Получение генетически модифицированных растений табака (nicotiana tabacum l.), экспрессирующих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы
На правах рукописи
ТИТОВ СЕРГЕЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ ПОЛУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА (NICOTIANA TABACUM L.), ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ АНТИСМЫСЛОВОЙ СУПРЕССОР ГЕНА ПРОЛИНДЕГИДРОГЕНАЗЫ 03.00.15 ГЕНЕТИКА
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Новосибирск 2008 1
Работа выполнена в лаборатории генной инженерии растений Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.
Научный консультант: кандидат биологических наук, доцент Кочетов Алексей Владимирович Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск
Официальные оппоненты: доктор биологических наук Першина Лидия Александровна доктор биологических наук Беклемишев Анатолий Борисович Ведущее учреждение: Биолого-почвенный институт ДВО РАН, г. Владивосток
Защита диссертации состояться «14» мая 2008 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук (Д-003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект Лаврентьева, 10, тел (383) 333-12-78, e-mail: [email protected] HTU TH
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.
Автореферат разослан « » 2008 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук А.Д. Груздев ВВЕДЕНИЕ В процессе эволюции растения выработали механизмы адаптации к неблагоприятным факторам окружающей среды. Вместе с тем многие культурные виды в результате однонаправленного отбора на проявление отдельных признаков утратили устойчивость к стрессовым воздействиям, что существенным образом снижает их продуктивность. Сравнение рекордных и стандартных урожаев нескольких видов возделываемых растений показало, что урожаи культурных растений обычно составляют не более 20% от их максимально возможного уровня (Boyer, 1982). Хотя такое уменьшение продуктивности отчасти связано с воздействием биотических факторов (болезней, фитофагов и сорняков), считают, что и абиотические стрессы могут играть существенную роль.
При изучении механизмов индукции и поддержания стрессоустойчивости к абиотическим факторам у растений особый интерес вызывает роль пролина в этих процессах. Это связано с тем, что содержание свободного пролина в растительных клетках многократно возрастает в ответ на различные стрессорные факторы: 1) засуху, 2) засоление, 3) повышение или понижение температуры, 4) токсическое действие тяжелых металлов, 5) недостаток питательных веществ (Кузнецов и Шевякова, 1999). Возможно, поэтому, несмотря на значительное количество работ, посвященных защитному действию пролина, его роль по-прежнему остается во многом не ясной. Например, согласно некоторым предположениям, значительное накопление пролина в клетках растений во время стресса является не защитной реакцией, а индикатором повреждения клеток стрессовыми факторами (Lutts et al, 1996;
Serraj and Sinclair, 2002).
В растениях накопление пролина во время стресса происходит как за счет увеличения скорости его синтеза, так и за счет ингибирования его деградации. Скорость-лимитирующим ферментом деградации пролина является пролиндегидрогеназа (ПДГ). На сегодняшний момент, однако, нет ясности в вопросе о том, какую роль играет катаболизм пролина в стрессоустойчивости и восстановлении растений после стресса. Было выдвинуто предположение о важной роли этого процесса, поскольку деградация пролина сопровождается синтезом АТФ и изменением окислительно-восстановительного потенциала (Hare and Cress, 1997). Для изучения роли ПДГ в стрессоустойчивости растений были получены трансгенные растения арабидопсиса с пониженной активностью этого фермента. Однако, снижение активности ПДГ в одном случае приводило к увеличению содержания пролина и повышению стрессоустойчивости (Nanjo et al., 1999), а в другом такого эффекта не наблюдалось (Mani et al., 2002), что не позволяло делать каких-либо заключений. Баланс синтеза и деградации пролина является одним из важных элементов механизма устойчивости к осмотическому стрессу, поэтому проблема взаимосвязи между ПДГ и стрессоустойчивостью относилось к числу актуальных задач молекулярной генетики растений.
Трансгенные растения с супрессированной активностью ПДГ представляют собой адекватную генетическую модель для исследования этой проблемы. Мы предполагали, что снижение активности ПДГ может привести к повышению содержания пролина в клетках трансгенных растений в нормальных условиях и, возможно, к повышению их стрессоустойчивости. С другой стороны, снижение активности этого фермента могло негативно сказаться на устойчивости к стрессу, например в том случае, если деградация пролина в условиях стресса важна для поддержания адекватного баланса NAD/NADH.
Таким образом, цель настоящей работы заключалась в исследовании роли гена ПДГ в устойчивости растений к абиотическим стрессам. В рамках данной работы было запланировано решить следующие задачи:
1. Создать генетические конструкции, экспрессия которых в геноме растений будет приводить к супрессии гена пролиндегидрогеназы, отвечающего за деградацию пролина.
2. Получить растения табака, несущие генетические конструкции супрессоры пролиндегидрогеназы.
3. Исследовать биохимические и физиологические параметры растений-трансформантов, такие как активность пролиндегидрогеназы, содержание пролина, осмотическое давление клеточного сока, солеустойчивость.
Научная новизна. В результате проведенного исследования создана новая генетическая модель – трансгенные растения табака, несущие гетерологичный антисмысловой супрессор пролиндегидрогеназы.
Получена новая информация о роли ПДГ в контроле стрессоустойчивости растений: показано, что частичная супрессия гена ПДГ сопровождается повышением устойчивости растений к засолению, что позволяет выдвинуть гипотезу о возможности контроля стрессоустойчивости за счет изменения активности этого фермента. Предложен новый подход для получения стрессоустойчивых форм растений, основанный на использовании генетических конструкций – супрессоров ПДГ.
Практическая ценность. Показано, что супрессоры гена пролиндегидрогеназы могут использоваться для получения генетически модифицированных растений с увеличенной стрессоустойчивостью.
Создан набор генетических конструкций, которые могут быть использованы для получения стрессоустойчивых форм растений. Показана возможность создания достаточно эффективного супрессора на основе гетерологичного гена. Разработан подход, позволяющий исключать из состава генетических конструкций маркерные гены устойчивости к антибиотикам и проводить отбор трансформантов непосредственно на стрессовых фонах. Подана заявка на патент «Способ получения трансгенных растений табака c повышенным содержанием пролина».
Генетические конструкции, содержащие супрессоры гена пролиндегидрогеназы, переданы и используются в Институте физиологии растений РАН и ВНИИ картофельного хозяйства РАСХН.
Положения, выносимые на защиту.
1. Создан антисмысловой супрессор гена ПДГ. Показано, что частичная супрессия гена ПДГ увеличивает стрессоустойчивость растений, что подтверждает гипотезу о роли этого гена в контроле стрессоустойчивости.
2. Созданы генетические конструкции, не содержащие генов устойчивости к антибиотикам и несущие минимальное количество чужеродной для растения векторной ДНК. Показана возможность отбора и получения трансгенных растений, несущих антисмысловой супрессор ПДГ, на средах, не содержащих антибиотики.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на российских и международных конференциях: 7-ой Пущинской школе– конференции молодых ученых, 2003;
конференции МОГиС, 2003;
Международной конференции «Биология растительных клеток in vitro и биотехнология», Саратов, 2003;
Съезде ВОГиС, Москва, 2004;
III международной научной конференции «Факторы экспериментальной эволюции организмов», Украина, Алушта, 2006;
Всероссийской конференции «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды», Иркутск, 2007.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ и подана заявка на патент.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы.
Работа изложена на 108 страницах, включает 21 рисунок и фотографии, таблиц в тексте диссертационной работы. Библиографический указатель включает 216 источников.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Получение генетических конструкций. Для получения генетических конструкций использовали стандартные методы молекулярного клонирования (Маниатис и др., 1984).
Получение трансгенных растений табака. Для получения трансгенных растений табака Nicotiana tabacum L. в качестве исходного материала был взят сорт табака SR1. Трансформация растений табака проведена путем кокультивирования листовых дисков с Agrobacterium tumefaciens (штаммы LBA4404 или GV2260). Для последующей регенерации растений табака листовые экспланты помещали на питательную среду MS с добавлением соответствующих растительных гормонов и селектирующего агента (канамицина, 200 мг/л). Для проведения экспериментов трансформанты размножали с помощью микроклонирования.
Анализ геномной ДНК растений методом Саузерн-блот гибридизации. Геномную ДНК выделяли из листьев контрольных и трансгенных растений с использованием набора Genomic DNA purification kit (Fermentas). 10 мкг выделенной геномной ДНК обрабатывали эндонуклеазой рестрикции HindIII, разгоняли в 0.8% агарозном геле и переносили на заряженную нейлоновую мембрану капиллярным способом.
В качестве зонда использовалась часть Т-ДНК использованной для трансформации конструкции.
Измерение содержания пролина в листьях растений. Содержание свободного пролина определяли по методу Бейтса (Bates et al., 1973).
Измерения проводили в листьях растений в возрасте 5-8 недель, культивируемых при температуре 23-25P0 и 16-часовом световом дне, PС либо у проростков в возрасте трех недель, выращенных на агаризованной среде MS в чашках Петри.
Измерение активности фермента пролиндегидрогеназы в листьях трансгенных растений. Активность пролиндегидрогеназы оценивали по скорости использования НАДP+ на окисление пролина, P измеряя увеличение концентрации образующегося НАДН в единицу времени с помощью метода Маттиони с соавторами (Mattioni et al., 1997).
Активность выражали в наномолях НАДP+ восстановленного в течение P, мин в расчете на 1 мг растворимого белка.
Измерение осмотического давления клеточного сока в листьях трансгенных растений. Для определения осмотического давления клеточного сока использовали клетки нижнего эпидермиса листа. Образцы помещали в гипертонические растворы сахарозы разной концентрации (от 0 до 50 Атм. О.Д.) на 40-50 минут. Затем проводился их анализ на степень плазмолиза в клетках. По изотоническому коэффициенту (Полевой, 1989) определяли осмотическое давление клеточного сока. Осмотический потенциал в клетках тех же образцов определяли в Институте физиологии растений РАН (Москва).
Изучение солеустойчивости трансгенных растений. Для оценки были взяты растения на разных стадиях развития (семена и проростки, выращенные в нормальных условиях до стадии двух пар настоящих листьев), которые помещались на среду MS с различным содержанием NaCl (в разных опытах – 150 мМ и 250 мМ).
Прямой отбор трансформантов на стрессовом фоне. Был проведен эксперимент по прямой селекции трансформантов, несущих конструкции pBi101, pBEF и pBEFmin, на стрессовом фоне. Отбор трансформантов проводили на среде MS с добавлением 0.1 мМ азетидин-2-карбоксилата.
Определение активности неомицинфосфотрансферазы в трансгенных растениях. Определение активности фермента NPTII в экстрактах из листьев проводилось по (Reiss et al., 1984) с модификациями.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Создание генетических конструкций для получения трансгенных растений с супрессированной активностью гена ПДГ. Для получения растений с супрессированной активностью ПДГ был создан ряд генетических конструкций. Последовательность гена ПДГ известна далеко не для всех видов растений, но известные последовательности в некоторых участках имеют достаточно большую консервативность, поэтому для конструирования был использован фрагмент одного из известных на момент начала работы генов (A. thaliana). В дальнейшем также была сделана конструкция pBi2E, содержащая дуплицированный участок гена ПДГ арабидопсиса, расположенный в виде инвертированного повтора, в результате чего в растениях должна синтезироваться молекула РНК с протяженным двуцепочечным участком. Из литературы известно, что использование двуцепочечного супрессора для подавления активности генов более эффективно (Wang and Waterhouse, 2000) (рис. 1).
А Б Рисунок 1. Т-ДНК области полученных конструкций. А: антисмысловой супрессор, pBE;
Б: двуцепочечный супрессор, pBi2E. Обозначения: 35S pro – промотор вируса мозаики цветной капусты;
PDH-ex1 фрагмент первого экзона гена ПДГ арабидопсиса;
NOSter – сигнал полиаденилирования;
NOSpro – промотор гена нопалинсинтазы;
GUS – ген бета-глюкуронидазы E. coli;
NPTII – ген неомицинфосфотрансферазы II E. coli;
RB и LB – повторы, ограничивающие Т-область.
Доказательство присутствия трансгенных встроек в геномах полученных растений. Для подтверждения наличия инсерций трансгена pBE в геном табака и приблизительной оценки их количества был проведен Саузерн-блот анализ отобранных трансформантов. Образцы геномной ДНК трансформантов и контрольных нетрансгенных растений в двух разных экспериментах обрабатывались рестриктазой HindIII. В конструкции pBE имеется только один сайт рестрикции этой рестриктазы.
Зонды для гибридизации были подобраны таким образом, что в первом случае одной встройке генетической конструкции должно соответствовать два сигнала, а во втором – один. Данные этих двух экспериментов суммированы в таблице 1.
Таблица 1. Данные Саузерн-блот гибридизаций о количестве копий трансгенной конструкции в геномах трансформантов.
Трансгенное Количество копий растение трансгена №1 №2 №5 №6 №8 2- №10 3- Отдельно был проведен анализ числа функционально активных копий Т-ДНК по наследованию репортерного гена nptII в поколении ТB1. B Согласно полученным данным, растения линий № 1, 2, 5, 6, 8 и являются гемизиготами с разной степенью выраженности замолкания (сайленсинга) трансгенных встроек. Расхождение данных Саузерн-блот гибридизации и сегрегационного анализа можно, по-видимому, объяснить тем, что часть копий трансгена может находиться в неактивном состоянии (Kumar and Fladung, 2000). При сегрегационном анализе будут определяться только функционально-активные копии трансгена, а при Саузерн-блот гибридизации – все копии. Кроме того, работа антисмыслового супрессора может сопровождаться посттранскрипционным сайленсингом близкорасположенного гена nptII, что не влияет на эффективность супрессии целевого гена ПДГ. Таким образом, результаты Саузерн-блот гибридизации показали наличие инсерций Т-ДНК области конструкции pBE в исследованных растениях.
Измерение содержания пролина в листьях трансгенных растений. Мы предполагали, что снижение активности ПДГ в результате экспрессии антисмыслового супрессора приведет в первую очередь к увеличению содержания свободного пролина. Содержание пролина измерялось в зеленых листьях растений в возрасте 5-8 недель, выращенных на керамзите, либо у проростков в возрасте трех недель, выращенных на агаризованной среде MS в чашках Петри. Позднее было проведено измерение содержания пролина в листьях некоторых трансформантов, несущих двуцепочечный супрессор, с целью сравнения двух разных типов конструкций. Всего было проанализировано независимых трансформантов, несущих антисмысловой супрессор ПДГ (pBE) (рис. 2) и 7 независимых трансформантов, несущих двуцепочечный супрессор (pBi2E).
** А Б ** Пролин, мкг/гр сырой массы Пролин, мкг/гр сырой массы * 1600 *** * 1400 *** ** ** * * 0 K №1 №2 №3 №5 №6 №8 №10 К №1 №2 №3 №5 №6 №8 № Растения Растения Рисунок 2. Содержание пролина в листьях нетрансгенных растений и трансгенных растений несущих конструкцию pBE: А: Трехнедельные растения, выращенные на среде MS;
Б: 5-8 недельные растения, выращенные в теплице (на керамзите). Различия между опытным образцом и контролем достоверны с вероятностью: * Р 0.95;
** Р 0.99;
*** Р 0.999.
Из диаграмм, представленных на рисунке (рис. 2А и 2Б), видно, что сходное распределение по уровню содержания пролина в общем сохраняется у проростков и взрослых растений (кроме линии №10), хотя у проростков абсолютные показатели по содержанию пролина на порядок больше, чем у взрослых растений. Обращает на себя внимание значительная вариабельность этого параметра, особенно у взрослых растений. Более того, содержание пролина в образцах, взятых с одного растения, также может существенно различаться. Эти данные согласуются с результатами, полученными другими авторами (Kishor et al., 1995;
Zhu et al., 1998).
По-видимому, содержание пролина зависит от целого ряда факторов, не все из которых известны. В целом, уровень пролина в наших экспериментах у трансгенных растений, как у взрослых, так и у проростков, выше чем у контрольных в 1.5-3 раза. На основе полученных данных можно заключить, что растения, несущие гетерологичный антисмысловой супрессор, характеризуются в среднем достоверно большим содержанием пролина, однако это повышение относительно невелико (например, в стрессовых условиях содержание пролина может увеличиться на порядок).
Что касается измерений у трансформантов с двуцепочечным супрессором (рис. 3), то полученные результаты оказались сходными с вышеприведенными с той лишь разницей, что уровень пролина у трансформантов превышал таковой у контрольных растений не в 1.5- раза, а в 1.5-6 раз. Эти данные, по-видимому, подтверждают тот факт, что двуцепочечные конструкции более эффективны в качестве супрессоров, чем антисмысловые. Таким образом, повышенный уровень пролина у трансформантов может отражать активность и эффективность использованных конструкций для супрессии гена ПДГ.
*** Рисунок 3. Содержание пролина в листьях Пролин, мкг/гр сырой массы нетрансгенных растений и ** трансгенных растений, ** несущих конструкцию pBi2E.
Четырехнедельные растения, * выращенные на среде MS.
* Различия между опытным образцом и контролем * достоверны с вероятностью:
* Р 0.95;
** Р 0.99;
*** Р 0.999.
K №1 №10 №11 №13 №14 №16 № Растения Измерение активности фермента пролиндегидрогеназы в листьях трансгенных растений. Для того чтобы непосредственно оценить, в какой мере введенная конструкция подавляет экспрессию гена ПДГ, было проведено измерение активности этого фермента у некоторых трансформантов и у контрольных растений. В нормальных условиях уровень экспрессии гена ПДГ относительно невысок, а в стрессовых условиях экспрессия этого гена вообще подавляется, однако, когда стрессовые факторы перестают действовать (например, в условиях регидратации после засухи или после снятия солевого стресса), наблюдается значительное увеличение активности ПДГ (Ribarits et al., 2007). В связи с этим, для измерения растения выращивали на обычной питательной среде и на среде с добавлением соли, а потом переносили на ночь в жидкую питательную среду для включения механизмов восстановления после стресса. Полученные данные приведены в таблице 2.
Как можно видеть, трансгенные растения в нормальных условиях не демонстрируют пониженного уровня активности ПДГ по сравнению с контролем. Однако в условиях восстановления после стресса, у контрольных растений активность ПДГ повышается, в то время как у трансформантов активность ПДГ не только не повышается, но становится меньше. Таким образом, трансформанты характеризуются снижением активности ПДГ, проявляющемся при смене условий норма-стресс-норма.
Таблица 2. Измерение активности ПДГ в листьях трансгенных растений и контроля.
Образец нмоль НАДH/мин*мгр белка Растения в нормальных Растения после условиях регидратации 2.82 ± 0.8P* Линия №4 4.85 ± 1.2 P 4.21 ± 1.15P* Линия №6 7.14 ± 1.01 P Линия №8 3.7 ± 0.6 5.5 ± 1.5 8.1 ± 1. Контроль *Различия между опытным образцом и контролем достоверны (Р 0.95) Измерение осмотического давления клеточного сока и осмотического потенциала клеточного сока в листьях трансгенных растений. Характерной особенностью адаптации растений к засухе и засолению является увеличение осмотического давления клеточного сока (ОДКС) и, соответственно, снижение осмотического потенциала (ОПКС) за счет повышения в клетках концентрации осмотически активных соединений. Поэтому можно было ожидать, что повышенное содержание пролина в клетках трансформантов приведет к снижению у них осмотического потенциала, по сравнению с контрольными растениями.
Данные, приведенные на рисунке 4, показывают, что у трансгенных растений действительно ОДКС повышалось (в 1.2-1.7 раза), а ОПКС понижался (в 1.2-1.5 раза) по сравнению с контролем. Особенно явные отличия обнаружились у линии №10.
Рисунок 4. ОДКС и ОПКС, в листьях контрольных растений и трансформантов.
Различия между опытным образцом и контролем достоверны с вероятностью: * Р 0.95;
** Р 0.99;
*** Р 0.999.
Характерно, что повышение ОДКС и понижение ОПКС у трансформантов слабо коррелирует с уровнем содержания пролина. Более того, наблюдаемое увеличение в содержании пролина явно недостаточно для того, чтобы объяснить этот эффект (эта проблема активно обсуждается: даже многократное увеличение в содержании пролина в условиях стресса недостаточно для того, чтобы объяснить наблюдаемые изменения осмотического потенциала (Serraj and Sinclair, 2002), что позволяет некоторым автором вообще отрицать роль пролина в стрессоустойчивости (Lutts et al., 1996)). Возможно, что взаимосвязи между содержанием пролина, выполняющего целый ряд специфических функций, и осмотическим давлением клеточного сока неоднозначны и могут находиться под влиянием дополнительных факторов.
Изучение солеустойчивости трансгенных растений. Одним из основных показателей, по которому можно определить силу стрессового воздействия на растения, является интенсивность их роста в условиях засоления, определяемая по накоплению биомассы. Известно так же, что в условиях солевого стресса содержание пролина в клетках растений многократно увеличивается. В связи с этим, был проведен эксперимент, целью которого было установить, дает ли повышенное содержание пролина у трансгенных растений им преимущество в солеустойчивости по сравнению с контролем. Для этого семена трансгенных и контрольных растений высевали на среду MS, затем проростки выращивали до появления пары настоящих листьев и пересаживали на среду MS, содержащую хлорид натрия в концентрации 250 мМ. При культивировании растений на среде с таким содержанием соли было заметно замедление роста как у контрольных, так и у трансгенных растений. Однако, у трансгенных растений этот процесс оказался не так сильно выражен, кроме того у контрольной линии был отмечен хлороз листьев (рис. 5, приведены растения линии 10), Рисунок 5. Рост растений на средах с добавлением мМ хлорида натрия. К – контрольные нетрансгенные растения, №10 – трансгенное растение №10.
К № Кроме того, для оценки устойчивости растений к повышенному содержанию соли были проведены эксперименты по проращиванию семян на солесодержащих средах: семена трансгенной линии №6 и сорта SR (контроль) высевали на стандартную среду MS и на среду MS с добавлением соли (150 мМ NaCl). На этой среде в условиях климатокамеры (+24P0 16 ч световой день) растения выращивали в PС, течение 2 месяцев. Обнаружено, что контрольные растения сорта SR1 в условиях солевого стресса были способны формировать только одну пару настоящих листьев. Рост растений был угнетен, средняя масса растения составляла 0,02 ± 0,001 г. В то же время, трансгенные растения линии № формировали две пары настоящих листьев и лучше адаптировались к стрессу: средняя масса растений составляла 0,04 ± 0,01 г. В нормальных условиях, на среде MS, как контрольные, так и трансгенные растения имели 4 пары настоящих листьев, а длина корней превышала 10 см. В условиях солевого стресса длина корней у табака сорта SR1 составляла 1- мм, а у линии № 6 – 3.5 ± 1,31 см. Таким образом, было показано, что трансгенные растения более устойчивы к повышенным концентрациям соли, чем растения контрольной линии.
Прямая селекция трансформантов на стрессовом фоне. Тот факт, что трансгенные растения характеризовались увеличенной стрессоустойчивостью, позволил нам выдвинуть предположение о возможности получения растений трансформантов на стрессовых фонах без использования генов-маркеров и антибиотиков. Такой отбор мог проводиться с использованием в качестве селектирующего агента NaCl или токсичных аналогов пролина. Азетидин-2-карбоксилат токсичен для растений с нормальным или пониженным содержанием пролина, растения с повышенным содержанием пролина менее подвержены его токсическому действию. К преимуществам такой методики можно отнести то, что исчезает необходимость введения в генетическую конструкцию гена устойчивости к антибиотику, а также появляется возможность сразу получать растения, характеризующиеся максимально возможным повышением стрессоустойчивости.
Для проведения экспериментов по прямому отбору трансформантов на стрессовых фонах были сделаны две новые конструкции. Была получена конструкция, содержащая полный первый экзон ПДГ - pBEF.
Кроме того, была сделана минимальная генетическая конструкция, содержащую только антисмысловой фрагмент – pBEFmin (рис. 6).
А Б Рисунок 6. Т-ДНК области полученных конструкций. А: антисмысловой супрессор, pBEF;
Б: «минимальная» конструкция, pBEFmin. Обозначения: 35S pro – промотор 35S вируса мозаики цветной капусты;
PDH-ex1 фрагмент первого экзона гена ПДГ арабидопсиса;
NOSter – сигнал полиаденилирования;
NOSpro – промотор нопалинсинтазы;
GUS – ген бета-глюкуронидазы;
NPTII – ген неомицинфосфотрансферазы II;
RB и LB – повторы, ограничивающие Т-область.
С этими конструкциями и контрольной конструкцией (вектором pBi101) был проведен эксперимент по селекции трансформантов на питательной среде с добавлением 0.1 mM азетидин-2-карбоксилата.
Результаты селекции листовых дисков табака, трансформированных конструкцией pBEF, минимальной pBEFmin и контрольной pBi показали, что трансформация с отбором на канамицине дает ожидаемые результаты: конструкции, несущие ген nptII, обеспечивают выживание листовых дисков и появление проростков;
листовые диски, трансформированные минимальной конструкцией, погибли. При отборе на азетидин-2-карбоксилате, выживали только растения, несущие конструкциею pBEF (рис. 7).
А Б Рисунок 7. Прямая селекция трансформантов на стрессовом фоне. Листовые диски, помещались на среду с 0.1 мМ азетидин-2-карбоксилатом. А: трансформация контрольной конструкцией pBi101;
Б: трансформация конструкцией pBEF.
Многократные повторения этого эксперимента с использованием в качестве селектирующего агента 0.1 мМ азетидин-2-карбоксилата или мМ NaCl всегда показывали однозначный результат: выживали только растения, трансформированные генетическими конструкциями pBEF (в других экспериментах использовали так же pBi2E). ПЦР на геномной ДНК трансформантов также показал наличие фрагмента, соответствующего использованному в конструкции фрагменту гена ПДГ. Трансформанты также были протестированы на активность неомицинфосфотрансферазы с помощью npt-теста (рис.8).
F1 F2 F3 F4 FW1g FW1w К Рисунок 8. Анализ активности гена неомицинфосфотрансферазы II в листьях трансформантов, полученных с помощью отбора на азетидин-2-карбоксилате.
Трансформанты обозначены: F1, F2, F3, FW1;
FW1g, FW1w;
К – нетрансгенное растение линии SR1.
У части растений было измерено содержание свободного пролина (на рис. 9 представлены результаты измерений двух таких растений).
450 ** Рисунок 9. Содержание пролина в листьях нетрансгенных растений Пролин, мкг/гр сырой массы (SR1) и трансгенных растений, несущих конструкцию pBEF (FW1, F2). Различия между опытным образцом и контролем достоверны с вероятностью Р 0.99.
SR1 FW 1 F Растения Эти эксперименты продемонстрировали возможность отбора и получения трансгенных растений на средах, не содержащих антибиотики, что позволяет исключить из конструкций соответствующие гены устойчивости. Трансформация минимальной конструкцией в ее нынешнем варианте дала отрицательный результат – все проростки были витрифицированы, но это можно объяснить тем, что использованный вариант минимальной конструкции не содержал даже промотор, а только фрагмент ПДГ. По-видимому, этого не достаточно и необходимо либо использовать промотор, либо увеличить размер антисмыслового фрагмента, либо использовать вариант с двуцепочечным супрессором.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ В рамках диссертационной работы было проведено исследование взаимосвязи между системой катаболизма пролина и стрессоустойчивостью растений. С этой целью нами был создан набор генетических конструкций – супрессоров гена пролиндегидрогеназы, кодирующего основной фермент деградации пролина, получены трансгенные растения табака и проведен анализ их морфологических, биохимических и физиологических характеристик. Полученные результаты позволяют сделать следующее заключение: трансгенные растения характеризуются сниженной активностью пролиндегидрогеназы, что не влияет на их морфологию и параметры развития. При этом растения характеризовались увеличенным содержанием пролина и повышенным давлением клеточного сока в нормальных условиях. Исследование характеристик трансформантов показало, что они значительно лучше выдерживают условия стресса (засоления): кроме того, дальнейшие исследования линий трансгенных растений табака, полученных из описанных в работе трансформантов с конструкцией pBE, показали, что они характеризуются повышенной устойчивостью к самым разным абиотическим стрессам (осмотическому, солям тяжелых металлов, высокотемпературному) (Колодяжная, автореферат канд. дисс., 2007). Эти данные также подтверждаются результатами, полученными при исследовании растений рапса, несущих конструкцию pBEF (Мохамед, автореферат канд. дисс., 2006). В нашей лаборатории были получены трансгенные растения картофеля сорта «Никулинский», несущие конструкцию pBEF и характеризующиеся повышенным содержанием пролина, которые были переданы для оценки их характеристик в ВНИИКХ РАСХН: согласно предварительным данным, трансформанты также характеризовались увеличенной устойчивостью к засухе и высокой температуре (Кирсанова, в печати). Таким образом, наблюдается явная взаимосвязь между снижением активности ПДГ и увеличением стрессоустойчивости у растений табака, картофеля и рапса, что согласуется с данными Nanjo с соавторами (1999) и противоречит данным Mani с соавторами (2002). Мы предполагаем, что увеличенная стрессоустойчивость в данном случае может быть связана со следующими механизмами:
1. Супрессия ПДГ приводит к увеличению в содержании пролина в 2- раза. Этот показатель не может объяснить наблюдаемое увеличение ОДКС: повышение стрессоустойчивости и ОДКС в данном случае не может быть связано с эффектом пролина как совместимого осмолита. Однако, известно, что пролин регулирует экспрессию некоторых генов, связанных со стрессоустойчивостью (Satoh et al., 2002). Возможно, эти гены и опосредуют изменение ОДКС (например, через синтез сахаров или сахароспиртов или других аминокислот).
2. Относительно небольшое увеличение в содержании пролина, которое наблюдается в трансформантах с супрессированной ПДГ, может оказаться важным на первых этапах стрессового воздействия.
Известно, что выживание растения при неожиданном наступлении стресса (без акклиматизации) часто определяется скоростью включения защитных механизмов. Если растение уже содержит некоторое дополнительное количество защитного агента широкого спектра действия (пролина), то это может придать дополнительную устойчивость клеточным системам, отвечающим за стрессовый ответ: например, защитить базовые ферменты транскрипции и трансляции от ингибирования и обеспечить первичный синтез стрессовых белков. Этот механизм хорошо согласуется с широким спектром устойчивости растений табака с супрессированной ПДГ (засоление, тяжелые металлы, осмотический стресс, высокая температура (Колодяжная, Титов и др., 2006;
2007)).
Полученные данные также показали, что созданные в рамках диссертационной работы конструкции могут использоваться для получения стрессоустойчивых форм трансгенных растений. С их помощью были получены растения рапса и картофеля, которые в настоящее время активно изучаются. Нами был разработан новый подход, основанный на получении трансгенных растений с супрессированной активностью ПДГ на стрессовых фонах без использования антибиотиков или других репортерных генов. Подана заявка на патент «Способ получения трансгенных растений табака c повышенным содержанием пролина».
Таким образом, разработанный в рамках диссертационной работы подход можно применять для модификации растений с целью получения форм, способных расти в условиях абиотических стрессов, а также для исследования роли пролина в механизмах стрессоустойчивости.
ВЫВОДЫ 1. На основе гена ПДГ арабидопсиса созданы три генетические конструкции – супрессоры гена пролиндегидрогеназы.
2. Получены трансгенные растения табака (Nicotiana tabacum SR1), несущие антисмысловой супрессор гена ПДГ. Показано, что:
• трансгенные растения характеризуются повышенным содержанием пролина по сравнению с контролем в 1.5-3 раза и снижением активности ПДГ в период восстановления после стресса;
• трансгенные растения характеризуются повышенным осмотическим давлением клеточного сока и увеличенной солеустойчивостью;
• трансгенные растения не отличаются от контрольных по морфологическим параметрам и срокам развития.
3. На основе совокупности полученных данных выдвинуто предположение о взаимосвязи между катаболизмом пролина и стрессоустойчивостью, которая может быть связана либо с влиянием пролина на экспрессию других генов стрессового ответа растений, либо с позитивным влиянием увеличенного содержания пролина на стрессоустойчивость на ранних этапах развития стресса.
4. Созданы генетические конструкции, не содержащие гена устойчивости к антибиотику и несущие минимальное количество чужеродной для растения векторной ДНК. Показана возможность отбора и получения трансгенных растений, несущих антисмысловой супрессор ПДГ, на средах, не содержащих антибиотики, что позволяет использовать эту конструкцию в качестве маркера.
Публикации 1. Титов С.Е., Кочетов А.В., Коваль В.С., Шумный В.К. Трансгенез как способ повышения устойчивости растений к абиотическим стрессам // Успехи совр. биологии. 2003. Т. 123. С. 487- 2. Кочетов А.В., Титов С.Е., Колодяжная Я.С., Комарова М.Л., Коваль В.С., Макарова Н.Н., Илинский Ю.Ю., Трифонова Е.А., Шумный В.К.
Повышение содержания пролина и осмотического давления клеточного сока у трансформантов табака, несущих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы // Генетика. 2004. Т. 40. C. 282- 3. Колодяжная Я.С., Титов С.Е., Кочетов А.В., Комарова М.Л., Романова А.В., Коваль В.С., Шумный В.К. Оценка солеустойчивости растений табака Nicotiana tabacum, несущих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы // Генетика 2006. Т. 42. С. 278-281.
4. Колодяжная Я.С., Титов С.Е., Кочетов А.В. Перспективы получения генетически модифицированных растений, устойчивых к тяжелым металлам // Сб.науч.трудов «Факторы экспериментальной эволюции организмов». Киев «Логос». 2006. С. 586-589.
Колодяжная Я.С., Титов С.Е., Кочетов А.В., Трифонова Е.А., Романова 5.
А.В., Комарова М.Л., Коваль В.С., Шумный В.К.. Трансформанты табака, экспрессирующие антисмысловую последовательность гена пролиндегидрогеназы, проявляют устойчивость к тяжелым металлам // Генетика. 2007. Т. 43. № 7. С. 994-998.