Исследование процесса олигомеризации бактериальных l-аспарагиназ

На правах рукописи

Мезенцев Юрий Владимирович ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА ОЛИГОМЕРИЗАЦИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ L-АСПАРАГИНАЗ 03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2007

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича Российской академии медицинских наук доктор биологических наук, профессор

Научный консультант:

Иванов Алексей Сергеевич кандидат биологических наук

Официальные оппоненты:

Эльдаров Михаил Анатольевич доктор биологических наук, профессор Шумянцева Виктория Васильевна

Ведущая организация: Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет

Защита диссертации состоится «11» октября 2007 года в 14.00 часов на заседании Диссертационного совета Д 001.010.01 при Государственном учреждении Научно исследовательском институте биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича Российской академии медицинских наук по адресу 119121, г. Москва, ул. Погодинская, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения Научно исследовательского института биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича Российской академии медицинских наук

Автореферат разослан « » сентября 2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук Карпова Елена Анатольевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Бактериальные КФ L-аспарагиназы (L-аспарагинамидогидролаза 3.5.1.1) используются в терапии опухолевых заболеваний и считаются одним из самых эффективных средств при лечении острого лимфобластного лейкоза. Объектом действия L-аспарагиназы является периплазматический ее главный субстрат. Снижение L-аспарагин, периплазматической концентрации L-аспарагина приводит в результате к снижению его количества внутри клетки. В отличие от нормальных клеток в лейкозных клетках экспрессия L-аспарагинсинтетазы выражена слабо или отсутствует вовсе. Поэтому опухолевые клетки не могут отреагировать адекватно на снижение внутриклеточного уровня L-аспарагина, в то время как в нормальных клетках уровень L-аспарагина своевременно восполняется. В свою очередь нехватка этой аминокислоты приводит к ингибированию белкового синтеза в клетке, что в итоге вызывает ее апаптоз. Более того, L-аспарагиназа действует исключительно в периплазматическом пространстве без проникновения внутрь клетки, что принципиально отличает механизм ее действия от прочих противоопухолевых препаратов (Тимаков А.М. и др., 2003).

Однако продолжительная терапия с использованием препаратов бактериальных L-аспарагиназ сопровождается большим количеством побочных эффектов вплоть до развития анафилактического шока. С учетом токсического действия разных препаратов бактериальных L-аспарагиназ к клиническому применению в настоящее время допущены лишь две L-аспарагиназы бактериального происхождения, а именно L-аспарагиназы из Esherichia coli и Erwinia chrysanthemi. Согласно общепринятому мнению, токсический эффект бактериальных L-аспарагиназ является следствием проявления этими ферментами глутаминазной активности. Другой причиной токсического эффекта бактериальных L-аспарагиназ по мнению ряда исследователей является -аспартилпептидная активность этих ферментов (Kelo E. et al., 2002). Более того, считается, что белки с из-за мультисубъединичной структуры бактериальные L-аспарагиназы вызывают аллергическую реакцию у пациентов в процессе энзимотерапии их препаратами (Goodsell D.S., 2005).

Большинство бактериальных L-аспарагиназ является гомотетрамером с четырьмя активными центрами. Если учесть тот факт, что их активный центр формируется в области контакта между двумя субъединицами, то очевидна роль олигомеризации L-аспарагиназы в процессе формирования ее активных центров и, как следствие, в ее субстратной специфичности. Димер L-аспарагиназы, имея два активных центра, не способен расщеплять L-аспарагин, и лишь только тетрамер L-аспарагиназы обладает такой активностью (Ehrman M. et al., 1971;

Kotzia G.A. et al., 2005;

Kozak M. et al., 2000;

Krasotkina J. et al., 2004;

Lubkowski J. et al., 2003;

Marlborough D.I. et al., 1975;

Shifrin S. et al., 1974).Несмотря на широкий интерес, проявляемый на протяжении многих лет к L-аспарагиназе, в литературе практически отсутствуют какие либо данные по олигомеризации этого фермента.

На сегодняшний день существует множество доступных методов, с помощью которых возможно исследование белок-белковых взаимодействий и, в частности, олигомеризации мультисубъединичных белков. Многие экспериментальные подходы позволяют регистрировать белок-белковые взаимодействия в широком диапазоне концентраций, однако не все дают возможность оценивать стехиометрию образующихся комплексов.

Существуют также биоинформационные подходы, позволяющие предсказывать возможность белок-белковых взаимодействий, оценивать устойчивость образующихся белковых комплексов, определять специфические контактные участки в белок-белковых взаимодействиях и т.д.

Совместное использование экспериментальных и биоинформационных методов дает возможность более эффективно решать различные задачи, направленные на исследование белок-белковых взаимодействий и, в частности, процесса олигомеризации мультисубъединичных белков.

Цель и задачи исследования Цель работы состояла в определении молекулярных основ и специфичности белок-белковых взаимодействий при олигомеризации бактериальных L-аспарагиназ.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Построить модели пространственных структур L-аспарагиназ Erw. carotovora, Helicobacter pylori J99 и Helicobacter pylori 26695, а также модели химерных тетрамеров, образующихся в экспериментах по исследованию специфичности процесса олигомеризации бактериальных L-аспарагиназ.

2. Выполнить сравнительный молекулярно-графический анализ области контакта между субъединицами для L-аспарагиназ из Erwinia carotovora и Erw. chrysanthemi и для моделей химерных тетрамеров.

3. Разработать методику иммобилизации, диссоциации и восстановления олигомерной структуры бактериальных L-аспарагиназ на поверхности оптического чипа для экспериментального изучения олигомеризации данных ферментов с помощью технологии оптического биосенсора.

Оценить специфичность процесса олигомеризации бактериальных 4.

L-аспарагиназ с помощью оптического биосенсора Biacore 3000.

Научная новизна работы Впервые был исследован процесс олигомеризации бактериальных L-аспарагиназ с помощью комбинации методов молекулярного моделирования и технологии оптического биосенсора.

Были построены модели тетрамеров L-аспарагиназ из H. pylori J99 и H. pylori 26695, для которых на данный момент отсутствуют кристаллографические данные.

Для L-аспарагиназ из E. coli и из Erw. carotovora были определены ключевые аминокислотные остатки контактных областей субъединиц, определяющие стабильность тетрамерного комплекса L-аспарагиназы.

Практическая значимость исследования Результаты, полученные в работе, могут служить основой для разработки модифицированных форм L-аспарагиназ. С одной стороны, тетрамеры модифицированных L-аспарагиназ могут быть более устойчивыми в плазме крови человека, что означает пролонгированное действие препарата, и, как следствие, позволяет снижать его лечебные дозы, вводимые пациентам. С другой стороны, разработка новых препаратов L-аспарагиназ может идти по пути снижения молекулярного веса активной формы этого белка, т.е. за счет получения активных димеров, не агрегирующих в комплексы более высокого порядка, что значительно снизит иммунную реакцию организма пациента.

Разработанная методика иммобилизации и мониторинга процессов диссоциации и олигомеризации бактериальных L-аспаргиназ в дальнейщем может быть успешно использована в работах с другими олигомерными белками.

Апробация работы Основные результаты диссертационной работы были доложены на международной школе-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия» (Москва, 2005), на V Международной конференции «Bioinformatics of genome regulation and structure» (Новосибирск, 2006), на научной конференции ГУ НИИ биомедицинской химии РАМН (Москва, 2007). По материалам диссертации опубликовано 3 статьи.

Структура и объем диссертации Диссертационная работа состоит из введения, 4-х глав обзора литературы, главы «Материалы и методы», 11-и глав раздела «Результаты и их обсуждение», выводов и списка цитируемой литературы, включающего 202 источника. Работа изложена на 113 страницах текста, содержит 31 рисунок и 20 таблиц.

Исследование выполнено на базе ГУ НИИ БМХ РАМН при финансовой поддержке РФФИ (гранты 04-04-49085 и 07-04-00575).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Экспериментальная часть Реагенты.

1) Следующие растворы и реагенты были получены от Biacore (Швеция):

- HBS-буфер (150 мМ NaCl, 3 мМ ЭДТА, 0,005% сурфактанта P20, 10 мМ HEPES, pH 7,4);

- 10 мМ ацетатный буфер, pH 4,5;

- 10 мМ глицин-HCl, pH 2,5;

- набор реагентов для ковалентной иммобилизации лигандов за первичные аминогруппы: EDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорид), NHS (N-гидроксисукцинимид), этаноламин-HCl.

2) L-аспарагиназы Erw. carotovora, H. pylori J99 и H. pylori 26695 (чистоты препаратов более 95 %), любезно предоставленые к.б.н. Красоткиной Ю.В. (ГУ НИИ БМХ РАМН, Москва).

3) L-аспарагиназа E. coli (Medac, Германия).

4) L-аспарагиназа Erw. chrysanthemi (Sigma).

Эксперименты по изучению процесса олигомеризации L-аспарагиназы Erw. carotovora.

Эксперименты были выполнены на оптическом биосенсоре Biacore 3000 (Biacore, Швеция), использующем эффект поверхностного плазмонного резонанса для регистрации межмолекулярных взаимодействий (Myszka D.G. et al., 1997;

Jonsson U. et al., 1991). В работе использовали стандартные оптические чипы СМ5 с карбоксиметилдекстрановым покрытием.

Иммобилизация L-аспарагиназы Erw. carotovora на поверхности оптического чипа СМ5.

Карбоксиметилированный декстран на поверхности чипа СМ5 был активирован путем инъекции смеси 0,2 М EDC /0,05 М NHS в течение 10 мин при скорости 1 мкл/мин с последующей промывкой HBS-буфером при той же скорости в течение 3 мин. Затем была выполнена иммобилизация L-аспарагиназы. Иммобилизация проходила по боковым аминогруппам остатков лизина и N-концевой аминокислоты, расположенных на поверхности (рис. 1), путем пропускания раствора белка (5 мкг/мл) в иммобилизационном буфере (10 мМ ацетатный буфер, pH 4,5) в течение 10 мин при скорости потока 1 мкл/мин. Далее через измерительную кювету пропускался раствор этаноламина (1 М) для инактивации непрореагировавших эфирных групп на поверхности чипа. После иммобилизации L-аспарагиназы пропускание через измерительную кювету рабочего буфера (HBS-буфер) приводит к постепенному снижению уровня сигнала биосенсора. Возможной причиной этого снижения может быть диссоциация иммобилизованных тетрамеров белка. Если в процессе диссоциации тетрамеров L-аспарагиназы приостановить ток рабочего буфера, наблюдается остановка дрейфа сигнала, что может быть обусловлено быстрым установлением равновесия сильно смещенным в сторону тетрамеров. При (тетрамердимермономер), возобновлении тока буфера распад продолжается с уровня сигнала на момент остановки.

Поэтому на оптическом чипе иммобилизуются преимущественно тетрамеры белка. Далее карбоксильные группы декстрана, активированные EDC/NHS, но не прореагировавшие с L-аспарагиназой, были блокированы путем инъекции 1 М этаноламина (pH 8,5) в течение мин при скорости потока 1 мкл/мин, после чего следовала промывка рабочим буфером.

Количество иммобилизованного белка составило 7800 RU, что соответствует примерно 7, нг белка/мм2 поверхности. Схема иммобилизации представлена на рисунке 1.

Рисунок 1. Схема иммобилизации L-аспарагиназы Erw. carotovora на карбоксиметилдекстрановой поверхности чипа СМ5. Стрелками обозначены следующие добавки: 1 - 0,2 М EDC /0,05 М NHS, 2 - HBS-буфер, 3 - раствор L-аспарагиназы (5 мкг/мл) в 10 мМ ацетатном буфере (pH 4,5), 4 - 1 М раствор этаноламина (pH 8,5), Им - количество иммобилизованного белка.

Ускорение процесса диссоциации иммобилизованной L-аспарагиназы достигалось за счет пропускания глицинового буфера (pH 2,5).

Олигомеризация L-аспарагиназы, иммобилизованной на поверхности оптического чипа, осуществлялась путем пропускания растворов L-аспарагиназы в иммобилизационном буфере.

Эксперименты по изучению специфичности процесса олигомеризации бактериальных L-аспарагиназ.

Для оценки специфичности процесса олигомеризации бактериальных L-аспарагиназ в разных каналах были иммобилизованы L-аспарагиназы из E. coli, H. pylori J99 и H. pylori 26695. Иммобилизованные L-аспарагиназы диссоциировали на субъединицы, после чего через каналы пропускались растворы следующих L-аспарагиназ:

- L-аспарагиназа из E. coli (50 мкг/мл), - L-аспарагиназа из H. pylori J99 (250 мкг/мл), - L-аспарагиназа из Erw. chrysanthemi (50 мкг/мл), - L-аспарагиназа из H. pylori 26695 (250 мкг/мл).

Биоинформационная часть Исходные данные для молекулярного моделирования.

• Аминокислотные последовательности L-аспарагиназ Erw. carotovora (Q6Q4F4), H. pylori J99 (Q9ZLB9) и H. pylori 26695 (O25424) были взяты на протеомном сервере ExPASy (Kotzia G.A. et al., 2005;

Bell K.S. et al., 2004;

Apweiler R. et al., 2004).

• Аминокислотные последовательности с известными L-аспарагиназ кристаллическими структурами из разных источников (E. coli, Wolinella succinogenes, Pseudomonas 7A, Erw. chrysanthemi, Erw. carotovora) были взяты из соответствующих файлов белкового банка данных Protein Data Bank (PDB) (Berman H.M. et al., 2000) (PDB индексы:

3ECA (Swain A.L. et al., 1993), 1WSA (Lubkowski J. et al., 1996), 4PGA (Jakob C.G. et al., 1997), 1O7J (Lubkowski J. et al., 2003), 1ZCF (Кислицын Ю.А. и др., 2006)).

• Трехмерные координаты кристаллических структур L-аспарагиназ Erw.

chrysanthemi, W. succinogenes, E. coli были получены из банка данных PDB (PDB индексы:

1O7J (Lubkowski J. et al., 2003), 1HG1 (Aghaiypour K. et al., 2001), 1HFW (Aghaiypour K. et al., 2001), 1HG0 (Aghaiypour K. et al., 2001), 1HFJ (Jaskolski M. et al., 2001), 1HFK (Jaskolski M. et al., 2001), 3ECA (Swain A.L. et al., 1993), 1WSA (Lubkowski J. et al., 1996)).

Использованное программное обеспечение.

• Сигнальная участок в аминокислотной последовательности фермента был определен с помощью программы SignalP 3.0 Server (Bendtsen J.D. et al., 2004).

• Множественное выравнивание последовательностей L-аспарагиназ из разных источников (Erw. carotovora, Erw. chrysanthemi, W. succinogenes, Pseudomonas 7A, E. coli, H.

pylori J99 и H. pylori 26695) было выполнено с помощью программы ClustalW 1.83 (Higgins D. et al., 1994).

• С целью определения аминокислотных остатков, образующих интерфейс между субъединицами в тетрамере L-аспарагиназы и выявления среди них значимых был выполнен анализ зоны контакта между мономерами с помощью виртуального аланинового сканирования на сервере Robetta (Kortemme T. et al., 2004). Для этого каждый аминокислотный остаток поочередно заменяли на аланин и оценивали изменение энергии взаимодействия между субъединицами в результате замены по уравнению, приведенному в общем виде (Kortemme T. et al., 2004):

EA/B = (EA/B - EA - EB) - (E’A/B - E’A - E’B), где: EA/B – изменение энергии связывания между партнерами белок-белкового взаимодействия до и после замены;

EA/B – свободная энергия комплекса дикого типа;

EA – свободная энергия белка-партнера A дикого типа;

EB – свободная энергия белка-партнера B дикого типа;

E’A/B – свободная энергия комплекса мутантного типа;

E’A – свободная энергия белка-партнера A мутантного типа;

E’B – свободная энергия белка-партнера B мутантного типа.

• Следующие процедуры были выполнены с помощью программного комплекса Sybyl 6.9.1 (Tripos Inc.) на сервере SGI Origin200 с использованием поля сил Tripos и расчетом зарядов по методу Gasteiger-Huckel:

Моделирования трехмерной структуры L-аспарагиназ Erw. carotovora, H. pylori J99 и H.

pylori 26695.

Для этого с помощью программы SignalP 3.0 Server был выполнен анализ последовательностей данных L-аспарагиназ, полученных с протеомного сервера ExPASy, после чего установленный сигнальный фрагмент был удален. Далее с помощью множественного выравнивания аминокислотных последовательностей был выполнен поиск ближайших гомологов среди L-аспарагиназ с известной трехмерной структурой. Выбранные для моделирования гомологи и аминокислотные последовательности моделируемых L-аспарагиназ использовались в программе Composer. В белках программой определялись области близкие между собой по аминокислотной последовательности, которые позднее укладывались по аналогии с гомологичными структурами. Для негомологичных фрагментов в последовательности моделируемого белка выполнялся поиск гомологичных структур по базе программы. Далее полученный мономер оптимизировался путем минимизации свободной энергии. В результате четыре копии построенного в Composer мономера совмещались с соответствующими мономерами в гомологичной L-аспарагиназы L-аспарагиназе.

Оптимизация молекулярных моделей и моделирование молекулярной динамики структуры L-аспарагиназы.

Минимизация энергии моделей L-аспарагиназы была выполнена по методу Powell с максимальным числом итераций 600. Моделирование молекулярной динамики трехмерных моделей L-аспарагиназ было выполнено в вакууме при постоянной температуре 300°К с продолжительностью 20 пс и шагом 1 фс.

Оценка энергии межсубъединичного взаимодействия.

Энергию взаимодействия между мономерами и димерами вычисляли по формуле:

E = EAB – (ЕA + EB), где: E – энергии взаимодействия партнера A с партнером B;

EAB – энергия комплекса;

EA – энергия партнера А;

EB – энергия партнера В.

Моделирование химерных тетрамеров L-аспарагиназ.

Модели химерных тетрамеров были получены в результате замены субъединицы A на соответствующую субъединицу L-аспарагиназы другого вида.

• Валидация полученных моделей была выполнена с помощью карт Рамачандрана, построенных в программе PROCHECK 3.4.4 (Laskowski R.A. et al., 1993) и сравнительного анализа структур L-аспарагиназ с помощью программы LGA (ver. 03/2003) на сайте Protein Structure Prediction Center (Zemla A., 2003).

• С помощью программного пакета Amber 7 с использованием поля сил Amber выполнялась оптимизация моделей химерных тетрамеров L-аспарагиназ (Case D.A. et al., 2004). Для этого в программе LEaP подготавливались файлы координат и топологии для всех оптимизируемых структур. Далее в программе SANDER для химерных тетрамеров выполнялись минимизация энергии и моделирование молекулярной динамики в водном боксе при постоянном объеме и температуре 300 °K с продолжительностью 20000 фс и шагом 50 фс.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Иммобилизация L-аспарагиназы из Erw. carotovora и мониторинг процессов ее диссоциации и олигомеризации.

L-аспарагиназа из Erw. carotovora была иммобилизована в одном из каналов оптического биосенсора по методике, описанной в разделе «Материалы и методы». В качестве контроля использовался канал с декстраном без иммобилизованного белка. После иммобилизации L-аспарагиназы наблюдался процесс распада тетрамеров фермента при длительном пропускании HBS-буфера через измерительную кювету (рис. 2). Через несколько дней уровень сигнала биосенсора снизился примерно в 4 раза. Если учесть, что в препаратах L-аспарагиназы отсутствуют примеси протеолитических ферментов, можно предположить, что четырехкратное снижение уровня сигнала прибора свидетельствует о распаде тетрамеров до мономеров. При пропускании 10 мМ раствора глицин-HCl (pH 2,5) скорость снижения сигнала резко возрастала, что указывает на увеличение интенсивности распада тетрамеров, что связано со снижением устойчивости олигомерного состояния L-аспарагиназы при данном значении pH (Sidney Shifrin et al., 1974). Восстановление тетрамеров L-аспарагиназы на поверхности оптического чипа осуществлялось путем пропускания раствора L-аспарагиназы в иммобилизационом буфере (10 мМ ацетатный буфер, pH 4,5), что приводило к резкому повышению концентрации белка на поверхности чипа за счет электростатического притяжения положительно заряженного белка с отрицательно заряженной поверхностью чипа. В растворе L-аспарагиназы существует равновесие тетрамердимермономер. При пропускании раствора через измерительную кювету оптического биосенсора происходит захват иммобилизованными мономерами субъединиц L-аспарагиназы из раствора до полного восстановления тетрамеров, что сопровождается увеличением уровня сигнала биосенсора. После промывки HBS-буфером уровень сигнала биосенсора возрастал в 4 раза, что свидетельствует о произошедшей олигомеризации фермента с восстановлением его тетрамерной формы (рис. 3). Эксперименты по разрушению тетрамеров L-аспарагиназы до мономеров с последующим их восстановлением удавалось многократно повторять на одном оптическом чипе.

Рисунок 2. Самопроизвольный распад тетрамеров L-аспарагиназы при пропускании HBS-буфера (скорость потока 1 мкл/мин).

Рисунок 3. Распад тетрамеров L-аспарагиназы при пропускании 10 мМ раствора глицин-HCl (pH 2,5) (скорость потока 1 мкл/мин) и последующая олигомеризация фермента при пропускании раствора L-аспарагиназы в 10 мМ ацетатном буфере (pH 4,5) (скорость потока 1 мкл/мин).

Моделирование L-аспарагиназы из Erw. carotovora.

Для того чтобы оценить ориентацию тетрамеров L-аспарагиназы на поверхности оптического чипа и характер связывания с карбоксиметилированным декстраном, необходимо было предварительно проанализировать поверхность белка на возможные места связывания. Однако на момент выполнения работы кристаллическая структура L-аспарагиназы из Erw. carotovora еще была неизвестна (кристаллографические данные с разрешением 3 для структуры L-аспарагиназы из Erw. carotovora были опубликованы в PDB только 18.04.06, PDB индекс 1ZCF (Кислицын Ю.А. и др., 2006)), поэтому первоочередной задачей было создание компьютерных трехмерных моделей мономера и тетрамера данного фермента.

Моделирование пространственной структуры L-аспарагиназы из Erw. carotovora и ее оптимизация были выполнены по методике, описанной в разделе материалы и методы. Было установлено, что ближайшим гомологом L-аспарагиназы из Erw. carotovora является L-аспарагиназа из Erw. chrysanthemi. Оптимизированная модель тетрамера L-аспарагиназы Erw. carotovora представлена на рисунке 4.

A C BB D Рисунок 4. Схематичное изображение мономера L-аспарагиназы (а) и тетрамера (б) L-аспарагиназы (субъединицы обозначены A, B, C, D и отображены разными оттенками серого).

Валидация полученных моделей L-аспарагиназ Адекватность полученной виртуальной модели L-аспарагиназы из Erw. carotovora была проверена путем построения и анализа карт Рамачандрана (рис. 5) в программе ProCheck и с помощью сравнительного анализа в программе LGA (табл. 2). Результаты программы ProCheck представлены в таблице 1. Карты Рамачандрана были построены для каждой субъединицы фермента. В виду идентичности полученных карт для всех четырех субъединиц на рисунке 5 приведена карта Рамачандрана для субъединицы А. На картах для L-аспарагиназ из Erw. carotovora и Erw. chrysanthemi значения углов всех аминокислотных остатков укладываются в допустимых зонах, исключением является треонин 204. Однако это исключение имеет место в обеих L-аспарагиназах. Остаток треонина 204 для бактериальных L-аспарагиназ является консервативным. Более того, такая аномальная конформация этого остатка присутствует и в других бактериальных L-аспарагиназах (Swain A.L. et al., 1993;

Lubkowski J. et al., 1994a;

1994b;

1996;

2003). Треонин 204 расположен в самом начале линкерного участка, соединяющего между собой C-концевой и N-концевой домены. Данная область белка характеризуется высокой подвижностью в сравнении с доменной частью. Тем не менее, отклонения в значениях атомных координат для самого треонина 204 и его ближайшего окружения между мономерами не превышает 0,15, что подтверждает консервативность данного участка бактериальных L-аспарагиназ. Треонин 204 находясь лишь только в такой конформации, способен образовывать 5 водородных связей, подобная стабилизация может энергетически компенсировать стерически невыгодную ориентацию треонина 204 (Lubkowski J. et al., 2003).

Рисунок 5. Карты Рамачандрана для L-аспарагиназы Erw. carotovora (слева) и Erw.

chrysanthemi (справа). Пространство карты разбито на четыре основные зоны:

предпочитаемая (темно-серая), разрешенная (серая), допустимая (светло-серая) и запрещенная (белая).

Таблица 1. Результаты анализа структуры L-аспарагиназ из Erw. carotovora и Erw.

chrysanthemi, выполненного в программме ProCheck Зоны карты Предпочитаемая Разрешенная Допустимая Запрещенная Рамачандрана L-аспарагиназа из 86,7% 12,6% 0,4% 0,4% Erw. carotovora L-аспарагиназа из 83,2% 15,8% 0,7% 0,4% Erw. chrysanthemi Поскольку позднее в белковом банке данных PDB появилась кристаллическая структура L-аспарагиназы из Erw. carotovora (PDB индекс: 1ZCF (Кислицын Ю.А. и др., представлялось актуальным сравнение построенной компьютерной модели 2006)), L-аспарагиназы из Erw. carotovora с ее кристаллической структурой. Величина RMSD и значения попарных расстояний между C атомами в мономерах при наложении одной структуры на другую представлены на рисунке 6. Полученные результаты указывают на достоверное предсказание трехмерной структуры L-аспарагиназы из Erw. carotovora, что обусловлено высокой степенью гомологии с белком-образцом (L-аспарагиназа из Erw.

chrysanthemi). Таким образом, использование компьютерного моделирования по гомологии является целесообразным при отсутствии трехмерных структур L-аспарагиназ.

Таблица 2. Сравнительный анализ структур L-аспарагиназы из Erw. carotovora и Erw.

chrysanthemi.

N1 N2 DIST N RMSD Seq_Id LGA_S LGA_Q SUMMARY (LGA) 1308 1300 5,0 1300 0,99 78,46 96,686 119, Примечание. Сравнительный анализ был выполнен с использованием программы LGA.

Все параметры программы приняты по умолчанию. N1 – количество остатков аминокислот L-аспарагиназы из Erw. carotovora;

N2 – количество остатков аминокислот L-аспарагиназы из Erw. chrysanthemi;

DIST – порог отсечения;

N – количество совпадающих аминокислот при заданном пороге отсечения;

RMSD – среднеквадратичное отклонение, рассчитанное для совпадающих аминокислот;

Seq_Id – показатель гомологичности между собой аминокислотных последовательностей;

LGA_S – оценка пространственного соответствия структур L-аспарагиназы из Erw. carotovora и L-аспарагиназы из Erw. chrysanthemi с учетом числа аминокислотных остатков в последней;

LGA_Q – качественная оценка, рассчитанная по формуле: Q=0,1•N/(0,1+RMSD).

RMSD 0, RMSD 0, Рисунок 6. Оценка попарных расстояний между C атомами в субъединице A у компьютерной модели и кристаллической структуры L-аспарагиназы из Erw. carotovora (жирная линия);

кристаллических структур L-аспарагиназ из Erw. carotovora и Erw.

chrysanthemi (тонкая линия).

Анализ поверхности для предсказания ориентации тетрамеров фермента на поверхности чипа.

Структурно-графический анализ поверхности белка и визуальная оценка позволили определить наиболее доступные аминогруппы для связывания с карбоксиметилированным декстраном. NH2-группы лизина и N-концевой аминокислоты должны быть ориентированы по отношению к поверхности связывания определенным образом и находиться в доступной области на поверхности белка, что стерически затрудняет иммобилизацию L-аспарагиназы сразу в нескольких местах. Поэтому иммобилизация тетрамера осуществляется преимущественно за одну субъединицу.

Оценка энергии взаимодействия между димерами AC и BD, а также между субъединицами в этих димерах (Erw. chrysanthemi и Erw. carotovora).

С целью выявления важных элементов для олигомеризации бактериальных был выполнен структурно-графический анализ полученной модели L-аспарагиназ L-аспарагиназы из Erw. carotovora и кристаллической структуры L-аспарагиназы из Erw.

chrysanthemi. Главным образом внимание уделялось интерфейсу между димерами AC и BD в тетрамерах этих L-аспарагиназ и между мономерами в этих димерах.

Для выявления типа межмолекулярных взаимодействий, вклад которых в устойчивость тетрамерного комплекса бактериальных L-аспарагиназ превалирует, была выполнена оценка энергии межсубъединичных взаимодействий между димерами AC и BD и соответствующими мономерами A и C, B и D. В таблице 3 показаны результаты оценки вклада различных видов межсубъединичного взаимодействия в общую энергию взаимодействия между димерами AC и BD и мономерами в этих димерах для L-аспарагиназ из Erw. carotovora и Erw. chrysanthemi. Для этого были оценены значения общей энергии, энергии Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий и энергии электростатических взаимодействий тетрамера каждой L-аспарагиназы, а также значения соответствующих видов энергий для димеров AC и BD. После чего по формуле, приведенной в разделе «Материалы и методы», были рассчитаны величины энергетических вкладов различных видов межмолекулярного взаимодействия в образование тетрамера L-аспарагиназы (табл. 3). Таким же образом были оценены значение общей энергии взаимодействия между мономерами, образующими димеры и а также вклады электростатических и Ван-дер-Ваальсовых AC BD, взаимодействий между этими мономерами в общую энергию их взаимодействия (табл. 3).

Таблица Оценка значений энергии различных видов межмолекулярных 3.

взаимодействий между субъединицами и димерами в L-аспарагиназе.

Erw. chrysanthemi Erw. carotovora AC_BD A_C B_D AC_BD A_C B_D E, ккал/моль -1255 -565 -591 -1111 -583 - E1, ккал/моль -285 -212 -218 -275 -214 - E2, ккал/моль -969 -353 -373 -837 -369 - Примечание. Значения энергии взаимодействий были рассчитаны с помощью программного комплекса Sybyl 6.9.1. E - общая энергия взаимодействия;

E1 - энергия Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий;

E2 - энергия электростатических взаимодействий.

Определение аминокислотных остатков, образующих интерфейс между димерами AC и BD в тетрамере L-аспарагиназы Erw. carotovora.

Для оценки вклада различных аминокислот, формирующих область контакта между двумя димерами AC и BD в L-аспарагиназе из Erw. carotovora, было выполнено виртуальное аланиновое сканирование данного интерфейса. В результате анализа были установлены аминокислотные остатки, формирующие интерфейс между димерами AC и BD и выявлены среди них значимые путем отбора по значению энергетического эффекта, вносимого ими в процесс комплексообразования. За значимые авторы программы рекомендуют принимать аминокислотные остатки, EABCD для которых больше 1 ккал/моль (Kortemme T. et al., 2004).

Как было установлено контактную область между димерами AC и BD образует примерно по 41 аминокислотному остатку от каждой субъединицы. Результаты виртуального аланинового сканирования показали, что в каждой субъединице в области контакта между димерами примерно 13 аминокислотных остатков играют ключевую роль во взаимодействие между димерами AC и BD, большинство из которых относится к остаткам заряженного типа:

аргинин (R122, R159, R198), аспартат (D158, D175) и глутамат (E181, E182). Эти заряженные аминокислотные остатки в интерфейсе между димерами образуют около 8 солевых мостиков, тем самым, обеспечивая высокую стабильность тетрамера L-аспарагиназы. Таким образом, результаты виртуального аланинового сканирования показали, что в тетрамере из между димерами и преобладает L-аспарагиназы Erw. carotovora AC BD электростатическое взаимодействие, что согласуется с данными, приведенными в таблице 3.

Дополнительно для стабилизации тетрамера в контактной области между димерами AC и BD может образовываться около 67 водородных связей.

Результаты, полученные в экспериментах по изучению олигомеризации L-аспарагиназы из Erw. carotovora, подтверждают сделанное заключение, что наибольший вклад в стабилизацию тетрамерного комплекса L-аспарагиназы из Erw. carotovora вносят электростатические взаимодействия типа «солевой мостик», а также водородные связи, образованные в контактной области между димерами AC и BD. В условиях низких значений pH наблюдается быстрая диссоциация тетрамеров L-аспарагиназы на субъединицы, что связано с протонированием отрицательно заряженных групп в области контакта между субъединицами и нарушением водородных связей. Быстрый распад тетрамеров L-аспарагиназы наблюдается также в диапазоне высоких значений pH, что согласуется с литературными данными (Cammack K.A. et al., 1972).

Экспериментальная оценка специфичности процесса олигомеризации бактериальных L-аспарагиназ.

Учитывая выше сказанное, а именно присутствие солевых мостиков в интерфейсе между димерами AC и BD, разумно было бы предположить обязательное наличие электростатической комплементарности между этими димерами. Из чего следует, что даже небольшие смещения в расположении аминокислотных остатков интерфейса, участвующих в образовании солевых мостиков, может приводить к нарушению последних и как результат к снижению общей устойчивости тетрамеров L-аспарагиназы. Таким образом, было интересно оценить специфичность процесса олигомеризации бактериальных L-аспарагиназ. Для этого на оптическом биосенсоре Biacore 3000 были выполнены эксперементы, в ходе которых в разных каналах были иммобилизованы L-аспарагиназы из E. coli, H. pylori J99 и H. pylori 26695. В качестве контроля использовался канал с декстраном без иммобилизованного белка.

Все белки были иммобилизованы по методике, описанной в разделе «Материалы и методы». Диссоциация всех белков осуществлялась путем пропускания глицинового буфера (pH 2,5), согласно методике. Специфичность олигомеризации бактериальных L-аспарагиназ оценивалась по изменению сигнала биосенсора при пропускании растворов L-аспарагиназ разных видов через измерительную кювету с иммобилизованной L-аспарагиназой.

При пропускании растворов бактериальных на поверхности L-аспарагиназ оптического чипа не наблюдается неспецифичного связывания из L-аспарагиназ пропускаемых растворов, о чем свидетельствует отсутствие значительных изменений уровня сигнала биосенсора в контрольном канале.

При пропускании растворов L-аспарагиназ через канал с иммобилизованной L-аспарагиназой из E. coli было зарегистрировано повышение сигнала оптического биосенсора на 5000 RU для раствора самой L-аспарагиназы из E. coli. Во всех остальных случаях уровень сигнала оставался без существенных изменений, что говорит о высокой избирательности L-аспарагиназы из E. coli в процессе ее олигомеризации (рис. 7). В тоже время это подтверждает предположение сделанное выше, что снижение уровня сигнала биосенсора при пропускании HBS-буфера или глицин-HCl буфера после иммобилизации L-аспарагиназы связанно с диссоциацией L-аспарагиназы на субъединицы.

При пропускании растворов L-аспарагиназ через канал с иммобилизованной L-аспарагиназой из H. pylori J99 также наблюдалось повышение сигнала биосенсора, однако в данном случае связывание было зарегистрировано для двух растворов L-аспарагиназ (рис.

8). При пропускании раствора L-аспарагиназы из H. pylori J99 наблюдалось повышение сигнала биосенсора примерно на 5500 RU. Немного меньше примерно на 4500 RU было зарегистрировано увеличение уровня сигнала при пропускании раствора L-аспарагиназы из H. pylori 26695. Это легко можно объяснить, если учесть, что гомология между двумя этими белками составляет 93%, и области межсубъединичного интерфейса, обеспечивающие узнавание других партнеров олигомеризации, высоко консервативны для этих L-аспарагиназ.

Изменение уровня сигнала биосенсора, RU 1 2 3 Рисунок 7. Регистрация связывания L-аспарагиназ из пропускаемых растворов на поверхности чипа в канале с иммобилизованной L-аспарагиназой из E. coli. Столбцы контроля окрашены в серый цвет. Номерами обозначены: L-аспарагиназа из H. pylori J99 (1), L-аспарагиназа из H. pylori 26695 (2), L-аспарагиназа из E. coli (3), L-аспарагиназа из Erw.

chrysanthemi (4).

Изменение уровня сигнала биосенсора, RU 1 2 Рисунок 8. Регистрация связывания L-аспарагиназ из пропускаемых растворов на поверхности чипа в канале с иммобилизованной L-аспарагиназой из H. pylori J99. Столбцы контроля окрашены в серый цвет. Номерами обозначены: L-аспарагиназа из H. pylori J99 (1), L-аспарагиназа из H. pylori 26695 (2), L-аспарагиназа из E. coli (3).

Также, как в случае с иммобилизованной L-аспарагиназой из H. pylori J99, при пропускании растворов L-аспарагиназ из H. pylori J99 и H. pylori 26695 через канал с иммобилизованной L-аспарагиназой из H. pylori 26695 было зарегестрировано повышение сигнала оптического биосенсора примерно на 4000 RU и 6000 RU, соответственно (рис. 9).

При пропускании растворов L-аспарагиназы из E. coli значительных изменений в уровне сигнала биосенсора не наблюдалось.

По результатам, полученным в ходе эксперимента, можно предположить, что процесс олигомеризации бактериальных L-аспарагиназ высоко специфичен. Взаимодействие между субъединицами разных L-аспарагиназ не приводит к образованию устойчивых комплексов.

Лишь L-аспарагиназы высокогомологичные по аминокислотной последовательности, и значимые аминокислотные остатки интерфейса которых высоко консервативны, способны образовывать относительно стабильные химерные комплексы.

Изменение уровня сигнала биосенсора, RU 1 2 Рисунок 9. Регистрация связывания L-аспарагиназ из пропускаемых растворов на поверхности чипа в канале с иммобилизованной L-аспарагиназой из H. pylori 26695.

Столбцы контроля окрашены в серый цвет. Номерами обозначены: L-аспарагиназа из H.

pylori J99 (1), L-аспарагиназа из H. pylori 26695 (2), L-аспарагиназа из E. coli (3).

Построение трехмерных моделей L-аспарагиназ из H. pylori J99 и H. pylori 26695 и их оптимизация.

На данный момент в базе PDB отсутствуют кристаллографические данные для L-аспарагиназ из H. pylori 26695 и H. pylori J99, поэтому были построены модели пространственных структур для этих белков.

Моделирование пространственной структуры L-аспарагиназ из H. pylori 26695 и H.

pylori J99 и их оптимизация были выполнены по методике, описанной в разделе материалы и методы. Было установлено, что ближайшим гомологом L-аспарагиназ из H. pylori 26695 и H.

pylori J99 является L-аспарагиназы из E. coli и W. succinogenes.

Проверка качества полученных моделей L-аспарагиназ из H. pylori 26695 и H.pylori J99 была выполнена путем построения и анализа карт Рамачандрана (рис. 10) в программе ProCheck и с помощью сравнительного анализа в программе LGA (табл. 4). Результаты программы ProCheck представлены в таблице 5. Карты Рамачандрана были построены для каждой субъединицы фермента. В виду идентичности полученных карт для всех четырех субъединиц на рисунке 12 приведены карты Рамачандрана для субъединицы А. На картах для L-аспарагиназ из E. coli, H. pylori 26695 и H. pylori J99 значения углов почти всех аминокислотных остатков укладываются в допустимых зонах. Однако для L-аспарагиназы из H. pylori 26695 пять аминокислотных остатков попадают в запрещенную зону, что соответствует 1,4% от общего количества. В случае L-аспарагиназы из H. pylori J99 на карте Рамачандрана 3 аминокислотных остатка находятся в запрещенной зоне, что составляет 1% от общего количества. В обоих случаях подобные отклонения в структуре считаются допустимыми.

Анализ в программе LGA также показал приемлемое качество моделей. Обычно пространственные структуры в программе имеют оценку LGA_Q больше 2. Модели, для которых LGA_Q 2, имеют значительные структурные отклонения. Для полученных моделей L-аспарагиназ из H. pylori 26695 и H.pylori J99 эта оценка имеет значения 92,887 и 96,233, соответственно.

Таблица 4. Сравнительный анализ структур L-аспарагиназ из H. pylori 26695 и H.

pylori J99 с L-аспарагиназой из E. coli N1 N2 DIST N RMSD Seq_Id LGA_S LGA_Q L-аспарагиназа из 1224 1304 5,0 1176 1,17 48,89 86,049 92, H. pylori L-аспарагиназа из 1232 1304 5,0 1184 1,13 50,00 86,948 96, H. pylori J Примечание. Сравнительный анализ был выполнен с использованием программы LGA.

Все параметры программы приняты по умолчанию. N1 – количество остатков аминокислот L-аспарагиназы, для которой выполняется анализ;

N2 – количество остатков аминокислот L-аспарагиназы из E. coli;

DIST – порог отсечения;

N – количество совпадающих аминокислот при заданном пороге отсечения;

RMSD – среднеквадратичное отклонение, рассчитанное для совпадающих аминокислот;

Seq_Id – показатель гомологичности между собой аминокислотных последовательностей;

LGA_S – оценка пространственного соответствия структур L-аспарагиназ из H. pylori J99 и H. pylori 26695 структуре L-аспарагиназы из E. coli с учетом числа аминокислотных остатков в последней;

LGA_Q – качественная оценка, рассчитанная по формуле: Q=0,1•N/(0,1+RMSD).

Таблица 5. Распределение значений углов в структурах L-аспарагиназ из H. pylori 26695 и H. pylori J99 на карте Рамачандрана.

Зоны карты Предпочитаемая Разрешенная Допустимая Запрещенная Рамачандрана L-аспарагиназа из 77,8% 18,8% 1,7% 1,7% H. pylori L-аспарагиназа из 76,7% 20,5% 1,7% 1,0% H. pylori J L-asparaginase E. coli а L-asparaginase H. pylori 26695 L-asparaginase H. pylori J б в Рисунок 10. Карты Рамачандрана для L-аспарагиназ E. coli (а), H. pylori 26695 (б) и H.

pylori J99 (в). Пространство карты разбито на четыре основные зоны: предпочитаемая (темно-серая), разрешенная (серая), допустимая (светло-серая) и запрещенная (белая).

L-аспарагиназ Построение трехмерной модели химерных тетрамеров и их оптимизация.

Чтобы оценить устойчивость химерных тетрамеров L-аспарагиназы, образующихся в эксперименте по изучению специфичности процесса олигомеризации бактериальных L-аспарагиназ, были получены модели этих химерных комплексов. Для этого в каждом из белке заменялась субъединица A из тетрамера одной L-аспарагиназы на соответствующую субъединицу из тетрамера L-аспарагиназы другого вида. Получены были следующие химерные тетрамеры L-аспарагиназ:

E. coli (A) – Erw. chrysanthemi (BCD) E. coli (A) – H. pylori J99 (BCD) E. coli (A) – H. pylori 26695 (BCD) H. pylori J99 (A) – E. coli (BCD) H. pylori J99 (A) – H. pylori 26695 (BCD) H. pylori 26695 (A) – E. coli (BCD) H. pylori 26695 (A) – H. pylori J99 (BCD) Полученные химерные тетрамеры были оптимизированы путем моделирования молекулярной динамики и минимизации энергии. Для оценки устойчивости этих химерных комплексов основное внимание уделялось интерфейсу между субъединицами A и C.

Оценка энергии взаимодействия между субъединицами A и C в моделях химерных тетрамеров.

Значение общей энергии взаимодействия между мономерами A и C были оценено с помощью программного комплекса Sybyl. Для этого были рассчитаны значения общей энергии каждого химерного тетрамера, а также значения общей энергии для мономеров A и C. После чего по формуле, приведенной в разделе «Материалы и методы», были рассчитаны величины энергетических вкладов различных видов межмолекулярного взаимодействия в образование этих химерных тетрамеров (рис. 11).

- Энергия, ккал/моль - - -400 H. pylori J99 (A) – H. pylori 26695 (C) - E. coli (A) – Erw. chrysanthemi (C) H. pylori 26695 (A) – E. coli (C) - H. pylori J99 (A) – E. coli (C) Erw. chrysamthemi H. pylori H. pylori H. pylori J H. pylori J E. coli E. coli E. coli Рисунок 11. Оценка значений энергии взаимодействия между субъединицами в димере AC в химерных тетрамерах L-аспарагиназы (черные столбцы) и в их диких формах (серые столбцы).

Определение аминокислотных остатков, образующих интерфейс между субъединицами A и C в химерных тетрамерах L-аспарагиназ и их диких формах.

Для оценки вклада различных аминокислот, формирующих область контакта между мономером A и мономером C в химерных тетрамерах L-аспарагиназ, было выполнено виртуальное аланиновое сканирование данного интерфейса. В результате анализа были установлены аминокислотные остатки, формирующие интерфейс между мономерами A и C и выявлены среди них значимые путем отбора по значению энергетического эффекта, вносимого ими в процесс комплексообразования. Результаты анализа показали, что при образовании димера AC из субъединиц от разных L-аспарагиназ происходит уменьшение общего числа значимых аминокислотных остатков во взаимодействии между мономерами A и C, а также солевых мостиков, вносящих вклад в устойчивость димера AC (табл. 6). Этот факт позволяет предполагать, что в данном случае происходит снижение стабильности химерных димеров и как следствие химерных тетрамеров относительно “диких” тетрамеров L-аспарагиназы. Если учесть, что активные центры L-аспарагиназы формируются в зоне интерфейса между субъединицами, можно предположить, что в L-аспарагиназах имеет место строго определенное позиционирование субъединиц тетрамера относительно друг друга, поскольку даже небольшие изменения в положении субъединиц могут привести к нарушению активного центра и как следствие к полной потери активности L-аспарагиназы.

Поэтому каждый мономер L-аспарагиназы в растворе других белков должен проявлять высокую специфичность по отношению к другим участникам олигомеризации бактериальных L-аспарагиназ.

Таблица 6. Число возможных солевых мостиков в зоне контакта между мономерами A и C.

L-аспарагиназа из E. coli 6 E. coli (A) – Erw. chrysanthemi (BCD) L-аспарагиназа из Erw. chrysamthemi 10 E. coli (A) – H. pylori 26695 (BCD) L-аспарагиназа из H. pylori 26695 6 H. pylori J99 (A) – H. pylori 26695 (BCD) ВЫВОДЫ 1. На примере моделирования трехмерной структуры L-аспарагиназы Erw. carotovora показана высокая эффективность моделирования по гомологии структур новых L-аспарагиназ. Построены и оптимизированы модели пространственной структуры L-аспарагиназ из H. pylori J99 и H. pylori 26695.

2. Молекулярно-графический анализ интерфейса между димерами AC и BD в тетрамерном комплексе L-аспарагиназы из E. carotovora показал, что высокая прочность комплекса обеспечивается преимущественно электростатическими взаимодействиями типа «солевой мостик». Экспериментально на оптическом биосенсоре была подтверждена высокая прочность тетрамеров данного фермента (константа скорости диссоциации – порядка 6·10-6 с-1).

Методом виртуального аланинового сканирования выявлены ключевые 3.

аминокислотные остатки в интерфейсе между димерами AC и BD в тетрамере L-аспарагиназы из Erw. carotovora.

4. В экспериментах на оптическом биосенсоре показана высокая специфичность процесса олигомеризации бактериальных L-аспарагиназ. С помощью компьютерного моделирования химерных структур тетрамеров L-аспарагиназ показана низкая устойчивость комплексов, собранных из субъединиц разных бактериальных L-аспарагиназ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Мезенцев Ю.В., Мольнар А.А., Иванов А.С. Олигомеризация L-аспарагиназы из Erwinia carotovora // Материалы Международной школы-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия». – Москва, 2005. – C. 38-39.

2. Мезенцев Ю.В., Мольнар А.А., Гнеденко О.В., Красоткина Ю.В., Соколов Н.Н., Иванов А.С. Олигомеризация из L-аспарагиназы Erwinia carotovora // Биомедицинская химия. – 2006. Т. 52, № 3. – С. 258-271.

2а. Mezentsev Yu.V., Molnar A.A., Gnedenko O.V., Krasotkina Yu.V., Sokolov N.N. and Ivanov A.S. Oligomerization of L-Asparaginase from Erwinia carotovora // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry. – 2007. – V. 1, № 1. – P. 58–67.

3. Ivanov A.S., Gnedenko O.V., Molnar A.A., Mezentsev Yu.V., Lisitsa A.V. and Archakov A.I. Protein–protein interactions as new targets for drug design: virtual and experimental approaches // Proceedings of the fifth international conference on bioinformatics of genome regulation and structure. – Novosibirsk, 2006. – C. 277-281.

4. Ivanov A.S., Gnedenko O.V., Molnar A.A., Mezentsev Yu.V., Lisitsa A.V. and Archakov A.I. Protein–protein interactions as new targets for drug design: virtual and experimental approaches // J. Bioinform. Comput. Biol. – 2007. – V. 5, № 4. – P. 579-592.

Список сокращений PDB – Protein Data Bank EDC – 1-этил-3((3-диметиламино)пропил)карбодиимид ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота HEPES – N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N’-этан сульфоновая кислота NHS – N-гидроксисукцинимид LGA – Local-Global Alignment RMSD – среднеквадратичное отклонение