Изучение антиоксидантного действия растительных экстрактов на бактерии escherichia coli
На правах рукописи
САМОЙЛОВА Зоя Юрьевна ИЗУЧЕНИЕ АНТИОКСИДАНТНОГО ДЕЙСТВИЯ РАСТИТЕЛЬНЫХ ЭКСТРАКТОВ НА БАКТЕРИИ ESCHERICHIA COLI 03.00.07 Микробиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Пермь - 2009
Работа выполнена в Лаборатории физиологии и генетики микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь
Научный консультант:
доктор биологических наук Октябрьский Олег Николаевич
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Горовиц Эдуард Семенович кандидат биологических наук Соломенный Александр Петрович
Ведущая организация: Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва
Защита состоится ” ” 2009 г. в ” ” часов на заседании диссертационного совета ДМ004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13.
Факс: (342) 2446711.
Автореферат диссертации размещен на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.
Автореферат разослан ” ” 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, Максимова Юлия Геннадьевна кандидат биологических наук
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Активные формы кислорода (АФК) оказывают токсическое действие на организмы, повреждая мембранные липиды, белки и ДНК. Образование активных форм кислорода может происходить как в процессе нормального аэробного метаболизма, так и при действии экзогенных физико-химических факторов, прямо или косвенно, генерирующих АФК. Для нейтрализации вредного воздействия активных форм кислорода бактерии конститутивно синтезируют антиоксидантные ферменты, а также обладают механизмами адаптивного ответа, регулируемыми на генетическом уровне. У бактерий Escherichia coli в ответе на действие перекиси водорода (H2O2) и супероксидного аниона (O2-) важную роль играют две группы генов (регулонов), контролируемых, соответственно, транскрипционными факторами OxyR и SoxRS (Storz, Imlay, 1999;
Pomposiello, Demple, 2002).
В последние годы большое внимание уделяется изучению антиоксидантной активности (АОА) экстрактов лекарственных растений, которые находят широкое применение в официальной и народной медицине и косметике. Во многих случаях обнаружена высокая антиоксидантная активность экстрактов и предполагается, что эта активность может вносить существенный вклад в их лечебный эффект. Показано также, что АОА экстрактов связана с наличием в них полифенолов, в том числе, флавоноидов и таннинов (Pietta, 1998;
Masaki et al., 1995;
Shahidi et al., 1992). Эти соединения обладают способностью к прямому ингибированию свободных радикалов (Rice-Evans et al., 1995) и хелатированию металлов, включая железо (Afanas'ev et al., 1989;
Sestili et al., 2002;
Melidou et al., 2005). В то же время было показано, что в определенных условиях полифенолы могут участвовать в генерации АФК и действовать как прооксиданты (Hoshino et al., 1999;
Smith et al., 2003).
В исследованиях на животных показаны антимутагенные эффекты полифенолов, а также положительное действие при лечении многих заболеваний сердечно-сосудистой и нервной системы, в профилактике рака и старения (Chung et al., 1998;
Nijveldt et al., 2001). Наименее исследовано влияние полифенолов и экстрактов растений на бактерии, в том числе на те, которые являются компонентами кишечной микрофлоры человека. Как и у других энтеробактерий, важный этап жизненного цикла грамотрицательных бактерий E. coli связан с пребыванием в кишечнике животных и человека. В процессе переваривания пищи кишечные бактерии могут прямо контактировать с экстрактами растений и полифенолами и участвовать в их метаболизме (Halliwell et al., 2005). Были доложены данные о токсическом и мутагенном действии полифенолов на бактерии (Максимов с соавт., 2003;
Edenharder, Grunhage, 2003;
Smith et al., 2003), однако сведения об антиоксидантных и прооксидантных эффектах растительных экстрактов на бактерии малочисленны.
Цель настоящей работы – изучить антиоксидантное действие водно спиртовых экстрактов растений Урала и Западной Сибири на бактерии E. coli.
Основные задачи исследований:
1. Изучить антиоксидантные свойства растительных экстрактов путем исследования их влияния на рост и выживаемость бактерий E. coli в условиях окислительного стресса.
2. Используя репортерные штаммы E. coli, изучить влияние экстрактов на экспрессию антиоксидантных генов в отсутствие экзогенных оксидантов и в условиях окислительного стресса.
3. Изучить способность экстрактов к хелатированию ионов железа в цитоплазме бактерий.
4. Сравнить антиоксидантное действие экстрактов и некоторых полифенолов на бактерии с их активностью в условиях in vitro.
Научная новизна. Впервые исследовано антиоксидантное действие растительных экстрактов и некоторых полифенолов на бактерии E. coli.
Выявлена тесная связь между радикал-связывающей, металл-хелатирующей активностями, способностью защищать ДНК от окислительных повреждений in vitro и способностью экстрактов снижать бактериостатическое и бактерицидное действие Н2О2 в аэробно растущих культурах E. coli.
Выявлена корреляция между антиоксидантной активностью экстрактов и содержанием в них полифенолов.
Показано прооксидантное действие ряда экстрактов, которое выражалось в способности стимулировать экспрессию генов, кодирующих каталазу-гидропероксидазу HPI и супероксиддисмутазу Mn-SOD.
Обнаружено, что прооксидантные эффекты экстрактов связаны с их способностью генерировать Н2О2. Выявлена корреляция между про- и антиоксидантными свойствами экстрактов. Таким образом, показано, что слабое прооксидантное действие экстрактов может вносить определенный вклад в защиту растущих клеток E. coli от последующей экспозиции к высоким концентрациям Н2О2.
Теоретическое и практическое значение работы. Изучение антиоксидантных эффектов экстрактов растений и их отдельных компонентов на бактерии E. coli позволяет получить новые данные об адаптации кишечной микрофлоры к окислительному стрессу.
Будучи хорошо изученными в физиолого-биохимическом и генетическом отношении, генно-инженерные штаммы бактерий E. coli могут быть использованы как относительно простые тест-системы для скрининга растений, обладающих высокой антиоксидантной активностью, и изучения молекулярных механизмов действия субстратов растительного происхождения и составляющих их биологически активных компонентов.
Полученные результаты позволили составить список растений, произрастающих на территории Российской Федерации, которые могут быть использованы как потенциальные источники получения антиоксидантов.
Особый интерес представляет обнаружение антиоксидантных свойств в растениях, которые широко применяются в официальной и народной медицине, что способствует пониманию механизмов их лекарственного действия.
Основные положения, выносимые на защиту 1. Выявлены виды растений, экстракты которых обладают выраженным антиоксидантным действием на бактерии E. coli при пероксидном стрессе.
2. Обнаружены экстракты, обладающие прооксидантным действием.
Эти экстракты продуцировали образование пероксида in vitro и стимулировали экспрессию антиоксидантных генов у бактерий in vivo.
3. Антиоксидантная активность экстрактов in vivo коррелировала с показателями in vitro и была связана с содержанием в испытанных образцах полифенолов.
4. Изучено действие некоторых полифенолов на бактерии E. coli.
Обнаружена корреляция между их антиоксидантной активностью in vitro и in vivo.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на VI Съезде общества физиологов растений в рамках международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем», Сыктывкар, 2007 г.;
региональной научной конференции молодых ученых «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии», Пермь, 2007 г.;
VII международной конференции «Загрязнение окружающей среды, адаптация, иммунитет», Пермь-Н.Новгород-Пермь, 2008 г.;
VII международной научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Экология и научно-технический прогресс», г. Пермь, 2008 г.;
II Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов биологов «Симбиоз Россия 2009», Пермь, 2009 г.;
на 13-м международном молодежном симпозиуме студентов и аспирантов биологов ‘SymBioSE 2009’ ‘Biology: Expansion of Borders’, г. Казань, 2009 г.
По теме диссертации опубликовано 20 работ, в том числе две статьи в иностранных рецензируемых журналах.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на страницах печатного текста, содержит 14 таблиц и 41 рисунок.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав экспериментальной части, обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 265 наименования работ отечественных и зарубежных авторов.
Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Изучение неспецифического отклика и адаптивных реакций клеток на различные стрессовые воздействия» (индекс приоритетного направления 4.1.13, номер госрегистрации 01910055305). Исследования поддержаны грантом РФФИ № 07-04-96030, грантом от Программы интеграционных проектов фундаментальных исследований, выполняемых в УрО РАН совместно с учеными СО РАН, а также грантом Президиума УрО РАН для молодых ученых (2009 г.).
Список принятых сокращений. АОА – антиоксидантная активность, РСА – радикал-связывающая активность, DPPH - дифенилпикрилгидразил, КОЕ – колониеобразующая единица, OD – оптическая плотность, HPI – каталаза гидропероксидаза I.
CОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Бактериальные штаммы. В работе использовали штаммы E. coli QC771 родительского типа (Touati, 1988), а также производные от него репортерные штаммы, несущие слияния гена lacZ с промоторами исследуемых генов katG, sodA и iucC, кодирующими каталазу гидропероксидазу HPI, Mn-зависимую супероксиддисмутазу и компонент транспортной системы железа, соответственно (Demple, 1997;
Smirnova et al., 2000;
Imlay, 2002).
Среды и условия культивирования. Бактерии E. coli выращивали аэробно на минимальной среде М9 с добавлением глюкозы, казаминовых кислот, тиамина и антибиотиков. После центрифугирования клетки из ночной культуры ресуспендировали в 100 мл свежей среды до значения оптической плотности OD600 = 0,1-0,15 и далее выращивали при 37С в колбах объемом 250 мл на качалках при частоте вращения 150 об/мин. За ростом бактерий следили по изменению OD600, измеряемому на фотометре КФК-3 (толщина кюветы 5 мм).
Определение антиоксидантных свойств экстрактов растений и чистых полифенолов in vitro. Определение радикал-связывающей активности экстрактов проводили спектрофотометрическим методом с использованием DPPH (Shyur et al., 2005). Металл-хелатирующую способность измеряли в тесте с феррозином (Kim et al., 2005). Способность экстрактов к защите ДНК от окислительных повреждений в ходе протекания реакции Фентона оценивали посредством измерения релаксации суперскрученной плазмидной ДНК (Park, Imlay, 2003).
Измерение скорости продукции H2О2 экстрактами растений и чистыми полифенолами осуществляли с использованием флуоресцентного метода (Seaver, Imlay, 2001).
Определение общего содержания растительных полифенолов в экстрактах проводили с использованием реактива Фолина-Чикольте (Wu et al., 2006).
Оценка влияния экстрактов и чистых полифенолов на устойчивость Е. coli к бактериостатическому действию H2О2 и менадиона. В середине логарифмической фазы роста клетки центрифугировали и затем ресуспендировали в 4 мл среды М9. По 100 мкл клеточной суспензии (до конечной OD600 = 0,1) вносили в пробирки, содержащие 5 мл среды и 50 мкл растворенных в 20 % спирте экстрактов, и инкубировали на качалке при 37С до достижения OD600 = 0,2. Затем клетки подвергали действию H2О2 (2 мМ) или менадиона (0,5 мМ) и инкубировали еще в течение 30 мин. Удельную скорость роста рассчитывали по уравнению:
µ = ln (N/N0)/t, где µ – удельная скорость роста, час-1, N и N0 – значения оптической плотности в начальный и t момент времени, соответственно.
Оценка влияния экстрактов и чистых полифенолов на устойчивость Е. coli к бактерицидному действию H2О2. Для оценки выживаемости бактерий в условиях пероксидного стресса, дозу H2О увеличивали до 10 мМ. Выживаемость бактерий на чашках Петри определяли по стандартной методике (Методы общей бактериологии, 1983).
Цитотоксичность экстрактов и чистых полифенолов оценивали как отношение выживаемости клеток, предобработанных экстрактами, к выживаемости клеток в контроле.
Определение активности -галактозидазы в клетках репортерных штаммов E. coli, несущих слияния гена lacZ с промоторами исследуемых генов, проводили по методу Миллера (Miller, 1972).
Определение активности каталазы в целых клетках E. coli определяли спектрофотометрическим методом (Beers and Sizer, 1952;
Visick, Clark, 1997). Содержание белка в клеточных гомогенатах определяли по методу Лоури c использованием реактива Фолина (Lowry et al., 1951).
Получение экстрактов растений. Водно-спиртовые экстракты были предоставлены сотрудниками Центрального сибирского ботанического сада СО РАН. Определение флавоноидов и таннинов проводилось сотрудниками ЦСБС СО РАН в соответствии с методами, описанным в работах (Беликов, 1985;
Гос. Фармакопея, 1987).
Статистическая обработка данных. Обработку экспериментальных данных осуществляли с помощью пакета программ Microsoft Excel (версия 9.0 для Windows) и Statistica 6.0, вычисляя среднее значение, стандартную ошибку и доверительный интервал, а также коэффициенты корреляции.
Каждый результат показан как среднее значение ± стандартная ошибка среднего.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Исследование свойств экстрактов растений. Испытанные экстракты получены из различных частей растений (стебли, листья, соцветия), растущих в Западной Сибири и на Урале и принадлежащих к различным семействам. Часть из них относится к лекарственным растениям. Всего исследовано 65 экстрактов из трех партий, собранных в течение летних периодов 2005-2007 гг. В автореферате приводятся данные для части экстрактов, которые являются типичными для всей исследованной группы растений.
В предварительных экспериментах нами была выбрана концентрация экстрактов (5 мг сух в-ва/мл), при добавлении которой в среду культивирования не наблюдалось значительного бактерицидного эффекта.
При этой концентрации некоторые экстракты оказывали стимулирующее или ингибирующее влияние на скорость роста в пределах 27% от контрольного уровня (рис. 1). При обработке аэробно растущей культуры E. coli 2 мМ Н2О отмечалось значительное снижение скорости роста в контрольной культуре.
Экстракты растений существенно различались по их способности снижать бактериостатическое действие Н2О2. В этой партии наибольший защитный эффект проявили экстракты хамериона, грушанки, лабазника, серпухи, латука, репейничка и полыни понтийской, предобработка которыми повышала скорость роста культур в присутствие 2 мМ Н2О2 более чем в три раза по сравнению с контролем (рис. 1).
Рис. 1. Рост культур E. coli NM111, предобработанных экстрактами, в отсутствие экзогенных оксидантов и при окислительном стрессе.
В качестве другого показателя защитного действия экстрактов мы использовали продолжительность остановки роста после обработки клеток оксидантом. Обнаружено, что предобработка клеток некоторыми экстрактами существенно снижала этот показатель. На рис. 2 в качестве примера приведены кривые роста для культур E. coli MN111, предобработанных экстрактами грушанки и конопли. Уже через 40 мин после добавления Н2О2 у клеток, предобработанных экстрактом грушанки, наблюдалось возобновление роста. При этом в контроле возобновление роста происходило лишь через 50-60 мин. Этот эффект отсутствовал у экстракта конопли.
Рис. 2. Рост E. coli NM при действии 2 мМ Н2О2 в присутствие экстрактов из листьев грушанки и конопли.
Стрелкой обозначено время добавления Н2О2.
В другой серии опытов было исследовано влияние предобработки экстрактами на выживаемость E. coli QC771 в условиях сильного пероксидного стресса (10 мМ Н2О2) (рис. 3).
Полученные данные свидетельствовали о том, что наиболее выраженное протективное действие на выживаемость бактерий оказали экстракты, которые проявляли наиболее высокую активность в защите от бактериостатического действия 2 мМ Н2О2.
Одним из факторов, инициирующих генерацию АФК в живых клетках, является наличие свободных ионов железа в цитоплазме. При участии Fe2+ и перекиси водорода образуются короткоживущие, но чрезвычайно токсичные молекулы гидроксильного радикала (реакции Фентона и Хабер-Вейса). К настоящему времени известно, что антиоксидантное действие растительных биосубстратов связано не столько с прямым взаимодействием с АФК, сколько со способностью хелатировать ионы металлов, включая ионы железа. С помощью химических методов in vitro нами были определены радикал-связывающая и металл-хелатирующая способности экстрактов, и показано, что эти параметры изменялись в довольно широком диапазоне.
Высокой радикал-связывающей и металл-хелатирующей способностью одновременно обладали экстракты хамериона, грушанки и репейничка (рис.
4, 5).
Рис. 3. Влияние экстрактов на выживаемость бактерий E. coli QC при действии 10 мМ Н2О2.
В скобках указано, во сколько раз в предобработанных экстрактами культурах повышалась выживаемость по сравнению с контролем.
Корреляционный анализ данных показал, что существует положительная связь между антиоксидантной активностью экстрактов in vitro и их защитным действием на рост и выживаемость бактерий в условиях окислительного стресса (рис. 6). Коэффициенты корреляции варьировали от + 0,68 до + 0,74, p 0,01. Испытуемые экстракты обладали способностью защищать ДНК от окислительных повреждений in vitro, что коррелировало с их способностью снижать бактериостатическое действие H2O2 (r = 0,62, p 0,01).
Рис. 4. Радикал связывающая активность экстрактов in vitro.
Рис. 5. Металл хелатирующая способность экстрактов in vitro.
Рис. 6. Корреляция между радикал связывающей активностью экстрактов in vitro и способностью снижать бактерио статическое действие H2O2 in vivo.
Экстракты растений представляют собой сложную смесь веществ, обладающих различной биологической активностью. К настоящему времени установлено, что существует тесная связь между АОА экстрактов растений и содержанием в них полифенолов (Rice-Evans et al., 1995;
Wojdyo et al., 2006). Это относится и к лекарственным растениям, многие из которых содержат большое количество полифенолов, таких как флавоноиды и таннины (Masaki et al., 1995;
Guo et al., 2008). Содержание этих соединений в испытуемых экстрактах варьировало в широком диапазоне (рис. 7). У экстрактов хамериона, девясила, полыни понтийской и австрийской обнаружено таннинов свыше 9.0 мг/г сух. веса, у экстрактов мелилотоидеса и конопли оно не превышало 2.5 мг/г сух. веса. Экстракты хамериона, репейничка, девясила и полыни понтийской содержали флавоноиды в количестве 3.2-5.3 мг/г сух. веса.
Рис. 7. Содержание флавоноидов и таннинов в испытуемых экстрактах, мг/г сух. веса.
Примечательно, что экстракты, обладающие высокой АОА, имели большое количество таннинов и флавоноидов. Коэффициенты корреляции между исследованными параметрами АОА и содержанием флавоноидов и таннинов изменялись в пределах от + 0.53 до + 0.80, p 0.01.
Нами было изучено влияние предобработки экстрактами на экспрессию антиоксидантных генов в культурах E. coli NM111 (katG::lacZ). Ген katG индуцируется H2O2 и кодирует каталазу-гидропероксидазу I (HPI), которая в аэробно растущих культурах E. coli вносит основной вклад в детоксикацию эндогенной H2O2. Уровень экспрессии katG может служить одним из показателей активности антиоксидантной защиты бактериальной клетки.
Предобработка некоторыми экстрактами вызывала достоверное увеличение экспрессии katG::lacZ в 1,5-2 раза в отсутствие оксиданта. Наиболее значительное повышение экспрессии (в 2 раза) наблюдалось после обработки клеток экстрактами хамериона и серпухи, наименьшее – после воздействия экстрактов лабазника, мелилотоидеса и алтея (рис. 8). Это наблюдение может свидетельствовать о наличии у ряда испытуемых экстрактов прооксидантных свойств.
Добавление 2 мМ Н2О2 после обработки клеток экстрактами вызывало дополнительное повышение экспрессии katG::lacZ. Индекс индукции изменялся от 1,1 (мелилотоидес) до 3,4 (латук). Существенное повышение экспрессии наблюдалось в случае серпухи, репейничка, лабазника, хамериона, девясила, грушанки и полыни понтийской (индекс индукции 2) (рис. 8).
Рис. 8. Влияние предобработки экстрактами на экспрессию katG::lacZ в культурах E. coli NM в отсутствие экзогенных оксидантов и при окислительном стрессе.
Ген katG вместе с рядом других H2O2-индуцибельных генов входит в регулон, регулируемый транскрипционным фактором OxyR (Storz, Imlay, 1999;
Seaver, Imlay, 2001). Было доложено, что этот белок экстремально чувствителен к H2O2, и OxyR-зависимая транскрипция гена katG прямо коррелирует со скоростью продукции пероксида (Gonzlez-Flecha, Demple, 1997;
Aslund et al., 1999).
Рис. 9.
Скорость продукции H2O экстрактами in vitro, мкмоль/мин.
С другой стороны, известно, что в определенных условиях растительные биосубстраты, в том числе танины и флавоноиды, могут окисляться с образованием H2O2 и гидроксильного радикала (Halliwell, 2008).
Поскольку некоторые тестируемые экстракты содержали значительные количества этих полифенолов, нами была исследована способность экстрактов продуцировать H2O2. Наиболее высокая скорость продукции H2O отмечена у хамериона (0,062 мкмоль/мин) и лабазника (0,041 мкмоль/мин), наиболее низкая у конопли, мелилотоидеса и алтея (0,001, 0,004 и 0,005, соответственно) (рис. 9). Примечательно, что экстракты, обладающие высокими скоростями продукции пероксида in vitro, оказывали наиболее сильное защитное действие на рост культур E. coli (r = + 0,60;
p 0,01).
Коэффициент корреляции между скоростью продукции пероксида экстрактами и их способностью снижать бактерицидное действие H2O составил + 0,90;
p 0,01 (рис. 10).
Рис. 10.
Корреляция между способностью экстрактов продуцировать H2O2 in vitro и их способностью снижать бактерицидное действие 10 мМ H2O2 in vivo.
В нашей работе показано, что экстракты, проявляющие антиоксидантное действие на бактерии E. coli, стимулировали также экспрессию гена sodA, кодирующего Mn-зависимую супероксиддисмутазу (Mn-SOD). Этот ген контролируется многими факторами, среди которых важную роль играют внутриклеточные уровни супероксида и ионов железа (Touati, 1997). Было доложено, что обработка E. coli хелаторами ионов металлов стимулирует активность супероксиддисмутазы и экспрессию слияния sodA::lacZ (Pugh, Fridovich, 1985;
Tardat, Touati, 1991). Используя штамм E. coli QC772, мы исследовали влияние экстрактов на экспрессию sodA::lacZ. Выявлена тесная связь между хелатирующей способностью экстрактов in vitro, (а также содержанием в них полифенолов) и экспрессией sodА, что указывает на возможность индукции этого гена экстрактами как посредством повышения внутриклеточного уровня АФК, так и хелатирования ионов железа.
Выше были рассмотрены результаты исследований антиоксидантных свойств экстрактов из одной партии. Свойства экстрактов из остальных партий, в основном, аналогичны: в каждой группе наблюдается широкая вариабельность определяемых параметров, часть экстрактов обладает высокой антиоксидантной активностью, наблюдается корреляция между параметрами, определяемыми in vivo и in vitro.
В таблице представлены экстракты из трех партий с высокой и низкой антиоксидантной активностью с учетом всех исследованных показателей.
Таблица Группы экстрактов с высокой и низкой антиоксидантной активностью Экстракты, обладающие Экстракты, обладающие высокой низкой антиоксидантной активностью антиоксидантной активностью Хамерион узколистный Конопля посевная Грушанка круглолистная Алтей лекарственный Лабазник обыкновенный Лопух войлочный Шиповник майский Черёмуха уединенная Земляника лесная Чистотел большой Пятилистник кустарниковый Чина Гмелина Манжетка обыкновенная Мелилотоидес плоскоплодный Медуница мягчайшая Осока большехвостая Щавель конский Черемица Лобеля Вероника Крылова Жимолость алтайская Ирга обыкновенная Яблоня ягодная Клён ясенелисный Карагана древовидная Миндаль степной Ракитник русский В целом, полученные данные свидетельствуют о том, что действие экстрактов, проявляющих повышенную АОА, носит сложный характер и может являться результатом одновременной работы нескольких механизмов, которые, на первый взгляд, носят противоположный характер. С одной стороны, экстракты, обладающие наиболее высокой способностью защищать бактериальные клетки от токсического действия H2O2, обладали повышенной способностью к прямому тушению радикалов и предотвращению образования АФК за счет железо-связывающей активности in vitro. С другой стороны, эти же экстракты обладали способностью продуцировать H2O2, оказывая слабое бактериостатическое действие на рост бактериальных культур.
Наблюдаемое противоречие между способностью экстрактов продуцировать H2O2 и их антиоксидантным эффектом является кажущимся, поскольку малые дозы пероксида обладают адаптивным действием и стимулируют экспрессию антиоксидантных генов, что защищает клетки от последующей экспозиции к высоким концентрациям H2O2.
Исследование свойств флавоноидов и таннина. Как показали наши эксперименты, многие параметры, характеризующие антиоксидантные свойства экстрактов, коррелировали с содержанием в них полифенолов. В связи с этим, представляло интерес исследовать действие таких полифенолов как таннин и флавоноиды различных подклассов на бактерии в тех же условиях, в которых испытывалось действие экстрактов.
С целью выявления механизма антиоксидантного действия активность флавоноидов сравнивали с таковой у тролокса, водорастворимого антиоксиданта, обладающего только радикал-связывающей активностью, и хелаторами железа – 2,2'-дипиридилом и дефероксамином. Известно, что дипиридил является хелатором железа (II), способным проникать внутрь клеток E. coli и защищать от летального действия Н2О2 (Park, Imlay, 2003).
Дефероксамин представляет собой хелатор железа (III), который также может проникать внутрь клеток E. coli и связывать свободные ионы Fe3+, а в присутствие кислорода активировать связывание и окисление ионов Fe2+ (Keyer, Imlay, 1996).
Для оценки влияния испытуемых веществ на рост E. coli NM111 в условиях пероксидного стресса нами был использован такой параметр, как задержка роста после обработки клеток Н2О2. Добавление 2 мМ Н2О2 к растущей культуре клеток E. coli NM111 вызывало 60-минутную задержку роста. Предобработка клеток в течение 40 мин нарингенином, гесперетином и тролоксом не оказывала существенного влияния на длительность периода остановки роста, обусловленной действием оксиданта. Добавление пероксида к клеткам, предобработанным кверцетином, таннином и дефероксамином, приводило к неполному подавлению роста, и в этих культурах наблюдалось более раннее возобновление линейного роста. Величины оптической плотности, достоверно отличающиеся от контроля, наблюдались уже через 40, 50, 70 и 80 мин после добавления Н2О2 в культурах, предобработанных кверцетином, таннином, дефероксамином и катехином, соответственно (рис.
11).
Предварительная обработка бактерий кверцетином, таннином и дефероксамином способствовала достоверному повышению их выживаемости при действии 10 мМ Н2О2 в 140, 8.2 и 8.4 раза, соответственно. Другие испытуемые вещества заметного защитного эффекта на выживаемость не оказывали (рис. 12).
Таким образом, в наших условиях из испытанных полифенолов только таннин и кверцетин проявили выраженное антиоксидантное действие, и этот эффект коррелировал с их высокой радикал-связывающей активностью и металл-хелатирующей способностью in vitro.
Рис. 11. Влияние предобработки полифенолами (0,2 мМ) на рост E. coli NM в условиях пероксидного стресса (2 мМ Н2О2). Время добавления Н2О отмечено стрелкой.
Рис. 12. Влияние полифенолов на выживаемость E. coli QC в условиях острого пероксидного стресса (10 мМ Н2О2).
Как было рассмотрено выше, металл-хелатирующая активность полифенолов может вносить существенный вклад в антиоксидантную защиту клетки. Чтобы проверить эту возможность, мы провели серию экспериментов, используя репортерные штаммы E. coli BN407, несущие слияние iucC::lacZ. У бактерий E. coli экспрессия iuc находится под контролем белка Fur, участвующего в регуляции метаболизма железа.
Повышение экспрессии гена iucC, кодирующего элемент системы транспорта железа, свидетельствует о понижении содержания свободных ионов Fe2+ в цитоплазме вследствие связывания с различными лигандами.
Рис. 13. Влияние предобработки полифенолами на экспрессию iucC::lacZ в культурах E. coli BN407.
В наших опытах высокий уровень экспрессии iucC::lacZ наблюдался при обработке бактерий кверцетином, таннином и дефероксамином (индекс индукции 4.8, 4.6 и 3.7, соответственно). При действии другого хелатора железа дипиридила этот показатель составлял около 10 (рис. 13). Катехин, нарингенин, гесперитин и тролокс не проявили существенной металл хелатирующей способности in vivo. Эти результаты указывают на то, что защитный эффект кверцетина и таннина от бактериостатического и бактерицидного действия Н2О2 может осуществляться за счет хелатирования ионов Fe2+ в цитоплазме и предотвращения протекания реакций типа Фентона с образованием гидроксильного радикала.
Показано также, что кверцетин и таннин индуцировали экспрессию katG::lacZ (рис. 14) и активность каталазы HPI в нормальных условиях и при действии 2 мМ Н2О2. Как и в случае с экстрактами, у испытуемых веществ была обнаружена способность продуцировать Н2О2 (рис. 15), которая коррелировала с защитным эффектом от бактерицидного действия пероксида (r = + 0,67, p 0,01). Эти данные свидетельствуют о наличии у этих полифенолов прооксидантных свойств.
Следует отметить, что металл-хелатирующая способность таннина и кверцетина также могла вносить определенный вклад в индукцию экспрессии katG. В пользу этого свидетельствует наши данные о стимулирующем действии хелаторов железа дипиридила и дефероксамина на экспрессию этого гена (рис. 14). Хелатирование Fe2+ могло снижать окислительные повреждения за счет подавления образования гидроксильного радикала, что способствовало нормальному функционированию транскрипционного аппарата и позволяло достичь более высокого уровня индукции katG.
Рис. 14. Влияние предобработки полифенолами на экспрессию katG::lacZ в культурах E. coli NM111.
Рис. 15. Скорость продукции Н2О испытуемыми веществами in vitro, мкмоль/мин.
На основании полученных результатов предлагается схема возможного действия полифенолов (на примере кверцетина) на бактериальные клетки (рис. 16).
Схема предусматривает несколько различных путей, посредством которых полифенолы могут осуществлять антиоксидантное действие:
радикал-связывающая и металл-хелатирующая активности, а также стимуляция экспрессии антиоксидантных генов, обеспечивающих защиту при последующем воздействии более высоких доз H2O2.
Учитывая всю совокупность полученных нами результатов, можно предположить, что экстракты растений, обладающих высокой АОА, могли осуществлять свою активность с участием тех же путей, что и полифенолы.
Рис. 16. Схема возможного действия полифенолов на бактерии E. coli.
ВЫВОДЫ 1. Исследовано действие 65 экстрактов из различных частей 57 растений Западной Сибири и Урала на бактерии E. coli. Выявлены экстракты с высокой антиоксидантной активностью, связанной со способностью защищать клетки от бактериостатического и бактерицидного действия оксидантов.
2. Обнаружены экстракты, обладающие прооксидантной активностью, которая выражалась в способности продуцировать Н2О2 in vitro и стимулировать экспрессию антиоксидантных генов katG и sodA в отсутствие экзогенных оксидантов. Выявлена корреляция между прооксидантными свойствами экстрактов и их защитным действием на бактерии в условиях окислительного стресса.
3. Показано, что способность экстрактов к защите бактерий от окислительного стресса коррелирует с показателями, характеризующими антиоксидантную активность экстрактов in vitro (радикал-связывающая активность, металл-хелатирующая способность и защита плазмидной ДНК), а также с содержанием таннинов и флавоноидов.
4. Изучено действие некоторых растительных полифенолов на бактерии E. coli. Показано, что наибольшей антиоксидантной активностью обладали кверцетин и таннин. Выявлена корреляция между способностью полифенолов к защите бактерий от окислительного стресса и показателями, характеризующими их антиоксидантную активность in vitro.
5. Полученные данные свидетельствуют, что антиоксидантное действие экстрактов растений и полифенолов может осуществляться с одновременным участием нескольких молекулярных механизмов: прямого ингибирования АФК в окружающей среде и цитоплазме;
снижения продукции АФК за счет хелатирования ионов железа;
стимуляции экспрессии антиоксидантных генов малыми дозами АФК, образующимися при аутоокислении изучаемых субстратов.
Благодарности Автор выражает благодарность д.б.н. заведующей лаборатории фитохимии Центрального сибирского ботанического сада СО РАН Высочиной Г.И. за предоставленные водно-спиртовые экстракты растений, а также за помощь в определении таннинов и флавоноидов в испытанных экстрактах.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Самойлова З.Ю. Сравнение антиоксидантных и прооксидантных свойств чистых флавоноидов и растительных экстрактов с помощью микробных тест-систем / З.Ю. Самойлова, Н.Ю. Елесина // Химия и экология: Тезисы докладов IX краевой конф. студентов и молодых ученых.
– Пермь, 2007. – С. 56-57.
2. Самойлова З.Ю. Изучение антиоксидантного и прооксидантного действия флавоноидов на бактерии Escherichia coli / З.Ю. Самойлова, И.В.
Буракова, Г.В. Смирнова // Современная физиология растений: от молекул до экосистем: Материалы докладов VI Съезда общества физиологов растений, международной конф. – Сыктывкар, 2007. – С. 196-198.
3. Oktyabrsky O.N. The study of antioxidant and prooxidant activities of plants with microbial test-systems / O.N. Oktyabrsky, G.I. Vysochina, G.V.
Smirnova, N.G. Muzyka, Z.Y. Samoilova // Basic Science for medicine: 3-rd International Conference. – Novosibirsk, Russia, 2007. – Р. 54.
4. Самойлова З.Ю. Использование микробных тест-систем для определения антиоксидантной активности водных экстрактов растений / З.Ю. Самойлова, М.Н. Брысова // Биология – наука XXI века: Тезисы международной конф. молодых ученых. – Пущино, 2007. – С. 216.
5. Самойлова З.Ю. Влияние экзогенных антиоксидантов на ответ Escherichia coli к пероксидному стрессу / З.Ю. Самойлова, Г.В. Смирнова // Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии:
Тезисы региональной научной конф. молодых ученых. – Пермь, 2007. – С.
95-96.
6. Самойлова З.Ю. Использование микробных тест-систем для скрининга антиоксидантов растительного происхождения / З.Ю.
Самойлова, О.Н. Октябрьский // Экология и научно-технический прогресс:
Материалы VI международной научно-практической конф. студентов, аспирантов и молодых ученых. – Пермь, 2007. – С. 324-327.
7. Самойлова З.Ю. Оценка прооксидантной и антиоксидантной активностей водно-спиртовых экстрактов растений с помощью микробных тест-систем / З.Ю. Самойлова, М.Н. Брысова, Т.А. Красных // Актуальные аспекты современной микробиологии: Тезисы III Международной молодежной школы-конференции. – Москва, 2007. – С. 98-99.
8. Самойлова З.Ю. Микробные тест-системы для оценки антиоксидантной активности экстрактов растений / З.Ю. Самойлова, Г.В.
Смирнова // Проблемы биоэкологии и пути их решения: Материалы международной научной конф. – Саранск, 2008. – С. 420-421.
9. Шкляева О. Исследование антиоксидантных свойств лекарственных растений / О. Шкляева, З.Ю. Самойлова, Г.В. Смирнова, О.Н. Октябрьский // Химия и экология: Тезисы докладов X краевой конф. студентов и молодых ученых. – Пермь, 2008. – С. 55-56.
10. Самойлова З.Ю. Использование микробных тест-систем для оценки антиоксидантной способности экстрактов лекарственных растений / З.Ю.
Самойлова, Г.В. Смирнова, О.Н. Октябрьский // Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии: Труды международной научной конф. – Минск, 2008. – Т. 2. – С.104-107.
11. Смирнова Г.В. Влияние полифенолов на рост и выживаемость бактерий в условиях окислительного стресса / Г.В. Смирнова, З.Ю.
Самойлова, Н.Г. Музыка, О.Н. Октябрьский // Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии: Труды международной научной конф. – Минск, 2008. – Т. 2. – С.58-60.
12. Самойлова З.Ю. Скрининг растений на антиоксидантную активность с помощью микробных тест-систем / З.Ю. Самойлова, Г.В. Смирнова, Г.И.
Высочина, О.Н. Октябрьский // Симбиоз Россия 2008. Биология: традиции и инновации в 21 веке: Материалы I Всероссийского, с международным участием, конгресса студентов и аспирантов-биологов. – Казань, 2008. – С. 77-80.
13. Samoilova Z.Y. Screening of plant antioxidant activity using microbial test-systems / Z.Y. Samoilova, G.I. Vysochina, G.V. Smirnova // Environmental Pollution, Adaptation, Immunity (ICEP-2008): VII Internat.
Conf. – Perm-N.Novgorod-Perm, 2008. – Р. 138.
14. Самойлова З.Ю. Исследование антиоксидантной активности растений Западной Сибири методами in vivo и in vitro / З.Ю. Самойлова, Г.В. Смирнова, Г.И. Высочина, О.Н. Октябрьский // Актуальные аспекты современной микробиологии: Тезисы IV Молодежной школы конференции с международным участием. – Москва, 2008. – С. 43.
15. Самойлова З.Ю. In vitro и in vivo определение антиоксидантной активности растений Западной Сибири / З.Ю. Самойлова, Г.В. Смирнова, Г.И. Высочина, О.Н. Октябрьский // Биология – наука XXI века: Тезисы международной конф. молодых ученых. – Пущино, 2008. – С. 221-222.
16. Самойлова З.Ю. Поиск растений-источников антиоксидантов с использованием микробных тест-систем / З.Ю. Самойлова, Г.И. Высочина, Г.В. Смирнова // Экология и научно-технический прогресс: Материалы VII международной научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых. – Пермь, 2008. – С. 232-233.
17. Самойлова З.Ю. Использование микробных тест-систем для скрининга растений с высокой антиоксидантной активностью / З.Ю.
Самойлова // Симбиоз Россия 2009. Биология: традиции и инновации в веке: Материалы II Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов. – Пермь, 2009. – С. 68-69.
18. Oktyabrsky O. Assessment of antioxidant activity of plant extracts using microbial test-systems / O. Oktyabrsky, G. Vysochina, N. Muzyka, Z.
Samoilova, T. Kukushkina, G. Smirnova // J. Appl. Microbiol. – 2009. – V. 106.
– P. 1175-1183.
19. Smirnova G.V. Influence of polyphenols on Escherichia coli resistance to oxidative stress / G.V. Smirnova, Z.Y. Samoylova, N.G. Muzyka, O.N.
Oktyabrsky // Free Radic. Biol. Med. – 2009. – V. 46. – P. 759-768.
20. Samoylova Z.Y. Screening of plants with high anti-oxidant activity using microbial test-systems / Z.Y. Samoylova, G.I. Vysochina, G.V. Smirnova, O.N.
Oktyabrsky // “Symbiose 2009” “Expansion of Borders”, Abstracts of the 13th annual Symposium for Biology Students of Europe. – Kazan, 2009. – P. 65.