Внутрисосудистое свертывание крови и толерантность к тромбину в зависимости от с-витаминной обеспеченности организма (экспериментальное исследование)
На правах рукописи
Багумян Эдуард Врежевич ВНУТРИСОСУДИСТОЕ СВЕРТЫВАНИЕ КРОВИ И ТОЛЕРАНТНОСТЬ К ТРОМБИНУ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ С-ВИТАМИННОЙ ОБЕСПЕЧЕННОСТИ ОРГАНИЗМА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) 03.00.04 – Биохимия
Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Тюмень - 2007
Работа выполнена в ГОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Научный консультант: доктор медицинских наук профессор Шаповалов Петр Яковлевич.
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук профессор Соловьев Владимир Георгиевич доктор медицинских наук профессор Высокогорский Валерий Евгеньевич Ведущее учреждение: ГОУ ВПО Башкортостанский Государственный медицинский университет Росздрава
Защита состоится «_» 2007 г в 9 часов на заседании диссертационного Совета ДМ 212.274.07 при ГОУ ВПО Тюменском государственном университете по адресу: г. Тюмень, ул. Пирогова. 3.
С диссертацией можно ознакомиться в читальном зале библиотеки Тюменского государственного университета Автореферат разослан _2007 г
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук профессор Е.А.Чирятьев
Общая характеристика работы
Витамин С - обязательный компонент питания для большинства представителей животного мира - определяет течение многих процессов жизнедеятельности [В.В.Еф ремов, 1949;
Б.А.Лавров, 1951;
П.Н.Шараев, 2003;
В.П.Мищенко и др., 2005;
Chen C.Y.
e.a., 2005;
E.C.Kennett e.a., 2006]. Гемостаз также зависит от обеспеченности этим вита мином, что и обусловило внимание к изучению связи гемостаз-витамин С. Первона чально у больных со скорбутом не находили гипокоагулемии [В.В.Пашутин, 1902], но позже отметили позитивный эффект аскорбиновой кислота (АК) на свертываемость кро ви при С-гиповитаминозе [В.М.Новодворский, 1928;
Г.Я.Каган, 1953;
Cooper M.J e.a., 2006;
Kumari J. e.a. 2006;
Xie Z. e.a., 2006]. При некоторых формах кровоточивости дополнительное введение АК сокращало время свертывания крови и повышало актив ность ф. II [А.А.Ахрарходжаев, 1961;
Cotti, Larizza, 1936;
Duckerhoff e.a., 1940]. Выяс нилось, что скорбут сопровождается тромбоцитопенией [А.Л.Мясников, 1938;
P.Bar chan e.a., 1942], дефицитом фф. I, II [В.Копалейшвили и др., 1960] и гипокоагулемией.
С-витаминотерапия устраняла эти сдвиги, не влияя на те же показатели у лиц без дефи цита витамина С, поэтому допускали нормализующее действие АК на некоторые про коагулянты и общую свертываемость [С.М.Рысс и др., 1945;
Duckerhoff H. e.a., 1940], чему, однако, противоречили другие наблюдения [М.В.Игнатьева, 1963;
К.И.Сте пашкина, 1939, Б.И.Рубинштейн и Е.В.Лебедева [1940].
Эффекты АК положительны при гинекологических и других видах кровоточивости [Б.И.Кузник и др., 1964, 1974, 1976;
;
Junghans, 1935: Vogt, 1935]. Находили, однако, что АК, оказывая гемостатическое действие при климактерических кровотечениях, не влия ет на время свертывания и содержания тромбоцитов [М.М.Домбровский, 1964], что свя зывали с действием АК на состояние сосудов [В.Копалейшвили и др., 1960]. Связь меж ду С-гиповитаминозом и наклонностью к геморрагии подтвердилась экспериментально [И.С.Краевская,1940], а работы лаборатории проф. Б.А.Кудряшова (МГУ) указали как на причину кровоточивости при С-дефицитах тромбоцитопению и малую тромбопла стическую активность тромбоцитов [Г.В.Андреенко, Н.П.Сытина, 1959;
Г.В.Андреенко, 1960;
Г.В.Андреенко, Л.В.Лютова, 1969]. Подтверждалась возможность влияния АК на гемостаз при С-дефицитах и через изменение активности прокоагулянтов [В.С.Шевчен ко, 1969;
Л.В.Лютова, 1971;
Cotti Z., Larizza, 1936;
Sen. e.a., 1994]. Находили, что АК не влияя заметно на свертываемость крови при нормальной обеспеченности витамином С, вызывает гипокоагулемию после длительного [В.П.Мищенко и др., 2005] и кратковре менного введения в умеренных дозах АК у здоровых [А.В.Костинская, 1958]. Находили небольшой рост уровня ф. VIII:ФВ и снижение активатора профибринолизина при де фиците витамина C [Tofler. e.a., 2000], установлена зависимость между ЛПО и уровнем маркеров ВТФ при аденоме простаты, атеросклерозе сосудов нижних конечностей, ИБС и токсическом зобе [И.Физдель, 2004;
Э.Н.Согрин, 2005;
И.Г.Леонтьев, 2006;
А.В.Фатеев, 2006], при введении половых стероидов и других прооксидантов [П.Я.Ша повалов, А.И.Бродер, 2002;
И.А.Аптекарь, 2003]. То же нашли у беременных и родиль ниц с поздним гестозом [Е.А.Винокурова, 2006]. При всех этих состояниях препараты, содержащие витамин С, ограничивали сдвиги ЛПО и свертываемости крови.
Выявлена роль С-витаминной обеспеченности в состоянии гемостаза при умеренной гомоцистеинемии, повышающей риск тромбозов через рост адгезивных свойств эндоте лия - АК блокирует эффекты гомоцистеина [Labinjoh. e.a., 2001;
Labinjoh e.a., 2001].
Нагрузки АК, не влияя на уровни активатора и ингибитора профибринолизина ткани, ФГ, ф. VIII:ФВ и на вязкость крови на фоне нормы, повышают уровень ф. VIII:ФВ [Tofler. e.a., 2000], снижают активность эндотелия, скорость ЛПО и активность фибри нолиза на фоне С-авитаминоза у пациентов с интолерантностью к глюкозе и у куриль щиков [Antoniades e.a., 2003;
Tomiyama e.a., 2003], усиливают ответ сосудов на вазоди лататоры [Pellegrini e.a., 2004], как впрочем, и другие антиоксиданты [Sumitra.e.a., 2001;
Chen e.a., 2005], предотвращают активацию тромбоцитов, увеличивая выход NO из по лиморфноядерных лейкоцитов [Raghavan.e.a., 2003]. Все эти данные, однако, не харак теризуют общего состояния системы, ответственной за стабилизацию крови при экс тремальных воздействиях, изменяющих ЛПО [В.П.Мищенко, 1981;
А.Ш.Бышевский и др., 2004, 2005, 2006] и толерантность организма к тромбиногенезу [М.К.Умутбаева, 2005].
Так как нельзя составить ясного представления о характере влияния дефицита или избытка витамина С на непрерывное внутрисосудистое свертывание, об интенсивности которого можно судить о наклонности к тромбообразованию или кровоточивости [И.Н.Бокарев, 2000;
Д.М.Зубаиров, 2000;
М.К.Умутбаева, 2003;
П.Я.Шаповалов и др., 2005;
Gawaz., 2001], мы провели исследования, которые, как нам казалось, позволят по лучить важные для теории и практики медицины данные, позволяющие обосновать ис пользование АК как средства направленного воздействия на систему гемостаза.
Цель исследования. Экспериментально изучить изменения интенсивности внутрисосу дистого свертывания крови и толерантности к тромбину (способности реагировать на гипертромбинемию) в зависимости от уровня С-витаминной обеспеченности организма.
Задачи: 1.Изучить агрегационную активность тромбоцитов, их способность высвобож дать фф. Р3 и Р4, содержание продуктов ВТФ и толерантность к тромбину у несинтези рующих витамин С животных (морские свинки) при содержании их на рационе питания, отчасти или полностью лишенного витамина С;
2.То же изучить при введении избытка витамина С морским свинкам на фоне полноценного питания;
3. Изучить то же у вита мин С-синтезирующих животных (белые крысы) при содержании их на рационе пита ния, свободном от витамина С и содержащем его;
4. Изучить в опытах на свинках зави симость эффектов витамина С на уровень маркеров ВТФ, толерантность к тромбину и активность тромбоцитов при угнетении или активации процессов ЛПО.
Научная новизна.
Установлено, что между уровнем маркеров ВТФ, характеризующим интенсивность внутрисосудистого свертывания крови, и толерантностью к тромбину у животных, не синтезирующих витамина С при С-гипо-, С-авитаминозе и избыточном введении АК существует обратная зависимость - при дефиците витамина С растет содержание марке ров ВТФ, а толерантность к тромбину падает, при дополнительном введении АК содер жание маркеров ВТФ снижается, а толерантность к тромбину растет.
Показано, что толерантность к тромбину и содержание маркеров ВТФ изменяются у животных, не синтезирующих витамин С, с увеличением длительности их содержания на С-авитаминном рационе.
Впервые показано, что у животных, синтезирующих витамин С, его отсутствие в ра ционе не ведет к снижению толерантности к тромбину и росту уровня маркеров ВТФ;
при введении избытка АК на фоне полноценного рациона питания уровень маркеров ВТФ у них снижается, а толерантность растет с увеличением дозы АК. В то же время у животных, несинтезирующих витамина С, существует параллелизм между ускорением непрерывного внутрисосудистого свертывания крови и ростом интенсивности ЛПО, у синтезирующих витамин С животных эта зависимость менее выражена.
Практическая ценность работы 1. Полученные данные обосновывают необходимость контролировать интенсивность внутрисосудистого свертывания крови путем оценки содержания плазменных маркеров ВТФ при состояниях с недостаточной обеспеченностью организма витамином С. 2. По лученные нами данные использованы при написании двух монографий: «О роли щито видной железы в регуляции гемостаза», М.: Медицина. - 2006) и «Витамины, вну трисосудистое свертывание крови и липидпероксидация» (Москва: Медицина. - 2006).
3. Результаты работы внедрены в практическую деятельность ряда лечебных учрежде ний г. Тюмени и Тюменского региона.
Положения, выносимые на защиту 1. Дефицит витамина С у несинтезирующих его животных ведет к ускорению не прерывного внутрисосудистого свертывания крови и ослаблению защитной реакции ор ганизма на гипертромбинемию при одновременной интенсификации процессов пере кисного окисления липидов и снижении антиоксидантного потенциала.
2. Нагрузки аскорбиновой кислотой в дозах, превышающих суточную потребность в 2-3 раза, ведут к снижению интенсивности липидпероксидации и внутрисосудистого свертывания крови при одновременном росте толерантности к тромбину, а при значи тельном (четырех- и восьмикратном) избытке аскорбиновая кислота проявляет проок сидантный эффект, особенно у животных, синтезирующих витамин С.
3. Зависимость уровня маркеров интенсивности непрерывного внутрисосудистого свертывания крови и толерантности к тромбину от витамина С определяется его свойст вом поддерживать способность тромбоцитов к агрегации и к высвобождению фф. Р3 и Р4.
Апробация и публикация. Результаты работы опубликованы: 1. В рецензируемых ме дико-биологических журналах – 2 статьи;
2. В монографиях «Витамины, внутрисосуди стое свертывание крови и липидпероксидация» (М.: Медицина, 2006. – 95 с);
«О роли щитовидной железы в регуляции гемостаза» М.: Медицина. - 2006. - 95 с) 3. В виде гла вы в упомянутой монографии;
4. В материалах республиканских, международных и за рубежных конференций, в заочной электронной конференции, проводимой РАЕ.
Доложены: на научн. конф. “Биологически активные добавки к пище - нутрицевти ки - и их использование с профилактической и лечебной целью при наиболее распро страненных заболеваниях” (Тюмень, 1995);
III Российской (с международным участи ем) конференции в НЦ ССХ им. Бакулева (Москва).
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 146 страницах, содержит 12 таб лиц и 9 рисунков, включает введение, обзор литературы, собственные исследования (материалы, методы и результаты), обсуждение, выводы и практические рекомендации, список литературы (333 публикации - 216 отечественных и 117 зарубежных).
Материалы и методы исследований Работа выполнена на морских свинках (252 особи, 360±20 г) и нелинейных белых крысах (512 особей, масса тела 175±15 г и 200±16 г). Свинки выбраны потому, что они не синтезируют витамина С, являясь корректным объектом для моделирования С-гипо витаминоза [Е.Б.Меньшикова и др., 2006], в том числе и при изучении гемостаза [Г.В.Андреенко, Н.П.Сытина, 1958-1960;
Г.В.Андреенко, Л.В.Лютова, 1969:
А.Ш.Бышевский, 1967, 1969;
Б.А.Кудряшов, 1975]. Выбор крыс связан с тем, что для них разработан оптимальный рацион питания, известна суточная потребность в витами нах, тем, что состояние гемостаза под влиянием разнообразных воздействий пре имущественно изучали на крысах. У крыс и свинок удобно брать пробы крови из ярем ной вены (непосредственно в шприц со стабилизатором) в количестве, достаточном для определения всех изучавшихся показателей - до 40 мл/кг массы тела, не нарушая гемо стазиологических требований [З.С.Баркаган, А.П.Момот, 1998].
Учитывая сезонные сдвиги в гемостазе и его зависимость от метеофакторов [А.Ш.Бышевский и др., 1986], в каждую серию включали контрольную группу, кроме серий с малыми интервалами между опытами. Кровь брали в шприц из обнаженной овальным разрезом яремной вены у наркотизированных диэтиловым эфиром животных (стабилизатор - 3,8% раствор цитрата натрия, 1:9). Рану закрывали кожным швом.
Пищевой рацион. Рацион питания морских свинок был приближен по составу к та кому, который обеспечивает прогрессивный прирост массы тела и увеличивает при плод: сено, свёкла, овес, морковь, печеный хлеб, молоко, дрожжи и водопроводная вода [К.Л.Ковалевский, 1949] – полноценный рацион. Содержание витамина С в суточной порции рациона составляло 5.5 мг на кг массы тела, т.е. было близким к расчетной ве личине, вычисленной по таблицам химического состава пищевых продуктов [К.Л.Ко валевская, 1948, А.И.Штенберг, 1960]. С-авитаминный рацион состоял из тех же про дуктов, с инактивированной АК в сене, свекле и моркови (автоклавирование -120 С, раза по 1 ч), а в молоке - кипячением в течение 1 ч [рекомендации Всесоюзной конфе ренции по витаминам, 1934 г]. После такой обработки витамин С в составе рациона не обнаруживался. Как С-гиповитаминный использовали С-авитаминный рацион с добав кой 1.1 АК на кг массы тела в сутки. Эта добавка отодвигает на 6-7 дней появление при знаков С-витаминной недостаточности и появление явных признаков скорбута [А.Ш.Бышевский, 1959].
Источниками витамина А и каротина в С-авитаминном рационе являлись морковь, молоко и сено - эти витамины лишь частично разрушаются при использованной обра ботке [Б.Г.Савинов, 1948]. Суточную потребность в витаминах группы В, витаминах РР и D обеспечивали высушенные на свету дрожжи - 0.4 г/кг массы в сутки. Источник ви тамина Е в - овес [П.Х.Попандопуло, 1949]. Аналогичные или близкие рационы исполь зовались и при изучении гемостаза [Г.В.Андреенко и др. 1958-1960, 1969:
А.Ш.Бышевский, 1967, 1969, 1978;
Л.В.Лютова, 1971;
Б.А.Кудряшов, 1975].
Итак, АК в дозе 5.5 мг/кг в сутки вводили в контрольных группах. При изучении влияния С-гиповитаминного рациона на гемостаз вводили АК в дозе 1.1 мг/кг в сутки.
При изучении эффекта нагрузок витамином С свинкам вводили на фоне полноценного рациона двух-, трёх- или четырехкратные суточные дозы АК (соответственно 11.0, 16. или 22.0 мг/кг в сутки). Вводили АК глазной пипеткой в ротовую полость в виде водно го раствора (в утренние часы).
Для крыс использовали рацион института питания АМН СССР [Инструкция…., 1952], основная диета которого удовлетворяет потребность крыс в белках, липидах и углеводах, минеральных солях и витаминах: коммерческий казеин - 18% по калорийно сти, крахмал маисовый - 55% по калорийности, подсолнечное масло - 27% по кало рийности. Потребность в минеральных солях обеспечивается солевой смесью. Витами ны вводили ежедневно в соответствии с суточной потребностью: А - 200 МЕ, D - 40 МЕ, Е - 1.5 мг, В1 - 200, В2 - 250, В6 - 200, В15 - 1500, РР - 250 мкг и холин - 50 мг на кг мас сы тела в сутки. Жирорастворимые витамины вносили в порцию подсолнечного масла, туда же вносили навески казеина, крахмала и солевой смеси. Смесь вносили в сосуд с кипящей дистиллированной водой, добавляя в неё предварительно водорастворимые витамины. Образовавшуюся кашицу помещали в кормушку. При раздаче пищевой сме си учитывали её фактическое потребление - 100 г/кг массы тела [О.Я.Курцинь, 1952].
Преимущества этого рациона в сравнении со стандартами Дональдсона, характеризую щими «идеальных» крыс [Hawk P.W., Ozer B.L., 1954], многократно подтверждены ра ботами из институтов питания АМН СССР и УССР, а также кафедр гигиены питания Киевского и Львовского медицинских институтов (1958-1975 гг.). Так как крысы не ну ждаются в поступлении витамина С, в опытах на них изучали эффекты дополнительно го введения АК в дозах 11.0, 16.5 или 22.0 мг/кг (и более) в сутки. Значения доз взяты по аналогии с дозой для свинок, так как данных о потребности крыс в витамине С не существует (АК вносили в составе суточной порции рациона в утренние часы, а после её потребления в кормушки помещали остальную часть рациона).
Состояние непрерывного внутрисосудистого свертывания оценивали, определяя в плазме крови продукты, содержание которых позволяет судить об интенсивности ВТФ:
1. Содержание продуктов деградации фибрина (ПДФ) - маркера интенсивности внутри сосудистого свертывания крови и компенсаторной активации фибринолиза [Т.А.Руд ницкая, 2003;
Wada e.a., 1994] - определяли по описанию [А.Ш.Бышевский и др., 1991].
2. Содержание D-димеров (маркеры ВТФ или компенсаторного фибринолиза [Е.Г.Со болева и др. 2003;
Moerloose, Boehlen, 2003]) - с помощью латексной агглютинации с моноклональными антителами к D-димерам (набор «D-dimer test”, Roche), результат выражали в мкг/мл эквивалентов фибриногена. 3. Содержание РКМФ, растущее при по вышении коагуляционной активности крови [С.Т.Ветриле и др. 2003;
Wada e.a., 1996, 2003], определяли количественно - фенантролиновый тест [А.П.Момот и др., 1999].
4.Содержание ф. Р3 в плазме вычисляли по разнице АВР до, и после освобождения плазмы от тромбоцитов – по Rabiner & Groder в описании [В.П.Балуда и др. 1980].
5.Содержание ф. Р4 - по действию прогретой и обедненной тромбоцитами плазмы на тромбин-гепариновое время свертывания субстратной плазмы, степень сокращения времени свертывания - мера активности ф. Р4 [В.П.Балуда и др., 1980]. Высвобождаемые тромбоцитами фф. (Р3 и Р4) - косвенные маркеры ВТФ - их содержание пропорциональ но уровню в крови тромбина, ускоряющего высвобождение. 6. Количество тромбоцитов в периферической крови определяли, как описано [З.С.Баркаган, А.П. Момот 1998]. По требность в их определении вызвана тем, что концентрацию тромбоцитов следовало корригировать при оценке агрегации [З.С.Баркаган, 1998;
Wada e.a., 2003]. 7. Спонтан ную агрегацию тромбоцитов определяли по Н.И.Тарасовой в описании [В.П.Балуда и др., 1980]. 8. АДФ-индуцированную агрегацию определяли агрегометром “Биола”, ко нечная концентрация АДФ 0,01 мг/мл [З.А Габбасов и др., 1989]. Концентрацию тром боцитов в плазме приводили к 250-500 тыс. клеток/мкл (диапазон, корректный для ра боты на агрегометре), разбавляя исследуемую плазму (1:2) обедненной тромбоцитами плазмой. Оба вида агрегации также косвенно свидетельствует об уровне тромбинемии, так как тромбин является индуктором образования агрегатов [А.С. Шитикова, 2000].
Результаты определений уровня фф. Р3, Р4, являются одновременно и показателями интенсивности ВТФ и активности тромбоцитов (вместе с показателями СА и АДФ-аг регации). 9. Концентрация в плазме осаждаемого тромбином фибриногена определяли спектрофотометрически [А.Ш.Бышевский, В.Мохнатов, 1969].
Содержание витамина С и витамин С-обеспеченность организма оценивали, опреде ляя количество АК в крови и её поглотительную способность по отношению к АК.
Применяли прием, включающий титрование безбелковым фильтратом крови 2,6-ди хлорфенолиндофенола [М.М.Эйдельман, Ф.Я.Гордон, 1948, 1951]. Определение спо собности крови поглощать АК, в отличие от однократного определения в ней количест ва витамина С, указывает на дефицит витамина С и в тех случаях, когда содержание АК не снижено. Оценка состояния С-витаминной насыщенности путем определения погло тительной способности крови в клинике и эксперименте давала положительные результаты [А.М.Агалецкая, 1948;
М.М.Эйдельман и Н.Г.Цариковская, 1955;
М.М.Эйдельман, 1956;
А.Ш.Бышевский, 1966,1978].
Для оценки ЛПО и АОП определяли: 1. Содержание первичных и вторичных липид пероксидов (ДК и ТБК-продуктов);
2. Период индукции (ПИ);
3. Скорость окисления (СО). Липиды экстрагировали смесью (1:1 по объему) гептана и изопропилового спирта в 100-кратном избытке. Содержание ДК устанавливали по оптической плотности ( 232 нм) гептановой фазы. Содержание продуктов ЛПО, реагирующих с тиобарбиту ровой кислотой (ТБК), определяли в экстракте флуорометрически [В.Н.Ушкалова, 1987]. Интенсивность флуоресценции возбуждения оценивали на флуориметре «Биан 130». В экстрактах же определяли кинетические величины прямого инициированного окисления липидов молекулярным О2 в присутствии инициатора свободнорадикального окисления динитрилазобисизомаслянная кислота. ПИ выражали временем, затрачивае мым на поглощение пробой 25 мм3 О2, а СО - углом наклона линейного участка кинети ческой кривой [С.Н.Ельдецова, 1990].
Модифицировали ЛПО и АОП ацетатом свинца (прооксидант) или димефосфоном (антиоксидант). Ацетат свинца вводили в дозе (50 мг/кг массы тела), которая активирует ЛПО и снижает АОП за 10-15 дней [В.Г.Соловьев, 1997;
М.К.Умутбаева, 2003]. Сравни тельно малый эффект объясняется тем, что всасывается лишь около 5% добавленного к рациону ацетата свинца [Материалы ВОЗ: Свинец, 1980]. Димефосфон (ДМ) - 1,1 диметил-3-оксибутирилфосфоновая кислота) - синергист физиологических антиокси дантов - не влияет на гемостаз [С.Л.Галян, 1993;
В.Г.Соловьев, 1997], в дозе 1г/кг по вышает у животных АОП [С.Н.Ельдецова, 1990]. Однократное введение такой дозы из меняет агрегацию примерно на 50% - т.е. в степени, позволяющей выявлять эффект дру гих антиоксидантов [М.К.Умутбаева, 2005]. Суточные порции прооксиданта и антиок сиданта вводили свинкам орально глазной пипеткой в утренние часы одновременно с АК или без неё, а крысам - с утренней порцией рациона. Определяли ЛПО и АОП в тромбоцитах, которые, выделяя и отмывая их [А.Б.Самаль и др., 1989].
Толерантность к тромбину определяли согласно описанию в патенте [А.Ш.Бышевский и др., 2003]. Результат рассчитывали по формуле, включающей концентрацию ФГ (%) в плазме крови крыс, которым тромбин не вводили (исходный уровень), и уровень ФГ (в %) после введения тромбина (остаточная концентрация):
D = {1- [(Ск – Со) : Ск]} х где D – остаточная концентрация ФГ, %;
Ск – его концентрация в плазме крыс, ко торым тромбин не вводили и другим воздействиям не подвергали (исходный уровень);
Со – концентрация ФГ у крыс, которым ввели тромбин на фоне изучающегося воздей ствия или без него (остаточная концентрация).
Значение остаточной концентрации ФГ у крыс, которым тромбин ввели без предва рительных воздействий, принимали за 100-процентную толерантность к тромбину, и ус танавливали степень изменения (в %) толерантности при изучаемом воздействии по формуле: Х% = (Do : Dк)х100, где X - толерантность к тромбину в %, Do – остаточ ная концентрация ФГ (в %) у группы, подвергавшейся изучаемому воздействию, Dк остаточная концентрация ФГ (в %) у группы, не подвергавшейся изучаемому воздейст вию (контрольная группа). Специфичность способа обусловлена тем, что ФГ - основной субстрат тромбина в процессах свертывания [В.П.Балуда и др., 1995;
Д.М.Зубаиров, 2000], и тем, что изменение уровня ФГ, реагирующего на тромбин, при экзогенной ги пертромбинемии зависит от состояния всех систем, обеспечивающих выживание орга низма при ускоренном тромбиногенезе [Б.А.Кудряшов, 1975;
Д.М.Зубаиров, 2000].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Вначале изучили эффективность применения ранее описанного С-гипо- и С-ави таминного рационов, определяя при их использовании уровень витамина С в крови свинок и её поглотительную способность. Анализ выявил (рис. 1), что рационы отве чают задачам работы: 1) при полноценном рационе не изменяется в течение 3-х не дель уровень витамина С и С-поглотительная способность крови у свинок, получав ших С-гипо- или С-авитаминный рацион, 2) прогрессивно снижается содержание витамина С в крови и растет её С-поглотительная способность, особенно при С авитаминном питании, и это согласуется с результатами осмотра и вскрытия свинок (снижение прироста, затем и убыль массы тела, тусклая шерсть, малая подвижность, снижение аппетита, петехии).
75, 75 Полноценный рацион 65 61, 55 51, 42, 45 40, 35, С 35 31,2 30,5 гиповитаминны 29, й рацион 18 18 15 5 5 С-авитаминный рацион -5 7- 15 21 7- й й - -й -й -й де де де де де де нь нь нь нь нь нь Рисунок 1. Изменения уровня витамина С и С-поглотительной способности крови (абсо лютные величины) в зависимости от рациона (уровень в крови витамина С умножен на 10, чтобы поместить его в этой же системе координат) Следовательно, все разновидности рациона по влиянию на С-витаминную обес печенность соответствуют задачам работы – можно сопоставлять сдвиги С-гипо- и С-авитаминного рационов с показателями при полноценном рационе. Это позволило провести эксперименты с определением изучавшихся показателей на 7-й, 15-й и 21-й дни содержания свинок на С-гипо и С-авитаминном рационах.
Оказалось (табл. 1) что к 7, особенно к 15 дню растут активность тромбоцитов (высвобождение фф. Р3 и Р4, СА и АДФ-агрегация) и скорость ВТФ (рост плаз менного содержания маркеров). К 21 дню признаки активации тромбоцитов умень шаются, а содержание прямых маркеров ВТФ увеличивается.
Ускорение ЛПО и снижение АОП, в отличие от сдвигов в гемостазе, нарастало до 21-го дня. Толерантность к тромбину снижалась у свинок до 21-го дня опытов, что более выражено при С-авитаминном питании.
Таким образом, при дефиците витамина С возникают сдвиги, аналогичные тем, которые выявляли при введении прооксидантов различной природы – тироксина, по ловых стероидов, свинца [Р.Г.Алборов и др., 2000;
И.А.Карпова и др., 2001;
П.Я.Шаповалов и др., 2002]. Следовательно, отсутствие или дефицит АК оказывает такое же влияние на гемостаз, как прооксиданты. Это согласуется с представлением об антиоксидантных свойствах АК и подтверждается в наших экспериментах тем, что отсутствие АК в рационе ускоряет ЛПО и снижает АОП пропорционально дли тельности опытов. При содержании АК в рационе свинок в объеме суточной потреб ности, интенсивность ЛПО и величина АОП близки к данным, полученным в опытах на животных, синтезирующих витамин С [И.А.Дементьева, 1998;
И.В.Ральченко, 1998;
Е.А.Матейкович, 2006], и длительно остаются постоянными.
Таблица 1. Содержание маркеров ВТФ, толерантность к тромбину, ЛПО и АОП у сви нок на 7, 15 и 21 дни содержания их на С-гипо- или С-авитаминном рационе Свинки получали С-гиповитаминный (1-я строка) или Показатели Контроль С-авитаминный рацион (2-я строка) 7-й день 15-й день 21-й день Р3 % 80.9±2.0 81.0±2.1 86.1±1.2*+ 75.0±2.1*+ (n -8) 85.2±2.2* 92.0±2.2*+ 72.1±1.9*+ Р4, с 3.1±0.03 3.6±0.02*+ 4.3±0.03*+ 2.3±0.02*+ (n -8) 4.1±-.05*+ 5.0±0.04*+ 1.8±0.01*+ ФГ, г/л 2.1±0.08 2.1±0.08 1.9±0.02*+ 1.7±0.02*+ (n -8) 1.8±0.05* 1.5±0.01*+ 1.2±0.01*+ ПДФ, мг% 14.2±1.0 14.8±1.1 15.3±1.0*+ 20.1±1.4*+ (n -8) 15.9±1.2*+ 18.7±1.1*+ 25.3±1.6*+ РКМФ, мкг/мл 22.4±1.1 22.9±1.1 26.7±1.0*+ 28.8±2.0*+ (n -8) 25.2±1.3*+ 31.2±2.1*+ 35.6±2.5*+ D-Д, мкг/мл 0.19±0.006 0.18±0.007 0.22±0.007*+ 0.26.0±0.008*+ (n -8) 0.23±0.005*+ 0.27±0.008*+ 0.33±0.011*+ СА, % 4,1±0.04 4,4±0.06 6.8±0.09*+ 5.1±0.03*+ (n -8) 4.8±0.07*+ 10.1±0.11*+ 7.0±0.04*+ АДФ-АГ, % 52.0±2.1 55.4±2.4 68.7±3.5*+ 61.2±2.3*+ (n -8) 60.1±3.0*+ 74.9±3.9*+ 65.1±*+ ДК, А/мг ЛП 0.041±0.004 0.048±0.006 0.063±0.001*+ 0.078±0.008*+ (n -8) 0.054±0.004*+ 0.092±0.001*+ 0.131±0.011*+ ТБК, ед/мг ЛП 0.65±0.051 0.69±0.051 0.72±0.025*+ 0.81±0.022*+ (n -8) 0.76±0.056*+ 0.83±0.034*+ 0.94±0.041*+ ПИ, мин/мл 45.1±3.1 43.1±3.3 37.8±1.6*+ 30.91±1.9*+ (n -8) 40.1±3.0*+ 34.6±2.0*+ 28.2±2.2*+ СО, мм3 в мин 0.68±0.05 0.71±0.04 0.80±0.06*+ 0.93±0.03*+ 0.83±0.05*+ 0.93±0.08*+ 1.09±0.02*+ Т. к ТР, % 95.4±8.6 88.1±4.4*+ 75.2±3.1*+ (n -7) 100 88.2±7.3*+ 64.7±3.6*+ 51.8±2.8*+ Примечания: Т. к ТР – толерантность к тромбину;
знак * - достоверное отличие от соответ ствующей величины в контроле;
знак + - достоверное отличие от соответствующей величи ны в предшествующий срок отбора проб Ускорение внутрисосудистого свертывания крови (рост уровня маркеров ВТФ) при дефиците витамина С согласуется с обнаруженным снижением уровня ФГ – следствием его ускоренного потребления, и это согласуется с тем, что толерантность к тромбину снижается, а рост уровня маркеров ВТФ выявляется на протяжении трёх недель эксперимента. То, что на 3-й неделе кормления С-гипо- и особенно С-ави таминным рационом активность тромбоцитов, вначале повысившаяся, затем снижа лась, можно объяснить истощением клеток. Это согласуется с найденной у лиц с диабетом типа I активацией тромбоцитов [И.И.Дедов и др., 1995, 1996], сменяющей ся позднее снижением их активности [Р.Г.Алборов, 2003: Ю.В.Нелаева, 2003].
В соответствии с задачами работы не имело смысла продолжать исследования после двух недель пребывания животных на С-гипо- и С-авитаминном рационе, т.к. в дальнейшем свинки потребляли корм в уменьшенном количестве (С-гиповитаминоз), в связи с чем на дефицит витамина С наслаиваются последствия алиментарного го лодания и, следовательно, недостаточности витаминов других групп.
Установив, что дефицит витамина С вызывает пропорциональное степени недос таточности ускорение ЛПО, снижение АОП, активацию тромбоцитов и ускорение ВТФ уже к концу 1-й и особенно к концу 2-й недели, мы пытались установить поря док появления этих сдвигов. Для этого брали пробы крови чаще между 7 и 15 днями аналогичного опыта. Быстроту увеличения сдвигов оценили, сопоставляя графиче ски значения степени их отклонения от контроля в процентах. На рис. 2 приведены данные, полученные при С-авитаминозе. Здесь видно, что уже на 7-й день наиболее значимо повышено содержание липидпероксидов (ДК и ТБК) и снижен АОП (укоро чение ПИ и рост СО), за ними следуют показатели активности тромбоцитов (Р4, СА и АДФ-агрегация). Изменения эти нарастают и в последующем, сохраняя соотноше ние между величинами, характеризующими эти сдвиги относительно контроля.
Р-4 ФГ ПДФ РКМФ Д-д СА АДФ-АГ ДК ТБК ПИ СО Т - - 7-й день 10-й день 13-й день 15-й день Рисунок 2. Степень изменений (% к контролю - рациону с дозой АК, равной суточной по требности) активности тромбоцитов, маркеров ВТФ, ЛПО, АОП и толерантности к тромби ну при С-авитаминном питании. Столбцы диаграммы слева направо: фф. Р3, Р4, фибриноге немия (ФГ), ПДФ, РКМФ, D-димеры, спонтанная агрегация, АДФ-агрегация, диеновые конъюгаты (ДК), ТБК-активные продукты, период индукции (ПИ), скорость окисления (СО) и толерантность к тромбину (Т.к ТР) За этими показателями (по степени их изменения относительно контроля) распо лагаются величины, которые характеризуют сдвиги содержания маркеров ВТФ.
Степень снижения уровня ФГ, как характеристика его потребления, заметно уве личилась только к концу опыта, когда интенсивность ВТФ уже существенно увели чилась. Мы не приводим данных у свинок с С-гиповитаминным питанием - они идентичны по направленности найденным у свинок с С-авитаминозом.
Категорически утверждать, что при С-авитаминозе рассматриваемые сдвиги раз виваются в предполагаемой последовательности (вначале ЛПО и АОП, затем акти вация тромбоцитов, затем ускорение ВТФ и падение толерантности к тромбину) нет достаточных оснований, хотя именно в таком порядке протекают сдвиги этих пока зателей при активации ЛПО введением прооксидантов. При введении антиоксидан тов последовательность изменений такова же, но противоположна по направлению [Э.А.Шабанов, 2000;
Е.А.Матейкович, 2006;
А.Ш.Бышевский и др., 2006].
Для выявления связей между изменением изучавшихся показателей сопоставлен характер кривых, отражающих сдвиги во времени. На рис. 3 сравнивается динамика изменений (при С-авитаминозе) уровня вторичного липидпероксида (ТБК), ПИ, фф.
Р3, Р4, СА и АДФ-агрегации: изменения всех величин в зависимости от длительности опытов линейны - коэффициенты аппроксимации, приведенные для каждого графи ка, предельно близки единице (от 0.89 до 0.98). Следовательно, зависимость между темпом нарастания скорости ЛПО, а также скорости снижения АОП с одной сторо ны, и степенью прироста агрегационной активности тромбоцитов и их способности к реакции высвобождения – с другой, близка к линейной. Это не говорит о том, какие из сдвигов инициирующие - ЛПО и АОП, или активность тромбоцитов. Однако, если учитывать, что С-авитаминоз - это устранение из участия в метаболизме одного из антиоксидантов (витамина С), то логично рассматривать ускорение ЛПО и угнетение АОП инициатором последующих сдвигов.
Р-3 Р-4 СА АДФ-АГ ТБК ПИ Линейный (СА) Линейный (Р-3) Линейный (АДФ-АГ) Линейный (ТБК) Линейный (ПИ) Линейный (Р-4) R = 0, R = 0, 43 45 R = 0, 32 R = 0, 14 R = 0, 6 - -13 R = 0, - - - - 7-й день 10-й день 13-й день 15-й день Рисунок 3. Динамика изменения (% к контролю) активности тромбоцитов, ЛПО и АОП при С-авитаминном питании. В легенде слева направо фф. Р3, Р4, ФГ, ПДФ, РКМФ, D-димеры, спонтанная агрегация, АДФ-агрегация, диеновые конъюгаты (ДК), ТБК-активные продукты, период индукции (ПИ), скорость окисления (СО) и толерантность к тромбину (Т.к ТР) О такой же последовательности появления сдвигов свидетельствует и то, что ин фузия тромбоцитов от реципиентов (крысы с гипероксидацией) нормальным крысам мало изменяет у них ЛПО [Р.Г.Алборов, 2006]. Видимо, инициатор изменения ак тивности тромбоцитов при дефиците витамина С - ускорение ЛПО. При этом сте пень активации тромбоцитов, особенно СА, несоразмерна степени активации ЛПО.
Так, к 15-дню ЛПО, оцениваемая по уровню ТБК-продуктов, ускорилась на 40%, а СА на 151%. Однако, если учесть, что уровень ДК к тому же сроку увеличился на 138%, то вопрос о несоразмерности отпадает. Следует принять во внимание и то, что активированные хотя бы в малой степени тромбоциты аутокаталитически наращи вают свою активность через ускорение тромбиногенеза, а тромбин активирует тром боциты [Д.М.Зубаиров, 2000;
А.С.Шитикова, 2000;
Gawaz M.P., 2001].
Сопоставляя у свинок динамику изменений активности тромбоцитов с изменени ем интенсивности ВТФ (при кормлении С-авитаминным рационом), мы нашли сле дующее. Сравнение графиков, отражающих сдвиги показателей активности тромбо цитов (содержание фф. Р3, Р4, СА и АДФ-агрегация), с графиками изменения уровня маркеров ВТФ (ПДФ, РКМФ и D-димеры), обнаруживает следующее (рис. 4).
Р-3 Р-4 ПДФ РКМФ Д-д СА АДФ-АГ Линейный (АДФ-АГ) Линейный (СА) Линейный (Д-д) Линейный (ПДФ) Линейный (Р-4) Линейный (Р-3) Линейный (РКМФ) R2 = 0, R2 = R2 = 0, R2 = 0, R2 = 0, R2 = 0, R2 = 0, 7-й день 10-й день 13-й день 15-й день Рисунок 4. Динамика изменения (% к контролю) активности тромбоцитов, и содержания маркеров ВТФ при содержании свинок на С-авитаминном рационе питания.
Содержание маркеров ВТФ изменяется параллельно росту активности тромбоци тов, причем в период наблюдения прирост уровня маркеров ВТФ происходит линей но. Особенно это относится к D-димерам – коэффициент аппроксимации соответст вующего тренда равен единице, т.е. имеет место абсолютная «линейность» сдвига. В малой степени отклоняются от единицы и коэффициенты аппроксимации трендов, характеризующих динамику изменения содержания двух других маркеров ВТФ – ПДФ и РКМФ (они равны 0.892 и 0.968 соответственно).
На рис. 5 представлены графики, характеризующую динамику изменения во вре мени уровня маркеров ВТФ и толерантности к тромбину.
ПДФ РКМФ Д-д Т.к ТР Линейный (ПДФ) Линейный (Д-д) Линейный (РКМФ) Линейный (Т.к ТР) R = 40 R = 0, 20 R = 0, - R = 0, - 7-й день 10-й день 13-й день 15-й день Рисунок 5. Динамика изменения (в % к контролю) содержания маркеров ВТФ и толерантности к тромбину (Т.к ТР) при С-авитаминном питании.
Здесь видно, что степень изменений толерантности к тромбину линейно снижа ется с ростом уровня маркеров ВТФ (такое же отношение «толерантность к тром бину/маркеры» распространяется и на остальные маркеры ВТФ).
Обсуждение опытов, в которых изучали, как меняется гемостаз и ЛПО при С авитаминозе, можно закончить следующим: 1. На ранних этапах скармливания С авитаминного рациона несинтезирующим его животным наряду с ускорением ЛПО и снижением АОП увеличивается агрегационная и «высвобождающая» способность тромбоцитов;
растет плазменное содержание маркеров ВТФ, т.е. интенсивность не прерывного внутрисосудистого свертывания крови, и одновременно падает толе рантность к тромбину;
2. При развитом С-дефиците (21-й день при С-гипо- и осо бенно С-авитаминном рационе) активность тромбоцитов падает в сравнении с обна руживающейся к концу 2-й недели наблюдений;
усугубляется и снижение толерант ности к тромбину;
3. Ещё более увеличивается содержания маркеров ВТФ и при по явлении явных признаков скорбута;
4. Появляющиеся уже к 7-му дню признаки ак тивации ЛПО и снижения АОП усугубляются в течение всего периода витамин С дефицита.
В следующей серии опытов одна группа свинок получала АК в составе С-ави таминного рациона в дозе, равной суточной потребности, другая группа получала ДМ в дозе, предупреждающей гипероксидацию (1 г/кг). Результаты опытов (табл. 2) показывают, что введение АК свинкам, в дозе, равной суточной потребности, прак тически предупредило все гемостатазиологические изменения. Это позволило счи тать, что они (изменения) вызваны дефицитом витамина С.
В дозе, поддерживающей обычную для данных животных, интенсивность про цессов ЛПО и величину АОП при С-авитаминном питании, ДМ устранил сдвиги ЛПО и АОП, возникавшие у свинок в этих условиях на 7 и 15 дни С-авитаминного питания, и предупредил появление гемостазиологических сдвигов.
На 21-й день сдвиги активности тромбоцитов оказались менее выражены, чем на 15-й день, но выше, чем в контроле. Уровень маркеров ВТФ, напротив, стал ещё зна чительнее, заметнее снизилась и толерантность к тромбину.
В целом в конце 3-й недели у свинок, получавших АК или ДФ в составе С авитаминного рациона, изменения (в сравнении с С-авитаминным) сгладились лишь отчасти (некоторое ограничение уровня липидпероксидов, сдвигов ПИ и СО).
Таблица 2. Степень отклонения (в % к контролю) показателей активности тромбоцитов, содер жания маркеров ВТФ, ЛПО и АОП, и толерантности к тромбину у свинок на 7, 15-й и 21-й дни содержания их на С-авитаминном рационе, том же рационе с добавкой АК, том же рационе с добавкой димефосфона Контроль -1-я строка - свинки получали С-авитаминный рацион (АК Показатели -2-я строка -тот же рацион+ АК (5.5 мг/кг/сут) 5.5. мг/кг/сут) -3-я строка – тот же рацион+димефосфон (1 г/кг/сут) 7-й день 15-й день 21-й день Р3 % 7 8 79.7±1. (n -8) 3 2 0 0 Р4, с 16 53 3.2±0. (n -8) 1 9 1 16 ФГ, г/л 4 -23 - 2.2±0. (n -8) 1 -14 - 4 -9 - ПДФ, мг% 7 38 14.2±1. (n -8) 0 6 2 4 РКМФ, мкг/мл 4 43 22.4±1. (n -8) -4 0 0 0 D-Д, мкг/мл 40 65 0.20±0. (n -8) 15 10 5 5 СА, % 20 72 4,0±0. (n -8) 5 10 - 7 2 АДФ-АГ, % 7 32 52.0±2. (n -8) 2 4 0 0 ДК, А/мг ЛП 14 45 0.044±0. (n -8) 0 102 -4 0 ТБК, ед/мг ЛП 12 11 0.66±0. (n -8) 0 -3 - -3 0 ПИ, мин/мл -10 -17 - 45.4±2. (n -8) 3 -1 0 0 - СО, мм3 в мин 13 16 0.70±0. 4 3 1 1 Т. к ТР, % -9 -15 - (n -7) 100 0 0 - 0 -2 - Обозначения: знак «–» - показатель уменьшен относительно контроля Это видно из диаграмм (рис. 6), характеризующих динамику СА, уровня D-диме ров, ПИ и и толерантности к тромбину у свинок, получавших С-авитаминный рацион без добавок, тот же рацион+АК или тот же рацион+ДМ. Так, у свинок, получавших С-авитаминный рацион, СА увеличена на 7 и 15 дни, снижаясь к 21 дню, но остава ясь выше исходного значения. Содержание D-димеров у них растет до конца наблю дений, ПИ сокращается к 7 и 15 дням, отчасти восстанавливаясь к 21 дню, а толе рантность к тромбину продолжает падать с увеличением длительности опыта.
45 40 25 15 10 57 53 5 5 0 00 -1 - -5 - -10 - - - -17 - -35 - 7-й день 15-й день 21-й день Рисунок 6. Изменения (% к контролю) СА, содержания D-димеров, ПИ и толерантно сти к тромбину при С-авитаминном питании свинок, том же питании+АК и том же питании+ДМ (слева направо в пределах всех сроков отбора проб) У свинок, получавших АК в дозе, равной суточной потребности, СА не меняет ся в ходе опытов. Уровень D-димеров слегка увеличен во все периоды опыта, но в меньшей мере, чем у свинок С-авитаминозной группы. ПИ и толерантность к тром бину у них практически не изменены. У свинок, получавших с рационом ДМ, СА немного увеличена на 7 и 15 дни, как у свинок, получавших АК, а к 21 дню увеличена на 27%. Уровень D-димеров не изменился на 7 и 15 дни, но увеличился к 21 дню (на 45%). ПИ не изменен на 7-й и 15-й дни, сократился к 21 дню. Толерант ность к тромбину не изменена на 1 и 2 этапах опыта и снижена на 11% к концу на блюдений, т.е. меньше, чем при С-авитаминном питании без добавок. Не представ ленные здесь показатели активности тромбоцитов, интенсивности ВТФ и ЛПО изме нялись аналогично приведенным на рис. 6.
Такое развитие событий позволяет предполагать, что инициатором сдвигов в ран ние сроки дефицита витамина С служит ускорение ЛПО и снижение АОП, а следст вие - активация гемостаза. При выраженной картине скорбута (21-й день), когда ан тиоксидантный эффект АК или ДМ ограничивают изменения ЛПО и, особенно, АОП, тромбоциты, сохраняющие повышенную активность, обеспечивают дальней ший рост содержания маркеров ВТФ.
Поэтому активацию тромбоцитов и связанное с этим ускорение ВТФ при дли тельном дефиците витамина С, вызвавшем скорбут, нельзя объяснить только выклю чением из оборота одного из антиоксидантов, каким является АК. Об этом свидель ствует тот факт, что подмена АК другим антиоксидантом (ДМ) не купирует полно стью гемостатических сдвигов, хотя и ограничивает дальнейшую активацию ЛПО и снижение АОП. Данные литературы позволяют объяснять неспособность ДМ полно стью устранить сдвиги в гемостазе нарушением функции эндотелия - сосудистого компонента гемостаза [А.С.Шитикова, 2000;
Gawaz, 2001]. Так, в частности, извест но, что уже при умеренной гомоцистеинемии (гомоцистеин в малых количествах – нормальный компонент крови) усиливаются адгезивные свойства эндотелия, а вве дение витамина С блокирует этот эффект [Nappo. e.a., 1999;
Labinjoh. e.a., 2001;
Labinjoh e.a., 2001]. Известно и то, что нагрузки АК, не влияющие на уровни актива тора и ингибитора профибринолизина ткани, ФГ, ф. VIII:ФВ и вязкости крови при нормальной обеспеченности витамином С, на фоне его дефицита повышают уровень ф. VIII:ФВ [Tofler. e.a., 2000]. Обнаружено, что введение АК снижает активность эн дотелия, уменьшая скорость ЛПО, и снижает активность фибринолиза на фоне С авитаминоза, в то время как у лиц с нормальной обеспеченностью витамином С это го не наблюдают [Antoniades e.a., 2003;
Tomiyama. e.a., 2003]. АК усиливает эффект вазодилататоров [Pellegrini. e.a., 2004], а изменения просвета сосудов не может не сказаться на свертывающей активности крови.
Установлено, что АК ограничивает и даже предотвращает активацию тромбоци тов, благодаря способности увеличивать высвобождение полиморфноядерными лей коцитами оксида азота - соединения с антиагрегантной активностью [Raghavan e.a., 2003]. Наконец, доказана роль витамина С в формировании субэндотелия путем уча стия в гидроксилировании пролина в молекуле преколлагена, что необходимо для его трансформации в коллаген [П.Н.Шараев, 2004;
В.П.Мищенко и др., 2005;
Е.Б.Меньщикова и др., 2006].
Это позволяет заключить, что значение витамина С в процессах свертывания кро ви обусловлено не только антиоксидантными, но и его специфическими свойствами.
Поэтому ДМ, как антиоксидант, поддерживающий эффекты физиологических анти оксидантов, не в состоянии полностью предупредить те гемостазиологические изме нения, которые возникают при С-авитаминозе – он устраняет только ту их часть, ко торая связана с ативацией ЛПО и снижением АОП в тромбоцитах – клетках в суще ственной мере определяющих состояние гемостаза как многокомпонентной системы.
Наши данные – дополнительное свидетельство того, что гемостазиологические сдвиги при дефиците витамина С связаны со снижением АОП и с активацией ЛПО, но не только с этим, но также и с выключением при С-авитаминозе некоторых спе цифических функций витамина, обеспечивающих его косвенное участие в гемостазе.
Далее, изучая влияние АК в дозах, существенно превышающих суточную по требность, мы нашли, следующее.
Двух- и трёхкратный избыток АК у свинок несинтезирующих витамин С и полу чающих рацион, включающий АК в соответствии с суточной потребностью, в малой степени тормозит ЛПО и повышает АОП, и это сопровождается столь же небольшим замедлением ВТФ, снижением агрегационной и «высвобождающей» способности тромбоцитов, не отражаясь на толерантности к тромбину (наблюдается лишь тен денция к её росту, не подтверждаемая статистически). Четырёхкратный избыток АК на фоне полноценного рациона у свинок сопровождается слабой активацией ЛПО и малым снижением АОП к концу 1-й и 2-й недель, однако, на 21-й день эти измене ния привели ещё и к небольшому увеличению скорости ВТФ, а также к повышению активности тромбоцитов и снижению толерантности к тромбину (рис. 7).
Р-3 Р-4 ФГ ПДФ РКМФ Д-д СА АДФ-Аг ДК ТБК ПИ СО Т.к ТР 10 9 - - - - - 7-й день 15-й день 21-й день Рисунок 7. Динамика изменения (% к значениям при полноценном питании) активности тромбоцитов, уровня маркеров ВТФ, интенсивности ЛПО-АОП и толерантности к тромби ну при питании рационом с АК в дозе, четырехкратно превышающей суточную потребность Здесь видно следующее: 1. Невелики сдвиги, отражающие тенденцию к актива ции (или к угнетению) тромбоцитов, уровня ВТФ, ЛПО и АОП;
2. Четко выражены сдвиги, отражающие ускорение ЛПО, снижение АОП, активацию тромбоцитов, рост содержания маркеров ВТФ и снижение толерантности к тромбину на 21-й день.
Этот, кажущийся неожиданным, эффект можно рассматривать как причину сниже ния толерантности к тромбину у свинок, получавших четырёхкратную дозу АК.
Активацию ЛПО и снижение АОП при значительном избытке АК можно считать следствием проявления прооксидантных свойств больших доз АК, которая может вести себя как активатор свободнорадикальных процессов [Е.Б.Меньщикова и др., 2006;
Cohen A. Schwarz E., 1981;
Burton G. e.a., 1990].
Это наблюдение подтверждает также и то, что эффекты АК на гемостаз обуслов лены их влиянием на ЛПО, как установлено относительно витаминов А, Е и Р в экс периментах, позволивших сопоставить эффекты этих витаминов с эффектами анти оксиданта без витаминных свойств [Е.А.Матейкович, 2006;
С.В.Миневцев, 2006].
У крыс, синтезирующих витамин С эффекты АК на тромбоциты, ВТФ, ЛПО, АОП и на толерантность к тромбину имели ту же направленность и заметно не отличались по степени (установлено нами при использовании дополнительных доз АК на фоне полноценных для обоих видов рационов питания). Это видно при сопоставлении данных в таблицах 3 и 4). Вместе с тем, есть и заметное отличие: у свинок АК в дозе, превышающая суточную потребность в 2 и 3 раза, повысила толерантность тромбину на 9-10% в виде тенденции, о которой можно говорить потому, что во все периоды опыта есть прирост толерантности, не подтверждаемый статистически. У крыс в те же сроки толерантность при такой дозе АК выросла до 110, 121 и 127%. Видимо, у синтезирующих витамин С животных эти дозы АК обусловливают достаточное по вышение насыщенности организма витамином С. Доза, превышающая суточную по требность в 4 раза, вызвала у свинок слабую тенденции к снижению толерантности к тромбину к 7 и 15 дням, реализовавшуюся к 21 дню (достоверное снижение на 12%).
У крыс эта доза снизила толерантность уже к 15 дню (на 8.7%) и на 12.7% - к 21 дню.
Видимо, в этом случае проявилась прооксидантная способность АК, к избытку кото рой крысы как животные, синтезирующие витамин С, более чувствительны.
Таблица 3. Содержание маркеров ВТФ, толерантность к тромбину, ЛПО и АОП у свинок содержав шихся на полноценном рационе (контроль) или том же рационе с избытком АК Контроль -1-я строка - свинки получали тот же рацион+АК Показатели (полноценный рацион (11.1мг/кг/сут) - 5.5 мг/кг АК в сут) - 2-я строка - тот же рацион+ АК (16.5 мг/кг/сут) - 3-я строка - тот же рацион+АК (22 мг/кг/сут) 7-й день 15-й день 21-й день Р3 % 79.6±1.2 81.0±1.5 77.3±1.4 77.9±2. (n -8) 78.3±1.1 75.0±2.1* 74.1±1.3* 77.2±0.8. 78.2±1.2 85.4±1.7*+ Р4, с 3.4±0.02 3.6±0.02 3.5±0.04 3.6±0. (n -8) 3.3±0.03 3.1±0.02*+ 3.2±0.04+ 3.7±0.09 3.5±0.04 4.1±0.02*+ ФГ, г/л 2.2±0.07 2.1±0.06 1.9±0.04 1.9±0. (n -8) 2.2±0.05 2.1±0.04 2.0±0. 2.4±0.09 2.4±0.06 1.8±0.061* ПДФ, мг% 14.2±1.1 15.4±0.5 15.0±1.2 15.0±1. (n -8) 14.0±0.5 12.0±0.7*+ 11.4±1.01*+ 15.9±0.5 15.9±0.07 16.4±1.0*+ РКМФ, 23.0±1.0 24.7±1.0 22.4±1.0 22.8±1. мкг/мл 22.6±0.8 19.1±1.1*+ 20.3±1.1*+ (n -8) 22.4±1.1 25.1±1.0 26.3±1.0*+ D-Д, 0.22±0.007 0.24±0.008 0.23±0.007 0.23±0. мкг/мл 0.23±0.008 0.18±0.006*+ 0.19±0.010*+ (n -8) 0.22±0.006 0.23±0.005 0.26±0.014*+ СА, % 4,0±0.03 4,3±0.06 4.4±0.09 4.1±0. (n -8) 4.1±0.05 3.8±0.04+ 3.7±0.02*+ 4,2±0.04 4.6±0.04 4,7±0.04*+ АДФ-АГ, % 52.0±2.1 52.7±2.3 51.9±3.1 54.1±2. (n -8) 53.4±3.3 48.0±1.6 48.0±1.7*+ 52.2±1.7 56.1±2.7 57.2±1.2*+ ДК, А/мг ЛП 0.044±0.004 0.047±0.005 0.043±0.012 0.046±0. (n -8) 0.043±0.006 0.038±0.011*+ 0.040±0.002*+ 0.044±0.004 0.046±0.012 0.052±0.003*+ ТБК, 0.65±0.043 0.62±.0.048 0.63±0.029 0.61±0. ед/мг ЛП 0.64±0.054 0.57±0.019*+ 0.57±0.03*+ (n -8) 0.65±0.036 0.68±0.057 0.77±0.050*+ ПИ, мин/мл 45.1±2.0 44.7±3.1 47.2±2.5 47.0±1. (n -8) 46.0±3.7 43.1±0.8*+ 48.9±0.8*+ 45.7±2.1 43.1±2.1 41.0±1.2*+ СО, мм3 в мин 0.68±0.03 0.69±0.04 0.67±0.11 0.64±0. (n - 8) 0.71±0.08 0.53±0.03*+ 0.61±0.02*+ 0.70±0.07 0.71±0.05 0.73±0.01*+ Т. к ТР, % 109±7.9 110±8.9 108±8. (n -7) 100 112±8.3 113±9.8 106±9. 98.6±4.5 98.6±5.1 88.1±3.1*+ Примечания: * - достоверное отличие от той же величины в контроле;
+ - достоверное отличие от той же величины у свинок, получавших АК в 2-кратной дозе Таблица 4. Содержание маркеров ВТФ, толерантность к тромбину, ЛПО и АОП у крыс, содержав шихся на казеиново-крахмальном рацион, при дополнительном введении АК в дозах 11.0, 16.5 и 22.0 мг/кг/сут (соответственно 1-я, 2-я и 3-я строки) Контроль крысы полу -1-я строка - тот же рацион+ АК (11.1 мг/кг/сут), Показатели чали С-авитаминный -2-я строка тот же рацион+ АК (16.5 мг/кг/сут) рацион - 3-я строка – тот же рацион+АК (22.0 мг/кг/сут) 7-й день 15-й день 21-й день Р3 % 69.1±1.0 71.2±1.4 67.2±1.1 66.9±2.0* (n -8) 70.0±1.2 64.1±0.7* 61.5±1.1* 70.2±1.2. 67.0±0.9 76.0±1.2* Р4, с 3.4±0.02 3.6±0.03 3.1±0.03* 3.0±0.03* (n -8) 3.3±0.03 3.0±0.02* 3.0±0.04* 3.5±0.09 3.5±0.04 4.0±0.01* ФГ, г/л 2.3±0.06 2.3±0.06 2.4±0.02 2.1±0. (n -8) 2.2±0.05 2.2±0.03 2.0±0. 2.5±0.09* 2.0±0.07 1.7±0.063* ПДФ, мг% 14.9±1.0 15.1±0.6 15.0±1.1 13.4±1.1* (n -8) 14.8±0.4 11.0±0.4* 10.4±0.8* 14.9±0.5 15.4±0.06 16.2±0. РКМФ, мкг/мл 23.9±0.8 23.6±0.9 22.0±0.6 21.0±1.1* (n -8) 23.7±0.9 19.2±0.9* 18.6±1.0* 25.0.±1.4 24.1±1.0 24.9±1. D-Д, мкг/мл 0.18±0.006 0.19±0.007 0.16±0.007 0.14±0.008* (n -8) 0.21±0.011 0.14±0.005* 0.13±0.011* 0.21±0.012 0.20±0.009 0.23±0.012* СА, % 4,2±0.04 4,4±0.03 3.7±0.05* 3.4±0.04* (n -8) 4.2±0.08 3.3±0.03* 3.2±0.02* 4,4±0.07 4.3±0.05 4,6±0.08* АДФ-АГ, % 51.0±1.9 51.4±1.9 46.1±1.1* 44.2±2.1* (n -8) 53.7±3.2 43.0±1.0* 41.4±1.3* 54.1±2.8 55.0±2.2 54.4±1.2* ДК, А/мг ЛП 0.040±0.001 0.036±0.004* 0.033±0.010* 0.030±0.003* (n -8) 0.033±0.002* 0.027±0.011* 0.028±0.002* 0.041±0.004 0.043±0.012 0.047±0.001* ТБК, ед/мг ЛП 0.60±0.041 0.58±.0.041* 0.51±0.022* 0.48±0.021* (n -8) 0.54±0.054* 0.46±0.011* 0.44±0.02* 0.65±0.034 0.63±0.051 0.69±0.033* ПИ, мин/мл 40.1±1.1 44.5±0.9* 47.3±2.1* 49.2±0.9* (n -8) 46.8±0.7* 48.5±0.8* 51.2±0.7* 40.7±1.1 39.4±1.8 37.1±0.6* СО, мм3 в мин 0.61±0.02 0.57±0.01* 0.54±0.13* 0.50±0.01* 0.56±0.02* 0.52±0.08* 0.48±0.01* 0.63±0.08 0.63±0.08 0.67±0.02* Т. к ТР, % 110±2.1* 121±3.9* 127±5.1* (n -7) 100 113±1.9* 123±6.4* 126±3.7* 99.5±2.5 91.3±4.1* 87.3±4.8* Примечания: Т. к ТР – толерантность к тромбину;
* - достоверное отличие от соответствую щей величины в контроле Чтобы уточнить, ведет ли себя АК в больших дозах как прооксидант, мы изучили в опытах на крысах эффекты восьмикратной (против суточной потребности) дозы – 40.0 мг/кг/сут, и подтвердили это. На рис. 8 видно, что уже на 7-й день введения АК в этой дозе повысились агрегационная и «высвобождающая» активность тромбоци тов, уровень маркеров ВТФ, уровень ДК и ТБК, СО и снизился ПИ, т.е. активирова лась ЛПО, снизился АОП, и ускорилось внутрисосудистое свертывание крови. Вид но и то, что с увеличением сроков введения этой дозы АК все сдвиги усиливаются при одновременном снижении толерантности к тромбину. Примечательно, что на 7-й и 15-й дни введения АК в восьмикратной дозе содержание ФГ выше контрольного значения, и это согласуется с данными о способности витамина С ускорять биосин тез белков [Б.А.Лавров, 1951;
В.Г.Ребров, О.А.Громов, 2003]. Однако к 21-му дню фибриногенемия снизилась, что можно рассматривать как признак ускоренного по требления ФГ в связи с активацией внутрисосудистого свертывания крови. Кроме этого к 7-му дню была ускорена ЛПО и чуть снижен АОП.
Р-3 Р-4 ФГ ПДФ РКМФ Д-д СА АДФ-Аг ДК ТБК ПИ СО Т.к ТР - - 7-й день 15-й день 21-й день Рисунок 8. Динамика изменения (% к значению при полноценном питании) активности тромбоцитов, содержания маркеров ВТФ, интенсивности ЛПО-АОП и толерантности к тромбину у крыс, получавших АК в дозе, восьмикратно превышающей суточную потреб ность О том же свидетельствует и заметный рост содержания D-димеров – продуктов фибринолиза, ускоряющегося в ответ на усиленное (в конце наблюдений) фибрино образование [З.С.Баркаган, 1978;
А.Ш.Бышевский, 1990;
Д.М.Зубаиров, 2000].
Следовательно, в избытке витамин С обнаруживает способность прооксиданта, и это может усиливаться с увеличением дозы (другие прооксиданты, например, свинец или тирозин, дозазависимо активируют ЛПО и снижают АОП [И.А.Аптекарь, 2003]).
К 15-му дню увеличился уровень фф. Р3 и Р4, заметнее повысилась СА, АДФ агрегация и плазменное содержание маркеров ВТФ. Заметнее увеличилась к этому сроку скорость ЛПО, значительнее стала и степень снижения АОП. К концу наблю дений (21-й день) все рассмотренные изменения усугубились.
Таким образом, выяснилось, что большие дозы АК снижают АОП в тромбоцитах, ускоряют в них ЛПО и повышают агрегационную и «высвобождающую» активно сти, и, видимо, в связи с этим, ускоряют ВТФ. Подтверждается это ещё и тем, что толерантность к тромбину при введении АК в высокой дозе уже через неделю сопро вождается тенденцией к снижению толерантности к тромбину, которое становится достоверным к 15 дню, усиливаясь (на 28.9%) к 21 дню.
Итак, при С-гипо-, особенно при С-авитаминном питании ускоряется ЛПО и сни жается АОП. В связи с этим мы пытались выяснить, как влияет АК на гемостаз при гипероксидации или торможении ЛПО у синтезирующих и не синтезирующих вита мин С животных. С этой целью изучили влияние АК на уровень маркеров ВТФ, ак тивность тромбоцитов и толерантность к тромбину при ускорении и угнетении ЛПО у морских свинок и крыс. Это было необходимо, так как известна способность неко торых витаминов-антиоксидантов ограничивать сдвиги гемостаза заметнее при гипе роксидации [И.В.Ральченко, 1998;
С.В.Миневцев, 2005;
П.Я.Шаповалов, 2005]. Ре зультаты экспериментов представлены в виде интенсивных величин табл. 5 и 6.
Таблица 5. Степень сдвигов активности тромбоцитов, содержания маркеров ВТФ, ЛО, АОП и толерантности к тромбину у свинок, получавших С-авитаминный рацион, или тот же ра цион+АК (5.5 мг/кг/сут), или тот же рацион+ АК+свинец (50 мг/кг/сут), или тот же рацион+ АК+димефосфон (1 г/кг/сут).
Контроль 1-я строка - свинки получали С-авитаминный раци Показатели (С-авитаминный он+АК (5.5мг/кг);
рацион), абсолютные 2-я строка - тот же рацион+АК+свинец ;
величины 3-я строка - тот же рацион+АК+димефосфон 7-й день 15-й день 7-й день 15-й день Р3 % -35* -40* 85.2±1.4 95.2±1.7* (n -6) 9*+ 14*+ -50*+» -49+» Р4, с -5* -3* 3.6±0.02 4.8±0.04* (n -6) 8* 20*+ -17*+» -25*+ ПДФ, -13* -12* 16.4±0.3 19.5±1.0* мг% 69*+ 79*+ (n -6) -24*+» -16.9*+» РКМФ, -10* -34* 24.6±1.1 32.3±0.8* мкг/мл 42*+ 32*+ (n -6) -26*+» -47*+» D-Д, -33* -37* 0.27±0.005 0.30±0.007* мкг/мл 44*+ 90*+ (n -6) -48*+» -70*+» СА, % -17* -37* 4,8±0.04 6.7±0.06* (n -6) 48*+ 22*+ -19*+» -68*+» АДФ-АГ, % 55.6±1.4 -19* -34* 68.5±2.4* (n -6) 24*+ 15*+ -26*+» -37*+» ДК, А/мг ЛП 0.051±0.001 0.062±0.010 -14* -32* (n -6) 54*+ 43*+ -57*+» -56* ТБК, ед/мг 0.74±.0.51 0.75±0.021* -12* -11* ЛП 70*+ 97*+ (n -6) -36*+» -48*+» ПИ, мин/мл 12* 19* 40.0±1.6 37.6±1.1* (n -6) -25*+ -40*+ 57*+» 85*+» СО, мм3 в 0.77±0.033 0.84±0.12* -11* -9* мин 28*+ 41*+» (n-6) -34*+» -45* Т. к ТР, % 10* 49* 91.4±4.1 85.0±3.3* (n -8) -39*+ -39*+ 31*+» 46*+» Обозначения как к табл. 2;
Примечание: величины, выраженные в %%, указывают насколько и в каком направлении (знак «-» - ограничение эффекта, отсутствие знака - прирост эффекта) изменен эффект С-недостаточности (1-я строка - при наличии в рационе АК, 2-я - при наличии в рационе АК и свинца, 3-я - АК и димефосфона) Таблица 6. Изменения (в % относительно величин, найденных на 7-й или 15-й дни при питании ра ционом без АК) активности тромбоцитов, уровня маркеров ВТФ, ЛПО, АОП и ТкТР у крыс при вве дении им с АК, АК+ацетат свинца, АК+димефосфон Казеиново-крахмальный - 1-я строка - тот же рацион+АК (5.5.мг/кг);
рацион без добавки АК - 2-я строка – тот же рацион +АК+свинец Показатели (50 мг/кг/сут).
- 3-я строка - тот же рацион+АК+ДМ (1 г/кг/сут) 7-й день 15-й день 7-й день 15-й день Р3 % (n -8) 0 67.9±009 67.1± 6* 7*+ -10* -13* Р4, с (n -8) 0 3.3±0.01 3.2±0. 3*+ 6*+ -3+ - ФГ, г/л (n -8) 0 2.2±0.05 2.3±0. -12*+ -40*+ 0 9*+ ПДФ, мг% 0 15.1±0.7 14.8±0. (n -8) 10* 20*+ 0 -11* РКМФ, мкг/мл 0 23.5±0.7 24.0±0. (n -6) 7* 9*+ 0 -21*+ D-Д, мкг/мл 0 0.18±0.006 0.19±0. (n -8) 22* 26*+ 0 -21*+ 4,1 ±0. СА, % (n -8) 0 4,2±0. 7* 12* 0 -14*+ АДФ-АГ, % 0 50.3±0.7 51.1±1. (n - 8) 8 10*+ 8* -10*+ ДК, А/мг ЛП 0 0.043±0.002 0.040±0. (n -6) 7* 25* -9* -12*+ ТБК, ед/мг ЛП 0 0.63±0.039 0.61±0. (n -8) 5* 15*+ -5* -10*+ 40.4 ±1. ПИ, мин/мл 0 39.8±0. (n -8) -8* -9* 8*+ 20*+ СО, мм3 в мин 0 0.63±0.03 0.59±0. (n-8) 5* 34* -5*+ -5*+ Т. к ТР, % 100 100 0 (n -8) -21*+ -30*+ 9 15*+ Примечания: Т. к ТР – толерантность к тромбину;
* - достоверное отличие от величин в 1-й (или 2 й) колонке цифр, + - от данных, полученных на 7-й или 15-й день (т.е. от данных 1-й строки в той же колонке). Знак «-« - снижение, без знака «–« - повышение.
Анализ данных указывает на следующее:
1. У свинок (табл. 5), при исключении витамина С из рациона растут уровни фф.
Р3 и Р4, маркеров ВТФ, липидпероксидов, способность к агрегации и СО, сокращает ся ПИ (особенно на 15-й день). При ведении АК в дозе, равной суточной потребно сти, изменений нет. 2. Ускорение ЛПО свинцом усугубляет сдвиги, вызванные де фицитом АК особенно на 15-й день. 3. Введение ДМ на фоне АК в объеме суточной потребности устраняет сдвиги.
Следовательно, прооксидант активирует тромбоциты, ускоряет ВТФ и ЛПО, снижая одновременно АОП. Антиоксидант, напротив, усиливает эффект АК, способ ствуя более полному устранению гемостатических сдвигов. Действие ДМ суммиру ется с действием АК не только на ЛПО и АОП, но и на гемостаз, хотя суммация и не является полной.
У крыс (табл. 6), изменения иные: 1. Добавление АК к С-авитаминному (казеи ново-крахмальному) рациону не изменило параметров гемостаза, ЛПО и АОП (вы явлено лишь некоторое замедление ЛПО и небольшой рост АОП). 2. При введении крысам свинца на фоне той же дозы АК растет активность тромбоцитов, содержание маркеров ВТФ и интенсивность ЛПО, снижаются АОП и толерантность к тромбину, однако, интенсивность сдвигов уменьшена. 3. При введении крысам ДМ одновре менно с АК в дозе, эквивалентной суточной потребности свинок, наблюдаются слабо выраженные изменения противоположной направленности. Изменения усиливаются при бльшей продолжительности опыта (к 15 дню).
Есть ли различия в степени изменений, вызываемых введением АК в составе С-ави таминного рациона, между животными синтезирующими и несинтезирующими ви тамин С, а также в реакции животных на введение свинца или ДМ? Сопоставляя сдвиги показателей, установленных у свинок и крыс в одинаковых по характеру экс периментах, мы нашли следующее (рис. 9):
Р-3 Р-4 ПДФ РКМФ Д-дим. СА АДФ-АГ ДК ТБК ПИ СО ТкТР 55 42 32 29 35 24 20 15 6 3107 9 98 675 15 - -8 - - - - - -45 -39 -40 - 7-й день 15-й день 7-й день 15-й день Морские свинки Крысы Рисунок 9. Степень изменения (относительно контроля, в %) активности тромбоцитов, у ровня маркеров ВТФ, ЛПО и АОП у морских свинок и крыс на 7-й и 15-й дни содержания на С-авитаминном рационе 1. При питании рационом без витамина С в течение 15 дней у крыс не изменяются показатели состояния гемостаза, ЛПО и толерантность к тромбину. 2. Введение в рацион АК в дозе, равной суточной потребности свинок, не приводит у крыс к сдви гам этих показателей (сдвиги на 0.5-1.6% статистически не подтверждаются - отме чены в таблицах как равные нулю). 3. Введение на фоне АК свинца вызвало актива цию тромбоцитов, рост уровня маркеров ВТФ, ускорение ЛПО, снижение АОП и то лерантности к тромбину уже к 7, и заметнее – к 15 дню, однако степень сдвигов у крыс в эти сроки менее выражена, чем у свинок.
4. Менее выражены у крыс в сравнении со свинками сдвиги, вызванные свинцом или димефосфоном.
Заключая, выделим основное.
У свинок, несинтезирующих витамин С, его дефицит в рационе сопровождается ускорением ЛПО и снижением АОП в тромбоцитах, ростом их агрегационной и «вы свобождающей» активности, ускорением непрерывного внутрисосудистого сверты вания крови (рост уровня маркеров ВТФ). Эти изменения усиливаются с увеличени ем длительности С-гиповитаминного кормления. У свинок, получавших С-ави таминный рацион, в течение первых двух недель перечисленные выше сдвиги более выражены, а к концу 3-й недели (т.е. при появлении явных признаков скорбута) на блюдается уменьшение сдвигов агрегационной и «высвобождающей» способности тромбоцитов при прогрессирующем росте уровня маркеров ВТФ.
Введение в составе С-авитаминного рациона АК в дозе, отвечающей суточной потребности свинок, предупреждает описанные изменения практически полностью.
Ограничиваются у них, но не устраняются полностью, вызываемые С-авитаминозом изменения, при введении ДФ (антиоксиданта невитаминной природы). В связи с этим можно считать, что гемостатические сдвиги при С-авитаминозе у свинок со пряжены с ускорением ЛПО и снижением АОП, однако, есть и другие механизмы развития гемостатических сдвигов. Наиболее вероятно, один из механизмов, обу словленных отсутствием витамина С в рационе, - нарушение формирования коллаге на, роль которого в поддержании целостности сосудистой стенки известна (дефицит витамина С сопровождается нарушением формирования коллагена, обусловливаю щим рост проницаемости сосудистой стенки, что в свою очередь может за счет уско ренного поступления в кровоток тканевого фактора интенсифицировать ВТФ, что проявляется повышением уровня маркеров этого процесса в кровотоке).
У крыс, синтезирующих витамин С, его отсутствие в рационе не сопровождает ся изменениями ЛПО и АОП - видимо, синтезирующийся в организме этих живот ных витамин С обеспечивает (естественно, наряду с другими компонентами антиок сидантной системы) обычную интенсивность ЛПО и обычные уровни АОП. Введе ние в С-авитаминный рацион таких животных дополнительного количества АК в до зе, соответствующей суточной потребности свинок, также не оказывает заметного влияния на активность тромбоцитов, ВТФ, ЛПО и АОП. Введение невитаминного антиоксиданта димефосфона одновременно с небольшой дозой АК проявляется в ор ганизме крыс небольшим ограничением ЛПО (менее заметным, чем у свинок).
ВЫВОДЫ 1. Пребывание на С-гиповитаминном рационе питания приводит у животных, не синтезирующих витамин С, к прогрессирующему ускорению липидпероксидации, снижению антиоксидантного потенциала, росту интенсивности взаимодействия тромбин-фибриноген и снижению толерантности к тромбину.
2. При появлении явных признаков скорбута (к концу 3-й недели С-авитаминного питания) у морских свинок агрегационная и «высвобождающая» способность тром боцитов уменьшается, но не достигает исходного уровня, а интенсивность ВТФ про должает увеличиваться на фоне нарастающей гипероксидации 3. У свинок при С-авитаминозе изменения взаимодействия тромбин-фибриноген и толерантности к тромбину предупреждаются аскорбиновой кислотой в дозе, рав ной суточной потребности, и неполностью ограничиваются антиоксидантом диме фосфоном (антиоксидантом невитаминной природы), устраняющим изменения ли пидпероксидации и антиоксидантного потенциала.
4. У животных, синтезирующих витамин С, аскорбиновая кислота в дозах, пре вышающих суточную потребность в 2-3 раза, сохраняет антиоксидантное действие, снижая интенсивность взаимодействия тромбин-фибриноген и повышая толерант ность к тромбину, а в бльшей дозе действует как прооксидант, ускоряя взаимодей ствие тромбин-фибриноген и снижая толерантность к тромбину.
5. Четырёхкратный избыток АК в рационе у свинок к концу 3-й недели оказывает прооксидантный эффект (активация ЛПО и снижение АОП), повышает активность тромбоцитов, ускоряет взаимодействие тромбин-фибриноген и снижает толерант ность к тромбину.
6. Введение антиоксиданта невитаминной природы усиливает, а введение проок сиданта снижает способность аскорбиновой кислоты ограничивать изменения интен сивности ВТФ и толерантности к тромбину, сопутствующие С-витаминной недоста точности у животных, не синтезирующих витамина С. У животных, синтезирующих аскорбиновую кислоту, эти эффекты менее выражены.
7. Прооксидантный эффект аскорбиновой кислоты у несинтезирующих витамина С животных, выражен заметнее при дозах, одинаковых в пересчете на массу тела.
… На основании полученных данных можно допустить, что влияние дефицита ви тамина С на непрерывное внутрисосудистое свертывание крови обусловлено не только его антиоксидантыми свойствами, но и другими метаболическими функция ми, в частности, участием витамина С в формировании коллагена и в сохранении ат ромбогенности эндотелия. Тот факт, что избыток витамина С ускоряет внутрисосу дистое свертывание крови, должен приниматься во внимание при назначениях больших доз аскорбиновой кислоты в терапии заболеваний с наклонностью к тром бообразованию.
Публикации по теме диссертации.
1.Влияние половых стероидов (этинилэстрадиолола и левоноргестрела) на взаимодействие тромбин-фибриноген в кровотоке /Ю.А.Рудзевич, Е.М.Шаповалов … Э.В.Багумян и др. // Теория и методология современного научного исследования Тюменского региона (сб. ста тей аспирантов и соискателей). Тюмень. - 2003. С.121- 2.Толерантность к тромбину при гипо-гипертиреозе и тиреотоксикозе /Г.А.Сулкарнаева, Е.М.Шаповалов, Э.В.Багумян и др.// Экологическое образование и здоровый образ жизни (Сб. матер. 2-й региональной научно-практ. конференции). - Сургут. - 2006. - С.. 147- 3.Влияние витаминов А,Е,С и Р., вводимых порознь и одновременно, на внутрисосудистое свертывание крови / А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, Э.В Багумян.и др. // Фундаментальные исследования. - 2007. - 1. - С. 4.Послеоперационные тромботические осложнения и их профилактика /А.Ш.Бышевский, В.А.Полякова, Е.А.Винокурова, Э.В.Багумян // Глава в книге «Гемостаз при оперативных вмешательствах в гинекологической практике». - М: Медицинская книга. - 2006. - С.74- 5.Влияние витамина Е на фибринолиз и общую свертываемость крови /Г.А.Сулкарнаева, С.В.Миневцев, О.З.Мустаев, Э.В.Багумян // Глава в книге «Витамины, внутрисосудистое свертывание крови и липидпероксидация». – М:Медицина. – 2006. – С.13- 6.Гемостатичесские эффекты витамина Р /Э.В.Багумян // Там же. – С.50- 7.Зависимость гемостаза от обеспеченности витамином С / А.Ю.Рудзевич, Э.В.Багумян, Е.М.Шаповалова, А.В.Шидин // Глава в кн. «Зависимость гемостаза от С-витамииной обес печенности организма». - М: Медицинская книга. 2007. - С 16-28.
8.Влияние аскорбиновой кислоты на липидпероксидацию и внутрисосудистое свертыва ние крови при гипероксидации /А.В.Багумян, А. Ю.Рудзевич, М.К.Умутбаева и др.// Глава в кн. «Зависимость гемостаза от С-витаминной обеспеченности организма». - М: Медицин ская книга. - 2007. - С 47- 9.Влияние дефицита витамина С на содержание в крови аскорбиновой кислоты, её погло тительную способность и на взаимодействие тромбин-фибриноген / Э.В.Багумян, П.Я.Шаповалов // Медицинская наука и образование Урала. - 2007. - 1. - С.7- 10.Соотношение между толерантностью к тромбину и плазменным содержанием маркеров взаимодействия тромбин-фибриноген / А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, … Э.В.Багумян и др. // Матер. конф. «Клиническая гемостазиология в сердечно-сосудистой хирургии» (с междуна родным участием). - Москва: НЦ ССХ им. А.Н.Бакулева РАМН. - 2007. - С.41- 11. Влияние половых стероидов (этинилэстрадиолола и левоноргестрела) на взаимодейст вие тромбин-фибриноген в кровотоке /Ю.А.Рудзевич, Е.М.Шаповалов … Э.В.Багумян и др. // Заочная электронная конференция «Доклиническая и клиническая апробация новых лекарственных средств. 15-20 октября 2006 г Использованные сокращения Оптическая плотность А………… АДФ-индуцируемая агрегация АДФ-АГ… Аскорбиновая кислота АК……….
антиоксидантный потенциал АОП…….
взаимодействие тромбин-фибриноген ВТФ……..
D-димеры D-Д……..
диеновые конъюгаты ДК……..
Димефосфон ДМ…….
липиды ЛП……..
липидпероксидация ЛПО…….
продукты деградации фибрина ПДФ…….
период индукции ПИ……… растворимые фибринмономерные комплексы РФМК…..
спонтанная агрегация СА……….
скорость окисления СО……….
ТБК (продукты, реагирующие с тиобарбитуровой кислотой) ТБК……..
фибриноген ФГ……….
фактор (факторы) Ф. (фф.)…...
-------------------------------------------------------------------------------------------- ВНУТРИСОСУДИСТОЕ СВЕРТЫВАНИЕ КРОВИ И ТОЛЕРАНТНОСТЬ К ТРОМБИНУ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ С-ВИТАМИННОЙ ОБЕСПЕЧЕННОСТИ ОРГАНИЗМА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук 03.00.04 – биохимия Подписано в печать «……….….» Тираж 100 экз.
Объем 1п.л. Формат 60х84/16. Заказ № Технический отдел ТГМА 625023, ул. Одесская,