Иммунобарназные конъюгаты для диагностики и терапии рака

На правах рукописи

Эдельвейс Эвелина Федоровна ИММУНОБАРНАЗНЫЕ КОНЪЮГАТЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И ТЕРАПИИ РАКА Специальность 03.01.03 – Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2010

Работа выполнена в лаборатории молекулярной иммунологии Института биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А.

Овчинникова РАН.

Научный консультант: член-корреспондент РАН, профессор, доктор биологических наук Деев Сергей Михайлович

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН, профессор, доктор химических наук Габибов Александр Габибович кандидат биологических наук Велибеков Рамис Махачевич

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта

Защита состоится « 9 » июня 2010 года в 10 часов на заседании Диссертационного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им.

академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, ГСП-7, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, Москва.

Автореферат разослан « 7 » мая 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор физико-математических наук В. А. Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ежегодно в мире выявляется 10 млн. новых случаев онкологических заболеваний, являющихся причиной смерти 250 из 100000 человек.

Это указывает на необходимость разработки новых и совершенствование существующих методов диагностики и лечения рака.

Метаболические пути опухолевых и нормальных клеток во многом совпадают, имея больше сходств, чем различий. Поэтому разработка средств, специфически удаляющих опухолевые клетки и не повреждающих нормальные клетки, является актуальной проблемой современной медицины. Реализация идеи направленной доставки лекарств к опухолям стала возможной благодаря идентификации опухолеассоциированных маркеров – антигенов, количество которых значительно больше в клетках опухоли по сравнению с клетками нормальных тканей, и развитию средств для избирательной доставки к ним цитотоксических агентов. Использование антител, специфически связывающихся с опухолевыми маркерами, и токсинов позволяет создавать иммуноконъюгаты, селективно убивающие опухолевые клетки.

Однако сильные бактериальные и растительные токсины обладают гепатотоксичностью, а также вызывают у пациентов синдром повышенной проницаемости капилляров. Одним из возможных решений проблемы системной токсичности является использование в качестве токсина рибонуклеазы, которая не является мутагенной, не вызывает сильного побочного токсического действия и, проникнув в клетку, расщепляет РНК, приводя к гибели клетки. Было показано, что некоторые положительно заряженные РНКазы избирательно токсичны для опухолевых клеток. Иммуноконъюгат, сконструированный на основе антитела и рибонуклеазы, получил название иммуноРНКаза. Данная работа посвящена разработке и исследованию иммунобарназных конъюгатов – иммуноРНКаз, состоящих из мини-антител (антиген-связывающих одноцепочечных вариабельных фрагментов антител, scFv) и рибонуклеазы Bacillus amyloliquefaciens – барназы. В работе использованы мини-антитела к тирозинкиназному рецептору эпидермального фактора роста EGFR и его гомологу ERBB2, гиперэкспрессия которых наблюдается в клетках многих злокачественных опухолей эпителиального происхождения и является прогностическим фактором высокой степени рецидивов и низкой выживаемости пациентов с такими опухолями.

ИммуноРНКазы, направленные к опухолевым маркерам, представляют собой новое поколение противоопухолевых препаратов. Их разработка и использование, возможно, позволят преодолеть развитие вторичной устойчивости опухолей к антителам, обладающим цитостатическим действием, и решить проблемы острой системной токсичности препаратов.

Цели и задачи работы. Цель настоящей работы состояла в изучении действия рибонуклеазы барназы и иммунобарназных конъюгатов – слитых белков, состоящих из барназы и мини-антител к рецепторам EGFR и ERBB2, – на человеческие опухолевые клетки in vitro и in vivo, а также разработке подхода для детекции опухолевых клеток, основанного на взаимодействии барназы с ее природным ингибитором – барстаром.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Оценить токсическое действие барназы и созданных на ее основе иммунобарназных конъюгатов (scFv 425-барназа и scFv 4D5-дибарназа) на мононуклеарные клетки периферической крови здоровых доноров и линии опухолевых клеток человека.

2. Определить механизмы цитотоксического действия барназы и иммунобарназного конъюгата scFv 4D5-дибарназа на человеческие опухолевые клетки.

3. Разработать подход для флуоресцентной детекции опухолевых клеток, гиперэкспрессирующих EGFR и ERBB2, с использованием иммунобарназных конъюгатов, содержащих мини-антитела scFv 425 и scFv 4D5, и барстара, слитого с зеленым флуоресцентным белком EGFP.

4. Создать генетическую конструкцию для эукариотической тетрациклин контролируемой экспрессии иммунобарназного конъюгата scFv 4D5-барназа.

5. Исследовать противоопухолевую активность и системную токсичность иммунобарназного конъюгата scFv 4D5-дибарназа в мышах.

Научная новизна полученных результатов. В настоящей работе впервые показано, что рибонуклеазная активность барназы не подавляется человеческим ингибитором рибонуклеаз, и барназа оказывает токсическое действие на человеческие опухолевые клетки, расщепляя клеточную РНК и индуцируя апоптоз.

На основе барназы и мини-антител к опухолевым маркерам EGFR и ERBB2 были созданы иммуноРНКазы, которым мы дали название иммунобарназные конъюгаты.

Иммунобарназные конъюгаты scFv 425-барназа и scFv 4D5-дибарназа специфически связывались, соответственно, с рецепторами EGFR или ERBB2 на поверхности опухолевых клеток, интернализовались рецептор-опосредованным эндоцитозом и убивали клетки, вызывая в них апоптоз, при концентрациях на три порядка меньших, чем барназа. Показано также, что scFv 4D5-дибарназа ингибировала в мышах BALB/c nude рост привитых человеческих опухолей молочной железы, гиперэкспрессирующих ERBB2, и не оказывала серьезных побочных токсических эффектов на мышей BDF1 и BALB/c nude.

Теоретическое и практическое значение работы. Оценено токсическое действие барназы на восемь линий опухолевых клеток человека разного тканевого происхождения и среди них выявлены две линии, обладающие высокой чувствительностью к этой РНКазе. Показано, что барназа малотоксична для нормальных мононуклеаров периферической крови человека. Исследованы два иммунобарназных конъюгата, специфически связывающихся с рецепторами EGFR или ERBB2 – опухолеассоциированными антигенами человеческих карцином.

Высокая эффективность рецептор-опосредованного действия на клетки человеческих карцином молочной железы, яичника, эпидермоидной карциномы in vitro и in vivo и отсутствие побочного токсического действия на мышей позволяет рассматривать эти иммунобарназные конъюгаты, в частности, scFv 4D5-дибарназу, как перспективные противоопухолевые средства для дальнейших доклинических исследований. Создана конструкция для тетрациклин-контролируемой экспрессии в клетках млекопитающих гена, кодирующего слитый белок scFv 4D5-барназа, состоящий из лидерного пептида, анти-ERBB2 мини-антитела и барназы.

Трансфицированные этой конструкцией человеческие клетки эмбрионального почечного эпителия HEK293 продуцировали белок scFv 4D5-барназа и секретировали его в культуральную среду. Показана возможность детекции in vitro опухолевых клеток, гиперэкспрессирующих рецепторы EGFR и ERBB2, на основе взаимодействия барназы с ее природным ингибитором барстаром.

Публикации. По теме диссертации опубликована 21 печатная работа, из них статей в журналах, рекомендованных ВАК, получено 2 патента РФ на изобретения.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Российских конференциях: Дни иммунологии в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2001, 2004, 2005, 2006), XXI Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 2006), Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2005), VIII чтении, посвященном памяти академика Ю. А. Овчинникова (Москва, 2003), Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, 2007), зимних молодежных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2007, 2008);

на Международных конференциях: Familial Cancer Conference (Мадрид, 2006), 18-й и 19-й конференциях Европейской Ассоциации Исследований рака (Инсбрук, 2004;

Будапешт, 2006).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 196 страницах машинописного текста, иллюстративный материал содержит 61 рисунок и 6 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Анализ in vitro функциональной активности полученных в Е. coli барназы и иммунобарназных конъюгатов 1. 1. Рибонуклеазная активность барназы и scFv 4D5-дибарназы Рибонуклеазную активность барназы и scFv 4D5-дибарназы определяли методом кислото-растворимого остатка: к раствору дрожжевой РНК добавляли барназу или scFv 4D5-дибарназу и инкубировали 15 мин при 37°С. Реакцию останавливали добавлением хлорной кислоты и реакционную смесь центрифугировали 10 мин при 16000g. Количество гидролизованной РНК определяли, измеряя оптическое поглощение супернатанта при 260 нм. Полученные таким образом значения оптического поглощения характеризовали рибонуклеазную активность полученных препаратов рекомбинантной барназы и scFv 4D5-дибарназы.

Барназа в составе иммуноконъюгата scFv 4D5-дибарназа была способна эффективно расщеплять РНК (Рис. 1.1. а), и ее активность составляла 88% от нативной барназы.

РНКаза, проникнув в цитоплазму клетки, может не проявить своей рибонуклеазной активности, если она чувствительна к ингибитору рибонуклеаз, присутствующему в цитоплазме клеток млекопитающих. Поэтому, прежде чем тестировать токсический эффект барназы и иммунобарназных конъюгатов на клетках, мы оценили чувствительность барназы к человеческому ингибитору рибонуклеаз (hRI). Было установлено, что hRI в концентрации в 4 раза больше той, при которой он подавляет активность РНКазы А на 50%, не ингибирует барназу: ед/мл hRI не подавляли активность 25 нМ барназы, в то время как 100 ед/мл hRI снижали активность 37 нМ (500 нг/мл) РНКазы А в 2 раза (Рис.1.1. б).

Рисунок 1.1. Характеристика барназы и иммунобарназного конъюгата scFv 4D5-дибарназа in vitro. (а) РНКазная активность барназы и scFv 4D5-дибарназы. Оптическое поглощение, соответствующее активности барназы (по данным Хартли, 1972), обозначено черным квадратом.

(б) Влияние человеческого ингибитора рибонуклеаз на РНКазную активность барназы. (в) Рибонуклеазная активность барназы и scFv 4D5-дибарназы в эквивалентных концентрациях в присутствии барстара.

Для анализа способности барстара связываться с барназой в составе иммуноконьюгата scFv 4D5-дибарназы рибонуклеазную активность барназы и scFv 4D5-дибарназы определяли в его присутствии. Барназа и scFv 4D5-дибарназа демонстрировали сходную чувствительность к ингибированию барстаром (Рис. 1.1.

в), то есть барназа в составе scFv 4D5-дибарназы сохранила способность связываться с барстаром.

1.2. Действие барназы на человеческие опухолевые и нормальные клетки Чтобы определить токсическое действие рекомбинантной барназы на клетки, мы использовали человеческие мононуклеары периферической крови (hPBMCs) здоровых доноров и линии клеток человека разного тканевого происхождения:

карцином молочной железы BT-474, MCF-7, яичника SKOV-3, эпидермоидной карциномы A-431, острой миелоидной лейкемии U-937, эритролейкоза K-562, промиелобластного лейкоза HL-60, эмбрионального почечного эпителия HEK293.

Клетки инкубировали с барназой (диапазон концентраций от 0,1 нМ до 113 мкМ) в течение 72 ч. Жизнеспособность клеток определяли с помощью МТТ-теста. (Рис.

1.2.).

Рисунок 1.2. Цитотоксическое действие барназы на человеческие опухолевые клетки и нормальные мононуклеары периферической крови. Барназу в различных концентрациях добавляли к клеткам, инкубировали 72 ч и определяли ее токсический эффект с помощью МТТ-теста. Жизнеспособность клеток выражена как доля метаболической активности клеток, обработанных барназой, от активности необработанных клеток, показанной перекрестьем на оси. Каждая кривая представляет минимум независимых эксперимента. Величина стандартных ошибок определения жизнеспособности не превышала 10%.

Было показано, что барназа высокотоксична для клеток BT-474 (IC50 = 0, мкM) и U-937 (IC50 = 2,4 мкM). Для клеток SKOV-3, А-431, HEK293, K-562 и MCF- барназа была среднетоксичной с IC50 от 5 до 13 мкM. Клетки HL-60 были наиболее устойчивыми к барназе (IC50 = 82 мкM). Для нормальных человеческих hPBMCs максимальный цитотоксический эффект (27%) был достигнут при концентрации барназы 110 мкM, в то время как на клетки BT-474 барназа оказывала такой же эффект в концентрации 0,01 мкМ. Таким образом, для клеток карциномы молочной железы BT-474 барназа в 10000 раз токсичнее, чем для нормальных мононуклеарных клеток периферической крови человека. Высокая эффективность действия барназы на опухолевые клетки определяет целесообразность создания противоопухолевых средств на основе этой РНКазы.

1.3. Цитотоксическое действие иммунобарназных конъюгатов, направленных на опухолевые маркеры ERBB2 и EGFR Для направленной доставки барназы к опухолевым клеткам были сконструированы конъюгаты барназы с мини-антителом, специфически связывающимся с рецептором ERBB2, – scFv 4D5-дибарназа, и с мини-антителом, специфически связывающимся с рецептором EGFR, – scFv 425-барназа, и оценено их влияние на жизнеспособность мононуклеарных клеток переферической крови здоровых доноров и линий опухолевых клеток человека.

Было установлено, что иммунобарназный конъюгат scFv 4D5-дибарназа избирательно токсичен для ERBB2-позитивных клеток человеческих карцином молочной железы BT-474 (IC50 = 2,4 нM) и SKBR-3 (IC50 = 4,1 нM), карциномы яичника SKOV-3 (IC50 = 1,8 нM);

иммунобарназный конъюгат scFv 425-барназа высокотоксичен для EGFR-позитивных клеток человеческой эпидермоидной карциномы A-431 (IC50 = 0,04 нM), токсичен для клеток эритролейкоза К-562 (IC50 = 1,7 нM) и мелкоклеточной карциномы легких SW2 (IC50 = 3,2 нM). Токсичность иммунобарназных конъюгатов была на три порядка выше, чем барназы. Данные сравнения цитотоксического действия барназы, scFv 4D5-дибарназы и scFv 425 барназы на разные клеточные линии представлены в таблице 1.

Таблица 1. Цитотоксическое действие барназы, scFv 4D5-дибарназы и scFv 425-барназы на человеческие опухолевые и нормальные клетки барназа, scFv 4D5-дибарназа, scFv 425-барназа, нМ нM нM Клетки IC30 IC50 IC70 IC30 IC50 IC70 IC30 IC50 IC н/o н/o н/o 10 210 2000 0,72 2,4 9, BT- н/o н/o н/o U-937 1100 2400 6200 8100 - н/o н/o н/o SKOV-3 1500 5000 18000 0,55 1,8 A-431 2500 10000 63000 740 - - 0,01 0,04 0, н/o н/o н/o HEK293 3000 10000 46000 74 490 K-562 5800 12000 31000 140 460 1000 0,94 1,7 2, MCF-7 3100 13000 40000 1500 - - 4,8 14 н/o н/o н/o HL-60 36000 82000 82000 8100 - SKBR32 н/o н/o н/o 9,0 4,1 2,2 121 405 н/o н/o н/o н/o н/o н/o SW2 1,7 3,2 5, н/o н/o н/o hPBMCs 110000 - - 2600 - Цитотоксическое действие определяли c помощью МТТ-теста после инкубирования клеток с белками в течение 72 ч при 37°С в среде RPMI, содержащей 10% фетальную сыворотку теленка (FCS). ICnn – концентрация белка, при которой он вызывал уменьшение жизнеспособности клеток на nn% Клеточные линии, гиперэкспрессирующие ERBB Клеточные линии, гиперэкспрессирующие EGFR hPBMCs выделяли из периферической крови здоровых доноров и немедленно использовали для анализа цитотоксического действия белков - при тестированных концентрациях уменьшение жизнеспособности клеток на nn% не было достигнуто;

н/o, цитотоксичность не определяли 2. Механизмы цитотоксического действия барназы и иммунобарназных конъюгатов на человеческие раковые клетки 2.1. Связывание барназы и иммунобарназных конъюгатов с клетками Связывание барназы и scFv 4D5-дибарназы с клетками человеческой карциномы яичника SKOV-3, гиперэкспрессирующими рецептор ERBB2, и клетками мышиной цитотоксической интерлейкин-2 зависимой линии CTLL-2, лишенными человеческого ERBB2, а также связывание scFv 425-барназы с клетками эпидермоидной карциномы А-431, гиперэкспрессирующими рецептор EGFR, определяли с помощью флуоресцентной микроскопии (Рис. 2.1.). Клетки инкубировали с рекомбинантым белком (барназой или scFv 4D5-дибарназой или scFv 425-барназой), а затем с кроличьей анти-барназной сывороткой (RABS) и козьими анти-кроличьими антителами, конъюгированными с техасским красным (GAR-TR). В случае обработки клеток SKOV-3 раствором барназы (20 мкМ) наблюдалась интенсивная флуоресценция клеток (Рис. 2.1. а), что свидетельствует о связывании барназы с клетками SKOV-3. При инкубировании клеток с 20 нМ scFv 4D5-дибарназой наблюдали флуоресценцию мембран ERBB2-позитивных клеток SKOV-3, но не ERBB2-негативных клеток CTLL-2 (Рис. 2.1. в, д). Инкубирование клеток со смесью белков scFv 4D5 и scFv 4D5-дибарназы приводило к заметному уменьшению флуоресценции мембран клеток SKOV-3 (Рис. 2.1. в, е). О специфичности связывания scFv 4D5-дибарназы с рецептором ERBB свидетельствуют как уменьшение флуоресценции в результате добавления scFv 4D5, так и отсутствие связывания scFv 4D5-дибарназы с ERBB2-негативными клетками.

Связывание scFv 425-барназы с EGFR-позитивными клетками А-431 детектировали также с помощью RABS и GAR-TR (Рис. 2.1. и). В контролях при инкубировании клеток A-431 с растворами RABS и GAR-TR (Рис. 2.1. л) и при инкубировании с scFv 425-барназой и GAR-TR в отсутствие RABS флуоресценция не обнаруживалась.

2.2. Интернализация scFv 4D5-дибарназы ERBB2-позитивными раковыми клетками Чтобы изучить интернализацию и внутриклеточную локализацию scFv 4D5 дибарназы, мы использовали методы электронной микроскопии. Было показано, что комплексы белка scFv 4D5-дибарназы с золотом (scFv 4D5-дибарназа-Au) связывались с клетками SKOV-3 (Рис. 2.2.) при 4С и 37С. При связывании комплексов с поверхностью клеток SKOV-3 частицы золота располагались на выростах и на гладких участках клеточной мембраны (Рис. 2.2. а-г).

Рисунок 2.1. Связывание рекомбинантных белков с клетками SKOV-3, CTLL-2 и А-431.

Живые клетки SKOV-3 (а-г, ж, з), CTLL-2 (д, е), A-431 (и-м) инкубировали 1 ч при 4°C с 20 мкМ барназой (а, б);

20 нМ scFv 4D5-дибарназой (в-е);

20 нМ scFv 4D5-дибарназой и 20 нМ scFv 4D (ж, з);

с 20 нМ scFv 425-барназой (и, к) или фосфатно-солевым буфером PBS (л, м). Несвязавшиеся белки отмывали, клетки инкубировали с RABS и GAR-TR и анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа. В случае барназы, клетки фиксировали перед процедурой инкубирования с растворами RABS и GAR-TR (а, б). Клетки фотографировали в проходящем белом свете (б, г, е, з, к, м – поля зрения, соответствующие а, в, д, ж, и, л).

Проникновение scFv 4D5-дибарназы-Au внутрь клеток SKOV-3 было обнаружено при 37С, и не обнаружено при 4С, то есть проникновение scFv 4D5 дибарназы-Au в клетки SKOV-3 зависело от температуры. Интернализация scFv 4D5-дибарназы-Au проходила с образованием окаймленных ямок (Рис. 2.2. в), которые отпочковывались от клеточной мембраны и формировали окаймленные везикулы (Рис. 2.2. д). Внутри клетки большая часть иммунобарназного конъюгата была локализована в эндосомах (Рис. 2.2. е, ж), а некоторая часть молекул находилась в цитоплазме вблизи эндосом (Рис. 2.2. е, показано стрелками). Такое наблюдение означает, что scFv 4D5-дибарназа может высвобождаться из эндосом в цитоплазму. scFv 4D5-дибарназа-Au была обнаружена в мультивезикулярных тельцах (Рис. 2.2. е), и не обнаружена в ядре (Рис. 2.2. д). Наличие scFv 4D5 дибарназы в окаймленных ямках, окаймленных везикулах и эндосомах указывает на то, что эта иммуноРНКаза проникает внутрь ERBB2-позитивных клеток SKOV- путем эндоцитоза.

Рисунок Иммунобарназный 2.2.

конъюгат scFv 4D5-дибарназа связывается и проникает в ERBB2 позитивные клетки SKOV- посредством эндоцитоза. Клетки SKOV-3 инкубировали с 20 нМ scFv 4D5-дибарназой-Au в течение 1 ч при 4С (а) или 37С (б-е, ж – увеличение е).

Клеточная мембрана (км);

выросты (обозначены звездочками);

окаймленная ямка (оя);

окаймленная везикула (ов);

эндосома (э);

цитоплазма (ц);

золотые частицы, расположенные в цитоплазме, показаны треугольными стрелками;

мультивезикулярные тельца (MВТ);

ядро (я). Масштабная линейка равна 200 нм.

2.3. Деградация РНК в клетках, обработанных барназой или scFv 4D5 дибарназой Анализ клеточной РНК, выделенной из клеток SKOV-3, позволил выявить деградацию РНК в клетках, обработанных барназой или scFv 4D5-дибарназой (Рис.

2.3.). Существенная деградация РНК наблюдалась через 24 ч инкубирования клеток с барназой (Рис. 2.3. дорожка 3). Через 48 ч такой обработки клеточная РНК была полностью деградирована (Рис. 2.3. дорожка 4). РНК с низким молекулярным весом, а именно тРНК и 5.8S рРНК, но не 5S рРНК, была наиболее чувствительной к действию барназы. РНК с высоким молекулярным весом, в частности, 18S рРНК, была преимущественно расщеплена после обработки клеток scFv 4D5-дибарназой (Рис. 2.3. дорожка 7).

Денситометрический анализ изображения геля, представленного на рисунке 2.3., показал, что относительное содержание тРНК и 5.8S рРНК в клетках, обработанных барназой, было уменьшено, соответственно, на 30% и 16%, тогда как 5S, 18S и 28S рРНК – на 60%, 43% и 54% относительно необработанных клеток (контроля). Относительное содержание 18S рРНК в клетках, обработанных scFv 4D5-дибарназой, было уменьшено на 30% по сравнению с контролем, в то время как содержание других видов РНК почти не изменилось.

Рисунок 2.3. Расщепление клеточной РНК барназой и scFv 4D5-дибарназой.

Тотальную РНК выделяли из клеток SKOV-3, обработанных 50 мкМ барназой 24 ч (дорожка 3) или 48 ч (дорожка 4);

нМ scFv 4D5-дибарназой 72 ч (дорожка 7);

из клеток SKOV-3, культивируемых без рекомбинантных белков 24 ч (дорожка 2) или 72 ч (дорожка 6) и анализировали в 9% полиакриламидном геле, содержащем 7,5 M мочевину. В каждую дорожку наносили РНК, выделенную из клеток, обработанных (+) или необработанных (-) белком. М – РНК-маркер молекулярного веса (дорожки 1, 5). Наиболее яркие полосы РНК, отсутствующие в необработанных белком клетках и возникшие в результате расщепления клеточной РНК барназой или scFv 4D5-дибарназой, показаны звездочками.

2.4. Морфологические изменения клеток под действием барназы и scFv 4D5 дибарназы Для анализа морфологических изменений под действием барназы и scFv 4D5 дибарназы клетки SKOV-3 инкубировали 72 ч в среде без рекомбинантных белков (Рис.2.4. а, г), с scFv 4D5-дибарназой (б, д, е) или барназой (в). Необработанные белками клетки были распластаны и прикреплены ко дну планшета. Инкубирование с барназой или scFv 4D5-дибарназой вызывало открепление клеток от подложки, блеббинг клеточных мембран. В клетках, обработанных scFv 4D5-дибарназой, наблюдали пикнозис ядер и ядерную фрагментацию (д, е).

Рисунок 2.4. Морфологические изменения клеток под действием барназы и scFv 4D5-дибарназы.

Клетки SKOV-3 инкубировали 72 ч в среде без рекомбинантных белков (а, г), с 50 нМ scFv 4D5 дибарназой (б, д, е) или 50 мкМ барназой (в). Клетки анализировали в проходящем белом свете (а-в) или окрашивали акридиновым оранжевым и анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа (г-е).

Разрушенные клетки показаны стрелкой (в), блеббинг клеточных мембран показан звездочками (б, в). В клетках, обработанных scFv 4D5-дибарназой, наблюдали пикнозис ядер и ядерную фрагментацию (д, е –увеличение д).

2.5. Анализ повреждения геномной ДНК в клетках, обработанных барназой и иммунобарназным конъюгатом scFv 4D5-дибарназа Обработка клеток SKOV-3 барназой или scFv 4D5-дибарназой приводила к расщеплению геномной ДНК типичным для апоптоза способом – межнуклеосомным расщеплением хроматина (Рис. 2.5. дорожки 2, 6), отличным от нерегулярного расщепления ДНК в клетках SKOV-3, культивированных в среде без сыворотки (Рис. 2.5. дорожка 7).

Рисунок 2.5. Межнуклеосомное расщепление хроматина в клетках SKOV-3, обработанных барназой и scFv 4D5-дибарназой. Геномную ДНК выделяли из клеток, инкубированных 72 ч с 50 мкМ барназой (+, дорожка 2) или 50 нМ scFv 4D5 дибарназой (+, дорожка 6);

из клеток, не обработанных рекомбинантными белками (-, дорожки и из клеток 3 5);

SKOV-3, культивированных 7 суток в среде без сыворотки ( дорожка и анализировали в FCS, 7), неденатурирующем 1,5 % агарозном геле. М – маркер молекулярного веса (т.п.н., дорожки 1, 4).

2.6. Детекция фосфатидилсерина и активации каспазы-3 в клетках SKOV-3, обработанных барназой или scFv 4D5-дибарназой Чтобы обнаружить маркер апоптоза фосфатидилсерин на внешней стороне плазматической мембраны, клетки SKOV-3 инкубировали с 50 мкМ барназой или нМ scFv 4D5-дибарназой, окрашивали Annexin-V-FITC и пропидий иодидом (PI) и анализировали методом проточной цитометрии (Рис. 2.6. а). Было показано, что 21,7% клеток в случае барназы и 32,7% клеток в случае scFv 4D5-дибарназы было окрашено Annexin-V-FITC, что свидетельствовало о появлении фосфотидилсерина на поверхности клеток, а значит о гибели этих клеток путем апоптоза. При этом лишь незначительная часть клеток (2,5% и 3,0%, соответственно для барназы и scFv 4D5-дибарназы) окрашивалась PI и Annexin-V-FITC, то есть подвергалась некрозу.

Эти результаты указывают, что тип клеточной смерти, индуцируемой как барназой, так и scFv 4D5-дибарназой, – апоптоз.

Измерение активности специфичной для апоптоза каспазы-3 в анализе протеолитического расщепления специфического субстрата PhiPhiLux-G1D2 (Рис.

2.6. б) показало, что активность каспазы-3 была увеличена на 13,1% для клеток SKOV-3, обработанных барназой, и на 11,6% для клеток SKOV-3, обработанных scFv 4D5-дибарназой, по сравнению с необработанным контролем.

Рисунок 2.6. Активация каспазы-3 и появление фосфатидилсерина на внешней стороне клеточной мембраны опухолевых клеток, обработанных барназой или scFv 4D5-дибарназой.

(а) Клетки SKOV-3 инкубировали 72 ч в среде, содержащей 50 мкМ барназу или 50 нМ scFv 4D5 дибарназу, или в среде, не содержащей рекомбинантные белки, затем окрашивали Annexin-V-FITC и PI. (б) Каспаза-3-подобная ферментативная активность клеток SKOV-3, инкубированных с мкМ барназой или 50 нМ scFv 4D5-дибарназу, оценена в анализе расщепления флуорогенного субстрата PhiPhiLux-G1D2.

Таким образом, было показано, что и барназа, и scFv 4D5-дибарназа вызывали гибель опухолевых клеток путем апоптоза, о чем свидетельствовали мембранный блеббинг, появление фосфатидилсерина на внешней стороне плазматической мембраны, межнуклеосомная фрагментация хроматина, активация каспазы-3. Важно отметить, что благодаря специфическому взаимодействию с рецептором, иммунобарназный конъюгат индуцировал в опухолевых клетках апоптоз при концентрации в 1000 раз меньшей, чем барназа.

3. Детекция человеческих опухолевых клеток с помощью иммуноРНКаз scFv 4D5-дибарназа, scFv 4D5-барназа, scFv 425-барназа и белка EGFP-барстар На основе иммунобарназных конъюгатов был разработан подход для флуоресцентной иммунодетекции человеческих опухолевых клеток, основанный на взаимодействии барназы и барстара. Для этого был сконструирован слитый белок, состоящий из барстара и зеленого флуоресцентного белка EGFP. Инкубирование клеток с белками scFv 4D5-барназа (или scFv 4D5-дибарназа) и EGFP-барстар позволяло специфически детектировать in vitro опухолевые клетки, экспрессирующие рецептор ERBB2. При этом scFv 4D5-барназа и EGFP-барстар не связывались с клетами CTLL-2, не экспрессирующими ERBB2. Клетки А-431, гиперэкспрессирующие рецептор детектировали помощью EGFR, c иммунобарназного конъюгата scFv 425-барназа и белка EGFP-барстар. Когда клетки SKOV-3 или А-431 инкубировали только с EGFP-барстаром, флуоресценции клеток не наблюдалось (Рис. 3).

Рисунок 3. Детекция раковых клеток с помощью scFv 4D5-дибарназы, scFv 4D5-барназы, scFv 425-барназы и EGFP-барстара. Клетки SKOV-3 (а-е), CTLL-2 (ж, з), А-431 (и-м) инкубировали 1 ч при 4С с 20 нМ scFv 4D5-барназой (а, б, ж, з), 20 нМ scFv 4D5-дибарназой (в, г), 20 нМ scFv 425-барназой (и, к) или раствором PBS (д, е, л, м), затем отмывали и инкубировали с 20 нМ EGFP-барстаром.

4. Создание конструкции для эукариотической экспрессии гена иммунобарназного конъюгата scFv 4D5-барназа Для тетрациклин-контролируемой экспрессии иммунобарназного конъюгата scFv 4D5-барназа в клетках млекопитающих мы сконструировали вектор pBS-tTA Mlp-4D5-Bn-Bs, содержащий ген слитого белка scFv 4D5-барназа, состоящего из N концевого лидерного пептида легкой -цепи иммуноглобулина мыши (Mlp), анти ERBB2-мини-антитела scFv 4D5, барназы и пяти С-концевых гистидинов (Рис. 4.1.).

Ген белка scFv 4D5-барназа находится под контролем минимального промотера тетрациклин-зависимого элемента (TRE). TRE состоит из последовательностей тетрациклиного оператора, соединенных с минимальным промотером человеческого цитомегаловируса (CMV), и регулируется трансактиваторным белком (tTA), находящимся под контролем независимого промотера CMV. В присутствии тетрациклина в культуральной среде белок tTA не может связываться с TRE, и ген scFv 4D5-барназы не экспрессируется, тогда как в отсутствие тетрациклина, tTA связывается с TRE и активирует транскрипцию гена scFv 4D5-барназы. Лидерный пептид обеспечивает секрецию в культуральную среду белка scFv 4D5-барназа, токсичного для клеток-хозяев. Рибонуклеазная активность scFv 4D5-барназы внутри клеток-продуцентов подавляется барстаром, ген которого в созданной конструкции находится под независимым промотером CMV.

Рисунок 4.1. Схема вектора для эукариотической тетрациклин-контролируемой экспрессии гена белка scFv 4D5-барназа. TRE – тетрациклин зависимый элемент, CMV – минимальный промотер человеческого цитомегаловируса, Mlp – генная последовательность лидерного пептида легкой -цепи иммуноглобулина мыши, 4D5VL и 4D5VН – гены вариабельного фрагмента легкой и тяжелой цепей анти ERBB2-антитела 4D5, барназа – ген барназы, барстар – ген барстара, tTA – ген трансактиваторного белка tTA.

Клетки человеческого эмбрионального почечного эпителия HEK котрансфицировали плазмидами pBS-tTA-Mlp-4D5-Bn-Bs и pEGFP-N1. Плазмиду pEGFP-N1 (Clontech), кодирующую ген зеленого флуоресцентного белка EGFP, использовали, чтобы оценить эффективность трансфекции. Вестерн-блот анализ (Рис. 4.2.) показал наличие белка scFv 4D5-барназа как внутри клеток HEK293, трансфицированных вектором pBS-tTA-Mlp-4D5-Bn-Bs, так и в культуральной среде, в которую белок секретировался благодаря наличию лидерного пептида.

Рисунок 4.2. Продукция белка scFv 4D5-барназа в клетках HEK293 в отсутствие тетрациклина в культуральной среде. Неочищенный лизат (дорожка 1), лизат, очищенный на Ni-NTA сефарозе (дорожка 2), кондиционированная среда (дорожка 3) клеток HEK 293, котрансфицированных pBs-tTAMlp-4D5-Bn Bs и pEGFP-N1. В качестве контроля использовали неочищенный лизат (дорожка 4), лизат, очищенный на Ni-NTA сефарозе (дорожка 5), кондиционированную среду клеток (дорожка 6) HEK 293, трансфицированных pEGFP-N1. M – маркер молекулярного веса;

scFv 4D5-барназа, полученная в E.coli и очищенная на Ni-NTA сефарозе, кДа (дорожка 7). Вестерн-блот анализ был выполнен с кроличьей анти-барназной сывороткой, козьими анти-кроличьими антителами, конъюгированными со щелочной фосфатазой, и субстратом CSPD/TROPIX.

5. Оценка токсического действия scFv 4D5-дибарназы на мышей BDF1 и BALB/c nude Для оценки токсического действия иммуноРНКазы scFv 4D5-дибарназа in vivo мышам BDF1 и BALB/c nude вводили внутривенно 7 мг/кг этого белка в растворе PBS. Установлено, что scFv 4D5-дибарназа не вызывала гибели мышей, потери веса, а также изменений их состояния и поведения в течение 7 дней наблюдений. Вес печени, сердца, селезенки, почек, легких, вилочковой и щитовидных желез, который определяли через 1 и 7 дней после инъекций, не отличался у мышей BDF1 в опытных и контрольных (мыши, получавшие раствор PBS) группах. Биохимический анализ крови мышей BDF1, который проводили на 7 день после введения scFv 4D5 дибарназы, не выявил значительных различий биохимических показателей крови у животных опытной и контрольной групп. В частности, не было достоверных различий (P 0,05) активности аланин-аминотрансферазы и аспартат аминотрансферазы в плазме крови мышей, которым вводили scFv 4D5-дибарназу и раствор PBS, что указывает на отсутствие повреждения печени.

Гематологический анализ крови показал (Рис. 5.1.), что scFv 4D5-дибарназа Рисунок 5.1.

Гематологический анализ крови мышей BDF1 и BALB/c nude на 1 и 7 дни после введения scFv 4D5 дибарназы. Среднее значение количества лейкоцитов (тыс./мм ) в каждой группе мышей равно высоте столбцов гистограммы: лимфоциты сегменты);

(голубые сегментоядерные нейтрофилы розовые сегменты);

(с/я, палочкоядерные нейтрофилы (п/я), эозинофилы, моноциты, базофилы (белые сегменты).

Соотношение различных видов лейкоцитов определено при подсчёте их в окрашенном по Май-Грюнвальду мазке крови под микроскопом и выражено в %.

на 7 день после введения вызывала лимфоцитопению у иммунокомпетентных мышей BDF1, но не у иммунодефицитных мышей BALB/c nude. При этом количество лимфоцитов у мышей BDF1 снижалось в 3 раза по сравнению с контролем. Количество лейкоцитов у мышей BDF1 снижалось на 40% и составляло 6,7 тыс. клеток/мм3, что ниже физиологической нормы (7 – 11 тыс. клеток/мм3).

Кроме того, scFv 4D5-дибарназа вызывала полнокровие сосудов в корковом и мозговом слое почек у 2 из 5 мышей (Рис. 5.2.) на 1 день после введения, однако полнокровие было обратимым и уменьшалось на 7 день.

Рисунок 5.2. Гистологические срезы почек мышей BDF1. Срезы приготовлены на 1 или 7 дни после внутривенного введения мышам 7 мг/кг scFv 4D5-дибарназы (б, в) или раствора PBS (а).

Микрофотографии срезов коркового (к) и мозгового (м) слоев почек, окрашенных гематоксилином и эозином. Увеличение 200 (для панели а, верхних панелей б, в) и 70 (для нижних панелей б, в).

Серьезного повреждения почек после введения scFv 4D5-дибарназы не наблюдалось, также как и повреждения других органов (сердца, печени, селезенки, мозга). Таким образом, иммунобарназный конъюгат scFv 4D5-дибарназа не вызывал острой системной токсичности у мышей BDF1 и BALB/c nude.

6. Определение противоопухолевой активности scFv 4D5-дибарназы в мышах BALB/c nude Бестимусным мышам BALB/c nude вводили подкожно ERBB2 гиперэкспрессирующие клетки человеческой карциномы молочной железы SKBR-3, чтобы вызвать у них развитие опухолей. Белок scFv 4D5-дибарназу вводили три раза внутривенно (в/в), а затем внутрибрюшинно (в/б) в количестве 0,7 мг/кг (Рис. 6).

Опухоли измеряли, начиная с 9 дня после введения клеток, когда их средний объем был примерно 30 мм3, и продолжали измерения до 42 дня, пока опухоль одного из мышей не достигла 2000 мм3, после чего животных умерщвляли. Установлено, что иммуноконъюгат scFv 4D5-дибарназа вызывал достоверное подавление опухолей, при этом на 42 день после введения клеток ингибирующий эффект scFv 4D5 дибарназы на рост опухолей составил 76%.

Рисунок 6. Противоопухолевый эффект scFv 4D5-дибарназы в мышах BALB/c nude, несущих человеческие опухоли молочной железы SKBR-3. Мышам (2 группы по животных) вводили подкожно 1,5106 клеток SKBR-3. Начиная с 5-го дня после введения клеток мышам опытной группы вводили scFv 4D5-дибарназу () в количестве 0,7 мг/кг, мышам контрольной группы вводили раствор PBS () на 5, 7, 9 (в/в) и на 10, 12, 14, 16, 19, 21, 23 (в/б) дни (). Средний объем опухолей представлен с указанием стандартных ошибок.

Противоопухолевая активность и низкая системная токсичность иммуноРНКазы scFv 4D5-дибарназа позволяет рассматривать барназу в качестве агента для создания на ее основе противоопухолевых соединений. Результаты, полученные в данном исследовании, свидетельствуют об эффективности и перспективности дальнейших испытаний иммунобарназных конъюгатов с целью их использования в качестве противоопухолевых препаратов.

ВЫВОДЫ 1. Установлено, что бактериальная рибонуклеаза барназа токсична (IC50 от 0,21 до 82 мкМ) для линий человеческих опухолевых клеток и малотоксична для мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров.

2. Показано, что иммунобарназные конъюгаты – слитые белки, состоящие из барназы и мини-антител к EGFR или ERBB2, – избирательно токсичны (IC50 от 0, до 4,1 нМ) для человеческих опухолевых клеток, гиперэкспрессирующих рецепторы EGFR и/или ERBB2, причем их токсичность на три порядка выше, чем барназы.

3. Продемонстрировано, что барназа и иммунобарназный конъюгат scFv 4D5 дибарназа связываются с опухолевыми клетками, проникают в них, расщепляют клеточную РНК и вызывают гибель клеток по механизму апоптоза, сопровождающегося мембранным блеббингом, межнуклеосомным расщеплением ДНК, появлением фосфатидилсерина на внешней стороне мембраны и активацией каспазы-3.

4. Разработан подход для флуоресцентной детекции опухолевых клеток, гиперэкспрессирующих EGFR и ERBB2, с использованием иммунобарназных конъюгатов, содержащих мини-антитела scFv 425 и scFv 4D5, и белка EGFP барстар.

5. Создан вектор для эукариотической тетрациклин-контролируемой экспрессии иммунобарназного конъюгата scFv 4D5-барназа, состоящего из анти-ERBB2-мини антитела и барназы.

6. Показано, что иммунобарназный конъюгат scFv 4D5-дибарназа не обладает системной токсичностью в мышах BDF1, подавляет рост привитых человеческих опухолей молочной железы SKBR-3 в бестимусных мышах BALB/c nude и может быть рекомендован для дальнейших доклинических исследований.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Balandin T G, Edelweiss E, Andronova N V, Treshalina E M, Sapozhnikov A M, Deyev S M. Antitumor activity and toxicity of anti-HER2 immunoRNase scFv 4D5 dibarnase in mice bearing human breast cancer xenografts //Invest New Drugs, – 2009. – Sep 30. – DOI 10.1007/s10637-009-9329-2.

2. Edelweiss E., Balandin T. G., Ivanova J. L., Lutsenko G. V., Leonova O. G., Popenko V. I., Sapozhnikov A. M., Deyev S. M. Barnase as a new therapeutic agent triggering apoptosis in human cancer cells //PLoS One. – 2008. – V. 18, – P. e2434.

3. Semenyuk E. G., Stremovskiy O. A., Edelweiss E. F., Shirshikova O. V., Balandin T.

G., Buryanov Y. I., Deyev S. M. Expression of single-chain antibody-barstar fusion in plants // Biochimie. – 2007. – V. 89. – Р. 31-38.

4. Лебеденко Е. Н., Баландин Т. Г., Эдельвейс Э. Ф., Георгиев О., Моисеева Е. С., Петров Р. В., Деев С. М. Визуализация раковых клеток с помощью флуоресцентного белка ЕGFP-барназа //Докл. РАН. – 2007. – Т. 414. – C. 120-123.

5. Глинка Е. М., Эдельвейс Э. Ф., Деев С. М. Эукариотические экспрессирующие векторы и иммуноконъюгаты для терапии рака //Биохимия. – 2006. – Т. 71. – С. 597 606.

6. Glinka E. M., Edelweiss E. F., Sapozhnikov A. M., Deyev S. M. A new vector for controllable expression of an anti-ERBB2/neu mini-antibody-barnase fusion protein in HEK 293T cells //Gene. – 2006. – V. 366. – Р. 97-103.

Патенты:

1. Деев С. М., Эдельвейс Э. Ф., Баландин Т. Г., Стремовский О. А., Урусов А. Е., Ермоленко Д. Н., Жердев А. В., Дзантиев Б. Б. Способ иммунофлуоресцентного определения локализации антигенов //Патент RU 2350959 C2. – № 9. – 2009.

2. Дзантиев Б. Б., Ермоленко Д. Н., Урусов А. Е., Жердев А. В., Баландин Т. Г., Эдельвейс Э. Ф., Стремовский О. А., Деев С. М. Способ иммуноферментного определения антигенов //Патент RU 2303783 C1. – № 21. – 2007.

Тезисы конференций:

1. Гук К. Д., Лысенко А. А., Стремовский О. А., Эдельвейс Э. Ф., Баландин Т. Г., Сапожников А. М., Деев С. М. Направленная доставка БТШ70 на поверхность опухолевых клеток с использованием системы барназа-барстар. XX зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико химической биологии и биотехнологии» (Москва, 11-15 февраля, 2008), Тезисы докладов и стендовых сообщений. C. 115.

2. Деев С. М., Баландин Т. Г., Эдельвейс Э. Ф., Стремовский О. А., Акципетрова Е.

О., Здобнова Т. А., Лебеденко Е. Н., Лукаш С. В. Генно-инженерные антитела для диагностики и терапии рака. III Российский симпозиум “Белки и пептиды”, (Пущино, 16-21 сентября, 2007), Сборник тезисов, C. 46.

3. Deyev S. M., Aktsipetrova E. O., Balandin T. G., Edelweiss E. F., Lebedenko E. N., Moiseeva E., Semenyuk E. G., Stremovskiy O. A., Zdobnova T. A. Fluorescent visualization of tumor cells. International Symposium “Topical Problem of Biophotonics – 2007”, (Nizhny Novgorod, August 4-11, 2007), Proceeding. Р. 75-76.

4. Гук К. Д., Лысенко А. А., Стремовский О. А., Эдельвейс Э. Ф., Баландин Т. Г., Сапожников А. М., Деев С. М. Разработка нового подхода к противоопухолевой иммунотерапии. XIX зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», (Москва, 7-9 февраля, 2007), Тезисы докладов и стендовых сообщений, С. 60.

5. Edelweiss E., Balandin T., Moiseeva E., Deyev S.M. Complex immunotoxin based on barnase-barstar connectivity selectively cytotoxic to ERBB2-positive human breast and ovarian cancer cells. Familial Cancer Conference, (Madrid, Spain, June 15-16, 2006), Abstracts, Р. 55.

6. Эдельвейс Э. Ф., Баландин Т. Г., Луценко Г. В., Сапожников А. М., Деев С. М.

Барназа – новый агент для эффективной селективной супрессии человеческих раковых клеток. X Всероссийский Форум с международным участием им. академика В. И. Иоффе “Дни иммунологии в Санкт-Петербурге”, (Санкт-Петербург, 29 мая- июня, 2006), Медицинская иммунология, 2006, 8: 359-360.

7. Деев С. М., Эдельвейс Э. Ф., Баландин Т. Г., Лебеденко Е. Н., Каменский В. А., Турчин И. В., Плеханов В., Балалаева И. В., Орлова А. Г., Шахова Н. М. Новый комбинированный подход к диагностике рака молочной железы. «Фундаментальные науки – медицине», (Москва, 27-29 ноября, 2006), Сборник тезисов, с. 54-55.

8. Balandin T. G., Edelweiss E. F., Ivanova Iu. L., Deyev S. M. A new immunoRNase 4D5 scFv-dibarnase-His5 is selectively cytotoxic for HER2/neu-overexpressing cells of human breast carcinomas. 19th Meeting of European Association for Cancer Research, (Budapest, Hungary, July 1-4, 2006), Proceedings of 19th Meeting of European Association for Cancer Research, p. 118.

9. Иванова Ю. Л., Леонова О. Г., Эдельвейс Э. Ф., Баландин Т. Г., Попенко В. И., Деев С. М. Электронномикроскопическое выявление Р185 her2 антигена с помощью комплекса barnase-barstar-коллоидное золото. XXI Российская конференция по электронной микроскопии, (Черноголовка, 5-10 июня, 2006), Сборник тезисов, С.

230.

10. Эдельвейс Э. Ф., Баландин Т. Г., Лебеденко Е. Н., Лукаш С. В., Луценко Г. В., Сапожников А. М., Деев С. М. ИммуноРНКаза 4D5 scFv-дибарназа-His избирательно токсична для клеток человеческой аденокарциномы яичника SKOV3.

IX Всероссийский научный Форум с международным участием им. академика В. И.

Иоффе “Дни иммунологии в Санкт-Петербурге”, (Санкт-Петербург, 23-26 мая, 2005), Медицинская Иммунология, 2005, Т.7, №2-3, С. 128-129.

11. Трещалина Е. М., Андронова Н. В., Степанова Е. В., Филоненко Д. В., Барышников А. Ю., Деев С. М., Эдельвейс Э. Ф. Адаптация клеточных линий рака яичника SKOV3 и рака молочной железы человека SKBR3 c гиперэкспрессией Her 2/neu к росту у nude мышей. IV Всероссийская научно-практическая конференция «Отечественные противоопухолевые препараты», (Москва, 16-18 марта, 2005), Российский биотерапевтический журнал, 2005, №1., С. 91.

12. Edelweiss E. F., Glinka E. M., Deyev S. M. The changing of internalization ability of anti-ERBB2/neu antibody by using protein transduction domain. 18th meeting of the European Association for Cancer Research, (Innsbruck, Austria, July 3-6, 2004), Abstract.

Р. 316.

13. Эдельвейс Э. Ф., Баландин Т. Г., Кузнецова Е. М., Степанова Е. В., Барышников А. Ю., Деев С. М. Оценка НER2/neu статуса опухолей у больных раком молочной железы с использованием анти-НER2/neu-мини-антитела. VIII Всероссийский научный Форум с международным участием им. академика В. И. Иоффе “Дни иммунологии в Санкт-Петербурге”, (Санкт-Петербург, 27-30 сентября, 2004), Медицинская Иммунология, 2004, Т.6, №3-5, С. 263.

14. Баландин Т. Г., Эдельвейс Э. Ф., Моисеева Е. С., Лебеденко Е. Н., Сапожников А. М., Деев С. М. Флуоресцентная визуализация раковых клеток с помощью анти НER2/neu мини-антител и модуля барназа•барстар. VIII Всероссийский научный Форум с международным участием им. академика В. И. Иоффе “Дни иммунологии в Санкт-Петербурге”, (Санкт-Петербург, 27-30 сентября, 2004), Медицинская Иммунология, 2004, Т.6, №3-5, С. 220.

15. Эдельвейс Э. Ф., Баландин Т. Г., Лебеденко Е. Н., Лукаш С. В., Луценко Г. В., Сапожников А. М., Стремовский О. А., Деев С. М. Иммуноконъюгат анти-HER 2/neu-мини-антитело-барназа избирательно токсичен для клеток человеческой аденокарциномы яичника SKOV-3. VI чтения, посвященные памяти академика Ю.

А. Овчинникова, (Москва-Пущино, Россия, 25 ноября - 2 декабря, 2002), Тезисы докладов. С. 33.