Экологический анализ грамотрицательной микрофлоры грунтов, воды и европейского угря (anguilla anguilla l.) вислинского залива (балтийское море)
На правах рукописи
КАЗИМИРЧЕНКО Оксана Владимировна ЭКОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ ГРУНТОВ, ВОДЫ И ЕВРОПЕЙСКОГО УГРЯ (ANGUILLA ANGUILLA L.) ВИСЛИНСКОГО ЗАЛИВА (БАЛТИЙСКОЕ МОРЕ) 03.00.16 – Экология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Калининград - 2008
Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Калининградский государственный технический университет»
Научный консультант: кандидат биологических наук, доцент Авдеева Елена Витальевна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Никитина Светлана Михайловна доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник ФГУП «АтлантНИРО» Архипов Александр Геральдович
Ведущая организация: ГОУ ВПО «Московский государственный университет технологий и управления»
Защита состоится 19 июня 2008 г. в 15.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.084.04 при ФГОУ ВПО «Российский государственный университет им. И. Канта» по адресу: 236040, г. Калининград, ул. Университетская, 2, ауд. 143.
Факс: (4012) 53-37-07;
(4012) 53-37-
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного университета им. И. Канта
Автореферат разослан « » 2008 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент И.Ю. Губарева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Антропогенное воздействие на водоем приводит к увеличению биомассы микроорганизмов, изменению их видового состава. С ухудшением качества воды связано высокое обсеменение рыбы условно-патогенными бактериями. При неблагоприятных для хозяина условиях внешней среды бактерии выделяются в ассоциациях и становятся причиной септических инфекций рыб [Snieszko, 1974;
Ведемейер, 1981;
Конев, 1997;
Щелкунов, 1998;
Ларцева, 2000, 2004].
В последние два десятилетия повсеместно наблюдается тенденция снижения численности угря, в том числе европейского (Anguilla anguilla L.). В странах Европейского Союза вступила в силу Директива по мерам сохранения и восстановления запасов этой ценной промысловой рыбы, которая обязывает страны Евросоюза подготовить планы Управления численностью угря (Eel Management Plans), включающие мероприятия по уменьшению смертности данного промыслового объекта от антропогенного воздействия [Draft European Parliament legislative resolution…, 2006]. Вислинский залив - один из важнейших внутренних водоемов, в который угорь заходит естественным путем. На протяжении ряда лет и по настоящее время в рыбопромысловых уловах отмечают особей угря с нарушениями целостности кожных покровов. Подобные патологические изменения могут быть связаны с воздействием условно-патогенной микрофлоры. Исследования по установлению этиологии этих изменений на коже угря не проводились. В связи с этим актуальной является цель настоящей работы: экологический анализ видового состава грамотрицательных бактерий грунтов, воды и европейского угря Вислинского залива, путей проникновения и распространения бактерий в системе «внешняя среда – угорь».
Нами были поставлены следующие задачи:
1 Установить бактериальную обсемененность грунтов, воды и угря по сезонам года и районам Вислинского залива;
2 Исследовать количественный и видовой состав грамотрицательной микрофлоры грунтов, воды и угря по сезонам года;
3 Сравнить видовой состав микрофлоры угря и среды его обитания по районам Вислинского залива;
4 Провести анализ путей проникновения и распространения бактерий в организме угря;
5 Выявить степень патогенности микрофлоры для европейского угря Вислинского залива.
Основные положения, выносимые на защиту:
1) Бактериальная обсемененность грунтов, воды и европейского угря определяется сезоном года и районами Вислинского залива;
2) Видовой состав грамотрицательной микрофлоры, доминирующей у угря Вислинского залива, формируется под влиянием микробиоценозов воды и грунта;
3) Условно-патогенные бактерии родов Aeromonas и Pseudomonas могут иметь эпизоотическое значение для угря Вислинского залива.
Научная новизна. Данная работа является первой по комплексному изучению условно-патогенной микрофлоры угря, воды и грунтов Вислинского залива, ее зависимости от некоторых факторов внешней среды и оценке роли этих бактерий для европейского угря Вислинского залива.
Теоретическое и практическое значение работы. Данные по количественным показателям, видовому составу микрофлоры угря, воды и грунтов, патогенным свойствам и антибиотикорезистентности изученных бактерий применимы при культивировании угря в установках с замкнутым циклом водообеспечения (УЗВ) и описании санитарно эпизоотической ситуации в заливе. Теоретически значимо установление видового состава грамотрицательной микрофлоры европейского угря, воды и грунтов Вислинского залива.
Результаты работы могут быть использованы при чтении курсов «Ихтиопатология», «Инфекционные и инвазионные болезни рыб» и при подготовке специалистов по направлению 110900.62 – Водные биоресурсы и аквакультура.
Апробация работы. Основные результаты диссертации были представлены на VIII съезде Гидробиологического общества РАН (Калининград, 2001), Всероссийской научно практической конференции «Проблемы патологии, иммунологии и охраны здоровья рыб и других гидробионтов» (Москва, 2003), II международных чтениях, посвященных памяти и 85-летию со дня рождения С.С. Шульмана «Современные проблемы паразитологии, зоологии и экологии» (Калининград, 2004), научно-практическом международном семинаре «Новые энергосберегающие технологии в зоотехнии и ветеринарии» (Калининград, 2005);
IX съезде Гидробиологического общества РАН (Тольятти, 2006);
VI региональной конференции «Экологические проблемы Калининградской области и Балтийского региона» (Калининград, 2007);
Международной научно-практической конференции «Проблемы иммунологии, патологии и охраны здоровья рыб и других гидробионтов – 2» (Борок, 2007).
Декларация личного участия автора. Автором самостоятельно в полевых и лабораторных условиях собран, обработан и проанализирован материал по изучению микробиоценоза угря, воды и грунтов Вислинского залива.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, выводов, списка литературы. Работа изложена на 171 странице, включает 39 таблиц, 60 рисунков.
Список литературы содержит 168 источников, из них 74 - иностранных авторов.
КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 1 Абиотические и некоторые биотические характеристики условий существования европейского угря (литературный обзор) В главе рассмотрена гидрологическая, гидрохимическая характеристика и экологическая обстановка в российской части Вислинского залива Балтийского моря.
Описана биология европейского угря с учетом экологических особенностей его обитания в заливе.
Бактериальные инфекции европейского угря, в том числе язвенные поражения на коже, многие исследователи связывают с высокими органическими нагрузками на водоемы, стимулирующие развитие условно-патогенной микрофлоры (аэромонад и псевдомонад) [Einszporn-Orecka, 1976;
Jensen et al, 1983;
Halsband et al, 1985;
Dalsgaard, 1987;
Orecka Grabda, 1993;
Nikolauz et al., 1999;
Teles et al., 2004;
Ribeiro et al., 2005]. Практически не изучена условно-патогенная микрофлора в воде и грунтах Вислинского залива и ее роль при патологических изменениях у европейского угря, что и определило цель и задачи данного исследования.
Глава 2 Материал и методика исследований Объектами исследований послужили грамотрицательные бактерии, выделенные из органов европейского угря и среды его обитания - воды и грунтов Вислинского залива.
Отбор проб угря, воды и грунта сопровождался измерением температуры воды. Сбор материала осуществляли на различных рыбопромысловых участках залива (рисунок 1) в течение 2001 - 2006 гг. Объем собранного и проанализированного материала представлен в таблице 1.
Отбор материала осуществляли в лаборатории от живых угрей.
Ихтиопатологические исследования соответствовали общепринятым в ихтиопатологии методам [Мусселиус, 1983]. Для бактериологического исследования рыбы брали кожу, жабры, кровь из сердца, содержимое желчного пузыря, печень, селезенку, содержимое заднего отдела кишечника, почки. Для определения общей бактериальной обсемененности органов угря первичные бактериологические посевы проводили на рыбо-пептонный агар.
Бактерий семейства Enterobacteriaceae выявляли на среде Эндо и инкубировали при температуре 37°С [Лабинская, 2004]. По дифференциально-диагностическому агару дифференцировали бактерий родов Aeromonas, Vibrio, Pseudomonas [Временная инструкция по борьбе с вибриозом рыб, 1998]. Для выявления пигментообразующих бактерий рода TM Pseudomonas использовали псевдосельагар (BBL Pseudosel Agar), для накопления вибрионов - пептонную воду и щелочной агар [Методические указания…,1976;
Elliot, 2001].
Первичные посевы инкубировали при температуре 25°С.
Неполный бактериологический анализ угрей в полевых условиях включал изучение микробного пейзажа кожи, кожных язв и содержимого желудочно-кишечного тракта.
Исследование кожи и кожных язв проводили при помощи стерильных бактериологических печаток (ПО «Ленмедполимер») с селективными питательными средами. Содержимое желудочно-кишечного тракта отбирали стерильными пастеровскими пипетками с последующим их погружением в пробирки с физиологическим раствором. Отобранные пробы кожи, язв и кишечника помещали в сумку-холодильник и доставляли в лабораторию.
Из пробирок с посевами содержимого кишечника высевали по 0,1 мл суспензии в чашки с селективными питательными средами. Бактериологические печатки и чашки с посевами помещали в термостат и инкубировали при температуре 25°С.
Условные обозначения:
I - Эстуарная зона - угорь II - Центральная зона - вода III - Юго-западная зона - грунт IV - Приморская бухта Рисунок 1 - Районы сбора проб материала в Вислинском (Калининградском) заливе Таблица 1 - Объем собранного и проанализированного материала весна лето осень Годы Вид сентябрь Показатель октябрь исследований материала Всего апрель август июнь июль исследований май Угорь, экз. 4 4 5 5 4 7 7 2001 Вода, проб 1 - 1 1 1 2 1 Грунт, проб - - - - - - - Угорь, экз. 5 5 5 7 5 5 6 2002 Вода, проб 2 - 1 2 - 3 - Грунт, проб - - - - - - Угорь, экз. - 7 8 5 5 6 - Объем материала 2003 Вода, проб 3 - 3 3 - 1 - Грунт, проб - - - - - 3 - Угорь, экз. - 5 5 5 5 6 - 26 (87*) 2005 Вода, проб - 2 2 3 2 3 2 Грунт, проб - 3 3 - - 2 1 Угорь, экз. - 5 5 5 - - - 15 (905*) 2006 Вода, проб - 2 - 3 - - - Грунт, проб - 3 - 3 - - - Рыбы, экз Всего:
Воды, проб Грунта, проб Рыбы 160 160 200 200 160 280 280 2001 Воды 6 - 6 6 6 12 6 Грунта - - - - - - - Рыбы 200 200 200 280 200 200 240 2002 Воды 12 - 6 12 - 18 - Грунта - - - - - - - Первичных Рыбы - 280 320 200 200 240 - бактериологических Воды 18 - 18 18 - 6 - посевов Грунта - - - - - 15 - 1040/348* Рыбы - 200 200 200 200 240 2005 Воды - 12 12 18 12 18 12 Грунта - 15 15 - - 10 5 600/3620* Рыбы - 200 200 200 - - 2006 Воды - 12 - 18 - - - Грунта - 15 - 15 - - - 5840/3968* Рыба Вода Всего первичных посевов:
Грунт Рыбы 53 59 103 141 172 96 37 Воды 47 - 78 104 115 123 144 Грунта - - - - - - - Рыбы 68 23 114 142 186 75 10 2002 Воды 53 - 108 132 - 90 - Грунта - - - - - - - Рыбы - 67 119 127 93 77 - 2003 Воды 41 - 137 110 - 94 - Штаммов бактерий Грунта - - - - - 93 - Рыбы - 59 713 770 1017 146 - 2005 Воды - 135 160 252 231 120 102 Грунта - 403 269 - - 47 172 Рыбы - 77 844 120 - - - 2006 Воды - 64 - 65 - - - Грунта - 874 - 158 - - - из рыбы – Всего штаммов бактерий из воды - из грунта - * - количество угрей, подвергнутых неполному бактериологическому анализу Пробы воды из различных участков залива отбирали в стерильные стеклянные бутылки. Отбор проб грунта производили с помощью дночерпателя Петерсена (площадь захвата 0,025 м2). Грунт переносили и упаковывали в чистые полиэтиленовые пакеты.
Санитарно-бактериологические анализы воды и грунтов выполняли с использованием метода десятикратных серийных разведений. Общую бактериальную обсемененность воды и грунтов определяли на агаре Рябова. Накопление бактериальной массы, учет характера роста бактерий в жидкой питательной среде проводили на рыбо-пептонном бульоне. Свежее фекальное загрязнение воды регистрировали на лактозном бульоне с борной кислотой при температуре 44°С [Антипчук, 1979;
Лабинская, 2004]. Выделение и дифференциацию грамотрицательных бактерий проводили на аналогичных селективных питательных средах при тех же температурах инкубирования.
Общую бактериальную обсеменность рассчитывали по количеству выросших колоний и выражали в колониеобразующих единицах (КОЕ) на 1 г органа (грунта) или 1 мл жидкого содержимого органа (воды) [Мусселиус, 1983;
Антипчук, 1979;
Лабинская, 2004].
Колонии бактерий пересевали на первично-дифференцирующую среду Клиглера или скошенный агар. При изучении штаммов бактерий использовали методы, принятые в ихтиопатологии и санитарной микробиологии [Мусселиус, 1983;
Лабинская, 2004;
Поздеев, 2002;
Юхименко, 1979;
Elliot et al., 2001;
Методы общей бактериологии, 1984].
Родовую и видовую идентификацию выделенных бактерий проводили по Определителю бактерий Берджи [Определитель.., 1997], Руководству по клинической лабораторной диагностике [Руководство.., 1992], Руководству по определению грамотрицательных потенциально-патогенных бактерий (1984). Виды вибрионов идентифицировали по Элиот [Elliot et al., 2001], псевдомонад – по Шлейфер [Schleifer, 1975], энтеробактерий – по Сиволодскому (1999).
У всех выделенных штаммов бактерий анализировали факторы патогенности и чувствительность к антибиотикам. Протеолитическую активность бактерий проверяли по разжижению желатина. Гемолитическую активность штаммов бактерий выявляли по гемолизу на 5%-ном кровяном агаре, лецитиназную активность - на чашках с желточным агаром [Методы общей бактериологии, 1984;
Лабинская, 2004]. ДНК-азную активность бактерий рода Aeromonas определяли по ДНК-агару (Difco). Результат оценивали согласно Методическим указаниям по определению патогенности аэромонад по степени ДНКазной активности (1998). Для определения чувствительности бактерий к антибиотикам применяли диско-диффузионный метод [Лабинская, 2004;
Справочник…, 1982]. Степень чувствительности бактерий к антибиотикам определяли по Красильникову (1999).
Статистическая обработка данных проводилась в пакете программ Microsoft Office Excel 2003 (Корпорация Майкрософт, 2003): применяли t-критерий Стьюдента, вычисляли доверительный интервал для среднего с вероятностью 0,95;
сравнивали две совокупности по регрессионно-корреляционному анализу с вычислением коэффициента корреляции Пирсона.
Глава 3 Эколого-микробиологическая характеристика европейского угря 3.1 Общая бактериальная обсемененность грунтов, воды и угря Вислинского залива Нами было установлено сезонное изменение общей бактериальной обсемененности грунтов, воды и угря Вислинского залива. Пик численности сапрофитной микрофлоры в грунтах залива отмечали весной (в среднем 1,2x105 КОЕ/г). Летом и осенью в грунтах происходило существенное снижение численности бактерий (в среднем 4,6x102 и 1,9x КОЕ/г соответственно).
С повышением температуры воды и увеличением содержания взвешенного вещества в заливе весной количество сапрофитной микрофлоры увеличивалось (в среднем 4,8x КОЕ/мл) с максимумом в июне (в среднем 6,9x104 КОЕ/мл) и с последующим изменением численности сапрофитных бактерий в июле и августе (1,1x104 КОЕ/мл и 0,96x103 КОЕ/мл соответственно). Осенью в заливе происходило увеличение численности водных гетеротрофных микроорганизмов (в среднем 4,9x103 КОЕ/мл). Сезонная динамика содержания сапрофитных бактерий в воде совпадает с процессами ветроволного взмучивания осадков в заливе [Чечко, 2002;
2006].
Районы юго-восточной части Приморской бухты и Центральная зона залива отличались минимальными значениями содержания сапрофитных бактерий в течение года, как в грунтах, так и в воде. Максимальные величины общей бактериальной обсемененности грунтов и воды приурочены к Эстуарной зоне залива. На повышенные значения сапрофитных бактерий в этой зоне оказывают влияние вынос осадочного материала рек, интенсивность осадконакопления и низкая степень биотурбации [Чечко, 2006].
Отмечена сезонная динамика общей бактериальной обсемененности органов угря.
Экологические особенности обитания угрей у дна, вероятнее всего, определяли общую бактериальную обсемененность кожи угрей весной. Обсеменение кишечника и жабр проходило через воду при вымывании бактериальной флоры из грунтов залива. Через жабры и стенки кишечника бактерии расселялись по всем органам рыбы, однако численность сапрофитов в органах была незначительной. Летом происходило дальнейшее увеличение сапрофитной микрофлоры на коже, жабрах и в кишечнике угрей. Повышение микробной контаминации крови привело к увеличению бактериальной обсемененности печени, желчного пузыря, селезенки и почек рыбы. Осенью значения общей бактериальной обсемененности жабр, крови, печени и селезенки оставались практически такими же, как летом. Некоторое снижение бактериальной обсемененности отмечено в кишечнике угря.
Наибольшие показатели бактериальной обсемененности органов летом и осенью были выявлены у угрей, выловленных в Эстуарной части залива (районы г. Светлый - Ушаково, пос. Комсомольский, пос. Береговое и район Морского канала).
3.2 Исследование количественного и видового состава грамотрицательной микрофлоры угря и среды его обитания по сезонам года 3.2.1 Грамотрицательная микрофлора воды и грунтов В микрофлоре воды было выделено 24 вида грамотрицательных бактерий, относящихся к 7 родам (рисунок 2). В микрофлоре грунтов идентифицировали 20 видов грамотрицательных бактерий, относящихся к 6 родам (рисунок 3).
Pseudomonas Vibrio Ps. acidovorans V. fluvialis Ps. alcaligenes V. furnissii Ps. cepacia V. sp.
Ps. diminuta Ps. maltophilia Ps.
pseudoalcaligenes Ps. putida Ps. putrefaciens Ps. stutzeri Ps. testosteroni Proteus Pr. mirabilis Pr. vulgaris Alcaligenes faecalis Aeromonas Escherichia coli A. caviae A. eucrenophila A. hydrophila Enterobacter A. schubertii agglomerans A. sobria A. veronii Рисунок 2 - Видовой состав грамотрицательной микрофлоры воды Вислинского залива Pseudomonas Ps. acidovorans Ps. alcaligenes Ps. cepacia Ps. diminuta Ps. mendocina Ps. putida Ps. putrefaciens Ps. solanacearum Ps. stutzeri Vibrio fluvialis Escherichia coli Aeromonas A. caviae A. eucrenophila Citrobacter A. hydrophila A. schubertii C. amolanaticus A. sobria C. freundii Alcaligenes faecalis A. veronii Рисунок 3 - Видовой состав грамотрицательной микрофлоры грунтов Вислинского залива В микрофлоре воды и грунтов по количеству выделенных штаммов доминировали условно-патогенные бактерии родов Pseudomonas и Aeromonas. Значительное число штаммов дали сапрофитные бактерии рода Alcaligenes. Во все сезоны преобладающими в воде были бактерии рода Pseudomonas. Весной численность псевдомонад составляла 35,4±4,38% штаммов, летом и осенью количество данных бактерий в воде было высоким и практически не изменялось (67,5±5,41% и 68,1±5,08% штаммов бактерий соответственно).
В микрофлоре грунтов весной и летом псевдомонады были доминирующими (69,6±9,38% - 66,9±14,19% штаммов). Осенью количество псевдомонад в грунтах резко снижалось - 18,6±5,88% штаммов.
Условно-патогенные бактерии рода Aeromonas максимальной численности в микрофлоре воды залива достигали весной (40,9±6,07% штаммов). В микрофлоре грунтов численность аэромонад весной была минимальной (16,4±7,37% штаммов). Летом в грунтах численность аэромонад увеличивалась до 29,7±3,93% штаммов, напротив, в воде отмечено резкое снижение их численности до 3,2±0,24% штаммов. К осени количество аэромонад в микрофлоре воды незначительно возрастало (18,0±1,12% штаммов), в грунтах эта группа бактерий достигала максимальной численности (72,7±10,85% штаммов).
Максимальное количество сапрофитных бактерий рода Alcaligenes в микрофлоре воды было летом (27,5±2,24% штаммов). Вибрионов в малых количествах высевали из воды только в весенне-летние месяцы (4,9±0,73 и 1,2±0,12% штаммов соответственно). В микрофлоре грунтов вибрионы присутствовали летом (3,3±1,2% штаммов). Из бактерий семейства Enterobacteriaceae наибольшее число штаммов в микрофлоре воды приходилось на энтеробактеров при максимальной численности весной (6,7±1,18% штаммов). Кишечных палочек и протеусов высевали из воды единичными штаммами в течение года. В микрофлоре грунтов весной по числу штаммов преобладали цитробактеры (9,7±4,24% штаммов).
В работе приводится видовой состав микрофлоры воды и грунтов по сезонам года с указанием частоты выделения каждого вида бактерий. Значительных изменений видового состав грамотрицательной микрофлоры воды и грунтов в течение периода исследований не выявлено.
3.2.2 Грамотрицательная микрофлора угря За весь период исследований количество угрей с патологическими изменениями на коже и во внутренних органах составило 72,8%. Патологические изменения отмечали как у мелких (55,08±0,41 см), так и у крупных экземпляров угрей (73,98±0,45 см). Основное количество патологических признаков у угрей залива отмечали летом – ранней осенью: язвы и геморрагии на коже, воспаление печени и кишечника, скопление экссудата в полости тела.
Грамотрицательная микрофлора угря Вислинского залива была представлена видом бактерий, относящихся к 8 родам (рисунок 4). В микрофлоре угря, как и в среде его обитания, доминировали условно-патогенные бактерии родов Aeromonas и Pseudomonas.
Численность бактерий рода Aeromonas была наибольшей весной (46,9±0,46% штаммов), несколько меньше летом (31,9±0,37% штаммов) и осенью (2,2±2,36% штаммов).
Aeromonas A. caviae A. eucrenophila Alcaligenes faecalis A. hydrophila A. schubertii A. sobria A. veronii Vibrio V. fluvialis V. furnissii V. sp.
Pseudomonas Ps. acidovorans Ps. alcaligenes Ps. cepacia Citrobacter Ps. diminuta freundii Ps. maltophilia Ps. mendocina Ps. pseudoalcaligenes Enterobacter Ps. putida E. aerogenes Escherichia coli Ps. putrefaciens Proteus E. agglomerans Ps. solanacearum Pr. mirabilis E. sakazakii Ps. stutzeri Pr. penneri E. sp.
Ps. testosteroni Pr. vulgaris Рисунок 4 – Видовой состав грамотрицательной микрофлоры угря Вислинского залива Весной в микрофлоре угря отмечено 16,3±0,17% штаммов бактерий рода Pseudomonas. Летом и осенью численность псевдомонад в микрофлоре рыбы различалась незначительно (30,9±0,29% и 28,6±0,54% штаммов). В ассоциации с псевдомонадами во все сезоны из микрофлоры угрей выделяли сапрофитных бактерий рода Alcaligenes, количество которых постепенно нарастало к осени (26,8±0,89% штаммов).
Количество галофильных бактерий рода Vibrio в микробном пейзаже угря незначительно увеличивалось только летом (4,6±0,08% штаммов). Наибольшее количество цитробактеров в микробном пейзаже угря отмечали весной (29,2±0,37% штаммов), энтеробактеров – летом (9,1±0,24% штаммов). Численность бактерий родов Escherichia и Proteus была единичной.
В работе даны характеристики родов и видов грамотрицательных бактерий, обсеменяющих угря, проанализирована встречаемость видов бактерий по сезонам, а также приведены литературные данные об их эпизоотической и санитарно-экологической значимости.
3.2.3. Зависимость видового состава микрофлоры угря от температуры воды За период исследования температура воды весной изменялась от 6 до 15 °С, летом – от 13 до 22 °С, осенью – от 7 до 19 °С. Для установления зависимости видового состава грамотрицательной микрофлоры угря и среды его обитания от сезонного изменения температуры воды в Вислинском заливе был проведен регрессионно-корреляционный анализ. Формирование видового состава микрофлоры грунтов весной не зависело от изменения температуры воды (R=0,14). Летом существовала прямая зависимость увеличения количества видов грамотрицательных бактерий, обсеменяющих грунты, от повышения температуры воды в заливе (R=0,58). Осенью при незначительном понижении температуры воды в заливе в грунтах выявили увеличение количества видов грамотрицательной микрофлоры, что подтверждается обратной линейной зависимостью (R=-0,54).
Весной при постепенном увеличении температуры воды залива в водной микрофлоре происходит уменьшение количества видов грамотрицательных бактерий (R= 0,88). Летом выявили прямую линейную зависимость видов бактерий в воде и повышением температуры (R=0,85). Осенью зависимость видового состава водной грамотрицательной микрофлоры и температуры воды не отмечена (R=0,08).
Полученные низкие коэффициенты корреляции Пирсона зависимости видового состава бактерий, обсеменяющих некоторые органы угря, от температуры воды весной (кожа R=0,11;
жабры R=0,20;
печень R=0,0) указывают на отсутствие влияния температурного фактора на формирование видового состава бактерий данных структур рыбы. В этот сезон нами была установлена средняя степень связи видового состава микрофлоры кишечника от повышения температуры воды в заливе (R=0,46). Летом для анализируемых органов угря зависимость видового состава микрофлоры от повышения температуры воды в заливе выявлена не была. Осенью также не установили влияния температуры воды на видовой состав микрофлоры кишечника (R=0,16) и микрофлоры кожи угря (R=0,41). Однако в этот сезон при незначительном понижении температуры воды в заливе в микрофлоре жабр и печени отметили уменьшение количества видов бактерий (при R=0,57 и R=0, соответственно).
3.3 Микробный пейзаж европейского угря и среды его обитания по районам Вислинского залива Анализ обсемененности угря по зонам залива имеет относительный характер с учетом того, что угорь постоянно перемещается по заливу. Условно-патогенные бактерии рода Pseudomonas доминировали в микрофлоре грунтов во всех районах залива, в микрофлоре воды - в Центральной и Эстуарной зонах. Наибольшее число штаммов псевдомонад изолировали из микрофлоры угря в Центральной зоне залива. Условно патогенные бактерии рода Aeromonas в микрофлоре воды и грунтов в наибольших количествах присутствовали в юго-восточной части Приморской бухты и в Центральной зоне залива. Высокое обсеменение угрей условно-патогенными аэромонадами выявили в Эстуарной зоне и в юго-восточной части Приморской бухты. Галофильных бактерий рода Vibrio обнаруживали в микрофлоре грунтов только в Центральной зоне залива, в воде – только в Эстуарной. У угрей, выловленных в Эстуарной зоне и юго-восточной части Приморской бухты, количество вибриофлоры единично, максимально – в Центральной зоне.
Санитарно-показательные бактерии семейства Enterobacteriaceae в наибольших количествах присутствовали в микрофлоре грунтов в Эстуарной зоне. В этой же зоне и в юго-восточной части Приморской бухты в микрофлоре угрей доминировали кишечные группы бактерий. В микробном пейзаже воды наибольшее число штаммов энтеробактерий выделили в Центральной зоне при их отсутствии в микрофлоре грунтов. Поступление в залив аллохтонных бактерий кишечной группы связано с речными водами или хозяйственно бытовыми стоками с берегов.
Проведен анализ видового состава грамотрицательных бактерий грунтов, воды и угря по зонам Вислинского залива. В Эстуарной зоне залива в микрофлоре угря и среды его обитания выделили наибольшее количество видов грамотрицательных бактерий.
В Эстуарной зоне и юго-восточной части Приморской бухты наиболее часто встречали угрей с кожными поражениями.
3.4 Пути проникновения и распространения грамотрицательных бактерий в органах угря В работе проанализировано обсеменение органов угрей различными видами грамотрицательных бактерий в разные сезоны, проведено сравнение видового состава органов угря и среды его обитания. Отмечена одновременная высеваемость нескольких видов условно-патогенных аэромонад и псевдомонад из одного органа рыбы.
Проникновение различных таксономических групп бактерий в угря происходит двумя путями: 1) с водой через жаберные капилляры в кровь;
2) с водой и пищей через кишечник. Выявили обсеменение грамотрицательными бактериями кожных покровов рыбы.
Источники бактериальной флоры и пути проникновения бактерий во внутренние структуры угря в зависимости от сезона года подтверждаются проведенным корреляционно регрессионным анализом. На рисунках представлены зависимости доминирующих видов штаммов бактерий, встреченных в микрофлоре угря и среде его обитания. Высокое значение коэффициента корреляции Пирсона между видовым составом микрофлоры грунтов и кожи (R=0,84), грунтов и кишечника (R=0,89) свидетельствует о том, что формирование грамотрицательной микрофлоры кожи весной зависит от содержания этих же групп бактерий в грунтах (рисунок 5, 6), что объясняется обитанием угря в придонных слоях воды.
Значение коэффициента корреляции Пирсона между видовым составом грамотрицательной микрофлоры воды и кожи было несколько ниже (y= 0,3302х + 8,4503;
R=0,50, P0,05), что еще раз подтверждает роль грунтов в качестве основного источника концентрирования бактериальной флоры. Вынесенная из грунтов микрофлора весной в воду обсеменяла жабры и кишечник угрей (рисунки 7, 8).
y = 0,4511x + 31, R = 0,84 P0, Грунт 0 50 100 150 200 250 300 350 Кожа Рисунок 5 – Зависимость видового состава грамотрицательной микрофлоры грунтов и кожи весной. Зависимость аппроксимирована линейным уравнением.
y = 1,991x + 11, R = 0,89 P0, Грунт 0 20 40 60 80 100 Кишечник Рисунок 6 – Зависимость видового состава грамотрицательной микрофлоры грунтов и кишечника весной. Зависимость аппроксимирована линейным уравнением.
y = 0,5887x + 8, R = 0,81 P0, Вода 0 10 20 30 40 Кишечник Рисунок 7 – Зависимость видового состава грамотрицательной микрофлоры воды и кишечника весной. Зависимость аппроксимирована линейным уравнением.
y = 1,4561x + 5, R = 0,65 P0, Вода 0 2 4 6 8 10 Жабры Рисунок 8 – Зависимость видового состава воды и жабр весной. Зависимость аппроксимирована линейным уравнением.
Летом среда обитания перестает играть основную роль в формировании видового состава грамотрицательной микрофлоры угря, о чем свидетельствуют низкие или отрицательные значения коэффициентов корреляции Пирсона. Летом благоприятные условия в заливе (повышение температуры воды, взвешенное органическое вещество, усиление интенсивности питания угрей) способствуют размножению микрофлоры, попавшей на рыбу весной. В органах, вследствие интенсивного размножения, бактерии создают присущий для этого органа комплекс видов. Взаимосвязь видового состава бактерий выявили только между микрофлорой печени и экссудата (рисунок 9).
y = 0,1577x + 2, R = 0,78 P0, Печень 0 10 20 30 40 50 Экссудат Рисунок 9 – Зависимость видового состава грамотрицательной микрофлоры печени и экссудата летом. Зависимость аппроксимирована линейным уравнением.
Активизация микрофлоры летом как на поверхности, так и во внутренних органах приводит к развитию инфекционных процессов у угря. Данные корреляционного анализа зависимости видового состава микрофлоры угря и среды его обитания позволяют предположить, что накопление основных видов бактерий - A. hydrophila и P. сepacia, которые участвуют в развитии кожных язв, происходит весной в грунте. Затем бактерии из грунтов попадают на кожу угря и при достижении определенной численности летом вызывают язвы и геморрагии на коже.
Осенью активность микрофлоры постепенно снижается. Корреляционный анализ данных не выявил влияния видового состава бактерий грунтов на его формирование в воде.
Обратная линейная зависимость видового состава бактерий грунтов и кожи (y= 0,4441х + 21,093;
R=-0,13, P0,05) и низкие значения корреляции между видовым составом воды и кожи (y= 1,899х + 12,448;
R=0,32, P0,05), указывают, что привнесение бактерий на кожу угрей осенью практически не происходит. Можно предположить, что часть бактерий, попавших на кожу рыбы весной, активно размножающиеся летом, остаются на поверхности угрей осенью. Часть бактериальной грамотрицательной флоры уходит с поверхности угря через воду в грунт. Связь воспаления стенок кишечника и скопления в полости тела экссудата осенью подтверждается корреляционной зависимостью видового состава экссудата и кишечника (y= 0,5349х + 11,313;
R=0,48, P0,05). Осенью кишечник угря вновь становится ведущей структурой, через которую осуществляется обмен бактериальной флорой между угрем и грунтом (рисунок 10).
80 y = 0,7436x - 8, R = 0,89 P0, Грунт 0 20 40 60 80 100 Кишечник Рисунок 10 – Зависимость видового состава грамотрицательной микрофлоры грунтов и кишечника осенью. Зависимость аппроксимирована линейным уравнением.
При проведении корреляционно-регрессионного анализа для изучения взаимосвязи микрофлоры внутренних органов было выявлено, что осенью существует тесная зависимость между видовым составом бактерий печени и кишечника (R=0,99) (рисунок 11).
y = 1,1934x - 2, R = 0,99 P0, Печень 0 10 20 30 40 Кишечник Рисунок 11 – Зависимость видового состава грамотрицательной микрофлоры печени и кишечника осенью. Зависимость аппроксимирована линейным уравнением.
Глава 4 Факторы патогенности грамотрицательной микрофлоры угря, воды и грунтов Вислинского залива 4.1 Ферментная активность микрофлоры и чувствительность к антимикробным препаратам Одним из важных факторов патогенности являются некоторые ферменты бактерий (гемолизины, протеазы, лецитиназы, ДНК-азы) с помощью которых они способны проникать в организм рыбы. В течение года происходило изменение гемолитической активности бактерий с максимумом ее проявления летом. Весной и осенью гемолитическую активность бактерии в основном проявляли при попадании на жабры и кожу при практическом отсутствии гемолитических штаммов бактерий в воде. Летом повышение гемолитической активности наблюдали как у водных штаммов бактерий, так и у бактерий, обсеменяющих угря. Гемолитическая способность бактерий отмечена практически во всех внутренних органах рыбы.
Во все сезоны выделенная грамотрицательная микрофлора, обсеменяющая угря, воду и грунты, проявляла достаточно высокую лецитиназную активность с незначительным повышением лецитиназаположительных штаммов летом. Наибольшее количество лецитиназаположительных штаммов в течение года отмечали в микрофлоре воды и на коже угрей.
Протеолитическая активность грамотрицательной микрофлоры угря, воды и грунтов Вислинского залива в течение весны и осени была низкой. Летом протеолитически активные штаммы отмечали среди всех таксономических групп бактерий. В большинстве случаев протеолитическая активность микрофлоры проявлялась только при попадании бактерий на кожу, жабры и в кишечник.
Анализ ДНК-азной активности бактерий рода Aeromonas, обсеменяющих угря, показал ее нарастание к лету. В микрофлоре воды и грунтов во все сезоны года отмечали высокую ДНК-азную активность аэромонад. Циркуляция в воде и грунтах вирулентных и высоковирулентных аэромонад в течение года приводила к попаданию ДНК азаположительных бактерий в основном на кожу и в кишечник угрей. Летом аэромонады при проникновении во внутренние органы угря сохраняли активность дезоксирибонуклеазы.
Выявлена множественная антибиотикорезистентность грамотрицательной микрофлоры угря, воды и грунтов Вислинского залива. Среди условно-патогенных бактерий родов Aeromonas и Pseudomonas отметили чувствительных к рифампицину, стрептомицину, ампициллину, карбенициллину и олеандомицину отдельных штаммов, особенно при их попадании на угря. Множественная антибиотикорезистентность грамотрицательной микрофлоры способствует длительному выживанию бактерий в окружающей среде, в организме рыбы и проявляется при увеличивающейся антропогенной нагрузке на водоем.
4.2 Роль некоторых условно-патогенных бактерий в развитии патологических изменений у европейского угря Вислинского залива Заслуживает внимание следующий комплекс признаков: доминирование в микрофлоре угря условно-патогенных бактерий родов Aeromonas и Pseudomonas, обсеменение ими как поверхностных, так и внутренних структур рыбы, высокая их ферментная активность, развитие патологических изменений у угря летом.
Учитывая различное действие ферментных групп, выявленных у аэромонад и псевдомонад, и контаминацию ими рыбы с патологическими процессами, выявили отдельные виды этиологически значимых условно-патогенных бактерий. В возникновении геморрагических явлений принимают участие A. caviae, A. schubertii, A. sobria, P. alcaligenes и P. putrefaciens;
кожных язв - A. hydrophila и P. cepacia. В воспалительном процессе стенок кишечника и печени с последующим проникновением в экссудат возможными участниками могут быть все выделенные виды аэромонад, а также P. alcaligenes, P. putida и P. putrefaciens.
Глава 5 Обсуждение результатов Нами установлено, что основным источником микробного обсеменения угря и воды являются грунты Вислинского залива, максимальная концентрация бактерий в которых отмечается весной. Попадание бактерий на кожу угрей происходит непосредственно из грунтов, что может быть связано с экологическими особенностями обитания этого вида рыбы у дна. С ростом численности бактерий в воде наступает момент, когда организм рыбы перестает справляться с растущей агрессивностью среды, в результате чего бактерии появляются в паренхиматозных органах [Амин, 1974;
Каховский, 1991;
Обухова, 2005].
Увеличение показателей общей бактериальной обсемененности органов угря, в том числе и паренхиматозных, происходило с повышением общего количества сапрофитных бактерий в воде, что свидетельствует об усилении агрессивности среды его обитания и ослаблении защитных свойств организма.
При оценке эпизоотологического состояния популяции рыб в отношении бактериальных инфекций особое внимание следует обратить на группу условно-патогенных бактерий, являющихся постоянными обитателями водной среды и организма рыбы и способных проявлять свою вирулентность в неблагоприятных для хозяина условиях [Ведемейер, 1981;
Конев, 1996;
Бычкова, 2000;
Юхименко, 2007]. У европейского угря Вислинского залива условно-патогенная грамотрицательная микрофлора представлена преимущественно бактериями родов Aeromonas и Pseudomonas. Эти же таксономические группы бактерий населяют воду и грунты залива.
Доля галофильных бактерий рода Vibrio в микробиоценозе угря и среды его обитания исключительно мала. При заходе в залив у угря происходит смена галофильной микрофлоры на микрофлору, с преобладанием пресноводных видов бактерий. Небольшая численность энтеробактерий в микрофлоре угря и среде его обитания в Вислинском заливе обеспечивается постоянным перемешиванием пресных и морских вод. Однако их обнаружение служит санитарным показателем качества речной воды, которая определяет санитарное благополучие залива.
Корреляционным анализом нами было установлено, что в микрофлоре воды и грунтов увеличение видов грамотрицательных бактерий происходит летом при повышении температуры воды в Вислинском заливе. На видовой состав микрофлоры структур рыбы температура существенного влияния не оказывает. Температурная зависимость отражает сезонные особенности видового состава бактерий и сезонную динамику температур в Вислинском заливе. За период исследований температурный режим в заливе с апреля (весна) до октября (осень) не выходил за границы толерантного диапазона роста и развития видов грамотрицательных бактерий, выявленных в микрофлоре угря и среде его обитания.
Обсеменение поверхностных и внутренних структур угря грамотрицательной условно-патогенной микрофлорой свидетельствует о возможности их участия в развитии эпизоотий в популяции угря Вислинского залива. Однако взаимодействие между микро- и макроорганизмом, реализующееся в определенных условиях внешней среды, не всегда заканчивается инфекционным процессом или гибелью макроорганизма. Ведущую роль, с одной стороны, играет способность макроорганизма противостоять постоянным атакам микробов, с другой стороны, исход инфекционного заболевания зависит от степени патогенности микроорганизма, которая проявляется при контакте с малоустойчивым к нему хозяином [Ведемейер, 1981;
Лукьяненко, 1989]. Анализ ферментной активности видов грамотрицательных бактерий, обсеменяющих различные органы угрей, выявил, что в большинстве случаев бактерии сохраняли активность при обсеменении кожи, жабр и кишечника. Особенно четко это проявлялось в микрофлоре угря в весенне-осенние сезоны.
Попадая во внутренние органы, многие виды бактерий теряли ферментную активность.
Летом, при отмеченном увеличении обсемененности, во внутренних органах ферментная активность бактерий сохранялась. Следует также указать, что проявление ферментативных свойств наиболее активно было у доминирующих видов условно-патогенных бактерий родов Aeromonas и Pseudomonas. При контаминации кожи с геморрагическими явлениями, кожных язв, кишечника и экссудата отдельные виды аэромонад и псевдомонад проявляли несколько ферментных активностей, что могло способствовать разрушению клеточных мембран и проникновению бактерий в цитоплазматическую часть клеток определенной структуры угря.
Патологические процессы на коже угря можно разделить на две группы – язвенные и геморрагические поражения. Одновременно воспалительные процессы отмечены во внутренних структурах угрей – кишечнике и печени.
На основании полученных данных, с учетом проведенного корреляционного анализа, в виде следующей схемы (рисунок 12) можно показать пути проникновения и перемещения грамотрицательных бактерий в организме угря и среде его обитания.
Жабры Кровь Почки Вода Селезенка Пища Вода Кишечник Кровь Печень Желчный пузырь Грунт Экссудат Вода - язвы и геморрагии Кожа Грунт - органы с ферментоактивной микрофлорой и патологией;
Примечания:
- направление проникновения и перемещения грамотрицательной микрофлоры.
Рисунок 12 – Пути проникновения и перемещения грамотрицательной микрофлоры в организме европейского угря Вислинского залива Первый путь - проникновение бактерий через жабры угря ведет к изменению обсемененности почек и селезенки, в которых не выявлено патологии. Второй путь проникновения бактерий в кишечник рыбы с пищей и водой – это единственный путь, вызывающий патологические изменения в кишечнике и печени, и, как следствие, скопление экссудата в полости тела. В желчном пузыре, при наличии его обсеменения грамотрицательными бактериями, патологические изменения не выявлены. Развитие бактерий на коже угря ведет к изменению целостности кожных покровов, проявляющиеся в виде язв и геморрагий.
Существование сезонности видимых клинических патологических изменений на коже угря (без значительной его гибели) позволяет предположить, что смешанная бактериальная инфекция угрей, в развитии которой участвуют условно-патогенные бактерии аэромонадно-псевдомонадного комплекса, протекает в хронической форме. Увеличение количества особей в популяции угря с язвенными или геморрагическими поражениями, происходящее в летний сезон, является результатом повышенной органической нагрузки на залив. Установленная нами связь между условно-патогенной микрофлорой и наружными и внутренними патологиями угря свидетельствует о том, что грамотрицательная микрофлора, также как и угорь, являются составной частью экосистемы Вислинского залива. Отсутствие ферментной активности у ряда видов грамотрицательных бактерий, поселившихся во внутренних органах угря, незначительная летальность при визуально-наблюдаемых патологиях, вызванных условно-патогенной аэромонадно-псевдомонадной группой бактерий, свидетельствует, на наш взгляд, о достаточно сильной иммунной системе угря, которая могла выработаться только в результате очень длительного существования комплекса «угорь – условно-патогенные бактерии».
ВЫВОДЫ 1. Общая бактериальная обсемененность угря, воды и грунтов зависит от сезона года и района Вислинского залива. Обсеменение угря весной происходит как непосредственно из воды, так и при вымывании бактерий из грунтов. Максимальное количество сапрофитной микрофлоры, обсеменяющей угря, воду и грунты выявлено в Эстуарной зоне залива.
2. В микробиоценозе угря и среде его обитания в Вислинском заливе во все сезоны доминировали условно-патогенные бактерии родов Aeromonas и Pseudomonas. С учетом сезонной динамики, грамотрицательная микрофлора грунтов представлена 8-20 видами, относящихся к 6 родам;
микрофлора воды - 18-24 видами, 7 родов бактерий. В микрофлоре угря обнаружен 31 вид бактерий, принадлежащих к 8 родам.
Незначительную долю во все сезоны в микробном пейзаже рыбы, воды и грунтов составляли галофильные вибрионы и бактерии семейства Enterobacteriaceae. В составе грамотрицательных бактерий, обсеменяющих угря и среду его обитания, в сезонном аспекте происходило изменение численности видов бактерий с максимумом их развития летом. На количество видов бактерий в микрофлоре угря, воды и грунтов может оказывать влияние изменение температуры воды в Вислинском заливе.
3. По всем районам исследования в микрофлоре рыбы, воды и грунта постоянно присутствовали условно-патогенные бактерии аэромонадно-псевдомонадного комплекса.
Наибольшее количество видов бактерий, обсеменяющих угря, воду и грунты, отмечено в Эстуарной зоне залива с донными иловыми отложениями и наибольшим содержанием взвешенного вещества в воде. Наименьшее число видов микрофлоры угря и среды его обитания приурочено к Центральной зоне залива с влиянием морских вод и низким содержанием взвешенного вещества в воде.
4. Установлено, что весной формирование грамотрицательной микрофлоры кожи угрей зависит от содержания этих же групп бактерий в грунтах и воде. Проникновение во внутреннюю среду угря весной осуществляется с водой и пищей через кишечник и с водой через жаберные капилляры и кровь. Летом среда обитания практически не оказывает влияния на формирование микрофлоры угря. Во внутренних органах рыбы создается собственный комплекс видов бактерий. Обмен флорой происходит только между кишечником, печенью и экссудатом. Осенью доминирует связь между микрофлорой кишечника и грунтов.
5. Патогенное действие грамотрицательных бактерий обусловлено наличием ферментных групп (гемолизины, лецитиназы, протеазы и ДНК-азы) и устойчивостью к ряду антибиотиков. Проявление патологических процессов у европейского угря Вислинского залива летом связано с ферментной активностью доминирующих в его микрофлоре условно-патогенных бактерий родов Aeromonas и Pseudomonas.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1 Барсукова (Казимирченко) О.В. Состав микрофлоры угря Вислинского залива / О.В.
Барсукова // Тезисы докладов VIII съезда Гидробиологического общества РАН (Калининград, 16 – 23 сентября 2001 г.). – Калининград, 2001. – Т. 3. – С. 16-17.
2 Казимирченко О.В. Роль водной среды в формировании состава микрофлоры угря Вислинского залива / Е.В. Авдеева, О.В. Казимирченко // Проблемы патологии, иммунологии и охраны здоровья рыб и других гидробионтов: тез. докл. Всероссийской научно-практич. конф. 16-18 июля 2003 г. – М.: Россельхозакадемия, 2003. – С. 10-11.
3 Казимирченко О.В. Микрофлора угря и воды Вислинского залива / О.В. Казимирченко // Современные проблемы паразитологии, зоологии и экологии: матер. I и II международных чтений, посвященных памяти и 85-летию со дня рождения С.С.
Шульмана. – Калининград: КГТУ, 2004. – С. 268-277.
4 Казимирченко О.В. Микробный пейзаж Калининградского залива и его экологическая оценка / Е.В. Авдеева, О.В. Казимирченко // Успехи современного естествознания. – М., 2005. - №11. – С. 80.
5 Казимирченко О.В. Мониторинг состояния европейского угря Anguilla anguilla L.
Вислинского (Калининградского) залива по бактериологическим параметрам / Е.В.
Авдеева, О.В. Казимирченко // Фундаментальные исследования. – М., 2005. - № 8. – С.
50.
6 Казимирченко О.В. Эпизоотическое значение микрофлоры европейского угря Anguilla anguilla L. Вислинского залива / О.В. Казимирченко // Новые энергосберегающие технологии в зоотехнии и ветеринарии. Материалы международного научно практического семинара. 10-11 ноября, 2005 г. - Калининград: изд-во КГТУ, 2005. – С.
38-48.
7 Казимирченко О.В. Итоги бактериологических исследований рыб в рыбоводных хозяйствах различного типа и естественных водоемах Калининградской области / Е.В.
Авдеева, О.В. Казимирченко // Успехи современного естествознания. – М., 2006. - №1. – С. 29.
8 Казимирченко О.В. Влияние микробного пейзажа воды на формирование микрофлоры рыбы в естественных и искусственных водоемах / Е.В. Авдеева, О.В. Казимирченко, М.Ю. Котлярчук // Тезисы докладов IX съезда Гидробиологического общества РАН (Тольятти, 18-22 сентября 2006 г.). – Тольятти: ИЭВБ РАН, 2006. – Т.1. - С. 3.
9 Казимирченко О.В. Роль условно-патогенных бактерий в возникновении патологических изменений у европейского угря (Anguilla anguilla L.) Вислинского залива / О.В.
Казимирченко // Рыбное хозяйство. - 2006. – №6. - С. 90-91.
10 Казимирченко О.В. Изучение возбудителей инфекционной патологии европейского угря (Anguilla anguilla L.) Калининградского залива / О.В. Казимирченко // Проблемы иммунологии, патологии и охраны здоровья рыб и других гидробионтов – 2:
расширенные материалы Межд. науч.-практич. конференции, Борок, 17-20 июля 2007 г. – М.: Россельхозакадемия, 2007. – С. 343-345.
11 Казимирченко О.В. Микробиологический мониторинг европейского угря в условиях антропогенной нагрузки / Е.В. Авдеева, Т.А. Берникова, О.В. Казимирченко, Н.Н.
Нагорнова // Экологические проблемы Калининградской области и Балтийского региона:
Сб. науч. трудов / под ред. В.В. Орленка. – Калининград: изд-во РГУ им. И. Канта, 2007.
– С. 129-134.
12 Казимирченко О.В. Экологическая значимость условно-патогенных бактерий, выделенных из микрофлоры европейского угря (Anguilla anguilla L.) и среды его обитания в российских водах Вислинского залива (Балтийское море) / О.В. Казимирченко // Вестник РГУ им. И. Канта, Серия «Естественные науки» (в печати).