Разработка основ технологии получения панкреатического гидролизата дрожжевой рнк
На правах рукописи
Баурина Марина Михайловна РАЗРАБОТКА ОСНОВ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ПАНКРЕАТИЧЕСКОГО ГИДРОЛИЗАТА ДРОЖЖЕВОЙ РНК 03.00.23.-биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Москва – 2007 1
Работа выполнена на кафедре биотехнологии Российского химико технологического университета им. Д.И.Менделеева доктор химических наук, профессор
Научный консультант:
Крылов Игорь Алексеевич доктор химических наук, профессор
Официальные оппоненты:
Коваленко Леонид Владимирович кандидат химических наук, доцент, Позмогова Галина Евгеньевна ОАО ГосНИИсинтезбелок
Ведущая организация:
Защита диссертации состоится “_” _2007 г в часов на за седании диссертационного совета ДМ 212.204.13 в РХТУ им. Д.И.Менделеева (125047, Москва, Миусская пл., д.9) в 443 ауд.
С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ им. Д. И. Менделеева.
Автореферат диссертации разослан “_” _ 2007 г.
Ученый секретарь диссертационного совета ДМ 212.204.13 И.В. Шакир
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. В настоящее время разработка недорогих эффектив ных лекарственных средств отечественного производства является одной из ак туальных задач сохранения здоровья, продолжительности и качества жизни лю дей, решаемых современной российской фармацевтической промышленностью.
Препараты нуклеиновой природы находят широкое применение в качестве ле карственных средств. Отечественный фармакопейный препарат - панкреатиче ский гидролизат РНК, известный под названием Энкад, представляет собой смесь олигорибонуклеотидов и пиримидиновых нуклеозид-3`-фосфатов. Препа рат регулирует обмен нуклеотидов в тканях, обладает иммуномодулирующими свойствами, способствует улучшению функций клеточных мембран, проведению импульса по двигательным нервам, уменьшению миодистрофических процессов и оптимизации биоэнергетики мышц. Препарат применяется для лечения на следственных тапеторетинальных абиотрофий – заболеваний, приводящих к слабовидению и слепоте. До настоящего времени не существует эффективных методов лечения этой группы болезней в мире. Препарат также разрешен к при менению при болезни Шегрена, при дегенеративных заболеваниях нервно мышечной системы: наследственных формах миопатий (ранние стадии), врож денном и приобретенном миопатическом синдроме, различных формах невраль ных абиотрофий, последствиях нейроинфекций, спинальных амиотрофиях. По казана клиническая эффективность применения препарата Энкад при ряде дру гих социально значимых заболеваниях (язвенная болезнь желудка и двенадцати перстной кишки, псориаз, боковой амиотрофический склероз, рассеянный скле роз).
Ранее сухая субстанция Энкада выпускалась на предприятии НПО «Биолар» (г.Олайне, Латвия) при использовании в качестве сырья РНК дрожжей р.Torula, производства которых прекращены. Лекарственная форма препарата, выпускае мая в настоящее время на Харьковском предприятии по производству бактерий ных препаратов (Украина), поставляется в Россию в ограниченных количествах, не удовлетворяющих потребности РФ. В связи с этим организация производства субстанции Энкад и его инъекционной формы на территории РФ является акту альной. Наиболее перспективным сырьем получения РНК в настоящее время для России являются хлебопекарные дрожжи Saccharomyces cerevisiae, которые не требуют организации специального производства, так как выпускаются про мышленностью в больших объемах и также образуются в значительных количе ствах в качестве отходов спиртового производства.
Для получения панкреатического гидролизата РНК используется рибонук леаза, выделяемая из бычьей поджелудочной железы – отхода мясоперерабаты вающей промышленности. Известно, что себестоимость большинства биологи чески активных веществ, получаемых с использованием ферментов, в значи тельной степени зависит от стоимости последних. Существующие технологии получения рибонуклеазы многостадийны, длительны и характеризуются низким выходом фермента. В настоящее время накоплен огромный опыт переработки и выделения различных комплексов ферментов из поджелудочной железы. В свя зи с этим актуальным является совершенствование технологии получения фер ментного препарата рибонуклеазы для создания эффективного и малоотходного производства. Рибонуклеаза помимо этого широко используется в медицине в качестве противовирусного средства и применяется в области молекулярной биологии.
Таким образом, современные потребности РФ в лекарственных препаратах отечественного производства настоятельно требуют разработок технологий на основе дешевого и доступного сырья в условиях комплексного производства.
Цель исследований. Разработать научные основы технологии получения панкреатического гидролизата дрожжевой РНК, а также ферментного препарата рибонуклеазы из бычьей поджелудочной железы, соответствующих требованиям фармакопеи. Для достижения этой цели поставлены следующие задачи:
1) Разработать технологический режим получения панкреатического гидроли зата дрожжевой РНК как субстанции препарата Энкад, обеспечивающий по вышение выхода целевого продукта:
- изучить возможность использования нового источника сырья натриевой соли низкомолекулярной РНК из хлебопекарных дрожжей для получения панкреатического гидролизата требуемого качества.
- разработать условия повышения стабильности состава панкреатического гидролизата.
2) Разработать режим основных технологических стадий извлечения рибо нуклеазы из бычьей поджелудочной железы: экстракции, концентрирова ния, осаждения и очистки фермента с целью повышения выхода целевого продукта.
Научная новизна.
Впервые разработана технология получения препарата панкреатического гидролизата РНК из хлебопекарных дрожжей Saccharomyces cerevisiae, отве чающего требованиям, предъявляемым к субстанциям лекарственных форм.
Впервые показана возможность применения миндальной кислоты на стадии ультрафильтрации в качестве ингибитора рибонуклеаз микроорганизмов, что по зволило стабилизировать состав готового продукта с сохранением качества и увеличить его выход.
Проведено количественное изучение процессов гидролиза полирибонуклео тидов дрожжей, отделения от высокомолекулярных компонентов продуктов гид ролиза и осаждения их из водно-спиртового раствора, что позволило разработать алгоритм управления технологическим процессом.
Проведено количественное изучение процессов извлечения рибонуклеазы из бычьей поджелудочной железы водными растворами серной кислоты, ультра концентрирования экстракта, осаждения фермента в изоэлектрической точке из водных растворов и спиртового осаждения, что позволило разработать алгоритм управления технологическим процессом.
Практическая значимость. Разработана технология получения панкреати ческого гидролизата рибонуклеиновой кислоты из хлебопекарных дрожжей с увеличением выхода продукта на 10-12% по сравнению с известными техноло гиями. Показано, что применение ингибитора рибонуклеаз - миндальной кисло ты на стадии ультраконцетрирования позволило повысить стабильность состава готового продукта при сохранении его нетоксичности и апирогенности.
Разработаны основные стадии технологического процесса получения фер ментного препарата рибонуклеазы (из бычьей поджелудочной железы) и условия их проведения, обеспечивающие увеличение выхода продукта до 0,5% мас. от сухой железы, что в 4,2 раза выше по сравнению с существующими технология ми.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на: III Между народной конференции “Окружающая среда для нас и будущих поколений. Эко логия, бизнес и экологическое образование” (Самара, 1999);
XIV Международ ной конференции «Успехи химии и химической технологии» (Москва, 2000);
Международной конференции “От фундаментальной науки к новым технологи ям. Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продук тов и добавок. Экологически безопасные технологии” (Тверь, 2001);
научно технической конференции “Технологии живых систем” (Москва, 2003);
1-м, 2-м и 3-м Международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003 и 2005 гг.);
ХII Всероссийской конференции «Нейроиммунология» (Ст.-Петербург 2003);
Международной конференции “Биотехнология и медицина” (Москва, 2006);
4-ой Российской конференции «Нейроиммунопатология» (Москва, 2006).
Публикации. По материалам работы опубликовано 3 статьи, 10 тезисных сообщений в материалах научных конференций, получено 3 патента РФ.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 2 глав, включающих описание ре зультатов и их обсуждение, выводов, списка литературы (_ наименований, в том числе _ на иностранных языках) и 4 приложений. Работа изложена на _ стр. машинописного текста и содержит _ таблиц, _ рисунков.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
.
1. Обзор литературы.
В обзоре литературы приводятся данные по исследованию процесса гидро лиза дрожжевой РНК, механизму действия панкреатической рибонуклеазы, а также анализу способов получения, области применения и характеристике про дуктов гидролиза нуклеиновой природы - панкреатического гидролизата дрож жевой РНК. Рассмотрены структура, способы выделения и область применения рибонуклеазы из бычьей поджелудочной железы.
2. Материалы и методы.
В работе использовали натриевую соль РНК дрожжей р.Candida (р.Torula) и Saсcharomyces cerevisiae (тип VI), содержащую не менее 70% нуклеиновых ки слот, а также химические реактивы квалификации не ниже “чда”;
растворы для проведения анализов готовили на дистиллированной воде. Объектом изучения явилась бычья поджелудочная железа производства ОАО Раменский мясоком бинат, содержащая 20% воздушно-сухих и 25% белковых веществ в пересчете на воздушно-сухое вещество.
Содержание суммарных рибонуклеиновых компонентов определяли мето дом Спирина, белковых веществ – методом Лоури. Определение удельной ак тивности рибонуклеазы в растворах и готовом продукте проводили методом Калницкого, удельной активности дезоксирибонуклеазы – методом Кунитца, ак тивности протеолитических ферментов – методом Ансона.
Процесс гидролиза полирибонуклеотидов изучали по изменению содержа ния нуклеиновых кислот в низкомолекулярной (НМ) и высокомолекулярной (ВМ) фракциях при разделении их 50% трихлоруксусной кислотой (ТХУ) и из менению содержания НМ компонента в НМ фракции методом ТСХ.
Исследование процессов экстракции рибонуклеазы, гидролиза РНК и осаж дения проводили в лабораторных реакторах емкостью до 1 л, снабженных ру башкой для подвода низкотемпературного теплоносителя, мешалкой, термомет ром и устройством для отбора проб.
Для исследования процессов микро- и ультрафильтрации использовали ап парат марки ФМ02-1000 с рабочим давлением до 0,2 МПа, оснащенный мембра нами УПМ-450 или УАМ-100 российского производства, позволяющий вести отбор проб образующихся ретанта и пермеата.
Спектрофотометрические измерения выполняли на спектрофотометре марки «Specord M-40».
Экспериментальные данные обрабатывали, используя стандартные про граммы интегрирования дифференциальных уравнений и оптимизации их пара метров с последующим сопоставлением результатов расчета с экспериментом по критерию Фишера при уровне значимости 0,05 для проверки адекватности раз работанных математических зависимостей эксперименту.
3. Экспериментальная часть и обсуждение результатов.
3.1. Разработка основ технологии получения панкреатического гидроли зата дрожжевой рибонуклеиновой кислоты 3.1.1. Ферментативный гидролиз дрожжевой рибонуклеиновой кислоты.
Количественные закономерности процесса Основным процессом получения панкреатического гидролизата является гидролиз дрожжевой РНК бычьей панкреатической рибонуклеазой. На первом этапе изучали закономерности процесса, сформировав массив эксперименталь ных данных из серии опытов, где изучали влияние следующих параметров на скорость гидролиза: температуры, рН среды, содержания ферментного препара та, начальной концентрации полирибонуклеотидов, которые меняли соответст венно в интервалах: 35-80C;
4,5-8,0;
0,25-2,00 тыс.ед/мл;
25,0-100,0г/л. Фермен тативный гидролиз РНК дрожжей изучали с позиций формальной кинетики по кривым расходования ВМ фракции и накопления НМ фракции и НМ компонен тов. Экспериментальные кривые являются типичными для ферментативных ре акций (рис.1), что позволило предположить схему превращений (1) с образова нием комплекса фермент-субстрат (ЕS), распадающегося до низкомолекулярных продуктов гидролиза (Р).
k К E+S ES P+E (1).
В ходе дифференциальной обработки данных по началь рибонуклеотидов, г/л ным участкам соответствую Концентрация щих кривых в координатах Лайнуивера-Берка определили значения эффективных кон 40 стант К и k2 в схеме превраще ний (1). Рассчитанные кривые гидролиза полирибонуклеоти 8 дов дрожжей адекватно описы 0 2 4 Время, ч Рис.1. Изменение концентрации 1-ВМФ, 2- вали лишь начальные участки НМФ и 3-НМК в ходе гидролиза дрожжевой кинетических кривых, что РНК. Концентрация субстрата - 100г/л, темпе- можно объяснить ингибирова ратура - 65С, рН 5,5, концентрация фермента - нием фермента низкомолеку лярными продуктами реакции 2,0 тыс. ед/мл или его инактивацией. Была проведена серия опытов по гидролизу РНК при различных концентрациях инги битора и установлено наличие ингибирования продуктом гидролиза. Получен ные данные подтвердили процесс ингибирования конечным продуктом, что со ответствует литературным данным. Таким образом, схему превращений (1) до полнили уравнением (2). Обработка вышеуказанной серии экспериментов позво лила найти численное значение константы ингибирования КИ.
KИ E+P EP (2).
Значение константы КИ составило 0,40±0,03 л/моль.
Предложенная модель не дала адекватного описания конечных участков ки нетических кривых, что может быть связано с инактивацией свободного фер мента или в составе фермент-субстратного комплекса. Линейная зависимость в координатах [ln(S0/S)]/ r – 1/S0 (рис.2) свидетельствовала о наличии инактива ции свободного фермента и позволила определить величину константы инакти вации. Схему превращений дополнили уравнением (3):
kин (3).
Е Ен/акт Константы k2 и kин зависят от рН среды и температуры гидролиза. Поэтому, следующим этапом стало изучение влияния этих параметров на процесс фермен тативного гидролиза полирибонуклеотидов дрожжей.
По результатам обработки соот ветствующих серий кинетических кривых были определены значения [ln (S0/S)]/Ar эффективных констант k2 и kин, отве чающие различным значениям рН и температурам процесса. Полученные значения констант были использованы для расчета параметров уравнения за 0 висимости эффективной константы 0 0,01 0,02 0,03 0,04 скорости ферментативной реакции от 1/S, л/г рН среды и уравнения Аррениуса.
Рис.2. Обработка экспериментальных дан- Рассчитанные значения параметров ных по гидролизу РНК в координатах [ln данных уравнений приведены в (S0/S)]/ r0 – 1/S, необходимая для расчета табл.1. Предложенная кинетическая константы инактивации. Концентрация суб- схема адекватно описывает весь мас страта - 100г/л, температура 65С, рН 5,5, сив экспериментальных данных.
концентрация фермента – 2,0 тыс. ед/мл Таблица 1.
Значение эффективных констант и энергий активации процесса гидролиза дрожжевой РНК бычьей панкреатической рибонуклеазой.
k*, с- Ка, моль/л Эффективная константа Е, кДж/моль (2,2±0,2)·10-4 (9,8±0,7)·10- 14,9 ± 1, К (5,9±0,5)·10-7 (1,2±0,1)·10- kин 10,6 ± 0, Степень чистоты препарата панкреатического гидролизата определяется по соотношениям оптических плотностей (А260/280) и ( А260/230), которые зависят от содержания НМ компонентов продуктов гидролиза и возможных белковых при месей. Из литературы известно, что препарат должен удовлетворять определен ным показателям качества А260/280 [2,5 - 4,5];
А260/230 [1,5 - 1,74]. Во-вторых, зна чение поглощения при длине волны 400 нм не должно превышать 0,5, а при дли не волны 520 нм – 0,1 при концентрации нуклеиновых компонентов 35 г/л. Эти показатели характеризуют наличие примесей, которые могут оказать токсиче ское действие.
На следующем этапе исследований было изучено влияние условий гидроли за на соотношения поглощений при длинах волн А260/230, А260/280. Из данных, лю безно предоставленных к.б.н. М.Е. Шабановой, одним из авторов препарата Эн кад, видно, что препарат панкреатического гидролизата содержит низкомолеку лярные компоненты (НМК). Доля НМК в препарате составляет 15,96% масс., из них 93,2% представлено компонентами нуклеиновых кислот (НК), полученными в результате гидролиза урацил- и гуанинсодержащих, а 6,8 % - цитозин- и аде нинсодержащих фрагментов РНК, то есть их соотношение составляет 13,7:1,0.
Из рис. 3 видно, что именно при содержании НМК до 20% препарат панкреати ческого гидролизата удовлетворяет необходимым показателям качества.
При дальнейших исследова А 260/ ниях были изучены количествен ные закономерности процесса 2,5 гидролиза РНК с точки зрения влияния их параметров на показа тели А260/280 и А260/230. Было пока 1, А260/ зано, что на исследуемые показа тели А260/280 и А260/230 наибольшее влияние оказывает время гидроли 0 1, за. Результаты исследований сви 10 15 20 25 детельствуют, что изменение ве Доля НМК,% Рис.3. Влияние доли НМК в препарате личины максимума поглощения Энкад на соотношение оптических плотно- при 260 нм связано с накоплением в гидролизате аденина и других 1 - А260/280 и 2 - А260/ стей.
оснований и нуклеозидов вследст вие неспецифических фермента тивных процессов. Из рис. 3 видно, что содержание НМ компонентов превышает 20% после 5-6-ти часового гидролиза, при этом расходование ВМ фракции прекращается. Таким образом, критерием окончания процесса гидролиза с целью получения препарата необходимого качества можно считать момент окончания расходования ВМ фракции.
Изучено влияние рН среды и температуры на показатели соотношений по глощений. По максимальному и минимальному допустимым значениям показа телей качества определили возможно допустимые отклонения значений рН и температуры от оптимальных. Данные рис. 4 и 5 позволяют сделать вывод о том, что гидролиз РНК панкреатической рибонуклеазой необходимо проводить при температуре 62-65C и рН среды 5,05±0,45.
На следующем этапе иссле дований была изучена кинетика 6 2, 1 накопления окрашенных соедине А260/ А260/ ний в ходе процесса гидролиза 4 2, 2 РНК. В результате обработки экс периментальных данных были 2 1, найдены значения эффективных констант скорости накопления ок 0 1, рашенных соединений, которые составили k520эфф=(11,0±0,5)·10-5 с- 3,5 4,5 5,5 6, и k400эфф= (7,1 ± 0,3)·10-5 с-1. На ос рН Рис. 4. Влияние рН среды на показатели со- нове полученных данных было отношений длин волн. Условия: концентрация определено, что показатели цвет субстрата - 100г/л, температура 65С, концен ности раствора олигонуклеотидов трация фермента – 2,0 тыс. ед/мл, время гид после 5-ти часового гидролиза не 1 - А260/230 и 2 - А260/ ролиза -5 ч.
превышают D400 = 1,45 и D520 = 0,35 при проведении процесса при А260/ А260/ 4 температуре 53-73оС и рН 5,3-5,7.
3 3 Данные показатели превышают показатели, предъявляемые к фарма 2 копейному препарату в 3-4 раза. По этому при разработке стадий выделе 1 ния и очистки конечного продукта 0 0 необходимо добиться их снижения.
Таким образом, режим прове 55 60 65 70 Температура,С дения гидролиза, который обеспечи вает максимально возможную Рис.5. Влияние температуры на пока (70,0±2,5%) степень гидролиза дрожже затели отношений длин волн. Условия:
вой РНКпри содержании НМК не более концентрация субстрата - 100г/л, кон 20% НК: 62-65C и рН среды 5,05±0, центрация фермента – 2,0 тыс. ед/мл, pH при времени гидролиза 5-6 часов.
1 – А260/280, 5,5, время гидролиза -5 ч.
260/ 2–А.
3.1.2. Отделение продуктов гидролиза от ВМ фракции рибонуклеоти дов ультрафильтрацией.
Следующей стадией технологического процесса получения панкреатиче ского гидролизата РНК является ультрафильтрация, целью которой было отде ление НМ от ВМ фракции. Для этого была исследована возможность примене ния отечественных мембран УАМ с диаметром пор 50-150 при давлении 0,15 0,4 МПа и температуре 20-30С. При исследовании зависимости производитель ности мембран от концентрации рибонуклеотидов в ретанте было найдено зна чение концентрации гелеобразования, которое составило 187±8 г/л. При исход ной концентрации дрожжевой РНК 100 г/л это позволяет получать пермеат при 3-х кратном изменении объема с выходом НМ фракции до 65%. Возможна двой ная промывка в режиме диафильтрации. При этом в пермеате концентрация мо но- и олигорибонуклеотидов составляет 78,3±3,1 г/л, что позволяет проводить эффективное осаждение их спиртом.
Результаты эксперимента показали, что при проведении ультрафильтрации панкреатического гидролизата РНК, содержание спирторастворимой фракции возрастает в 1,3 раза. Причиной наблюдаемого явления может быть наличие по сторонней ферментативной активности, так как процесс происходит в несте рильных условиях. То есть полностью управлять процессом ультрафильтрации из-за наличия посторонней микрофлоры невозможно. Это приводит к снижению выхода готового продукта. Проведение же процесса в стерильных условиях тре бует высоких энергозатрат на стерилизацию и сложную обработку оборудования с целью удаления посторонней ферментативной активности.
Поэтому представляется целесообразным разработать способ снижения со держания спирторастворимой фракции в пермеате. Был изучен процесс ультра фильтрации панкреатического гидролизата при добавлении к раствору L миндальной кислоты (-гидроксифенил-уксусной кислоты), ингибитора нуклеаз микроорганизмов, широко известного и применяемого в промышленности при производстве РНК. Преимуществом миндальной кислоты является то, что она сама не ухудшает качество готового продукта, так как является лекарственным препаратом. Результаты экспериментов использования в процессе ультрафильт рации миндальной кислоты в количестве 0,10-0,30 мг/л гидролизата представле ны в табл. 2.
Таблица 2.
Влияние использования миндальной кислоты в процессе ультрафильтрации на выход панкреатического гидролизата дрожжевой РНК.
Содержание миндальной Концентрация спирто- Выход готового растворимой фракции в пермеате продукта, % кислоты, мг/л 0,00 27,5 51,2±2, 0,03 24,8 58,3±2, 0,15 25,5 63,3±3, 0,20 21,7 63,2±3, Из приведенных в табл. 2 и 3 данных следует, что применение в процессе ультрафильтрации миндальной кислоты в количестве 0,15 мг/л приводит к сни жению посторонней ферментативной активности посторонних рибонуклеаз, что обеспечивает увеличение выхода продукта в 1,2 раза за счет снижения спиртора створимой фракции в пермеате. Применение миндальной кислоты также приво дит к повышению стабильности состава целевого продукта. Это количество миндальной кислоты было принято в качестве оптимального.
Таблица 3.
Влияние использования миндальной кислоты в процессе ультрафильтрации на состав панкреатического гидролизата.
Cостав панкреатического гидролизата, Миндальная кислота, мг/л (% мас.) 0,0 0, 1,5±0,1 1,1±0, Нуклеозиды и основания 27,4±1,2 19,1±1, мононуклеотиды ди- и другие олигонуклеотиды, состав ляющие общее количество до 100% 70,9±3,5 79,6±3, Результаты исследований показали, что в ходе ультрафильтрации также происходит осветление гидролизата, поскольку селективность по окрашенным соединениям с максимумом поглощения при 400 и 520 нм составляет соответст венно 87 и 93 %. Таким образом, после ультрафильтрации показатели цветности пермеата снижаются в 1,5-2 раза. Ретант дважды промывали водой в режиме диафильтрации. Полученные пермеаты объединяли.
3.1.3. Осаждение спиртом и получение готовой лекарственной формы.
Из объединенного пермеата панкреатический гидролизат осаждали этило вым спиртом с гидромодулем 1:10 при температуре 4-8 С в течение 4 часов.
Осадок отделяли фильтрованием (выход - 95±2%), промывали также этиловым спиртом и высушивали в вакуум-сушильном шкафу. Сухую смесь олигорибо нуклеотидов растворяли в 0,55-0,65%-ном растворе хлорида натрия до конечной концентрации 3,3-3,7%, фильтровали через фильтр с диаметром пор 2000- при давлении 87±8кПа. Раствор стерилизовали при температуре 119-122С в те чение 34 мин и ампулировали. Были получены панкреатические гидролизаты из дрожжей р.Candida и Saccharomyces cerevisiae. Проведенные испытания показа ли, что оба препарата соответствуют требованиям, предъявляемым к субстанции лекарственной формы.
3.2. Разработка основ технологии получения панкреатической РНК-азы.
3.2.1. Экстракция рибонуклеазы из поджелудочной железы.
На первом этапе исследования было изучено влияние концентрации серной кислоты на скорость накопления извлекаемой из ПЖ рибонуклеазы в объеме су пернатанта. Контроль процесса экстракции осуществляли по накоплению актив ности рибонуклеазы в экстракте. На рис. 6 приведены типичные кривые накоп ления фермента в жидкой фазе, полученные при различной начальной концен трации серной кислоты. Все кривые имеют экстремум, за которым РНКазная ак тивность монотонно падает. С увеличением исходной концентрации серной ки слоты в среде растут скорости извлечения РНКазы в объем жидкой фазы, причем максимум выхода РНКазы наблюдается при содержании серной кислоты в экст рагенте 0,125±0,005 моль/л, что согласуется с литературными данными.
8000 8000 РНК-азы, ед/мл РНК-азы, ед/мл Концентрация Концентрация 3 6000 0 0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 Время, ч Время, ч Рис.6. Влияние концентрации серной ки- Рис.7. Влияние температуры на слоты в экстрагенте на скорость накопления активность РНК-азы в объеме жид кой фазы при обработке 6,7 %-ной РНК-азы в объеме жидкой фазы. Условия:
температура - 4-6С,. ПЖ (СВ) - 6,7 % мас. суспензии ПЖ 0,125 М раствором серной кислоты, (С): 1 – 0;
2 - 5;
Обозначение: начальная концентрация сер ной кислоты в экстрагенте (моль/л): 1 – – 10 и 4 – 20.
0,031;
2 – 0,062;
3 – 0,125 и 4 - 0,156.
Типичные кривые накопления фермента в супернатантах, полученных при обработке отличающихся содержанием биомассы ПЖ в одном объёме раствора серной кислоты заданной концентрации указывают на то, что в пределах точно сти измерений доля извлекаемой РНКазы не зависит от исходного содержания биомассы ПЖ в суспензии. Следовательно, исследуемый процесс может быть описан уравнением кинетики 1-ого порядка по массе обрабатываемого биомате риала в суспензии. Отсутствие точек перегиба на начальных участках кривых рис. 6 и 7 позволило предположить для обработки экспериментальных данных следующую схему последовательных превращений:
(путь 1) k1 k2 (путь 2) AL AIN, (4), АS где АS, AL, AIN – соответственно РНКазная активность внутри клетки, в объеме жидкой фазы и инактивированная форма фермента, а k1 и k2 - соответственно не кие эффективные константы исследуемого процесса, зависимые от температуры и концентрации серной кислоты.
Обработку экспериментальных данных проводили с использованием урав нения Аррениуса и уравнения кислотно-основного катализа. Полученные значе ния эффективных констант приведены в табл. 5.
Таблица 5.
Значения эффективных констант и энергий активации отдельных стадий процес са экстракции РНКазы из клеток ПЖ КРС.
Ka, л·моль-1 k*5C ·105, с-1 Е, кДж·моль- Путь путь 1 2,03±0,1 9,6±0,4 15± путь 2 50,±2,5 1,7±0,1 30± В сочетании со схемой превращений (4) и уравнением Аррениуса они оп ределяют математическую модель процесса выделения РНКазы из ПЖ. Её адек ватность подтверждается выполнением условия Fоп = 3,74 Fтабл = 5,35, где F – соответственно опытное и табличное значение критерия Фишера для уровня значимости 0,05.
Предложенная кинетическая схема позволяет дать рекомендации для оп тимальных условий реализации процесса выделения РНКазы из ПЖ КРС: темпе ратура 5±2С;
концентрация серной кислоты в экстрагенте (0,125±0,005)М/л;
концентрация биомассы ПЖ в суспензии (6,7±0,3) % мас. CВ, при которых сте пень извлечения фермента достигает 95-97%, но время обработки биомассы со ставляет 18-20 часов.
Для сокращения времени экстракции замороженную и измельченную ПЖ подвергали обработке мембранотропным агентом - этиловым спиртом (0,5% мас.) в течение 1-2 ч (рис. 8).
Рис. 8. Влияние предварительной об работки ПЖ КРС на скорость накопле Р Н К -азы, ед/м л К он цен трац и я 2 ния РНК-азы в процессе экстракции.
Условия: содержание биомассы ПЖ в суспензии (% мас. СВ) – 6,7, начальная концентрация серной кислоты в суспен 2000 зии – 0,125 моль/л, температура – 4-6С.
Обозначение: 1 – без предварительной 0 обработки;
2 – с предварительной обра боткой этиловым спиртом в количестве 0 6 12 18 0,5% от массы (2 ч).
Время, ч Анализ полученных данных позволяет дать следующие рекомендации для реализации стадии экстракции РНК-азы: при обработке биомассы ПЖ раствором серной кислоты целесообразно интенсивное перемешивание среды;
рекомендуе мые условия обработки предварительно замороженной биомассы ПЖ: темпера тура (5±2)C;
концентрация серной кислоты в экстрагенте (0,125±0,005) М;
вре мя обработки клеток 6,0-6,5 ч.
3.2.2. Количественные закономерности стадии ультраконцентрирования.
Получаемые после отделения шлама растворы РНК-азы содержат ВМ фрак ции белковых веществ 3,5г/л (суммарного белка 10,9г/л) и имеют активность РНК-азы 11,5 тыс. ед/мл. При таких низких концентрациях проводить осажде ние, как будет показано ниже, нецелесообразно из-за низкой (около 25%) степе ни осаждения. С целью сокращения энергозатрат и расходных норм реагентов представляется целесообразным провести предварительное концентрирование экстракта.
Среди возможных методов концентрирования растворов мы выбрали ульт рафильтрацию. При этом в рассматриваемом процессе появляется возможность возврата пермеата на стадию экстракции, что позволяет сократить норму расхода серной кислоты. Были выбраны широко используемые в промышленности мем браны марки УАМ-100 и марки УПМ-450.
На рис. 9 показано влияние концентрации РНК-азы (ед/мл) в ретанте на ве личины удельной производительности мембранного аппарата для обеих мем бран. Из полученных данных следует, что ультраконцентрированию следует Рис. 9. Зависимость удельной про производительность, изводительности мембран УАМ- л/м ч МПа Удельная – (1) и УПМ-450 – (2) от концентра ции РНК-азы (А) в ретанте (в полу логарифмических координатах).
ln Aг ln Ак 10,7 11,1 11, ln A подвергать растворы, имеющие начальную активность РНК-азы не ниже 10, тыс. ед/мл, т.е. исходное содержание биомассы поджелудочной железы при экс тракции должно составлять 6,7%. Величина потерь РНК-азы в этом случае со ставляет около 10-12% (УАМ-100) и 12-13% (УПМ-450) от их начального со держания в экстракте. Наблюдаемые закономерности позволили рекомендовать для промышленного концентрирования растворов РНК-азы мембрану УПМ-450.
Высокое значение селективности (=95-98%) и соответствующая концентрации гелеобразования 108,7 тыc. ед/мл (39г/л по белку) позволяет проводить процесс глубокого ультраконцентрирования (степень концентрирования n=9-10) без до полнительного увеличения энергозатрат при перекачивании больших объемов.
3.2.3. Количественные закономерности стадии осаждения рибонуклеазы.
Ранее для осаждения РНК-азы использовали метод высаливания сульфатом аммония, что предполагает высокую расходную норму сульфата аммония. Было предложено заменить его осаждением в изоэлектрической точке (рН 7,8). Изуче ны количественные закономерности процесса и выявлены основные факторы, оказывающие на него наибольшее влияние: время образования осадка РНК-азы, ее начальная концентрация в растворе.
На рис.10 приведены типичные кривые по осаждению РНК-азы в зависимо сти от начальной активности РНК-азы. Вид полученных зависимостей свиде тельствует о том, что основная масса осадка образуется в течение 8-10 ч, и в дальнейшем значение степени осаждения существенно не изменяется. Вид полу ченных зависимостей также свидетельствует о том, что с увеличением времени осаждения, концентрации белковых веществ и РНК-азы в растворе степень оса ждения биополимеров растет симбатно концентрации последних и достигает в каждом случае своего квазистационарного значения. Для количественного опи сания данных зависимостей мы воспользовались данными теории осаждения частиц. Известно, что индуцированные сдвигом скорости зарождения и началь ного роста частиц осадка описываются уравнением 2-ого порядка.
Степень осаждения, % Рис. 10. Типичные кривые осажде ния РНК-азы из ретанта с различным содержанием фермента в ИЭТ (рН 7,8). Условия: температура – 4-6С.
Обозначение: начальная концентрация рибонуклеазы в ретанте (тыс. ед/мл): – 13,71;
2 – 26,7;
3 – 52,2 и 4– 68,5.
0 10 20 Время, ч В этом случае схему образования осадков можно представить в виде:
2(РНК-аза)о (РНК-аза)о2 (6), которому отвечает уравнение связи степени осаждения с начачальной концен хs/(1-xs)2=KsА0 (7).
трацией РНК-азы:
Схема 6, уравнение 7 и значения констант k-1=9,6±0,4·10-5 с-1, Ks=2,03±0, л·моль-1 определяют кинетическую схему процесса осаждения РНК-азы в изо электрической точке и позволяют дать рекомендации по оптимальному режиму процесса: температура 4-6 С, рН 7,8±0,1;
начальная активность РНК-азы в рас творах не ниже 105·103 ед/мл. При таких условиях осаждения и времени отстаи вания суспензии - 1,5-2 ч можно достичь степени осаждения РНК-азы 85-90%.
3.2.4. Очистка препарата технической РНКазы Образующийся осадок ФП имеет активность 9000 ед/мг белка, содержание белковых веществ - 65%. Однако, наряду с основным веществом он содержит примесь ДНК-аз на уровне 3,8±0,2 ед/мг белка, содержание которых в фармако пейном препарате не допускается. Чтобы избавиться от последних и одновре менно от протеаз, мы воспользовались известным способом [McDonald, 1955].
Для этого осадок технического ФП растворили в подкисленной воде (рН 3,0) до активности 150 тыс. ед/мл и добавили тонко измельченный сульфат аммония до концентрации 144 г/л. Полученный раствор нагревали при температуре 95С в течение 10 мин, затем охладили до 5С, довели рН раствора до 7,8 концентриро ванным раствором едкого натрия и осадили РНК-азу.
Далее РНК-азу освободили от соли гельфильтрацией на сефадексе G-25, пе реосадили 95%-ным этанолом и высушили. Полученный препарат содержал 85% белковых веществ, имел удельную активность (9,6±0,4) тыс. ед/мг препарата при практически полном отсутствии ДНК-азной и протеазной активности, что удовлетворяет требованиям ФС. Выход технической РНК-азы составил 0,5% от сухой массы железы (в 4,2 раз выше по сравнению с известными технологиями).
Расчеты технико-экономических показателей производства панкреатиче ского гидролизата при мощности производства 100 кг/год и рибонуклеазы 2кг/год показали, что себестоимость этих препаратов составляет соответственно 190 руб/г и 2000 руб/г.
Выводы 1.Разработана технология получения панкреатического гидролизата натриевой соли рибонуклеиновой кислоты из нового источника нуклеината натрия РНК хлебопекарных дрожжей, обеспечивающая получение фармакопейного препара та.
2.Исследовано влияние миндальной кислоты на подавление посторонней фер ментативной активности в процессе ультрафильтрации и показано, что введение миндальной кислоты является условием повышения стабильности состава пан креатического гидролизата при сохранении его нетоксичности и апирогенности и повышения выхода продукта на 10-12% по сравнению с известными технологиями.
3.Разработаны критерии контроля качества исходного сырья, полупродуктов и самого продукта по содержанию в них низкомолекулярных продуктов глубокого гидролиза РНК для получения панкреатического гидролизата дрожжевой РНК, отвечающего требованиям, предъявляемым к субстанциям лекарственных форм.
4.Разработана технология получения ферментного препарата рибонуклеазы бычьей поджелудочной железы с активностью 8500-14000 ед/мг препарата, в ко торой за счет введения ультраконцентрирования и осаждения рибонуклеазы в ИЭТ, обеспечивается выход продукта до 0,5 % мас. от поджелудочной железы, что в 4,2 раза выше по сравнению с существующей технологией.
5.Проведены расчеты технико-экономических показателей производства пан креатического гидролизата дрожжевой РНК мощностью 100 кг/год и рибонук леазы бычьей поджелудочной железы - 2 кг/год. Показано, что применение раз работанной технологии рибонуклеазы, обеспечивающей её себестоимость не более 2000 руб/г, приводит к снижению себестоимости панкреатического гид ролизата на 30% по сравнению с препаратом, полученным с использованием импортного фермента.
Список публикаций по теме диссертации:
1. Красноштанова А.А., Баурина М.М., Крылов И.А. Пути интенсификации процесса получения панкреатического гидролизата дрожжевой РНК // Тез. докл.
III Межд. конф. «Окружающая среда для нас и будущих поколений. Экология, бизнес и экологическое образование». – Самара, 1999. – С. 28.
2. Крылов И.А., Красноштанова А.А., Рукинова Т.А., Баурина М.М., Шаба нова М.М., Эль-Регистан Г.И., Кухаренко А.А. Способ получения низкомолеку лярных фракций биологически активных веществ из клеточных биополимеров.
Патент РФ № 2179579 от 24.02.2002.
3. Коротун И.В., Баурина М.М., Яковлева Н.В., Красноштанова А.А. Иссле дование количественных закономерностей процесса получения панкреатическо го гидролизата РНК // Тез. докл. XIV Межд. конф. по химии и химической тех нологии. – Москва, 2000. – C.9.
4. Красноштанова А.А., Баурина М.М., Кашкина Е.А, Крылов И.А. Способ получения панкреатической рибонуклеазы. Патент РФ № 2180918 от 27.03.2002.
5. Красноштанова А.А., Рукинова Т.А., Кашкина Е.А., Баурина М.М., Кры лов И.А., Эль-Регистан Г.И. Интенсификация ферментативных процессов гидро лиза биополимеров // Хранение и переработка сельскохозяйственного сырья. – 2000. – №6. – C. 59-60.
6. Баурина М.М., Красноштанова А.А., Крылов И.А. Изучение количествен ных закономерностей процесса получения панкреатического гидролизата РНК // Тез. докл. Межд. конф. «От фундаментальной науки к новым технологиям. Хи мия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии». – Москва - Тверь, 2001. – C. 22 23.
7. Эль-Регистан Г.И., Карпекина Т.А., Степаненко И.Ю., Крылова Е.И., Ша ненко Е.Ф., Крылов И.А., Красноштанова А.А., Баурина М.М., Будран Ж. Стаби лизация индивидуальных ферментов и ферментных систем алкилоксибензолами // 1-ый Межд. конгр. “Биотехнология - состояние и перспективы развития”. – Москва, 2002. – C. 195-196.
8. Баурина М.М., Красноштанова А.А., Шабанова М.Е., Крылов И.А. Полу чение очищенного препарата панкреатического гидролизата дрожжевой РНК // 1-ый Межд. конгр. “Биотехнология - состояние и перспективы развития”. – Мо сква, 2002. – C. 245.
9. Баурина М.М., Красноштанова А.А., Крылов И.А. Разработка ресурсосбе регающей технологии получения панкреатической рибонуклеазы. // 2-ой Межд.
Конгр. “Биотехнология - состояние и перспективы развития”. – Москва, 2003. – C. 296.
10. Баурина М.М., Красноштанова А.А., Шабанова М.Е., Крылов И.А., Краснопольский Ю.М. Способ получения и характеристика иммунокорректора нуклеинового ряда // Нейроиммунология. – 2003. – Т.1, №2. – С.18-19.
11. Баурина М.М., Красноштанова А.А., Крылов И.А. Разработка основ тех нологии получения пищевкусовой добавки на основе олиго-3,5-циклофосфатов // Тез. докл. научно-техн. конф. “Технологии живых систем”. – Москва, 2003. – C. 79-82.
12. Баурина М.М., Красноштанова А.А., Крылов И.А., Шабанова М.М. Спо соб получения панкреатического гидролизата рибонуклеиновой кислоты. Патент РФ № 2274658 от 20.04.2006.
13. Шабанова М.Е., Баурина М.М., Красноштанова А.А., Крылов И.А. При менение лекарственного препарата Энкад в качестве средства, стимулирующего гемопоэтическую функцию костного мозга // Тез. докл. Межд. конф. “Биотехно логия и медицина”. - Москва, 2006. – C.142-143.
14. Шабанова М.Е., Казаньев В.В., Баурина М.М., Красноштанова А.А., Крылов И.А. Способ усиления пролиферативной активности костного мозга. // Патогенез. –2006. – Т. 4, №1. – С. 71.
15. Baurina M. M.,. Krasnoshtanova A.A, Krylov I. A. Development of Resourse Saving Technology of Bovine Pancreatic Ribonuclease Manufacture // Industrial Ap plication of Biotechnology. – New York, 2006. – P. 55-61.
16. Dudnikova E.A., Baurina M.M., Krasnoshtanova A.A., Krylov I.A. Elaborat ing Bases of Technology of Isolation of Amylase, Lipase and a Complex of Proteases from Cattle Pancreas // Industrial Application of Biotechnology. – New York, 2006. – P. 28-37.
17. Баурина М.М., Красноштанова А.А., Крылов И.А. Разработка ресурсос берегающей технологии получения рибонуклеазы из поджелудочной железы КРС // Химическая технология. –2007. –Т.8, № 4. – C. 185-190.
Список сокращений: СВ–сухие вещества, ФС – фармакопейная статья, ТУ – технические условия, НК–нуклеиновые компоненты;
РНК – рибонуклеиновая кислота, ВМФ – высокомолекулярная фракция, НМФ – низкомолекулярная фракция, НМК – низкомолекулярные компоненты;
НМ - низкомолекулярные, ВМ – высокомолекулярные, РНК-аза – рибонуклеаза, ПЖ – поджелудочная же леза, ФП – ферментный препарат.