследованных гидротерм.
Для оценки эффективности использования метана микроорганизмами учитывали долю углерода метана не только окисленного до СО2, но и включенного в их биомассу. Высокие скорости окисления метана до СО2 (энергетический метаболизм) зарегистрированы в источниках Терра, Строма и Квадрат (1338;
513;
165 нг С /л в сут, соответственно). Наибольшие величины включения метки 14С в биомассу (конструктивный метаболизм) были обнаружены в гидротермах Строма, Терра, Сборный (141;
132;
21 нг С /л в сут, соответственно) (табл. 3).
Суммарные величины метанокисления варьировали от 26 до 1471 нг С /л в сут.
Наибольшая интенсивность метанокисления была отмечена в источнике Терра (65С, рН 6,2), наименьшая – в ручье Извилистый (40,6С, рН 2,6). Интенсивность окисления метана в остальных шести источниках не превышала 700 нг С /л в сут).
2.3 Детекция метанотрофов методом ПЦР в реальном времени Первым этапом в выявлении метанотрофных бактерий в обогащенных образцах было использование метода End-point PCR, однако, продукт удалось получить только для 2 образцов. Основываясь на результатах метода радиоактивных Таблица 3. Характеристики газогидротерм Интенсивность Содержание минерализа метанокисления ция, мг/мл Содержание ионов, мг/л газов, мкл/л Общая (нг C/л.сут) № T, Eh, Источник Координаты pH пробы C мВ СН4 СН СН NO3 СН4 Н2 Биом Na+ K+ NH4+ Ca2+ Mg2+ Cl- SO42 (общ) СО2 (%) Район ручья Извилистый Ручей o N 54 30,019' 15 40,6 2,6 242 38,9 9,2 113,4 10,4 7,3 18,5 4,2 74,7 99,1 327,6 21 5 (18,7) Извилистый E160o00,448' N 54o30,128' н.о. н.о. н.о. н.о. н.о. н.о. н.о. н.о.
Комета н.о.
17 51,1 2,8 165 77,1 10,4 43 3 (5,8) E160o00,444' N 54o30,076' н.о. н.о. н.о. н.о. н.о. н.о. н.о. н.о.
Сборный н.о.
18 54,2 2,7 286 346,4 10,1 65 21 (24,2) E160o00,435' Район оз. Фумарольное N 54о30. Культурный 19 63 5,2 280 161,8 15 35 0 28 1,2 7,4 4 0,9 0 76,5 136 11 (7,1) E159о59. н.о. н.о. н.о. н.о. н.о. н.о. н.о. н.о.
N 54o29,887' Терра н.о.
20 65 6,2 273 143,8 13,8 1338 132 (9,0) E159o59,410' N 54o29,855' Строма 21 56,1 5,3 205 72,6 18,7 191,7 21,0 1,1 62,7 51,7 35,9 176,6 3,5 544,2 513 E159o59,474' (21,5) н.о. н.о. н.о. н.о. н.о. н.о. н.о. н.о.
N 54o29,862' Квадрат н.о.
22 64,5 6,3 178 56,6 13,9 165 7 (4,0) E159o59,485' Глаз N 54o29,886' н.о 23 59,8 6,2 72,3 10,8 266,3 23,8 3,4 13,1 19,8 127,0 48,1 0 501,4 78 10 (11,3) Дракона E159o59,469' н.о. – не определяли.
изотопов, указывающих на наличие метанокисляющей активности в 8 источниках, был применен метод ПЦР в реальном времени, как более чувствительный.
Наличие бактериальных генов 16S рРНК было зафиксировано с помощью метода qPCR во всех исследованных обогащенных образцах. Только в 8-ми количество копий гена pmoA, молекулярного маркера метанокисления, превышало уровень детекции, который составлял 3–6 103 копий/мл. Таким образом, несмотря на наличие метана во всех гидротермах, метанотрофы были обнаружены лишь в обогащенных образцах.
Результаты, полученные с применением метода qPCR, находятся в соответствии с данными по определению метанокисляющей активности радиоизотопным методом.
2.4 Выявление метанокисляющих бактерий методом End-point PCR Для молекулярной детекции прокариот и метанотрофов в обогащенных образцах была проведена амплификация фрагментов рибосомального гена 16S рРНК и функционального гена pmoA, кодирующего мембранную метанмонооксигеназу.
Результаты анализа показали присутствие представителей домена Bacteria во всех 35 исследованных источниках.
При выявлении метанотрофов в исследуемом материале методом End-point PCR в целях повышения чувствительности ПЦР проводили в 2 стадии (nested подход).
Метанотрофные бактерии были обнаружены в обогащенных образцах восьми источников (рис. 1), подтвердив результаты, полученные методом qPCR.
L 19 20 21 22 23 15 17 18 + 15 17 18 23 20 21 22 19 - + А Б Рис. 1. Визуализация результатов ПЦР с помощью агарозного электрофореза А – 1 стадия;
Б – nested подход, 2 стадия 15–23 – порядковые номера образцов, «–» отрицательный контроль;
«+» положительный контроль, Methylosinus trichosporium;
«L» – маркер молекулярного веса.
Отметим, что сведения о метанотрофах в нейтральных и слабокислых источниках Камчатки с температурами выше 40С в литературе отсутствуют, и в нашем исследовании впервые было зафиксировано их наличие.
Таким образом, документально доказано присутствие метанокисляющих бактерий в 8-ми из 35 исследованных образцов. Так как выявление метанотрофов стало возможным лишь при использовании высокочувствительных методов (qPCR, nested подход, End-point PCR), можно утверждать, что их количество невелико.
2.5 Оценка разнообразия метанокисляющих бактерий в обогащенных образцах 2.5.1 Оценка состава метаболически активных клеток метанотрофов методом FISH Наличие метаболически активных клеток, дающих характерное свечение с зондом, специфичным для всех представителей домена Bacteria (зонд EUB-338 mix), зарегистрировано во всех 35 исследованных обогащенных образцах. При этом метанокисляющие бактерии с использованием специфических зондов обнаружены в 8-ми из 35 проанализированных проб.
Результаты по выявлению метанотрофов методом FISH согласуются с данными методов, использующих ПЦР, и данными радиоизотопного анализа.
С использованием специфических зондов было установлено, что метанотрофы представлены только Gammaproteobacteria (зонд М-84 + М-705). Количество метанотрофов II типа (Alphaproteobacteria) (зонд М-450) было ниже уровня детекции. Эти результаты согласуются с опубликованными в литературе данными о доминировании метанотрофов I типа в высокотемпературных местообитаниях [Bodrossy et al., 1997;
1999;
Tsubota et al., 2005;
Hirayama et al., 2011]. Также нам не удалось обнаружить в исследуемых образцах и представителей Verrucomicrobia (зонд EUB-338 III).
При гибридизации образцов с зондом, специфичным для I типа метанотрофов, положительный сигнал давали клетки сходной морфологии: в обогащенных образцах № 19, 20, 21, 22, 23 – округлые палочки, а в № 15, 17, 18 – тонкие палочки длиной около 1 мкм.
Таким образом, применение метода флуоресцентной гибридизации in situ позволило установить наличие метаболически активных клеток, морфологически сходных между собой и относящихся к метанотрофам I типа. Использование метода FISH было сопряжено со значительными трудностями, связанными со спецификой объектов исследования – высокая минерализация гидротерм, наличие органического вещества циано-бактериальных матов затрудняли анализ образцов вследствие механической загрязненности препаратов и интенсивного неспецифического свечения.
2.5.2 ПЦР – ДГГЭ анализ фрагмента гена pmoA Для обогащенных образцов из 8 источников, в которых был успешно амплифицирован продукт фрагмента гена pmoA ожидаемого размера, проведено разделение смеси ампликонов методом ДГГЭ. Количество характерных полос для каждого образца составляло не более трех, что может служить свидетельством низкого разнообразия метанотрофов. Исключением стал образец из источника Строма, где в полиакриламидном геле было зафиксировано 8 отдельных четких полос. Однако после реамплификации и сиквенса материала этих полос все полученные последовательности оказались одинаковыми (100% идентичности транслированных белковых последовательностей) и проявили высокое сходство с последовательностями Methylothermus subterraneus [Hirayama et al., 2011].
Филогенетический анализ показал, что в четырех источниках района озера Фумарольное (Культурный, Терра, Строма, Квадрат – последовательности Ku19-04, T20-11, S21-05, Kv22-14, соответственно) присутствуют метанотрофы, наиболее близкие к представителям рода Methylothermus (рис. 2). В пробах из источников Культурный (последовательность Ku19-04) и Квадрат (Kv22-14) идентифицированы метанотрофы, проявившие сходство с утраченным в культуре термофильным метанотрофом НВ [Bodrossy et al., 1999], но, тем не менее, значительно отличающиеся от него (около 90% идентичности). Один из двух метанокисляющих организмов из источника Терра (Т20-11) оказался достаточно далеким родственником как термофильного метанотрофа НВ, так и валидно описанных метанотрофов рода Methylothermus. Для метанотрофа из образца Строма (S21) ближайшим родственником оказался Methylothermus subterraneus, выделенный из горячих (69С) подземных водоносных слоев золотодобывающих рудников Японии.
В образцах из источников Терра и Глаз Дракона были обнаружены последовательности Т20-10 и DY23-25, наиболее близкие к некультивируемым представителям рода сходства), что для Methylomonas (65–70% высокотемпературных источников показано впервые.
Исследования, проведенные с помощью системы праймеров А189F и A682R и протокола амплификации со сниженной температурой отжига для уменьшения специфичности праймеров [Pol et al., 2007], не выявили присутствия в высокотемпературных источниках с низкими значениями рН (Извилистый – №15, Комета – №17, Сборный – №18) метанокисляющих Verrucomicrobia, ранее найденных в сходных условиях. В то же время, в данных источниках были обнаружены метанокисляющие организмы, относящиеся к Gammaproteobacteria. Во всех трех источниках ближайшим культивируемым родственником выявленных нами метанотрофов (последовательности Iz15-23, Km17-18 и Sb18-21) была гаммапротеобактерия Methylomonas methanica (рис. 2). В источнике Комета был также обнаружен второй метанокисляющий организм (Кm17-22), проявивший наибольшее сходство с Methylobacter tundripaludum (рис. 2).
Проведенный анализ разнообразия метанотрофов на основе анализа фрагментов генов pmoA выявил существенные различия в их составе для разных источников. Для выяснения возможных причин этих различий был проведен сравнительный анализ физико-химических и геохимических показателей, а также микробного разнообразия гидротерм Строма, Глаз Дракона, Культурный и ручья Извилистый (табл. 3). В двух из них – Строма и Культурный, характеризовавшихся высокими показателями значений температуры и рН, были обнаружены метанотрофы, проявившие высокое сходство с разными представителями рода Methylothermus. В источнике Культурный, отличающемся низкой минерализацией, был обнаружен метанотроф, Рис. 2. Филогенетическое дерево, построенное на основе транслированных аминокислотных последовательностей фрагментов PmoА, полученных по результатам анализа обогащенных образцов 2010 года. Последовательности, полученные в данной работе, выделены жирным шрифтом. Номера базы данных GenBank использованных последовательностей фрагментов генов указаны в скобках. Масштаб соответствует 10 заменам на 100 аминокислотных остатков. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью bootstrap_анализа 500 альтернативных деревьев (значимыми являются значения более 50).
наиболее близкий к Methylothermus’ HB, выделенному из горячего источника Венгрии.
В то же время, в источнике Строма с такими же физико-химическими характеристиками, но высоким содержанием сульфатов, был обнаружен другой метанотроф, ближайшим родственником которого оказался Methylothermus subterraneus. В образце из источника Глаз Дракона был обнаружен метанотроф, проявивший наибольшее сходство с некультивируемыми представителями рода Methylomonas. По своим физико-химическим характеристикам источник Глаз Дракона (59,8С;
рН 6,2) был близок к источникам Культурный и Строма и имел высокий уровень минерализации. Особенно высоко оказалось содержание ионов хлора, натрия и калия, отмечено присутствие минеральных соединений азота – аммония и нитрата. Анализ обогащенного образца из ручья Извилистый обнаружил присутствие в нем организма, ближайшим культивируемым родственником которого была бактерия Methylomonas methanica. Этот ручей отличался не только умеренными значениями температуры и экстремально низкими значениями рН, но и высокой степенью минерализации.
Нам не удалось обнаружить представителей метанотрофных Verrucomicrobia в исследованных кислых источниках. Возможно, их количество было ниже предела детекции ПЦР, или последовательность их гена pmoA настолько сильно отличается от таковой у протеобактерий, что существующие праймерные системы не могут успешно применяться даже при использованной нами процедуре снижения их специфичности.
Впервые обнаружено присутствие метанотрофных Gammaproteobacteria в термальных экосистемах с экстремально низкими значениями рН (2,6–2,8). В настоящее время описан только один ацидотолерантный метанокисляющий организм I типа, Methylomonas paludis, выделенный из сфагнового болота (рН 3,9) северо-восточной части России [Danilova et al., 2013].
Таким образом, горячие источники, в которых были обнаружены метанотрофные бактерии, образуют две группы – высокотемпературные нейтральные гидротермы в районе оз. Фумарольное, в которых обнаружены организмы, близкие к Methylothermus, и кислые источники с умеренными значениями температуры, располагающиеся вдоль ручья Извилистый, в которых присутствовали бактерии, отдаленно сходные с Methylomonas и Methylobacter.
2.7 Выделение и характеристика термофильных и термотолерантных метанотрофных сообществ В ходе проведения работы получено 13 накопительных культур – из образцов, отобранных в 2008 году: К14 (источник Культурный, образец №14), К7, К8 (Глаз Дракона, №7, 8), К11, К12 (Строма, №11, 12);
из образцов, отобранных в 2010 году:
Iz15 (ручей Извилистый, №15), Km17 (Комета, №17), Sb18 (Сборный, №18), Ku (Культурный, №19), T20 (Терра, №20), S21(Строма, №21), Kv22 (Квадрат, №22), DY23 (Глаз Дракона, №23).
По данным молекулярно-биологических анализов, в каждой накопительной культуре содержалось по одному метанотрофу.
2.7.1 Оценка филогенетического разнообразия метанотрофов на основе анализа фрагмента гена 16S рРНК Исследование филогенетического разнообразия метанотрофов методом молекулярного клонирования фрагмента гена 16S рРНК было проведено на примере накопительной культуры К14. Из анализа результатов клонирования (табл.
4) следует, что доминирующим организмом (29 клонов из 50) был метанотроф, наиболее близкий к штамму НВ [Bodrossy et al., 1999]. Минорные компоненты (1– клонов) представлены термофильными организмами, проявившими высокую степень сходства с бактериями, выделенными из термальных источников Камчатки, Йеллоустонского национального парка [Hugenholtz et al., 1998], Тибета [Lau et al., 2009] и геотермальных почв Новой Зеландии [Stott et al., 2008].
Таблица 4. Разнообразие бактерий в накопительной культуре К14, определенное методом клонирования фрагмента гена 16S рРНК Количество Процент покрытия Ближайший представитель клонов, шт. (сходство) Термофильный метанотроф HB (U89302) 98% (99%) 98% (94%) Некультивируемая бактерия SL_5.95 (AY550713) Некультивируемый представитель Chlorobi 95% VSM5Q1u (EU631213) 94% Некультивируемая зеленая серная бактерия 14, SM1H02 (AF445702) Thermoactinomyces sacchari (AM161154) 98% (83%) Некультивируемая бактерия LaC15L24 (EF667582) 5 73% (89%) 9% (83%) Propionibacterium acnes (AM161153) Некультивируемая бактерия ZB_P10_C06 83% (100%) (GQ328567) из источника Заварзина в Узоне Некультивируемая бактерия Acidobacteriaceae 83% (95%) (AM935486) Pseudomonas putida (AM161157) 98% (95%) Некультивируемая бактерия ZB_P14_B04 16S 73% (97%) (GQ328675) из источника Заварзина в Узоне 73% (96%) Представитель группы OP10 клон OPB (AF027089) из горячего источника Йеллоустонского парка Некультивируемая бактерия ZB_P13_F12 73% (85%) (GQ328655) из источника Заварзина в Узоне Некультивируемая бактерия TP146 (EF205576) и 78% (97%) горячего источника центрального Тибета 1 78% (94%) Некультивируемый представитель Acidobacteria (AM749745) из геотермальных почв Новой Зеландии Из полученных данных следует, что сообщество накопительной культуры К представлено небольшим числом видов, типичных для гидротерм, где единственным метанокисляющим организмом оказалась бактерия, ближайшим родственником которой является термофильный метанотроф НВ, ранее выделенный из горячего источника Венгрии.
Другим примером использования молекулярно-биологических методов для диагностики метанотрофов было проведение анализа фрагмента гена 16S рРНК методом ПЦР-ДГГЭ, на примере накопительной культуры S21.
ДГГЭ-профиль для этой накопительной культуры включал 3 полосы (рис. 3), сравнительный сиквенс-анализ которых показал для двух из них высокую степень сходства с организмами рода Methylothermus (94–98% сходства нуклеотидных последовательностей). Анализ последовательностей третьей полосы продемонстрировал высокую степень сходства (98%) с представителями рода Thermaerobacter, которые не являются метанотрофами.
Рис. 3. Профиль разделения фрагментов гена 16S рРНК культуры S21 (источник Строма, №21) методом ДГГЭ. Стрелками и цифрами обозначены полосы, которые были использованы для дальнейшего сиквенс-анализа.
2.7.2 Характеристики роста накопительных культур Накопительные культуры, доля клеток метанотрофов в которых составляла 80– 97%, получали путем последовательных пересевов. При подборе условий культивирования учитывали характеристики гидротерм, откуда были получены культуры (температура, рН, степень минерализации). На протяжении всего процесса культивирования присутствие клеток метанотрофов подтверждалось методами End point PCR (детекция фрагмента гена pmoА) и гибридизации in situ с флуоресцентно мечеными олигонуклеотидными зондами М-84 + М-705 (I группа метанотрофов).
Культуры Iz15, Km17 и Sb18 в среде «М3» выращивали при температурах 40С, 50С и 55С, соответственно. Все эти культуры характеризовались низкой скоростью роста, относительно малой долей метанотрофов и большим разнообразием сопутствующих организмов (6–8 компонентные сообщества). Посевы на агаризованную среду позволяли получать только колонии спутников, но не метанотрофов.
Культуры К7, К8 и DY23 инкубировали при температурах 50–55С в среде «ANMS», а культуры К11, К12, К14, Ku19, S21, T20, Kv22 – в разбавленной в 5 раз среде «П» при тех же температурах.
В жидкой минеральной среде культуры К7, К8, К11, К12, T20, Kv22 и DY росли в виде белых или светло-бежевых хлопьевидных скоплений, которые представляли собой ассоциации метанокисляющих бактерий с гетеротрофными спутниками, с высокой долей в них метанотрофов (рис. 4).
Культуры К14 и Ku19 в жидкой среде развивались в виде равномерной взвеси, без хлопьев. Хотя рост характеризовался как нестабильный, при высеве К14 на агаризованную среду удалось получить колонии, которые были смешанными, но с преобладанием метанотрофного организма (рис. 4).
А Б В Рис. 4. Фазово-контрастные фотографии клеток накопительных культур метанотрофов в суточной культуре на жидкой минеральной среде с метаном А – К8, источник Глаз Дракона;
Б – Ku19, источник Культурный;
В – S21, источник Строма.
Культура S21 характеризовалась стабильным равномерным ростом в жидкой минеральной среде. В фазах экспоненциального и линейного роста преобладали одиночные клетки или диплоформы (рис. 4), в фазе замедленного роста и стационарной фазе за счет выделяемой метанотрофами слизи образовывались скопления, которые визуально выглядели как хлопья. При высеве на агаризованную среду через 1 – 2 недели культивирования развивались круглые выпуклые гладкие светло-бежевые непрозрачные слизистые колонии с ровными краями 0,4–0,8 мм в диаметре. Температурные границы роста культуры S21: от 40 до 65С с оптимумом при 50–55С.
2.7.3 Морфологические характеристики метанотрофов При гибридизации клеток культур с флуоресцентно-мечеными олигонуклеотидными зондами М-84 + М-705 (I группа метанотрофов), они давали четкий положительный сигнал. Морфологически метанотрофные клетки, дающие сигнал с зондом, были двух типов: 1) короткие, крупные (около 1 мкм) округлые палочки, которые хорошо выявлялись методом фазового контрастирования (препараты живых клеток) в культурах, растущих при значениях рН близких к нейтральному (К7, К8, К11, К12, К14, Ku19, T20, S21, Kv22, DY23);
2) веретеновидные, довольно крупные клетки (0,7–1 мкм) в культурах, растущих при низких рН (Iz15, Km17, Sb18).
Методом электронной микроскопии тотальных препаратов выявлено наличие полярного жгутика у клеток культуры S21 (рис. 5а). У клеток остальных культур жгутики не обнаружены (рис. 5б).
Электронно-микроскопический анализ ультратонких срезов клеток метанотрофов обнаружил мембранные структуры, представляющие собой стопки уплощенных везикул, заполняющих значительную часть клетки, что характерно для метанотрофов I типа (рис. 5в). Клетки, выделяя значительное количество слизи, оказываются заключенными в чехлы, на которых размещаются бактерии-спутники (рис. 5г). Благодаря применению в фиксирующем растворе рутениевого красного обнаруживается фибриллярное строение слизистого материала. В старых клетках хорошо просматриваются электронно-плотные включения в виде гранул неправильной формы (рис. 5д, 5е).
А Б В Г Д Е Рис. 5. Электронные микрофотографии целых клеток (А, Б;
маркер – 0,5 мкм) и ультратонких срезов (В – Е;
маркер – 0,1 мкм) клеток накопительных культур метанотрофов А – S21, источник Строма;
Б – Ku19, источник Культурный;
В – S21, источник Строма;
Г – Ku19, источник Культурный;
Д – Т20, источник Терра;
Е – S21, источник Строма.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Несмотря на многочисленные микробиологические исследования, проводимые на территории Камчатки, к началу нашей работы информация о видовом разнообразии и распространении метанокисляющих бактерий, населяющих гидротермы данной территории, была весьма ограниченной. Был выделен и идентифицирован термоацидофильный метанотроф «Methyloacida kamchatkensis» [Islam et al., 2008];
для ряда источников с умеренными значениями температур зафиксированы процессы микробного окисления метана (максимум при 37С) и выявлены представители родов Methylococcus, Methylomonas, Methylosinus, Methylocyatis, Methyloacidiphilum [Хмеленина и др., 2011].
При исследовании 35 термальных источников в них был определен растворенный метан, однако, достоверная интенсивность его окисления была выявлена лишь в 8-ми гидротермах при варьировании скорости окисления от 26 до 1471 нг С /л в сут. Значительная часть окисленного метана (до 24,2%) переходила в биомассу и органическое вещество, что доказывает функциональную активность метанокисляющих бактерий в анализируемых природных системах.
Из всех 35 гидротерм были получены обогащенные образцы, в которых проведен мониторинг присутствия метанотрофов методом ПЦР с использованием в качестве маркера фрагмента функционального гена pmoA. Метанотрофные бактерии были обнаружены в 8-ми источниках. Методом флуоресцентной гибридизации in situ клеток (FISH) определена принадлежность этих бактерий к метанотрофам I типа.
Оценка обогащенных образцов из исследуемых гидротерм, проведенная с использованием метода ДГГЭ, продемонстрировала низкое разнообразие метанотрофов (1–2 вида в образце).
Филогенетическим анализом фрагментов генов pmoA обогащенных образцов из 4-х источников было подтверждено присутствие метанотрофов, близких к Methylothermus (около 90% идентичности). В пробах из источников Культурный (образец №19), Терра (№20), Квадрат (№22) обнаружены метанотрофы, проявившие достаточно высокую степень сходства с термофильным метанотрофом НВ, но отличающиеся от него. Для метанотрофа из образца №21 (источник Строма) ближайшим родственником оказался Methylothermus subterraneus, выделенный из горячих подземных водоносных слоев золотодобывающих рудников Японии. В образцах из источников Терра (№20) и Глаз Дракона (№23) были обнаружены последовательности (Т20-10 и DY23-25), наиболее близкие к некультивируемым представителям рода Methylomonas (65–70% сходства), что для гидротерм с температурой выше 40С показано впервые. Таким образом, только в образце из источника Терра (№20) обнаружено 2 метанотрофа, в остальных – по одному.
В образцах №15, №17 и №18 (Извилистый, Комета, Сборный, соответственно) из высокотемпературных источников с низкими значениями рН были обнаружены метанокисляющие организмы, относящиеся к Gammaproteobacteria. Во всех трех пробах ближайшим культивируемым родственником выявленных метанотрофов оказалась гаммапротеобактерия Methylomonas methanica. В образце из источника Комета был также обнаружен второй метанокисляющий организм Кm17-22 (рис. 2), проявивший наибольшее сходство с Methylobacter tundripaludum.
По физико-химическим характеристикам источники, в которых были обнаружены метанотрофные бактерии, образуют две группы: 1) высокотемпературные гидротермы со слабокислыми значениями рН в районе оз.
Фумарольное и 2) источники с умеренными значениями температуры и экстремально низкими рН вдоль ручья Извилистый.
Особый интерес представляет сочетание низких значений рН и высоких температур. Ранее из термальных источников Камчатки с подобными характеристиками (pH 3,5) были выделены ацидотермофильные метанокисляющие представители филума Verrucomicrobia. В нашей работе не удалось обнаружить представителей данного филума ни методом FISH, ни ПЦР. Однако обнаружено присутствие метанотрофных Gammaproteobacteria, что в рассматриваемых экосистемах, сочетающих экстремально низкие значения рН и высокие температуры, показано впервые. В настоящее время описан только один метанокисляющий организм I типа, выделенный из сфагнового болота (рН 3,9) и отнесенный к роду Methylomonas [Danilova et al., 2013].
Из обогащенных образцов восьми источников (Культурный, Глаз Дракона, Строма, ручей Извилистый, Комета, Сборный, Терра, Квадрат – образцы 2008 и 2010 года) путем последовательных пересевов на селективных средах и при снижении содержания кислорода в газовой фазе (2–5%) было выделено накопительных культур метанотрофов, в каждой из которых присутствовало по одному метанотрофу.
Таким образом, в результате проведенных исследований, основанных на использовании радиоизотопного анализа и молекулярно-биологических методов, впервые получены данные об активности, распространении и разнообразии метанотрофных бактерий в гидротермах Камчатки с температурами выше 40С.
Благодаря применению ПЦР технологий (ПЦР-детекция, ПЦР-ДГГЭ) и флуоресцентной гибридизации in situ для анализа рибосомальных генов, а также функциональных генов, отвечающих за синтез ключевых ферментов окисления метана, было установлено, что разнообразие термофильных метанотрофов в исследованных источниках ограничивается бактериями, наиболее близкими к Methylothermus, Methylomonas и Methylobacter.
В целом, результаты проведенных исследований значительно расширяют существующие представления о разнообразии метанотрофов в экстремальных местообитаниях, в частности, в горячих источниках, расположенных в кальдере вулкана Узон.
ВЫВОДЫ 1. Впервые проведены комплексные физико-химические, микробиологические и молекулярно-биологические исследования наземных газогидротерм Камчатки (кальдера вулкана Узон) с температурами выше 40С с целью изучения биогеохимического процесса окисления метана и разнообразия метанотрофных сообществ.
2. Из 35 исследованных термальных гидротерм активный процесс метанокисления выявлен в 8-ми источниках, которые можно разделить на два типа:
1) высокотемпературные (56–63С) со слабокислыми или близкими к нейтральным значениями рН (5,2–6,3), и 2) гидротермы с умеренными значениями температуры (40,6–54,2С) и экстремально низкими рН (2,6–2,8).
3. Состав метанотрофных сообществ обогащенных образцов 8-ми гидротерм, определенный с помощью комплекса молекулярно-биологических методов, характеризовался низким разнообразием и включал только представителей Gammaproteobacteria.
4. Результаты молекулярной детекции метанотрофов в обогащенных образцах методами, основанными на ПЦР фрагментов генов pmoA и FISH, находятся в полном соответствии с данными радиоизотопного анализа.
5. Выявлена зависимость структуры метанотрофных сообществ обогащенных образцов от физико-химических характеристик гидротерм. В высокотемпературных источниках со слабокислой реакцией среды выявлены бактерии рода Methylothermus, а в гидротермах с экстремально низкими рН и умеренными температурами впервые обнаружены метанотрофы, имеющие отдаленное сходство с Methylomonas и Methylobacter.
6. Получено 13 стабильных культур термофильных и термотолерантных метанокисляющих бактерий, в десяти из которых метанотрофный компонент представлен бактериями, близкими к Methylothermus, а в трех – организмами, сходными с Methylomonas и Methylobacter.
7. На основании изучения филогенетических и фенотипических характеристик накопительной культуры S21 установлено, что она является нейтрофильной, термофильной (диапазон роста 40–65С) и микроаэрофильной (содержание кислорода не более 5%) двухкомпонентной ассоциацией, состоящей из метанотрофа рода Methylothermus и органотрофа рода Thermaerobacter. По результатам анализа 16S рРНК оба компонента относятся к новым видам.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ В изданиях, рекомендованных ВАК:
Дворянчикова (Тихонова) Е. Н., Кизилова А. К., Менько Е. В., Кравченко И. К., 1.
Гальченко В. Ф. Молекулярная детекция метанотрофных бактерий в высокотемпературных источниках кальдеры вулкана Узон, Камчатка // Микробиология, 2011, том 80, № 6, с. 860 – 862;
Дворянчикова (Тихонова) Е.Н., Кизилова А.К., Кравченко И.К., Гальченко 2.
В.Ф. Анализ микробных сообществ термальных источников района озера Фумарольное кальдеры вулкана Узон, Камчатка // Известия Самарского научного центра Российской академии наук, 2011, т. 13, №1(6), с. 1418 – 1424;
Кизилова А. К., Дворянчикова (Тихонова) Е. Н., Сухачева М. В., Кравченко И.
3.
К., Гальченко В. Ф. Изучение метанотрофных сообществ гидротерм кальдеры вулкана Узон, Камчатка, методами молекулярной экологии // Микробиология, 2012, т.81, №5, с. 656 – 664.
Тезисы конференций:
Дворянчикова (Тихонова) Е.Н., Менько Е.В., Кизилова А.К., Кравченко И.К., 4.
Гальченко В.Ф. Метанотрофные бактерии высокотемпературных источников Узона, Камчатка // труды конференции "Экосистемы, Организмы, Инновации-12", Ecological Studies, Hazards, Solutions, volume 16;
Москва 23 июня 2010;
Дворянчикова (Тихонова) Е.Н., Кизилова А.К., Кравченко И.К., Гальченко 5.
В.Ф. Метанокисляющие бактерии горячих источников кальдеры вулкана Узон, Камчатка // материалы международной конференции «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний», Улан-Удэ – Улан Батор, 2011 с. 72 – 74;
Дворянчикова (Тихонова) Е.Н., Кизилова А.К., Кравченко И.К., Гальченко 6.
В.Ф. Выделение и характеристика метанокисляющих бактерий горячих источников кальдеры вулкана Узон, Камчатка // материалы VII молодежной школы конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, 2011, с. 71 – 73;
7. Dvorianchikova (Tikhonova) E., Kizilova A., Kravchenko I., Galchenko V. A novel thermophilic methane-oxidizing bacteria from thermal springs of Uzon volcano caldera, Kamchatka // EGU General Assembly 2012, held 22-27 April, 2012 in Vienna, Austria, p.775.