Акустическое детектирование микроэмболов на ранних этапах тромбообразования in vitro и in vivo

На правах рукописи

УЗЛОВА Светлана Геннадьевна АКУСТИЧЕСКОЕ ДЕТЕКТИРОВАНИЕ МИКРОЭМБОЛОВ НА РАННИХ ЭТАПАХ ТРОМБООБРАЗОВАНИЯ IN VITRO И IN VIVO 03.00.02 – биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2008

Работа выполнена в Государственном учреждении Гематологический научный центр Российской Академии Медицинских Наук

Научный консультант:

доктор физико-математических наук Гурия Георгий Теодорович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Ройтман Евгений Витальевич кандидат физико-математических наук Колобов Андрей Владимирович

Ведущая организация:

Кафедра Биофизики Государственного учебно-научного учреждения Биологического Факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится «28» января 2009 года в 14 часов в Большом конференц-зале на заседании диссертационного совета Д.001.042. в Гематологическом научном центре по адресу: 125167, г. Москва, Новый Зыковский пр-д, 4а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ ГНЦ РАМН (г. Москва, Новый Зыковский пр-д, 4а).

Автореферат разослан «24» декабря 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук Е.Е. Зыбунова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Проблемы тромбообразования интенсивно изучаются в связи с важной ролью нарушений системы гемостаза при целом ряде клинически проявляющихся патологий [Баркаган 1999, Балуда 1995, Макаров 2003, Levi 1999, Colman 2006]. Оценка состояния системы гемостаза производится посредством специальных диагностических тестов, многие из которых выполняются в лабораторно-клинических условиях [Баркаган 1999, Балуда 1995, Козинец 1997, Hall 1991, Baglin 2005].

Для изучения наиболее деликатных, а в ряде случаев и наиболее сложных вопросов, касающихся механизмов регуляции системы свертывания крови, создаются специальные методики, в том числе основанные на использовании новых физико-химических или биологических принципов [Barrowcliffe 2006, Baglin 2008, Brummel-Ziedins 2008]. В силу сложности механизмов регуляции системы свертывания крови (ССК) бывает далеко непросто установить истинную причину нарушения процессов тромбообразования у конкретного пациента [Балуда 1995, Баркаган 1999, Zwaal 1986]. Ситуация осложняется еще и тем, что в крупных сосудах свертывание крови и образование тромбов может протекать стремительно и представлять непосредственную угрозу для жизни пациента.

В связи с изложенным, большое значение имеют методы прямого детектирования в реальном времени процессов тромбообразования в сосудах большого диаметра.

Проведенный в данной работе анализ теоретических и экспериментальных данных показал, что в качестве метода раннего неинвазивного детектирования процессов свертывания крови в интенсивном кровотоке наиболее перспективно исследовать возможности акустических ультразвуковых методов регистрации микроэмболов.

Цель: разработка методов ультразвуковой регистрации фибриновых микроэмболов в кровотоке для диагностики начальных этапов свертывания крови.

В работе решались следующие задачи:

1. Изучить возможности использования ультразвуковых методов диагностики нарушения кровотока для регистрации ранних этапов тромбообразования.

2. Выявить индикативные параметры акустического сигнала, чувствительные к агрегатным изменениям цельной крови или ее плазменного компонента.

3. Изучить акустические эффекты, вызываемые коагулогическими процессами непосредственно в сосудистом кровотоке у пациентов, обследуемых в отделении ультразвуковой диагностики ГНЦ РАМН.

4. Провести пробные исследования действия фибринолитического препарата - стрептокиназы с помощью ультразвуковой регистрации процессов тромболизиса в условиях интенсивного массопереноса in vitro.

Научная новизна. При помощи специально разработанной экспериментальной установки продемонстрирована взаимосвязь появления акустически наблюдаемого эхоконтраста и оптически регистрируемых процессов тромбообразования. Показано, что появление фибриновых микроэмболов, регистрируемых оптически, в интенсивном кровотоке всегда проявляется в акустическом сигнале в виде эхоконтраста. Показано, что на начальном этапе тромбообразования в плазме крови интенсивность акустического доплеровского сигнала резко увеличивается в 6,4±1,3 раза;

при тромбообразовании в цельной крови – в 2,2±0,4 раза. Установлена стадийность процессов свертывания крови в интенсивном кровотоке.

Используя акустические методы, удалось выделить следующие последовательные стадии: «метель» (появление множественных микроэмболов, движущихся в потоке практически независимо друг от друга), «буран» (формирование агрегатов микроэмболов с нечеткими границами) и образование макроскопических сгустков. Продемонстрирована эффективность ультразвуковых методов для неинвазивной регистрации ранних этапов внутрисосудистого тромбообразования. Установлена принципиальная возможность мониторирования кинетики фибринолитических процессов (вызываемых действием стрептокиназы) акустическими методами.

Практическое значение. В настоящее время в клинической практике отсутствует общепринятая методика неинвазивной оценки в реальном времени коагулогического статуса крови в крупных сосудах. Полученные в работе результаты имеют важное значение для развития клинических методов диагностики претромботических состояний, а также для разработки методов контроля фибринолитических процессов, вызываемых введением лизирующих препаратов. В свете вероятных клинических приложений наибольшую ценность, по нашему мнению, имеет разработка методов непрерывного акустического мониторинга системы свертывания крови in vivo. Наиболее актуально применение такого непрерывного наблюдения для контроля состояния послеоперационных больных. Очевидно, что лоцировать все сосуды невозможно, но вполне возможно использовать несколько датчиков, сканирующих области наиболее вероятного образования тромбов.

Создание метода непрерывного акустического мониторинга позволит детектировать начальные стадии тромбообразования, на которых развитие процессов свертывания еще является обратимым при своевременной и адекватной фармакологической поддержке.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладывались на семинарах лаборатории криобиофизики клеток крови ГНЦ РАМН, на XLIX научной конференции МФТИ (Долгопрудный, 2006), на 13-й Всероссийской научной конференции студентов-физиков и молодых ученых (Таганрог, 2007), на Третьей Всероссийской конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (Москва, 2007), на Международном Симпозиуме «Современные методы спектроскопии для изучения структур и функций биополимеров в биологии и медицине» (Дубна, 2007), на 5-м съезде Российской ассоциации специалистов ультразвуковой диагностики в медицине (Москва, 2007), на XIV научной школе «Нелинейные волны - 2008» (Нижний Новгород, 2008), на семинаре «Vasomotion workshop -2008» (Копенгаген, 2008).

Апробация диссертации проведена в ГУ ГНЦ РАМН на заседании проблемной комиссии № 6 «Биохимия, биофизика и реология крови» (протокол №5 от 13.11.2008).

Публикации. За время работы над диссертацией опубликовано работ, в том числе 2 работы в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертационных исследований.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, иллюстрирована 3 таблицами и рисунками. Работа состоит из введения, пяти глав (обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 2-х глав с результатами исследования и обсуждения результатов), выводов, списка литературы, включающего 180 источников, среди которых 45 отечественных и зарубежных, а также приложения с описанием клинических наблюдений, сопоставляемых в данной работе с экспериментальными записями.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава I. Обзор литературы.

Данная глава содержит обзор литературы, в котором кратко излагается физиологическое значение и основные механизмы активации и регуляции системы свертывания крови (ССК), влияние гидродинамики на процессы свертывания крови, методы математического моделирования процессов активации тромбообразования, а также описываются существующие на настоящее время методы диагностики нарушений ССК и акустические методы исследования нарушений кровотока. Анализ современных работ по использованию ультразвуковых методов применительно к изучению проблем тромбообразования, проведенный в главе I настоящей диссертации, показал, что в этой области имеется несколько перспективных направлений.

Одно из таких направлений связано с применением транскраниального доплеровского сканирования (ультразвуковая доплерография сосудов головного мозга) для регистрации одиночных флотирующих эмболов различного происхождения [Markus 1995, Russell 2002, Ringelstein 1998].

Другое направление исследований представлено работами по непосредственному изучению изменения параметров акустического сигнала в ходе тромбообразования в бесконвективных системах in vitro [Грибаускас 1972, Machado 1991, Huang 2005, Shung 1986].

С клинической точки зрения большой интерес представляют работы, посвященные изучению эффекта спонтанного эхоконтраста (СЭК) [Iliceto 1985, Ercan 2003, Rastegar 2003, Merino 1992, Панченко 2007]. СЭК – явление увеличения интенсивности рассеяния ультразвука в кровотоке, часто наблюдаемое в крупных сосудах и полостях сердца. Природа механизмов, ответственных за появление СЭК, интенсивно изучается. В главе I настоящей диссертации подробно обсуждаются работы, в которых авторы рассматривают появление СЭК как следствие агрегационных процессов в крови.

На основании изучения накопленного к настоящему моменту экспериментального и клинического материала делается вывод о том, что регистрация ранних этапов тромбообразования представляет важное клиническое значение. Для решения проблемы регистрации в реальном времени ранних стадий процессов свертывания крови целесообразно использовать доплеровский режим ультразвукового сканирования.

Глава II. Методы и материалы. Схема эксперимента.

Лабораторные эксперименты проводились с цельной кровью и обедненной тромбоцитами плазмой крови. Кроме того, в двух сериях экспериментов по исследованию влияния гематокрита на протекание процесса свертывания крови и возможности его акустического детектирования использовались взвеси эритроцитарной массы в нативной плазме. Цельная кровь и ее компоненты были получены на станции переливания крови ГНЦ РАМН. Забор крови производился у здоровых доноров в полиэтиленовые контейнеры «Baxter», содержащие раствор одного из стандартных гемоконсервантов (CPDA), понижающих содержание свободных ионов кальция до подпороговой концентрации. Плазма отделялась от клеток крови центрифугированием в течение 15 минут при 2350g [Инструкция 1987].

Для регистрации оптического и акустического сигналов в ходе всего процесса тромбообразования в плазме крови использовалась специально разработанная оригинальная установка. Принципиальная схема экспериментальной установки приведена на рисунке 1.

Рисунок 1. Схема экспериментальной установки: 1 - перистальтический насос, 2 - замкнутая система прозрачных гибких силиконовых трубок (v=15мл, d=4мм), 3 - винтовой зажим, 4 - видеокамера, 5 - рабочая станция, 6 - ультразвуковой сканер HP Sonos 4500, 7 - датчик, 8 - ванна с водой.

В экспериментах использовалась замкнутая система прозрачных гибких силиконовых трубок (см. (2) на рис.1), являющихся частью системы для гемодиализа «Baxter». Внутренний диаметр трубок 4 мм, общая длина 110 см, полный объем -15 мл. Система трубок заполнялась плазмой крови или цельной кровью в зависимости от типа эксперимента. Скорость течения задавалась при помощи перистальтического насоса, и поддерживалась постоянной на протяжении всего эксперимента (см. (1) на рис.1). Значение средней скорости потока в различных экспериментах варьировалось в пределах от 10 до 30 см/с. Использование винтового зажима (см. (3) на рис.1) позволяло регулировать степень локального пережатия трубки, и таким образом создавать разнообразные условия течения. Кроме того, регулировка степени пережатия сосуда позволяла реализовывать в потоке застойные зоны, что облегчало регистрацию процессов тромбообразования оптическими методами.

Рекальцификация производилась в начале каждого эксперимента посредством введения в трубку 300-500 мкл 10%-ного раствора хлорида кальция (100 мг/мл). Все эксперименты проводились при комнатной температуре t = 23±1°C. Регистрация процессов свертывания плазмы крови производилась одновременно по двум каналам – оптическому и акустическому (см. (4) и (7) на рис.1). Оптическое изображение регистрировалось в отраженном свете лазерного диода (лаз. модуль S- d6х18mm, точка, 5мВт) с длиной волны излучения 640 нм при помощи цифровой видеокамеры (см. (4) на рис.1). Для получения акустического сигнала использовался ультразвуковой сканер HP Sonos 4500 (см. (6) на рис.1) с ультразвуковым датчиком (см. (7) на рис.1), работающим в диапазоне частот от 3,9 до 7,1 МГц. Акустический сигнал отображался на экране сканера в одном из двух режимов: в В-режиме (двумерное изображение) или в D-режиме (развертка доплеровского сигнала).

В опытах с плазмой крови производилась одновременная регистрация оптического изображения и акустического сигнала. В опытах с цельной кровью (средний гематокрит = 50%), в силу ее оптической непрозрачности, производилась регистрация только акустического сигнала. Данные записывались в компьютерный блок цифровой записи, хранения и обработки экспериментальных данных (см. (5) на рис.1), состоящий из персонального компьютера (Intel Pentium 4 CPU, 2.40 GHz, 512 Mb RAM) и двух плат видеозахвата (AverTV WDM Video Capture), в AVI формате. Скорость оцифровки видеоданных составляла 25 кадров в секунду.

В начале каждого эксперимента система трубок заполнялась исследуемой жидкостью (цельной кровью или плазмой крови). Трубка и ультразвуковой датчик закреплялись в кювете с водой. Выставлялись необходимые для поддержания заданной скорости потока обороты насоса. В случае опытов с плазмой крови (оптически прозрачной в отличие от цельной крови) включалась и наводилась на резкость видеокамера. Ультразвуковой сканер и видеокамера подключались к блоку цифровой записи данных. После выделения определенной области трубки в В-режиме, ультразвуковой сканер переключался в доплеровский режим исследования. Фильтр низких частот выставлялся на значение 100 Гц, скорость развертки 1,76 секунды, масштаб скоростей 0-40 см/с на всю шкалу.

В доплеровском режиме датчик излучает ультразвуковой сигнал в импульсном режиме, принимая отраженный потоком сигнал. По разности частот излучаемого и принимаемого сигнала определяется скорость отражающих элементов потока согласно формуле (1):

f 2V cos, = (1) f0 C где f – доплеровский сдвиг частот, f0 – частота излучаемого сигнала, V – скорость отражающего элемента, C – скорость распространения звука в среде, – угол между направлением падения ультразвукового пучка и вектором скорости отражающего элемента.

Во всех экспериментах цифровая запись запускалась одновременно с секундомером. Затем с целью активации ССК производилась рекальцификация физиологической жидкости. При этом по секундомеру замерялось время начала и окончания введения раствора хлорида кальция.

Все наблюдения и изменяемые от опыта к опыту параметры фиксировались в экспериментальном журнале. Спустя 10-40 минут после активации, в зависимости от объема введенного хлорида кальция и характера гидродинамического течения, начинался процесс тромбообразования.

После оцифровки оптического и акустического сигнала производился анализ записей. Типичный фрагмент двухканальной записи приведен на рисунке 2.

Рисунок 2. Структура кадра двухканальной записи. В верхней части кадра представлено оптическое изображение сгустка в участке трубки за пережатием. Пунктирной линией обозначены границы стенок силиконовой трубки. В нижней части кадра дана развертка доплеровского сигнала (по горизонтальной шкале отложено время (полная развертка 1,76 с), по вертикальной - скорость кровотока). Движущийся сгусток, регистрируется по обоим каналам.

Яркость доплеровской развертки пропорциональна интенсивности отраженного от потока акустического сигнала и определяется количеством, размерами и плотностью рассеивающих частиц, движущихся с данной скоростью. В приведенном на рисунке 2 кадре отчетливо виден движущийся в потоке тромб и соответствующий ему всплеск интенсивности в доплеровском сигнале (см. рис.2).

В рамках данной работы было поставлено 29 серий экспериментов ( опытов): среди них проведено 173 опыта по оптической регистрации процессов тромбообразования, по исследованию процессов свертывания с использованием акустической регистрации поставлено 43 опыта: 29 опытов на плазме крови, 7 опытов с цельной кровью и 9 опытов с взвесями эритроцитарной массы и плазмы крови.

По результатам каждого проведенного эксперимента строилась времення зависимость интенсивности отраженного ультразвукового сигнала. По видеозаписи, полученной с доплеровского сканера (нижняя часть кадра на рисунке 2), создавалась посекундная последовательность кадров при помощи видеоредактора VirtualDub (ver.1.4c). Данная последовательность обрабатывалась при помощи специально разработанной оригинальной программы DopLoop. С ее помощью в автоматизированном режиме строился график временнй зависимости интенсивности отраженного потоком сигнала. Так как абсолютная величина яркости, как таковая, сама по себе не представляет особого интереса, зависимость нормировалась на величину сигнала в начале эксперимента. Однако, для возможности сопоставления данных записей различных экспериментов такая нормировка не проводилась.

Программа DopLoop значительно ускорила процесс обработки данных, что позволило получать представляющие интерес зависимости практически сразу же по окончанию эксперимента.

Глава III. Акустическое детектирование ранних стадий внутрисосудистого свертывания крови.

В ходе экспериментов с бестромбоцитарной плазмой крови была установлена стадийность в протекании процессов тромбообразования в условиях интенсивного потока. В развитии процессов свертывания в интенсивных, близких по условиям к физиологическим, потоках удалось выделить несколько характерных стадий. На рисунке 3 приведены кадры из записи одного из типичных сценариев тромбообразования.

I стадия. В среднем через 20-40 минут после рекальцификации в потоке плазмы появляются первые фибриновые микроэмболы (см. кадры 2, 3 на рис.3). Концентрация последних стремительно возрастает в течение 15- секунд. Наблюдающиеся на этой, первой, стадии процессы напоминают собой своеобразную «метель».

II стадия. После этого в течение следующих 20-40 секунд (вторая стадия) происходит агрегация микроэмболов в кластеры, движущиеся в потоке (см. кадры 4, 5 на рис.3). В некоторых случаях формируются протяженные нити (см. кадры 6, 7 на рис.3). Эта стадия выпадения фибрина в нерастворимую фазу метафорически может быть названа «бураном».

III стадия. Последующее объединение фибриновых кластеров и нитей приводит к образованию крупных тромбов, до 10 см длиной (третья стадия) (см. кадры 8, 9 на рис.3). Весь процесс от появления микрочастиц до формирования тромбов занимает обычно 2-4 минуты.

Рисунок 3. Типичный сценарий тромбообразования в условиях интенсивного течения. На приведенной последовательности кадров в отраженном свете видны появляющиеся в потоке фибриновые сгустки. 1 - чистая плазма, 2, 3 - появление микросгустков, 4, 5 хлопья, 6, 7 - нити, 8, 9 - тромбы. В правом верхнем углу каждого кадра приведено время от начала эксперимента (в формате минуты:секунды.сотые доли секунды).

Появление мелкодисперсных микросгустков в потоке во всех проведенных экспериментах предшествовало образованию макроскопических тромбов.

При одновременной оптической и акустической регистрации процессов свертывания плазмы крови было обнаружено связанное с тромбообразованием резкое изменение акустического сигнала. Типичный результат представлен на рисунке 4.

Однородная жидкая плазма, сама по себе, слабо рассеивает ультразвук.

В связи с этим интенсивность доплеровского сигнала до начала тромбообразования мала (см. кадр 1 на рис.4). Детектируемые при этом фоновые неоднородности связаны с присутствием в потоке некоторого количества мелких пузырьков воздуха. Начало тромбообразования проявляется одновременно по обоим каналам регистрации (см. кадр 2 на рис.4). При этом оптически наблюдается появление описанной выше «метели». Одновременно с этим возрастает интенсивность доплеровского сигнала (см. кадр 2 на рис.4). В дальнейшем, по мере увеличения концентрации микрочастиц в потоке, интенсивность доплеровского сигнала продолжает расти (см. кадр 3 на рис.4). По прошествии 60-90 секунд от начала свертывания в потоке наблюдаются сформировавшиеся микроэмболы, которые регистрируются синхронно в оптическом и акустическом сигналах (см. кадр 4 на рис.4). Позднее происходит объединение микроэмболов в крупные сгустки, которые видны как протяженные объекты повышенной яркости в развертке доплеровского сигнала (см. кадр 5 на рис.4).

Рисунок 4. Регистрация процесса тромбообразования по оптическому и акустическому каналам. На каждом кадре стрелкой отмечен момент времени в доплеровской развертке, соответствующий оптическому изображению, представленному в верхней части кадра. На 6-м кадре пунктирными линиями выделена прозрачная желеобразная фибриновая сеть, хорошо различимая в динамике по колебательным движениям.

Установлено, что формирующиеся тромбы могут представлять собой не только плотные сгустки, но и прозрачные желеобразные фибриновые сети (на кадре 6 рис.4 границы фибриновой сети для наглядности выделены пунктиром). В некоторых случаях, процессы тромбообразования приводят к полной остановке течения. Об остановке потока можно судить по исчезновению доплеровского сигнала (см. кадр 6 на рис.4).

На рисунке 5 показано изменение относительной интенсивности доплеровского сигнала в ходе эксперимента с плазмой крови. На протяжении первых 20 минут эксперимента интенсивность отраженного доплеровского сигнала колеблется около исходного уровня. Появление детектируемых оптически микросгустков в потоке сопровождается резким ростом интенсивности доплеровского сигнала, которая на данном этапе свертывания увеличивается в 6,4±1,3 раза в течение 27±5 секунд. Последующая агрегация микросгустков и образование крупных эмболов ведет к уменьшению интенсивности доплеровского сигнала и увеличению осцилляций последней.

Когда процесс формирования макроэмболов завершается, осцилляции приобретают периодический характер, причем период осцилляций соответствует времени обращения сгустка в замкнутой системе силиконовых трубок.

Рисунок 5. Изменение относительной интенсивности доплеровского сигнала в ходе эксперимента с плазмой крови. Серой полоской отмечен промежуток времени, в течение которого производилась рекальцификация. Резкое увеличение интенсивности сигнала соответствует лавинообразному появлению фибриновых микросгустков в потоке.

Осцилляции сигнала после 1400 секунды связаны с движением крупных эмболов, сформировавшихся в замкнутой системе силиконовых трубок.

В опытах с кровью регистрация процессов тромбообразования в потоке осуществлялась только акустическими методами. Резкое увеличение интенсивности доплеровского сигнала в процессе тромбообразования наблюдалось и в каждом из 6 опытов с цельной кровью. Характерный график зависимости изменения интенсивности доплеровского сигнала в процессе свертывания крови приведен на рисунке 6. Во всех опытах с цельной кровью свертывание сопровождалось приблизительно 2-х кратным увеличением интенсивности доплеровского сигнала. Заметное изменение интенсивности происходило за 49±5 секунд.

Рисунок 6. Изменение относительной интенсивности доплеровского сигнала в ходе эксперимента с кровью. Серой полоской отмечен промежуток времени, в течение которого производилась рекальцификация. Рост интенсивности сигнала соответствует лавинообразному появлению микротромбов в потоке.

Глава IV. Ультразвуковое исследование процессов фибринолиза под действием препарата «Стрептокиназа».

При планировании серии экспериментов по изучению кинетики фибринолиза было поставлено несколько целей:

1. исследовать процесс активируемого извне фибринолиза с помощью ультразвуковой регистрации;

2. исследовать концентрационную зависимость эффективности действия препарата «Стрептокиназа» на фибринолитическую систему;

3. оценить влияние задержки введения препарата «Стрептокиназа» на процесс фибринолиза.

На рисунке 7 приведены зависимости изменения интенсивности доплеровского сигнала в двух экспериментах: черным цветом представлена зависимость кинетики процессов свертывания без активации фибринолиза, серым - при активации фибринолитической системы инъекцией 100 мкл раствора стрептокиназы с задержкой в 10±1 секунд от момента начала роста интенсивности рассеяния ультразвука.

Рисунок 7. Изменение интенсивности рассеянного ультразвука в ходе свертывания и фибринолиза. Черным цветом отображено изменение интенсивности рассеяния ультразвука в ходе эксперимента при свертывании плазмы крови, без активации фибринолиза, серым – изменение интенсивности рассеяния ультразвука в опыте с добавлением стрептокиназы, активирующей фибринолиз. Серой полоской выделено время, в течение которого производилось введение стрептокиназы.

Сравнение графиков, представленных на рисунке 7, показывает, что введение стрептокиназы не проявляется акустически на протяжении 130- секунд после введения. В дальнейшем, однако, влияние стрептокиназы становится заметным. Когда в процессе свертывания плазмы начинается этап образования кластеров из микросгустков (см. описание экспериментов Глава II) и происходит уменьшение интенсивности рассеяния ультразвука (см.

черный график на рис. 7) в системе с активированным фибринолизом, напротив, происходит увеличение интенсивности рассеяния ультразвука.

Рост интенсивности сигнала наблюдается в течение следующих 250 секунд (см. серый график на рис. 7). По истечении этого времени интенсивность рассеяния (I) выходит на плато при значении I = 1,4E+06 y.e. и не изменяется во время всего последующего наблюдения.

Вышеприведенные данные свидетельствуют о том, что через 130- секунд после введения препарата стрептокиназы в системе нарабатывается достаточное количество плазмина для того, чтобы началось расщепление уже сформировавшихся к этому моменту микросгустков фибрина. По-видимому, при этом происходит не «растворение» фибрина, а, скорее, измельчение молекул фибрин-полимера путем их фрагментации. При этом у молекул фрагментов сохраняется их акустическое сопротивление, а так как их общее число в потоке при фибринолизе увеличивается, то это и влечет за собой рост общей интенсивности рассеяния ультразвука. Простая оценка показывает, что интенсивность рассеянного сигнала (I) зависит от общей площади (S) поверхности частиц. Последняя пропорциональна произведению числа частиц (n) на квадрат их радиуса (R), получаем: I S nR2. Считая, что при фибринолизе суммарная масса частиц (m nR3) сохраняется, получаем: n1R13 = n2R23, и следовательно n1/ n2 = (R2/R1)3. Таким образом, I1/I2 = (n1/n2)(R1/R2)2 = (R2/R1)3(R1/R2)2 = R2/R1, (2) а так как при расщеплении размер микрочастиц уменьшается (R2 R1), то в силу соотношения (2) интенсивность рассеянного сигнала должна возрастать.

Стремление к плато при значении 1,4Е+06 y.e. (см. серый график на рис. 7) может свидетельствовать о полном израсходовании свободного плазмина в системе. Подтверждением последнего служит эксперимент, в котором после выхода интенсивности доплеровского сигнала на плато при значении около 1,4Е+06 y.e. проводилась дополнительная инъекция 100 мкл стрептокиназы (см. рис.8). В данном опыте первоначальная активация фибринолиза вызывалась также введением 100 мкл стрептокиназы в первые 20 секунд регистрируемого свертывания плазмы крови.

Рисунок 8. Влияние дополнительной инъекции стрептокиназы на изменение хода фибринолиза. На графике введение стрептокиназы выделено серыми полосами. Обе инъекции составляли 100 мкл.

Как видно из рисунка 8 дополнительная активация фибринолитической системы не приводит к заметному изменению рассеяния ультразвука. Можно предположить, что в системе не возобновляются процессы расщепления фибрина. Концентрация и размеры рассеивателей сохраняются на прежнем уровне.

Серия опытов по уменьшению объема вводимой стрептокиназы показала, что стрептокиназа может эффективно действовать и при низких концентрациях (в 2 раза ниже клинически рекомендованной дозировки – 1500000МЕ на 4 л циркулирующей крови), но скорость реакции при этом снижается. При уменьшении объема вводимой стрептокиназы до 20 мкл процесс фибринолиза идет заметно медленнее, чем при 100 мкл, но расщепление фибина с соответствующим увеличением концентрации его продуктов распада продолжается непрерывно и интенсивность доплеровского сигнала стремится к значению 1,4Е+06 y.e. В то же время опыт с введением 10 мкл стрептокиназы показывает, что такого объема препарата уже недостаточно, для максимально возможного при данных условиях эксперимента расщепления фибрина. Значительные колебания интенсивности доплеровского сигнала в этом эксперименте после секунд (при сохранении среднего значения) указывают на то, что в плазме крови к этому времени прекратились процессы расщепления фибрина. При этом в циркулирующем замкнутом потоке регистрируются микроагрегаты различных размеров, что и вызывает колебания значений интенсивности доплеровского сигнала.

Рисунок 9. Активация фибринолитической системы с задержкой 2 минуты после начала процессов свертывания, фиксирующемуся по резкому росту интенсивности доплеровского сигнала. Серой полоской выделено время, в течение которого производилось введение стрептокиназы.

Из рисунка 9 видно, что и в том случае, когда активация фибринолитической системы производится спустя две минуты после начала активного свертывания, процесс фибринолиза идет стремительно и достигает предела расщепления фибриновых сгустков приблизительно за 100 секунд.

Большая по сравнению с предыдущими опытами амплитуда колебаний сигнала (см. рис. 8) свидетельствует о том, что в потоке сохраняется значительная гетерогенность микроагрегатов по размеру. Это дает повод утверждать, что расщепление, не смотря на достаточную концентрацию активатора плазминогена в системе, прошло не полностью. Вероятно, дело в том, что в данном случае лизису препятствовала так называемая «прошивка» фибриновых сгустков (другими словами их стабилизация), активируемая XIIIa фактором системы свертывания крови. Вопрос, однако, требует дальнейшего изучения.

В результате проведенной серии экспериментов установлено, что акустические методы принципиально пригодны для определения скорости процессов фибринолиза в реальном времени. Установлено, что эффективность действия стрептокиназы, выражающаяся в степени фрагментации молекул фибрина-полимера, зависит не только от дозы (объема) вводимого препарата, но и от длительности задержки его введения с момента начала процессов тромбообразования. При этом было обнаружено, что расщепление фибриновых сгустков кинетически лимитировано.

(Возможно, это связано с ограниченностью количества плазминогена в системе, или же с особенностями реакций стабилизации фибриновых сгустков молекулами XIIIa фактора. Вопрос требует дальнейшей проработки.) Глава V. Обсуждение результатов.

В заключительной главе диссертации обсуждаются основные результаты работы, а также возможность развития разработанных методов регистрации начальных этапов тромбообразования для использования в клинической практике в диагностических целях и для контроля процессов активированного фибринолиза.

Данные, представленные в настоящей работе, однозначно указывают на возможность акустического выявления ранних стадий внутрисосудистого свертывания крови. Начало процессов тромбообразования в потоке во всех наших опытах вызывало приблизительно 2-х кратное увеличение интенсивности отражаемого потоком акустического сигнала. Образование микросгустков в потоке крови всегда влекло за собой появление эхоконтраста. Высокая степень выраженности обнаруженных эффектов, сопровождающих начальные стадии свертывания в интенсивных потоках крови, дает нам основание полагать, что полученные результаты могут лечь в основу нового неинвазивного метода диагностики ранних стадий внутрисосудистого свертывания.

Изменение характеристик отражаемого кровью акустического сигнала в процессе свертывания ранее исследовалось в ряде экспериментальных работ. В работах [Shung 1984, Voleisis 2002, Ossant 2004, Carlo-Filho 2006] исследовались изменения акустических характеристик в опытах с неподвижной плазмой крови и цельной кровью в ходе процессов свертывания in vitro. Процессы свертывания в движущейся крови изучались акустическими методами в недавно опубликованных исследованиях [Uzlova 2007, Huang 2007]. Во всех указанных работах при свертывании отмечались существенные изменения таких характеристик акустического сигнала, как скорость звука, амплитуда отраженного сигнала и ослабление (attenuation) прошедшего сигнала. В отличие от перечисленных выше работ других авторов, нами осуществлялась одновременная оптическая и акустическая регистрация процессов тромбообразования. Параллельное использование оптического и акустического методов в экспериментах с плазмой крови позволило выявить прямую корреляцию между изменениями в акустическом сигнале и образованием фибриновых сгустков в процессе тромбообразования.

Вопрос о возможных причинах возникновения спонтанного эхоконтраста (СЭК) в кровотоке широко обсуждается в литературе [Wang 1992, Fatkin 1997, Zotz 2001, Ercan 2003]. Механизмы, приводящие к появлению спонтанного эхоконтраста, изучались как в моделях in vitro [Fatkin 1997], так и in vivo [Wang 1992]. В настоящее время дискуссия продолжается [Tanaka 2007]. Необходимо отметить, что природа процессов ведущих к возникновению спонтанного акустического эхоконтраста не всегда сводится только к протеканию коагуляционных процессов в крови [Wang 1992, Fatkin 1997]. Однако полученные нами результаты однозначно указывают на то, что образование микросгустков на ранней стадии процессов тромбообразования в интенсивных потоках всегда сопровождается возникновением эхоконтраста в акустическом сигнале. На основании чего появление СЭК in vivo следует, по нашему мнению, рассматривать как ранний признак (или же значимый предвестник) тромбообразования.

Грубость полученных результатов свидетельствует о том, что регистрация ранних стадий тромбообразования акустическими методами может использоваться в клинических приложениях. Разработка акустического метода для диагностики процессов внутрисосудистого свертывания на ранней стадии представляет большой интерес в силу неинвазивности метода. Более того, все практически используемые коагулогические тесты позволяют установить состояние системы свертывания крови (ССК) только усредненно для всего организма, не давая информации о локальных нарушениях ССК. В тоже время тромботические процессы могут развиваться как следствие локально протекающих патологических процессов. Например, развитие некоторых патологических процессов в тканях может вызывать инфильтрацию активирующих ССК веществ в кровоток. Другой пример, локальная активация ССК вследствие гидродинамических нарушений в окрестности атеросклеротических внутрисосудистых образований. Применение ультразвуковых методов должно позволить регистрировать локальные изменения агрегатного состояния в крови в потенциально наиболее опасных участках сосудистого русла, что может представлять практический интерес, например, для постоперационного мониторинга состояния больного в сердечно-сосудистой хирургии. Важно отметить, что существенным преимуществом акустических методов является возможность их использования для непрерывного наблюдения за состоянием ССК в реальном времени.

Стадийное развитие процессов тромбообразования, наблюдаемое в наших экспериментах как в оптическом, так и в акустическом сигналах, удалось сопоставить с рядом клинических наблюдений. В отделении ультразвуковой диагностики ГНЦ РАМН (зав. А.А. Шевелев) в ходе выполнения данной работы при непосредственном участии автора накоплен обширный клинический материал по наблюдению эффектов спонтанного эхоконтраста. (Данный материал вынесен в Приложение к настоящей диссертации.) Клинические наблюдения показали, что развитие некоторых патологических процессов в тканях приводит к запуску внутрисосудистого тромбообразования за счет инфильтрации в кровоток активирующих свертывание веществ. Аналогичным образом механическое повреждение тканей, имеющее место практически при любых хирургических вмешательствах, должно сопровождаться активацией процессов внутрисосудистого тромбообразования. В клинической практике активация свертывания крови купируется за счет использования гепарина или его аналогов. В норме она купируется собственной фибринолитической системой. Однако в послеоперационном периоде преждевременная отмена гепариновой поддержки влечет за собой повышение риска внутрисосудистой активации процессов свертывания.

В настоящее время в клинической практике отсутствует общепринятая оперативная методика неинвазивной оценки коагулологического статуса крови в крупных сосудах. Для микроциркуляционного русла эта задача была решена благодаря разработке и внедрению в практику методов оптической микроскопии [Гурфинкель 2001]. Однако оптические методы не могут быть использованы для детектирования реологических и коагулологических свойств крови в крупных сосудах в силу их глубокого залегания.

Метод детектирования эхоконтраста, являясь неинвазивным, позволяет оперативно получать информацию о ранних этапах развития патологических коагулологических процессов в потенциально опасных зонах сосудистого кровотока. Наши эксперименты показывают, что появление в потоке микросгустков, формирующихся на ранней стадии тромбообразования, всегда сопровождается возникновением эхоконтраста. Как отмечалось выше, существуют различные причины, которые могут обуславливать появление спонтанного эхоконтраста (СЭК). Вероятность того, что в конкретном случае возникновение СЭК связанно именно с протеканием процессов свертывания крови, непосредственно зависит от характера патологии, с которой имеют дело в клинике. Этот вопрос требует дальнейшего клинического изучения.

В силу того, что тканевое повреждение и нарушение гемодинамики имеют место практически во всех послеоперационных ситуациях в сердечно сосудистой хирургии, с нашей точки зрения, есть основания полагать, что появление СЭК у пациентов в послеоперационном периоде следует рассматривать как значимый предвестник тромботических осложнений.

В свете вероятных клинических приложений наибольшую ценность, по нашему мнению, имеет разработка методов непрерывного акустического мониторинга системы свертывания крови in vivo. Наиболее актуально применение такого непрерывного наблюдения для контроля состояния послеоперационных больных. Очевидно, что сканировать все сосуды невозможно, но вполне возможно использовать несколько датчиков, сканирующих области наиболее вероятного образования тромбов. Создание метода непрерывного акустического мониторинга позволит детектировать начальные стадии тромбообразования, на которых развитие процессов свертывания еще является обратимым при своевременной и адекватной фармакологической поддержке.

Приложение. Клинические наблюдения акустически детектируемых внутрисосудистых микросгустков.

К настоящему моменту в отделении Ультразвуковой диагностики ГУ ГНЦ РАМН (зав. отделением А.А. Шевелев) при непосредственном участии автора накоплен архив, состоящий более чем из 30 записей ультразвуковой регистрации спонтанного эхоконтраста (СЭК).

Исследование показало, что СЭК может иметь различную структуру, характеристики которой такие как плотность, форма рассеивающих частиц, их подвижность, могут меняться во времени в широком диапазоне. В работе выделено несколько характерных видов СЭК: «метель», «буран», «мусс», «желе», «студень» и приведены примеры, наиболее ярко иллюстрирующие выделенные типы эхоконтраста. Сопоставление клинических записей и экспериментальных данных, описанных в главе III, показало сходство клинически наблюдаемых типов СЭК с наблюдаемыми в эксперименте картинами изменения эхоконтраста в ходе процессов тромбообразования in vitro.

Проведенный в свете полученных результатов анализ данных о детектировании методами ультразвуковой диагностики эффектов спонтанного эхоконтраста у пациентов ГНЦ РАМН позволил выдвинуть представление о стадийности тромбообразования в условиях in vivo [Узлова 2008].

Предполагается, что дальнейшее развитие исследований в клиническом направлении позволит установить границы применимости предлагаемых ультразвуковых методов для регистрации начальных этапов тромбообразования.

БЛАГОДАРНОСТИ Автор выражает искреннюю благодарность своему научному руководителю Георгию Теодоровичу Гурия.

Автор глубоко признателен академику А.И. Воробьеву за интерес, проявленный к работе, профессору С.А. Васильеву за содержательное обсуждение клинических аспектов применения акустических методов, руководителю отделения реконструктивно-восстановительной ортопедии к.м.н. В.Е. Мамонову за ценные замечания, профессору В.А. Макарову за ценные консультации по использованию некоторых коагулологических препаратов, ст.н.с. отделения анестезиологиии и реаниматологии к.м.н.

В.А. Атопкову и к.м.н. С.В. Моделу за стимулирующие дискуссии, профессору Н.Н. Самсоновой за внимание, проявленное к работе, и консультации по методам экспресс-диагностики.

Настоящая работа была выполнена благодаря тесному сотрудничеству с К.Г. Гурия, внесшему значительный вклад в разработку методики двухканальной регистрации процессов тромбообразования и принимавшему непосредственное участие в проведении ряда опытов и в обработке результатов, а также благодаря сотрудничеству с заведующим отделением ультразвуковой диагностики А.А. Шевелевым.

Автор благодарит также сотрудников и аспирантов лаборатории криобиофизики клеток крови ГНЦ РАМН: Е.А. Катруху, К.Е. Злобину, О.А. Дудченко, И.А. Романца, А.С. Рухленко и З.В. Ковальчук за помощь и поддержку.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 07-04-01523-а "Исследование спонтанного тромбообразования в интенсивных потоках" (рук. Г.Т. Гурия).

ВЫВОДЫ 1. С помощью специально разработанной оригинальной экспериментальной установки, позволяющей производить параллельное детектирование оптического и акустического сигналов в ходе процессов тромбообразования, показано, что появление в кровотоке фибриновых микросгустков, регистрируемых оптически, одновременно проявляется в акустическом сигнале в виде эхоконтраста.

2. Показано, что на начальном этапе тромбообразования в плазме крови интенсивность доплеровского сигнала резко увеличивается в 6,4±1,3 раза;

при тромбообразовании в цельной крови – в 2,2±0, раза.

3. Продемонстрирована принципиальная возможность использования ультразвуковых методов, основанных на доплеровском сканировании крупных сосудов, для неинвазивного детектирования ранних стадий внутрисосудистого тромбообразования в реальном времени.

4. Установлена принципиальная возможность мониторирования кинетики фибринолитических процессов (вызываемых действием стрептокиназы) акустическими методами.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. С.Г. Узлова, Г.Т. Гурия, А.А. Шевелев, Допплерография свертывания крови в интенсивных потоках. // Сб. тезисов 10 Пущинской школы-конференции «Биология – наука XXI века», Пущино 2006, с.168.

2. С.Г. Узлова, Г.Т. Гурия, А.А. Шевелев, С.А. Васильев, К.Г. Гурия, Акустическое детектирование ранних этапов тромбообразования. // Сб. тезисов, материалы Тринадцатой Всероссийской научной конференции студентов-физиков и молодых ученых, Таганрог 2007, с.482.

3. C.Г. Узлова, А.А. Шевелев, Г.Т. Гурия, Акустические эффекты при свертывании крови в интенсивных потоках. // Тезисы XLIX научной конференции МФТИ, Москва-Долгопрудный, ноябрь 2006, с.1-2. (доступны по ссылке http://bio.fizteh.ru/student/mipt_conference/conference_arhiv/conference2006/conf_programm/conf_ prog_livesystem/uzlova.pdf).

4. Г.Т. Гурия, С.Г. Узлова, А.А. Шевелев, С.А. Васильев, К.Г. Гурия, Акустически детектируемые микросгустки как предвестники внутрисосудистых тромботических постоперационных осложнений. // Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН, Сердечно сосудистые заболевания. Приложение. Т.8, № 3, май-июнь 2007, с.154. (ISSN 1810-0694) 5. C.Г. Узлова, А.А. Шевелев, Г.Т. Гурия, Акустическое детектирование ранних этапов тромбообразования в интенсивных потоках. // Материалы Третьей Всероссийской конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (с международным участием), Москва, 1-3 февраля 2007, с.244.

6. S.G. Uzlova, K.G. Guria, A.A. Shevelev, S.A. Vasiliev, G.Th. Guria, Detection of primary stages of intravascular blood coagulation by acoustic methods. // International Symposium Modern Spectroscopy Methods in Studying Structure and Function of Biopolymers in Biology and Medicine.

Dubna 2007, May 28- June 2, Editor A. Rubin, p.47.

7. А.А. Шевелев, С.Г. Узлова, Г.Т. Гурия, Внутрисосудистое спонтанное эхоконтрастирование у онкогематологических больных. // Тезисы 5-го съезда Российской ассоциации специалистов ультразвуковой диагностики в медицине, 18-21 сентября 2007, г. Москва, с.109.

8. С.Г. Узлова, К.Г. Гурия, А.А. Шевелев, С.А. Васильев, Г.Т. Гурия, Неинвазивная регистрация нарушений гемостаза акустическими методами. // Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН, Сердечно-сосудистые заболевания. Приложение. Т.8, № 6, ноябрь-декабрь 2007, с.245.

(ISSN 1810-0694) 9. К.Г. Гурия, С.Г. Узлова, А.А. Шевелев, С.А. Васильев, Акустическое детектирование процессов тромбообразования. // Сб. тезисов XIV научной школы «Нелинейные волны - 2008» Фундаментальные и прикладные задачи нелинейной физики. Конференция молодых ученых.

1-7 марта 2008 года. Нижний Новгород 2008, с.39.

10. S.G. Uzlova, K.G. Guria, G.Th. Guria, Acoustic determination of early stages of intravascular blood coagulation. // Philosophical Transactions of Royal Society A Vol.366, Nо. 1880 / October 13, 2008, p.3649-3661.

11. С.Г. Узлова, К.Г. Гурия, А.А. Шевелев, С.А. Васильев, Г.Т. Гурия Акустически детектируемые внутрисосудистые микросгустки как предвестники послеоперационных осложнений.

// Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН, Сердечно-сосудистые заболевания, Номер 6, 2008г.