Изучение химерных растений brassica napus l. при генетической трансформации
На правах рукописи
ХОАНГ ТХИ ЖАНГ ИЗУЧЕНИЕ ХИМЕРНЫХ РАСТЕНИЙ BRASSICA NAPUS L.
ПРИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ Специальности: 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.01.05 – физиология и биохимия растений
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
МОСКВА – 2011
Работа выполнена на кафедре генетики и биотехнологии Российского государственного аграрного университета – МСХА имени К.А. Тимирязева и в лаборатории физиологических и молекулярных механизмов адаптации Института физиологии растений имени К.А. Тимирязева РАН
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Калашникова Елена Анатольевна кандидат биологических наук, Ралдугина Галина Николаевна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Поляков Алексей Васильевич доктор биологических наук, профессор Чуб Владимир Викторович
Ведущая организация: Филиал Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова
Защита диссертации состоится "08" февраля 2012 г. в 1630 часов на заседании диссертационного совета Д220.043.10. при Российском государственном аграрном университете – МСХА имени К.А. Тимирязева, по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, д. 49, тел./факс (499) 976-24-92, (499) 976-08-
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Н.И. Железнова РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева
Автореферат разослан "30" декабря 2011 г.
и размещен на сайте www.timacad.ru
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Л.С. Большакова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В настоящее время трансформация растений является актуальным направлением исследований в биотехнологии и может быть практическим методом для улучшения растений. Она позволяет решать задачи селекции биологических объектов на устойчивость, высокую продуктивность и качество продукции. Однако при трансформации растений возникают определенные трудности, в том числе связанные с получением химер среди трансформантов.
При изучении наследования в растениях чужеродных генов для большинства трансгенных растений было показано, что трансгены, как правило, наследуются в потомстве самоопыленных трансгенных растений в отношении 3:1, как единый менделевский признак. Однако в некоторых случаях наблюдается наследование в других отношениях, например, только в из 50 семян трансгенного табака содержался встроенный ген nptII (Schmlling, Schell, 1993). Это затрудняет дальнейшую работу с полученными трансформантами. Поэтому, для создания генетически однородных растений трансформантов очень важно знать причины подобного явления, одной из которых может быть образование химер, то есть организмов, состоящих из генетически неоднородных клеток и чтобы исключить их формирование.
Химерность растений-трансформантов описывалась у некоторых видов, например, табака (Schmlling, Schell, 1993;
Faize et al., 2010), сои (Christou, 1990), картофеля (Rakosy-Tican et al., 2007), риса (Christou, Ford, 1995), льна (Dong, McHughen, 1993), капусты (Berthomieu et al., 1994) и земляники (Mathews et al., 1995), а также у древесных плодовых растений, например, у яблони (Flachowsky et al., 2008), или у цитрусовых (Costa et al., 2002).
Полученные в некоторых случаях химеры составляли до 90% растений регенерантов. Авторы по-разному объясняют причины возникновения химерных растений: результатом происхождения растений не из одной клетки, а из группы клеток первичного экспланта (Poethig, 1989;
Zhu et al., 2007);
последствием защиты нетрансформированных клеток от действия селективного фактора трансформированными клетками (Park et al., 1998;
Domnguez et al., 2004) или неэффективностью селективных агентов совместно с эндогенной толерантностью (Rakosy-Tican et al., 2007). Однако этот вопрос совершенно не исследован, и авторы, показавшие образование химерных трансгенных растений, не обсуждают причины этого феномена. Выяснение механизмов образования химерных растений позволило бы исключить условия их возникновения.
Цель и задачи исследований. Цель данной работы – изучить химерные растения Brassica napus, полученные при проведении генетической трансформации и выяснить причины их образования.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
1. Изучить влияние различных факторов питательной среды на морфогенетическую активность изолированных эксплантов при трансформации изучаемых сортов рапса.
2. Изучить образование химерных растений рапса после генетической трансформации.
3. Исследовать экспрессию встроенного гена gfp на этапах каллусообразования и морфогенеза.
4. Провести анализ растений-трансформантов рапса на наличие встроенного гена gfp.
5. Проверить потомство трансгенных растений на наследование встроенного гена gfp.
6. Провести биохимический анализ семян трансгенных и исходных растений рапса.
Научная новизна работы. Оптимизированы условия регенерации и трансформации разных сортов рапса с использованием семядольных и листовых эксплантов. Результаты по протоколу регенерации ярового рапса сорта Подмосковный являются оригинальными и проведены впервые.
Получены трансформированные растения из листовых эксплантов сорта Westar и Подмосковный. Впервые проведена трансформация растений рапса без применения селективного фактора и определено его влияние на эффективность трансформации. Впервые установлено влияние содержания сахарозы в среде для морфогенеза на дифференциацию побегов, полученных на листовых эксплантах рапса, а также на эффективность трансформации. Выявлены существенные различия в свечении белка GFP в зависимости от первичного экспланта и стадии развития растений-регенерантов. Анализ растений Т показал, что у трансгенных растений наследование гена gfp зависит от типа исследуемого экспланта. Установлены факторы, оказывающие влияние на проявление неменделевского наследования встроенного гена у трансгенных растений рапса, которые, вероятно, связаны с образованием генотипических химер. Показано, что основным фактором проявления этого является тип первичного экспланта. Выявлено, что расхимеривание не зависит от расположения стручков на цветоносе, но зависит от числа черенкований растений-трансформантов.
Практическая ценность работы. Полученные трансгенные растения рапса с маркерным геном gfp, кодирующим зеленый флуоресцирующий белок, являются модельным объектом для изучения образования химерных трансгенных растений. Разработанная система получения трансгенных растений рапса может применяться на других сельскохозяйственных растениях, а полученные результаты могут быть использованы в учебном процессе в курсе дисциплины "Сельскохозяйственная биотехнология".
Апробация работы. Результаты работы были представлены на: VII Международной конференции "Молекулярная генетика соматических клеток" (Звенигород, Москва, 2009);
Международной конференции "Molecular aspects of plant development" (Вена, Австрия, 2010);
X молодежной научной конференции "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии" (Москва, 2010);
III Всероссийском симпозиуме "Физиология трансгенного растения и фундаментальные основы биобезопасности" (Москва, 2010);
Международной конференции "Plant Transformation Technologies II" (Вена, Австрия, 2011);
Международной научной конференции молодых ученых и специалистов (Москва, 2011);
XI молодежной научной конференции "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии" (Москва, 2011);
Международной конференции "Физиология растений – фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий" (Нижний Новгород, Россия, 2011);
VIII Международной конференции "Молекулярная генетика соматических клеток" (Звенигород, Россия, 2011);
2-й Международной школе конференции молодых ученых "Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях" (Звенигород, Россия, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе статья опубликована в рецензируемом издании, рекомендованном ВАК РФ.
Структура и обьем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 123 страницах, включает 13 таблиц и 14 рисунков. Список литературы содержит 270 источников, в том числе 235 на иностранных языках.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объектом исследования служили два сорта ярового рапса (Brassica napus L.): Westar (канадской селекции) и Подмосковный (селекции ВНИИ кормов им.
В.Р. Вильямса). В качестве экспланта использовали семядоли, изолированные от пятисуточных стерильных проростков и листовые сегменты, полученные от 6-ти недельных растений-регенерантов. Семена стерилизовали 70% спиртом и 20% раствором гипохлорита натрия, после чего промывали стерильной дистиллированной водой, а затем высаживали на безгормональную агаризованную среду Мурасиге и Скуга (МС) (Murashige, Skoog, 1962), и помещали на сутки в темноту, после чего переносили в световую камеру.
Для трансформации использовали агробактерию Agrobacterium tumefaciens штамма AGL0, содержащую генетическую конструкцию с маркерным геном gfp под контролем промотора 35S вируса мозаики цветной капусты и селективным геном nptII, с использованием для обоих генов nos терминаторов (конструкция была получена от сотрудников кафедры вирусологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова). Культуру агробактерий выращивали в течение суток при 25-26°С на шейкере в жидкой среде LB, содержащей 50 мг/л рифампицина и 50 мг/л канамицина (Км).
Для получения трансгенных растений применяли метод совместного культивирования эксплантов с агробактерией, находящейся на поверхности агаризованной среды (Данилова и др., 2009) по ранее разработанному протоколу (Малышенко и др., 2003). После 2-х суток сокультивирования семядольные экспланты переносили на среду для морфогенеза (среда МС, 1% сахароза, 4 мг/л или 8 мг/л 6-бензиламинопурин (БАП), 0,5 мг/л или 1,0 мг/л нафтилуксусная кислота (НУК)), дополненную антибиотиком цефатоксим (Цф) (800 мг/л) и 3 мг/л абсцизовой кислотой (АБК) и помещали в световую камеру.
По истечению двух недель, в одних экспериментах семядольные экспланты переносили на среду для морфогенеза без AБК, дополненную Цф 500 мг/л и без добавления Км. В других экспериментах семядольные экспланты переносили на такую же среду, но с добавлением 15 мг/л Км.
Листовые экспланты после сокультивирования переносили на среду для морфогенеза, содержащую 4, 5, 8 мг/л БАП, 1 мг/л НУК, 3 мг/л АБК, 3 мг/л AgNO3, 800 мг/л Цф, а также сахарозу: 1% или 0,7%. После двух недель культивирования листовые экспланты переносили на среду для морфогенеза без добавления AБК, но дополненную Цф 500 мг/л.
Через 2 – 3 недели сформировавшиеся побеги пересаживали на питательную среду для дальнейшего их укоренения и роста. В состав питательной среды на этих этапах был включен Цф в концентрациях 500 и мг/л, соответственно.
Свечение зеленого флуоресцентного белка GFP наблюдали при использовании флуоресцентного микроскопа или лупы при освещении синим светом (440-480 нм).
Трансгенные растения Т0 обоих сортов были дважды расчеренкованы и высажены в почву в условиях фитотрона для получения потомков Т1. Семена из каждого стручка высевали отдельно.
Трансформанты и потомки T1 проверяли на наличие гена gfp методом ПЦР анализа c использованием праймеров: eGFP-FW 5’ CCTGAAGTTCATCTGCACCAC-3’;
eGFP-RV 5’ ACTCCAGCAGGACCATGTGAT-3’ при амплификации по следующему протоколу: 94С – 4 мин, 30 циклов (94С – 60 сек, 64С – 60 сек, 72С – 60 сек), 72С – 4 мин. Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса бактериальных колоний. ДНК растений для ПЦР-анализа выделяли по методу T.M. Fulton et al. (1995).
Амплифицированные фрагменты разделяли электрофорезом в 0,8% агарозном геле, который окрашивали бромиcтым этидием и фотографировали в ультрафиолетовом свете.
Содержание белка и жирных кислот определяли в семенах трансгенных растений и исходного сорта Westar по методике В.М. Косолапова и др. (2011) и Г.А. Бережной и др. (1988), соответственно.
Все опыты оставлены в трехкратной биологической повторности. Частоту регенерации определяли в процентах как отношение числа эксплантов, образовавшие побеги, к общему числу эксплантов, помещенных на среду, инициирующую морфогенез. Результаты экспериментов обработаны с использованием программы Excel. Критерий 2 рассчитывали по методике А.В.
Смиряева и А.В. Кильчевского (2007).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Влияние различных факторов питательной среды на морфогенетическую активность изолированных эксплантов изучаемых сортов рапса Для успешной генетической трансформации растений на первом этапе необходимо было изучить факторы, влияющие на способность к регенерации семядольных и листовых эксплантов, с целью получения высокой частоты побегообразования.
Для растений вида Brassica napus многие исследователи наблюдали зависимость морфогенетического потенциала от генотипа, источника экспланта, применения регуляторов роста и их соотношения (Ono et al., 2000;
Tang et al., 2003;
Ben Ghnaya et al., 2008;
Ravanfar et al., 2009;
Khan et al., 2010).
На начальном этапе исследований требовалось определить эффективные регуляторы роста и их концентрации для повышения морфогенетической активности изолированных эксплантов. В качестве цитокининов использовали 6-БАП в концентрациях 4, 5 или 8 мг/л, а в качестве ауксинов – НУК в концентрациях 0,5 или 1 мг/л.
Ранее было показано (Crouch, Sussex, 1981;
Ghasemi et al., 2007;
Haddadi et al, 2008), что АБК способствует усилению побегообразования в каллусных тканях различных видов Brassica, поэтому было интересно проверить действие АБК (3 мг/л) на регенерационную способность семядольных эксплантов изучаемых сортов рапса (табл.1).
Таблица 1. Влияние сорта и регуляторов роста на морфогенез изолированных эксплантов рапса Частота регенерации, % Концентрация регуляторов роста, семядольных эксплантов листовых эксплантов мг/л БАП НУК АБК с. Westar с. Подмосковный с. Westar с. Подмосковный 0 13,4 ± 0,1 0 - 3,0 - 35,9 ± 12,0 - 0 11,7 ± 0,1 4,7 ± 0,1 - 4,0 0, 3,0 89,0 ± 7,8 92,2 ± 0,1 - 0 18,3 ± 0,1 14,1 ± 0,2 - 1, 3,0 83,6 ± 10,0 37,5 ± 13,0 51,4 ± 17,2 7,1 ± 0, 0 10,4 ± 0,1 6,9 ± 0,1 - 8,0 1, 3,0 91,1 ± 0,1 72,7 ± 12,1 56,3 ± 17,9 47,9 ± 14, 5,0 1,0 3,0 - - 70,1 ± 14,7 46,3 ± 13, «-» - не проверяли Из данных табл. 1 следует, что на частоту регенерации побегов на семядольных эксплантах изучаемых сортов существенное влияние оказало добавление в питательную среду АБК, увеличив её в 7-8 раз. Для с. Westar на семядольных эксплантах частота регенерации составила до 91,1% на среде, содержащей 8 мг/л БАП, 1 мг/л НУК и 3 мг/л АБК, а для с. Подмосковный – 92,2% на среде, содержащей 4 мг/л БАП, 0,5 мг/л НУК и 3 мг/л АБК.
Исходя из полученных результатов, в дальнейших экспериментах при изучении регенерации на листовых эксплантах мы использовали среды с обязательным добавлением АБК.
На листовых эксплантах с. Westar наибольшую частоту побегообразования (70,1%) получали при концентрации 5 мг/л БАП, 1 мг/л НУК и 3 мг/л АБК, а для с. Подмосковный (47,9%) – 8 мг/л, 1 мг/л и 3 мг/л, соответственно (табл. 1).
Регенерацию побегов наблюдали по срезанному краю как семядольных, так и листовых эксплантов. Эта особенность может играть положительную роль при проведении трансформации, так как известно, что трансформация и пролиферация трансформированных клеток происходят, как правило, вокруг раневой поверхности.
Экспериментально установлено, что на одних и тех же эксплантах нередко наблюдали оба типа органогенеза – как корне-, так и побегообразование.
Однако в зависимости от типа первичного экспланта образование меристематических зон происходило по-разному. На семядольных эксплантах побеги формировались из небольшой каллусной ткани, которая образовывалась на черешке семядолей, а на листовых эксплантах – во многих местах вдоль срезанного края первичного экспланта, минуя образование каллуса. Несмотря на то, что частота регенерации на листовых эксплантах значительно ниже, чем на семядольных, суммарное число побегов, полученных в этом варианте, было выше. Следует отметить, что растения-регенеранты, формирующиеся на листовых сегментах, как правило, характеризовались слабой дифференцировкой и подвергались витрификации.
Было исследовано и влияние содержания сахарозы в среде для морфогенеза на получение растений-регенерантов с неизмененной морфологией на листовых эксплантах с. Westar (табл.2). В результате исследований было установлено, что понижение концентрации сахарозы приводило к некоторому повышению частоты образования побегов и к уменьшению их витрификации.
Таблица 2. Влияние сахарозы на частоту дифференцированных побегов Концентрация сахарозы, % Частота дифференцированных побегов, % 1,0 7,6 ± 0, 0,7 8,7 ± 0, Таким образом, результаты исследований свидетельствуют, что регенерационный потенциал рапса зависит от сорта, типа первичного экспланта, а также от класса и концентрации применяемых регуляторов роста.
Разработанный нами протокол регенерации различных сортов рапса позволил получать в достаточном количестве растения-регенеранты для проведения дальнейшей работы по генетической трансформации.
2. Трансформация двух типов эксплантов рапса Следующим этапом нашей работы было проведение агробактериальной трансформации рапса.
2.1. Освобождение эксплантов от бактериальной инфекции Одной из основных проблем трансформации растений с помощью Agrobacterium tumеfaciens является освобождение эксплантов от бактерий после сокультивирования. В наших исследованиях был использован цефотаксим в качестве антибиотика для элиминации агробактерий. По литературным данным при проведении трансформации Цф входит в состав питательной среды в концентрациях от 100 до 500 мг/л (Данилова, Долгих, 2004;
Bade, Damm, 1993;
Khan et al., 2003;
Khan et al., 2009). В нашей работе с целью полной элиминации агробактерий, Цф добавляли в питательную среду в концентрации 800 мг/л на этапе индукции образования побегов с последующим его постепенным уменьшением в среде до 300 мг/л – на этапе черенкования и укоренения.
2.2. Влияние сорта и регуляторов роста на частоту регенерации при агробактериальной трансформации Известно, что при проведении трансформации агробактерии сильно ингибируют побегообразование. Этот факт отмечен и в наших исследованиях.
Регенерация снизилась на 10-50% в зависимости от исследуемого сорта и первичного экспланта (табл. 3). Установлено, что среда, содержащая 8 мг/л БАП, 1 мг/л НУК и 3 мг/л АБК, была оптимальной для проведения трансформации как на семядольных, так и на листовых эксплантах обоих сортов рапса. Наиболее высокой регенерационной способностью обладали семядоли – 79,9% у с. Подмосковный и 70,5% у с. Westar. На листовых эксплантах частота побегообразования была ниже и составила 66,1% у с. Westar и 30,9% у с. Подмосковный.
Таблица 3. Влияние регуляторов роста на частоту регенерации при трансформации эксплантов различных сортов рапса Концентрация Частота регенерации при трансформации, % регуляторов роста, семядольных эксплантов листовых эксплантов мг/л БАП НУК АБК с. Westar с. Подмосковный с. Westar с. Подмосковный 0,5 3,0 62,7 ± 7,5 37,6 ± 9,5 - 4, 1,0 3,0 61,1 ± 13,3 69,4 ± 6,9 20,8 ± 9,6 8,0 1,0 3,0 70,5 ± 9,3 79,9 ± 5,5 66,1 ± 12,7 30,9 ± 12, 5,0 1,0 3,0 - - 15,3 ± 0,2 42,1 ± 16, «-» - не проверяли Полученные результаты показали, что регенерационная способность побегов при проведении агробактериальной трансформации также зависела от сорта, типа эксплантов и компонентов питательной среды.
3. Анализ растений-трансформантов Наличие гена gfp в трансформированных растениях было подтверждено с помощью ПЦР-анализа ДНК, выделенной из растений-трансформантов. В качестве отрицательного контроля использовали ДНК исходного растения, в качестве положительного – плазмидную ДНК вектора pA3011. На рис. 1, можно видеть четкие полосы, специфичные для гена gfp. Длина амплифицируемого фрагмента составляла 539 н.п. и соответствовала рассчитанной.
Рис. 1. Электрофореграмма продуктов ПЦР ДНК растений рапса со специфичными к гену gfp праймерами: М – маркер 1Kb;
С+ – положительный контроль;
С- – отрицательный контроль;
W – дистиллированная вода;
1-8 – ДНК трансгенных растений рапса Таким образом, в ДНК полученных растений-регенерантов после проведения трансформации было подтверждено наличие гена gfp.
3.1. Влияние типа эксплантов на частоту трансформации При ПЦР-проверке трансформантов на наличие встраиваемого гена gfp было показано, что при использовании семядольных эксплантов число трансгенных побегов составило для с. Westar и с. Подмосковный 71,8% и 74,1%, соответственно, тогда как на листовых эксплантах их число было значительно меньше и составило 47,1% и 28,6%, соответственно (табл. 4).
Таблица. 4. Влияние типа экспланта на образование растений, экспрессирующих ген gfp Число ПЦР «+» на Число полученных Сорт рапса Тип экспланта ген gfp растений с растений, шт.
флюоресценцией, шт.
семядоли 131 94 (71,8 %) Westar лист 17 8 (47,1 %) семядоли 81 60 (74,1%) Подмосковный лист 7 2 (28,6%) Таким образом, при использовании семядольных эксплантов эффект агробактериальной трансформации был вдвое выше, чем при использовании листовых эксплантов, то есть, очевидна зависимость эффективности трансформации от типа исследуемых эксплантов.
3.2. Влияние антибиотика канамицина на частоту трансформации Для оценки действия селективного агента антибиотика Км во втором пассаже семядольные экспланты культивировали на двух вариантах сред: 1) без применения Км, 2) с добавлением 15 мг/л Км. Известно, что действие Км приводит к разрушению хлорофилла у чувствительных побегов. Через 3 недели зеленые побеги, образовавшиеся на среде для морфогенеза, отделяли от эксплантов и переносили на среду для роста побегов без добавления Км.
Устойчивость к Км полученных растений была подтверждена экспрессией гена nptII. Для доказательства трансгенности полученных после отбора на Км зеленых растений проводили ПЦР-анализ на наличие гена gfp (табл. 5).
Таблица 5. Влияние канамицина на частоту трансформации на семядольных эксплантах Общее Число Число ПЦР «+» на ген gfp, Частота число белых зеленых среди канамицин- трансформации, Сорт рапса побегов, побегов, побегов, устойчивых % шт. шт. шт. растений, шт.
Westar 199 126 37 15 40, Подмосковный 174 128 20 9 45, ПЦР-анализ ДНК растений-трансформантов, устойчивых к Км, показал наличие гена gfp только у 15-ти зеленых растений с. Westar и у 9-ти зеленых растений с. Подмосковный. Частоту трансформации рассчитывали как отношение числа ПЦР-положительных на ген gfp канамицин-устойчивых растений к общему количеству канамицин-устойчивых растений. Частота трансформации семядольных эксплантов рапса при применении Км в качестве селективного агента, составила 40-45%, то есть результаты показали, что не все растения, устойчивые к Км, являются трансгенными. При сопоставлении с ранее полученными результатами (табл. 4) установлено, что при добавлении Км в среду для морфогенеза частота трансформации значительно уменьшается.
Мы предположили, что получение сравнительно небольшого числа трансформированных растений, несущих ген gfp, связано с тем, что не все растения, имеющие ген nptII, имели и ген gfp. Для подтверждения этого была проведена оценка наличия белка GFP у белых и зеленых побегов с применением флуоресцентного микроскопа. Результаты показали, что среди неустойчивых к Км побегов были обнаружены побеги, светящиеся зеленым цветом, а у некоторых зеленых побегов флуоресценцию GFP не наблюдали.
3.3. Влияние концентрации сахарозы на частоту трансформации листовых эксплантов Ранее было исследовано влияние содержания сахарозы в среде для морфогенеза на выход растений-регенерантов листовых эксплантов с. Westar.
При проведении трансформации также изучали влияние концентрации сахарозы на частоту получения растений-трансформантов (табл. 6).
Таблица 6. Влияние сахарозы на частоту трансформации листовых эксплантов с. Westar Концентрация сахарозы, % Частота трансформации, % 1,0 0,7 66,7 ± 19, Полученные результаты показывают, что частота трансформации зависела от концентрации сахарозы в питательной среде: при наличии 1% сахарозы трансгенные растения не были обнаружены, в то время как на среде с применением 0,7% сахарозы частота трансформации была достаточно высокой и составляла 66,7%.
4. Микроскопический анализ экспрессии гена gfp Образовавшиеся в процессе морфогенеза структуры анализировали в люминесцентном микроскопе. По мнению К. Эсау (1969) у большинства видов двудольных растений апикальная меристема состоит из корпуса и туники, которая часто разделена на 3 поверхностных слоя, в некоторых случаях изменяющиеся от 0 до 6 (Romberger, 1963). Отдельные поверхностные слои клеток обозначают L1, L2, L3 и относят к тунике. Из слоя L1 туники у двудольных обычно формируется только эпидермис. L2 формирует подэпидермальную ткань, и этот же слой участвует в формировании флоральных органов. Листья обычно формируются из слоя L2 или из слоев L и L3, а из слоя L3 формируется внутренняя ткань. Стебель и ткани корня возникают из слоя L3. Поэтому интересно было по свечению белка GFP посмотреть образование тканей на первых стадиях органогенеза, чтобы понять какие слои туники участвуют в процессе формирования трансгенных растений Визуализация белка GFP была проведена на всех стадиях развития трансформированных растений – как на стадии первичного морфогенеза при образовании побегов, так и на всех стадиях развития растений в почве.
4.1. Экспрессия гена gfp в каллусной ткани и образовавшихся из нее побегах Флюоресценцию белка GFP определяли в клетках морфогенной каллусной ткани, в частности, в меристематических зонах корня и адвентивных почек.
Визуально установлено, что свечение GFP наблюдалось в основном в клетках, расположенных в поверхностном слое каллуса (рис. 2,Б), или в клетках апикальной меристемы (рис. 2,Г), меристемы корня (рис. 2,А), а также в клетках проводящей системы. Причем на одной каллусной ткани можно наблюдать одновременное формирование и меристемы корня, и меристемы апекса (рис. 2,Г). При дифференцировке корня свечение белка GFP наблюдали в периферийной зоне (рис.2,В), а при дифференцировке почек обнаружена флюоресценция белка GFP почти во всех клетках (примордии, меристема, проводящая система) (рис. 2,Д).
4.2. Экспрессия гена gfp в полученных трансформированных растениях При наблюдении трансформированных растений во флуоресцентном микроскопе было видно, что у многих из них отмечалось интенсивное свечение белка GFP. Это свидетельствует об экспрессии гена gfp в клетках растений.
Причем в разных частях растений интенсивность свечения была различна. Так, например, у побегов свечение GFP наблюдали в листьях разных ярусов. При этом на одном и том же растении свечение было значительно ярче на старых листьях, чем на молодых (рис. 2,Е и Ж). По всей вероятности это связано с накоплением белка в зрелых клетках. В некоторых листьях свечение белка GFP наблюдали только в группах клеток, тогда как основная ткань листа не флуоресцировала (рис. 2,З).
На листьях растений-регенерантов свечение GFP лучше проявлялось на жилках, трихомах и устьицах (рис. 2И, К, Л). Белок GFP сильнее всего светился в клетках вокруг трихомы. Менее интенсивное свечение наблюдали на устьицах и жилках.
Исследования также показали, что при наблюдении листьев под флуоресцентной лупой отмечалось сильное свечение всех клеток главной жилки (рис. 2М), а с увеличением порядка жилкования интенсивность свечения уменьшалась, но была сильнее, чем в клетках мезофилла и эпидермиса.
Флуоресценция белка GFP была также обнаружена и в стебле (рис. 2,Н).
Обнаруженная флуоресценция белка GFP в различной ткани трансгенных растений не позволила нам сделать однозначный вывод об участии определенных слоев апикальной меристемы в формировании трансгенных растений. Трансформированные ткани могли происходить из всех слоев меристематической туники.
4.3. Экспрессия гена в генеративных органах gfp трансформированных растений Для проведения последующих исследований трансгенные растения с целью получения семян были высажены в закрытый грунт. Цветки этих растений были проанализированы с помощью флюоресцентного микроскопа. В результате было установлено, что свечение GFP наблюдалось в лепестках трансформированных растений (рис. 2,Р) и не наблюдалось в лепестках исходного образца (рис. 2,П), причем интенсивность свечения была ярче выражена в клетках проводящей системы. Кроме того, свечение белка GFP было обнаружено в пыльниках и пыльце трансгенных растений (рис. 2,Т и Ф).
У исходных растений также наблюдали слабое зеленое свечение пыльцы (рис.
2,С и У), по-видимому, связанное с автофлюоресценцией одного из растительных белков. Однако следует отметить, что люминесценция белка GFP в трансгенных растениях была значительно интенсивнее.
Рис 2. Экспрессия гена gfp в разных тканях: А, Б – поперечный срез каллуса: 1 – меристемоидные образования корней, 2 – каллус;
В – срез ризоидного образования;
Г – поперечный срез каллуса с формирующейся почкой: 1 – образование почки, 2 – образование корня;
Д – срез меристемы;
Е – старый лист;
Ж – молодой лист;
З – листовая пластинка;
И - устьица;
К – трихома листа;
Л – жилка листа;
М – главная жилка листа при увеличении 80Х;
Н – трансгенный побег;
О – срез ткани пыльника;
П – лепесток исходного растения;
Р – лепесток трансгенного растения;
С – пыльник исходного растения;
Т – пыльник трансгенного растения;
У – пыльца исходного растения;
Ф – пыльца трансгенного растения 4.4. Локализация белка GFP в клетках трансгенных растений Представляло интерес изучение мест локализации белка в различных органах и клетках трансгенных растений. Наиболее четкое доказательство о его локализации было получено при анализе пыльников. Обнаружено, что белок накапливается в клеточных стенках и располагается равномерно в виде отдельных телец по всему периметру клетки (рис.2,О). Исходя из данных других авторов (Замятнин, 2002;
Горшкова, 2003;
Hefferon et al., 1997;
Solovyev et al., 2000;
Cowan et al., 2002) мы предположили, что одним из мест локализации белка GFP может быть плазматическая мембрана или структуры эндоплазматического ретикулума, сконцентрированные в районах плазмодесм.
Таким образом, подводя итоги исследований по микроскопическому анализу трансгенных растений, можно заключить, что присутствие флюоресцирующего белка GFP в клетках различных органов и тканях растений-трансформантов, является доказательством встраивания гена gfp в геном растений рапса и его трансляция.
Однако из представленных результатов остается неясным вопрос о происхождении трансформантов из клеток имеющих или не имеющих ген gfp.
Поэтому было целесообразно провести дальнейшие исследования по изучению наследования полученных растений, так как только по наличию гена в потомстве можно сделать четкий вывод о трансгенности или нетрансгенности полученных растений.
5. Изучение наследования встроенного гена gfp Исходя из полученных данных, мы предположили, что трансформация затронула именно те клетки, из которых в дальнейшем образуются генеративные органы. Поэтому было решено проверить, какое количество трансгенных и нетрансгенных семян находится в одном стручке в зависимости от его расположения на цветоносе, и установить зависимость наследования от числа черенкований.
Для изучения наследования гена gfp использовали по 4-5 стручков с каждой линии, из семян которой были получены стерильные растения in vitro.
Было проанализировано 9 линий, полученных из семядольных эксплантов и линии – из листовых эксплантов.
Исследования показали, что ген gfp в трансгенных растениях, полученных на семядольных эксплантах, наследовался в семенном поколении. Однако его наличие в семенах каждого растения не зависело от порядка расположения стручков и происходило случайно по всей кисти. У трансгенных растений, сформировавшихся на листовых эксплантах, ген gfp в растениях первого поколения не был обнаружен. Вероятно, это связано с тем, что гаметы полученных трансформированных растений образовывались из нетрансформированной ткани.
Исходя из полученных данных, мы предположили, что регенеранты, полученные из семядольных эксплантов, как правило, формируются в основном из слоя L2, затрагивая слои L1 и L3, а на листовых эксплантах формирование побегов происходит исключительно из клеток слоя L3. Эти факты также подтверждают образование побегов из группы клеток.
По литературным данным известно (Misra, Gedamu, 1989;
Denis et al., 1993), что, как правило, в первом поколении, введенные гены наследуются как единичный локус (соотношение 3:1 при самоопылении и 1:1 при анализирующем скрещивании). Это свидетельствует о встраивании последовательностей чужеродной ДНК в один локус либо в одной копии, либо в виде кластера тандемных вставок.
Статистическая оценка результатов расщепления (табл. 7) с помощью критерия 2, проведённая нами, показала, что только у трех растений, полученных при первом черенковании, соблюдались менделевские правила наследования одного признака для самоопыленных растений. Однако уже после второго черенкования эти правила нарушались. Вполне вероятно, что это свидетельствовало о химерности получаемых трансформантов, в тканях, которых имелись как трансгенные, так и нетрансгенные клетки. Ткань генеративных органов растений, полученных на семядольных эксплантах, развивалась одновременно из клеток обоих типов, показывая в результате неменделевское наследование одного признака. Мы предположили, что такую "неправильность" развития флоральной ткани можно преодолеть, высаживая растения-регенеранты в грунт сразу же после получения, не проводя их черенкования.
Таким образом, размножение полученных растений черенкованием оказывало влияние на этап расхимеривания, и было экспериментально установлено, что при дальнейшем черенковании полученных растений соотношение изменялось в сторону уменьшения потомков, наследующих признак трансгенности. По-видимому, в процессе роста растений, трансформированные клетки в химерных растениях замещались нетрансгенными.
Исходя из этих данных, можно сделать предположение, что большинство полученных нами при трансформации растений-регенерантов являются химерами и при формировании цветоносных побегов, они «расхимериваются», т.е. разделяются на составляющие генотипы с преобладанием нетрансформированных клеток, а основным фактором образования химер является тип ткани экспланта.
Таблица 7. Анализ расщепления T1 трансгенных растений рапса по наследованию гена gfp Число Количество Количество 2факт.
Линия Черенкование растений трансгенных нетрансгенных Фактическое Н растений растений расщепление Т1, шт. + (ПЦР ), шт. (ПЦР ), шт.
a 20 4 16 0,8:3,2 3:1 3, В- b 21 0 21 0:4 3:1 a 24 18 6 3:1 3:1 В- b 42 6 36 0,6:3,4 3:1 3, a 18 15 3 3,3:0,7 3:1 0, В- b 33 16 17 1,9:2,1 3:1 3, a 20 16 4 3,2:0,8 3:1 0, В- b 37 14 23 1,5:2,5 3:1 3, a - - - - - В- b 31 24 7 3,1:0,9 3:1 0, a - - - - - В- b 18 0 18 0:4 3:1 a 47 7 40 0,6:3,4 3:1 3, П- b - - - - - a 37 19 18 2:2 3:1 3, П- b 40 17 23 1,7:2,3 3:1 3, a 39 5 34 0,5:3,5 3:1 3, П- b 30 11 21 1,5:2,5 3:1 3, Стандартное значение 2теор.=3,84;
Н0 – теоретическое расщепление;
В – сорт Westar;
П – сорт Подмосковный;
а – первое черенкование;
b – второе черенкование 6. Биохимический анализ семян трансгенных растений Очень важно работы по генной и клеточной инженерии направлять на создание новых форм растений с сохранением их питательной ценности. Особо показательным для рапса является содержание белка и жирных кислот в семенах. Поэтому был проведен сравнительный анализ семян Т1 и исходного с.
Westar по содержанию белка и жирных кислот.
В результате исследований было установлено, что содержание белка в семенах Т1 было ниже по сравнению с контрольным сортом и составляло в среднем 28,8% и 32,6%, соответственно. При анализе трансгенных линий были обнаружены различия: этот показатель менялся от 28,1% до 30,0%.
Определение содержания жирных кислот показало различия в их составе (табл.8).
Таблица 8. Содержание жирных кислот в семенах трансгенных линий и исходного с. Westar, % Жирные кислоты с. Westar Линия 1 Линия Лауриновая кислота 0 0,02 0, Миристиновая кислота 0,06 0,08 0, Пентадекановая кислота 0,02 0,05 0, Пальмитиновая кислота 6,13 5,54 6, 7-гексадеценовая кислота 0,03 0,07 0, Пальмитолеиновая кислота 0,15 0,21 0, 7,10-гексадиеновая кислота 0,03 0,12 0, Маргариновая кислота 0,04 0,08 0, 10-гептадеценовая кислота 0 0,07 0, 7,10,13-гексатриеновая кислота 0 0,15 0, Стеариновая кислота 1,75 2,42 2, Олеиновая кислота 61,00 67,40 64, Вакценовая кислота 3,79 3,02 3, Линолевая кислота 17,28 13,36 12, Линоленовая кислота 7,03 4,93 6, Нонадекановая кислота 0 0,09 0, 10-нонадеценовая кислота 0 0,05 0, Арахиновая кислота 0,61 0,72 0, Гадолеиновая кислота 1,42 1,01 1, 10,13-эйкозадиеновая кислота 0,04 0,05 0, Бегеновая кислота 0,35 0,38 0, Эруковая кислота 0,18 0 Лигноцериновая кислота 0,03 0,11 0, Нервоновая кислота 0,07 0,06 Из данных таблицы 8 видно, что эруковая кислота в отличие от исходного сорта не присутствует в семенах трансгенных линий. Кроме этого, в семенах трансгенных растений отмечено появление новых жирных кислот, таких как лауриновой, 10-гептадеценовой, 7,10,13-гексатриеновой, нонадекановой и 10 нонадеценовой. В семенах Т1 наблюдалось также и увеличение концентрации большинства проанализированных жирных кислот. Однако содержание некоторых жирных кислот, таких как линолевой, линоленовой и гадолеиновой в семенах трансгенных растений уменьшалось.
Таким образом, полученные результаты говорят, что в трансгенных растениях, вероятно, меняется в некоторой степени метаболизм, результатом которого является изменение количественного и качественного состава питательных веществ в семенах. Это свидетельствует о том, что даже встраивание нецелевых генов может изменять биохимию растений, позволяя создавать при дальнейшей селекции растения с новыми хозяйственно-ценными признаками.
ВЫВОДЫ 1. Усовершенствован протокол получения растений-регенерантов рапса из семядольных и листовых эксплантов, позволяющий увеличить частоту регенерации до 92%. Оптимальной питательной средой для регенерации растений рапса из семядольных и листовых эксплантов после трансформации является среда, содержащая 8 мг/л БАП, 1 мг/л НУК и 3 мг/л АБК.
2. Установлено, что наибольшей морфогенетической активностью обладают семядольные экспланты (92%) по сравнению с листовыми эксплантами (70%). При использовании семядолей развитие побегов происходит из первичного каллуса, формирующегося из черешков семядолей локально, а при использовании листовых сегментов – из края первичного экспланта минуя процесс каллусогенеза.
3. Выявлены существенные различия в частоте трансформации изучаемых сортов в зависимости от типа первичного экспланта: на семядольных эксплантах частота трансформации была более 70%, а на листовых сегментах – 28 - 47%. Присутствие в питательной среде селективного фактора Км приводило к существенному снижению частоты трансформации, а уменьшение концентрации сахарозы с 1% до 0,7% повышало частоту трансформации на листовых эксплантах до 66,7%.
4. Свечение белка GFP наблюдали на всех стадиях развития трансформированных растений. В каллусной ткани наибольшую флуоресценцию GFP наблюдали в зоне меристематических очагов, а также в местах дифференцировки проводящей системы. У сформировавшихся побегов свечение GFP было значительно ярче на старых листьях, чем на молодых, и лучше всего его можно было видеть на жилках, трихомах и устьицах. На листовой пластинке свечение часто проявлялось в группах клеток. Установлено, что белок GFP локализован по пунктирным тельцам в клеточных стенках.
5. Анализ растений Т1 показал, что у трансгенных растений, полученных из листовых эксплантов не наблюдали наследование гена gfp в растениях первого поколения, в то время как в трансгенных растениях, полученных из семядольных эксплантов, наличие гена gfp наблюдали. Черенкование трансгенных растений рапса приводит к проявлению неменделевского правила наследования встроенного гена gfp.
6. Установлено, что трансформация ярового рапса приводит к созданию растений с измененным количественным и качественным составом питательных веществ в семенах первого поколения.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Хоанг Тхи Жанг, Ралдугина Г.Н., Калашникова Е. А. Изучение первых стадий регенерации побегов на семядольных эксплантах рапса (Brassica napus L.) при использовании генетических конструкций, содержащих ген GUS с интроном или ген GFP // Известия ТСХА, 2010, № 5, С.96-102.
2. Хоанг Тхи Жанг, Ралдугина Г.Н. Регенерация трансгенных растений, экспрессирующих ген gfp, на семядольных и листовых эксплантах растений рапса (Вrassica napus l.): влияние абк и генотипа // Физиология растений, 2012, T.59, №3 (принято к печати).
3. Ралдугина Г.Н., Хоанг Тхи Жанг, Динь Суан Ту. Изучение первых стадий регенерации побегов на различных эксплантах рапса (Brassica napus L.) после трансформации генетической конструкцией, содержащей ген gus с интроном // Тезисы докладов VII Международной конференции "Молекулярная генетика соматических клеток". Звенигород, Москва, 2009, C.42.
4. Raldugina GN, Hoang TG, Belyaev DV. Approach to the Problem of Chimeric Genetically Transformed Rapeseed // Тезисы докладов Международной конференции "Molecular aspects of plant development". Вена, Австрия, 2010, C.75.
5. Хоанг Тхи Жанг, Ралдугина Г.Н. Подход к проблеме образования химер у генетически трансформированных растений рапса (Brassica napus L.) // Тезисы докладов X молодежной научной конференции "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии". Москва, 2010, С.57.
6. Хоанг Тхи Жанг, Ралдугина Г.Н. Проблемы химерности регенерантов при получении генетически трансформированных растений рапса (Brassica napus L.) // Тезисы докладов III Всероссийского симпозиума "Физиология трансгенного растения и фундаментальные основы биобезопасности".
Москва, 2010, С.82.
7. Raldugina, G., Hoang, G. Chimeric formation when obtaining genetically transformed plants of Rapeseed // Тезисы докладов Международной конференции "Plant Transformation Technologies II". Вена, Австрия, 2011, С.48.
8. Хоанг Тхи Жанг, Ралдугина Г.Н., Калашникова Е.А. Исследование формирования химер при регенерации растений рапса (Brassica napus L.) // Международная научная конференция молодых ученых и специалистов РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева: Сборник статей: Изд-во РГАУ МСХА имени К.А. Тимирязева, Москва, 2011, С. 48-49.
9. Хоанг Тхи Жанг, Ралдугина Г.Н., Калашникова Е. А. Образование трансгенных растений, экспрессирующих ген gfp, из листовых эксплантов рапса (Brassica napus L.) // Тезисы докладов XI молодежной научной конференции "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии" Москва, 2011, С.49-50.
10. Хоанг Т.Ж., Ралдугина Г.Н. Исследование влияния генотипа и вида экспланта на формирование трансгенных растений рапса (Brassica napus L.) // VII съезд Общества физиологов растений России. Международная конференция "Физиология растений – фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий" Нижний Новгород, Россия, 2011, Часть II, С.728-729.
11. Ралдугина Г.Н., Хоанг Тхи Жанг. Образование химерных растений при получении генетически трансформированных растений рапса // Тезисы докладов VIII Международной конференции "Молекулярная генетика соматических клеток" Звенигород, Россия, 2011, С. 37.
12. Т. Ж. Хоанг, Г.Н. Ралдугина, Е.А. Калашникова. Образование химерных побегов при получении генетически трансформированных растений рапса // Тезисы докладов 2-й Международной школа-конференции молодых ученых "Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях итехнологиях" Звенигород, Россия, 2011. С.73.