Активные формы кислорода и их источники в программированной гибели клеток растений и цианобактерии аnabaena variabilis
На правах рукописи
ШЕСТАК Анна Александровна АКТИВНЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОДА И ИХ ИСТОЧНИКИ В ПРОГРАММИРОВАННОЙ ГИБЕЛИ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ И ЦИАНОБАКТЕРИИ АNABAENA VARIABILIS 03.00.2503 – гистология, цитология, клеточная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2007
Работа выполнена на кафедре физиологии микроорганизмов биологического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова.
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Самуилов Виталий Дмитриевич Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Ягужинский Лев Сергеевич Научно-исследовательский институт физико химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, Москва доктор биологических наук, Доронин Юрий Константинович Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва
Ведущая организация: Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН
Защита состоится «20» ноября 2007 года в 15 ч 30 мин на заседании диссертационного совета Д. 501.001.52 при Московском государственном университете им.
М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, д.1, корп. 12, биологический факультет МГУ, ауд. М1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им.
М.В.Ломоносова
Автореферат разослан «18 » октября 2007 г
Ученый секретарь диссертационного совета, Е.Н. Калистратова кандидат биологических наук Актуальность темы. Активные формы кислорода (АФК) в клетках растений образуются в электронтранспортных цепях хлоропластов и митохондрий, а также в пероксисомах, аппарате Гольджи, эндоплазматическом ретикулуме. АФК обладают высокой окислительной способностью и скоростью взаимодействия. Они способны регулировать рост, развитие растений, участвовать в иммунитете, могут быть использованы клеткой при реализации ПКС. Источники, механизмы образования АФК и их участие в сигнальных системах являются главными направлениями в этой области исследований. В зависимости от концентрации АФК может происходить активация или ингибирование ферментов, задействованных в гибели клеток по типу некроза или апоптоза.
Цель работы – исследовать активные формы кислорода и их источники в программируемой гибели клеток в листьях гороха и клеток Аnabаena variabilis.
Задачи работы:
1. Испытать действие соединений, стимулирующих или подавляющих образование АФК, на ядра замыкающих клеток устьиц в эпидермисе листьев гороха и нуклеоиды клеток А. variabilis.
2. Исследовать действие хинакрина (ингибитора флавиновых ферментов) и ингибиторов фотосистемы II фотосинтетической элетронтранспортной цепи на образование АФК в клетках эпидермиса из листьев гороха.
3. Исследовать действие ингибитора гликолиза 2-дезоксиглюкозы, ингибиторов энергетического обмена митохондрий и разобщителя окислительного и фотосинтетического фосфорилирования на образование АФК и их возможную роль в переходе с одного типа клеточной гибели к другому.
4. Исследовать действие ингибитора синтеза белка линкомицина на клетки А. variabilis.
_ Список сокращений и обозначений: БР – бенгальский розовый;
БО – бромоксинил;
ДГ – 2-дезоксиглюкоза;
НСТ – нитросиний тетразолий;
ПКС – программируемая клеточная смерть;
УК – устьичные клетки;
ФС – фотосистема;
ХКФ – м хлоркарбонилцианидфенилгидразон;
DCMU – 3-(3',4'-дихлорфенил)-1,1 диметилмочевина, диурон;
DAPI – 4,6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид;
DCF – 2,7-дихлорфлуоресцеин;
DCFH-DA – 2,7-дихлорфлуоресцин диацетат;
NAC – N ацетил-L-цистеин;
PI – пропидий йодид;
TMRE – этиловый эфир тетраметилродамина;
О2· – супероксидный анион-радикал;
·ОН – гидроксильный радикал;
1О2 – синглетный кислород.
Научная новизна работы. Испытано влияние соединений, вызывающих или подавляющих образование АФК на ПКС у растений и A. variabilis. Полученные результаты О2·, показали, что Н2О2 и ·ОН стимулируют ПКС устьичных клеток гороха.
Предположительно Н2О2 активирует NADРH-оксидазу плазматической мембраны.
Установлено образование АФК пероксидазой клеточной стенки. Фотосенсибилизаторы БР и TMRE, подобно ингибиторам переноса электронов в ФСII диурону и бромоксинилу на свету, приводили к гибели клеток по типу некроза. Н2О2 вызывал увеличение содержания АФК в клетках, разрушение нуклеоидов и гибель клеток A. variabilis от антибиотика линкомицина, ингибитора синтеза белка у бактерий. Клетки A. variabilis погибали с признаками автолиза.
Установлена роль различных компартментов клетки (хлоропластов, митохондрий, плазматической мембраны, клеточного ядра и клеточной стенки) в образовании АФК и гибели УК.
Практическое значение работы. Полученные данные позволяют расширить представления о роли АФК и механизмах гибели клеток растений и бактерий. Испытан ряд гербицидов и цитотоксических агентов на образование АФК в клетках. Полученные результаты свидетельствуют о единстве путей ПКС у животных, растений, бактерий и могут быть использованы в клеточной биологии, микробиологии и биотехнологии в связи с работами в области сигнальных систем клеток, фитоиммунитета и лекарственной устойчивости микроорганизмов.
Апробация работы. Результаты работы были доложены и обсуждены на международной конференции «Российская биоэнергетика: от молекул к клетке» (Москва, 2005), всероссийской научной конференции «Молодые исследователи регионам» (Вологда, 2005), годичном собрании физиологов растений «Физиологические и молекулярно генетичекие аспекты сохранения биоразнообразия» (Вологда, 2005), XIII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2006» (Москва, 2006), I (IX) международной конференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2006), международной научной конференции «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах (Москва, 2006), международной 14-ой Европейской биоэнергетической конференции (Москва 2006), XIV международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2007» (Москва, 2007), международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2007), международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007), а также на заседаниях кафедры физиологии микроорганизмов МГУ.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на страницах, иллюстрирована 2 таблицами и 24 рисунками. Список литературы содержит библиографических названий.
Объекты и методы исследования. Исследования проводили на нижнем эпидермисе из листьев гороха (Pisum sativum L.) сорта Альфа и листьев кукурузы сахарной (Zea mays saccarata L.) сорта Монарх. Растения выращивали методом гидропоники при периодическом освещении (18 ч свет, 6 ч темнота) люминесцентной лампой (интенсивность света ~1000 лк, температура 20–25°С). В экспериментах использовали 8–15-суточные проростки. С помощью пинцета пленки эпидермиса отделяли и помещали в полистирольные культуральные планшеты и инкубировали в дистиллированной воде. Клетки цианобактерии A. variabilis АТСС 29413 (из коллекции кафедры физиологии микроорганизмов) культивировали в колбах объемом 750 мл, содержащих 200 мл среды, при постоянном освещении люминесцентными лампами (~1400 лк), на минеральной среде BG-11 (Rippka et al., 1979) в периодических условиях, при температуре ~27 °С. Перед посевом клеток среду стерилизовали при 0,5 атм в течение 30 мин. В экспериментах использовали клетки из 3–5-суточных культур, находящихся в экспоненциальной фазе роста.
Инфильтрация и инкубация с реагентами. Для обеспечения быстрого проникновения реагентов в клетки использовали метод вакуум-инфильтрации. Пленки эпидермиса инкубировали в растворе реагентов при 1,5–3 мм рт. ст. в течение 1–2 мин.
Инкубацию клеток проводили в темноте и на свету (~1000 лк) при 20–25°С.
Фиксация объекта, окрашивание и световая микроскопия. По завершении инкубации образцы обрабатывали 5 мин фиксатором Батталья (смесь хлороформа, 96%-ного этанола, ледяной уксусной кислоты и 40%-ного формалина в соотношении 5:5:1:1). Затем образцы отмывали 96%-ным этанолом 10 мин для удаления фиксатора, инкубировали 5 мин в воде и окрашивали красителем ядер гематоксилином Карацци в течение 20 мин.
Окрашенные пленки эпидермиса отмывали водопроводной водой и анализировали с помощью светового микроскопа Leitz Diaplan Wetzlar ФРГ. Из 300–500 просмотренных клеток определяли долю клеток с разрушенными ядрами (Самуилов и др., 2000).
Флуориметрия. Для регистрации АФК в клетках использовали DCFH-DA. Пленки эпидермиса помещали в 50 мкМ раствор DCFH-DA и инкубировали 10 мин в темноте. Этот краситель, проникая в клетку, дезацетилируется при участии внутриклеточных эстераз, превращаясь в нефлуоресцирующий DCFH. DCFH в клетках окисляется Н2О2 с участием Fe2+, пероксидазы или неферментативно в присутствии образуя интенсивно флуоресцирующий DCF (LeBel et al., 1992). DCFH окисляется также ·ОН, СО3 ·, NO2·, но не О2· однако, вероятность окисления этими агентами в исследуемых клетках не велика (Wrona et al., 2005). Образцы отмывали 5 мин в темноте, закрепляли силиконом на прозрачную пластинку из полистирола и помещали в кювету под углом 45° к падающему лучу, содержащую буферный раствор 25 мМ HEPES-NaOH, pH 7,2, и 25 мМ КСI. Флуоресценцию DCF возбуждали светом с 485–495 нм и регистрировали при 515–525 нм. Для обработки данных, полученных с флуориметра (VersaFluor фирмы Bio-Rad, США), использовали компьютерные программы Read COM Port, Graph 2, Microsoft Excel.
Клетки A. variabilis дважды отмывали раствором 25 мМ Hepes-NaOH, pH 7,2 и 25 мМ KCl центрифугированием при 3000 g 5 мин и суспендировали в том же растворе. Клетки обрабатывали в темноте 30 мин 50 мкМ DCF-DA между первым и вторым центрифугированием и использовали в экспериментах в течение 2–4 ч после отмывки.
Клетки хранили в темноте при комнатной температуре. Величина D540 суспензии клеток составляла 0,6–0,9.
Флуоресцентная микроскопия. Для прижизненного исследования состояния клеток использовали флуоресцирующие красители. Для определения состояния ядер использовали 20 мкМ 4,6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид (DAPI окрашивание проводили мин), 0,2 мкМ пропидий йодид (PI окрашивание проводили 20 мин), 20 мкМ DCF-DA ( мин). Клетки A. variabilis окрашивали 20 мкМ DAPI в течение 1 ч и 20 мкМ DCF-DA в течение 20 мин в темноте, 2 мкМ PI в течение 1 ч. Наблюдения проводили на флуоресцентном микроскопе Carl Zeiss Axiovert 200M LSM510 (Германия). Для получения фотоснимков использовали встроенную цифровую видеокамеру и компьютерную программу AxiVision.
Конфокальная микроскопия. Изучение серийных оптических срезов объектов проводили с помощью микроскопа Carl Zeiss Axiovert 200M (Германия), оборудованного конфокальной сканирующей приставкой Zeiss LSM510Meta. Определение энергетического состояния митохондрий в УК эпидермиса из листа гороха проводили с помощью TMRE.
ТМRE является катионом, проникающим через мембраны. Внутриклеточные митохондрии генерируют мембранный потенциал со знаком «минус» внутри. Накопление проникающего катиона ТМRE в митохондриях напрямую свидетельствует об энергизации митохондрий.
Пленки эпидермиса из листьев гороха окрашивали ТМRE в течение 1 ч в темноте, затем отмывали дистиллированной водой. Для визуализации красителя использовали гелий неоновый лазер (возб 543), измерения флуоресценции проводили при 560 – 590 нм. Для регистрации образования АФК пленки эпидермиса и клетки цианобактерии окрашивали мкМ DCF-DA в течение 10 мин в темноте. Флуоресценцию DCF возбуждали при 495 нм (аргоновый лазер) и регистрировали при 523 нм.
Оксиметрия. Выделение и поглощение кислорода измеряли с применением закрытого Pt-электрода Кларка. В ячейку с 25 мМ Неpes-NaOH, pH 7,2, и 25 мМ КСI помещали нарезки листьев гороха с концентрацией хлорофиллов 45–90 мкг/мл и инкубировали на магнитной мешалке. Напряжение на электроде составляло – 0,65 В. Свет от лампы накаливания пропускали через тепловой фильтр – слой воды толщиной 12 см. Интенсивность действующего света составляла ~ 0,1 Вт/см2. Электрический сигнал от электрода Кларка регистрировали на компьютере через аналого-цифровой преобразователь с помощью программы Record 4.
Спектрофотометрия. Концентрацию Н2О2 измеряли при 240 нм, = 43, 6 М-1. см- (Bielski and Allen, 1977) на спектрофотометре Uvidec-4 (Jasco, Япония). Рост цианобактерии при периодическом культивировании определяли по светорассеянию клеточных суспензий при 540 нм на спектрофотометре Uvidec-4 (Jasco, Япония) и с помощью вертикального фотометра Multiscan Plus 314 (Labsystem, США) с интерференционным светофильтром, максимум полосы пропускания – 540 нм. Исследование действия различных соединений в условиях периодического культивирования проводили с применением стандартных стерильных 96-луночных планшетов. Объем клеточной суспензии в лунке составлял 200 мкл.
Результаты исследования и их обсуждение Флуоресценция DCF в клетках. В замыкающих клетках устьиц как показали опыты с пленками эпидермиса, изолированными из листьев гороха, DCF интенсивно флуоресцирует (рис. 1 А). DCF флуоресцирует в клетках A. variabilis, образующих трихомы – клеточные нити (рис. 1 Б).
Рис. 1. Флуоресценция DCF в клетках: А – флуоресценция DCF в пленке эпидермиса из листа гороха, Б – флуоресценция DCF в клетках A. variabilis.
Влияние акцепторов электронов на H2O2-зависимое образование DCF. Менадион, восстанавливаясь фотосистемой II, b6f-цитохромным комплексом и фотосистемой I хлоропластов, а также митохондриальными NADH: и сукцинат: убихинон-оксидоредуктазой и bc1-цитохромным комплексом, окисляется О2 с образованием О2· и Н2О2. Рост выхода флуоресценции DCF в пленках эпидермиса из листьев гороха, индуцированный менадионом, усиливался при последующем добавлении Н2О2 и подавлялся НСТ, окисляющим О2· с образованием формазана и тем самым предотвращающим образование Н2О2 (рис. 2, линии 1, 2). Акцепторы электронов N,N,N,N-тетраметил-п-фенилендиамин (ТМФД), 2,6-дихлорфенолиндофенол (ДФИФ), а также п-бензохинон (БХ) не вызывали образование флуоресцирующего красителя (рис. 2, линии 3, 4). Эти соединения, взаимодействующие с ФСII, b6f-цитохромным комплексом и ФСI хлоропластов, подавляют фотовосстановление NADP+. Они подавляют также восстановление убихинона в митохондриях, взаимодействуя с NADH: убихинон-оксидоредуктазой, сукцинат: убихинон-оксидоредуктазой и bc1– цитохромным комплексом дыхательной цепи. Восстановленные формы этих соединений не взаимодействуют с кислородом, не вызывают образование О2· и Н2О2, необходимого для окисления DCFH. Напротив, аскорбат, добавленный вслед за ТМФД, образует электрондонорную пару для ФСI, генерирующей Н2О2 с участием супероксиддисмутазы.
Рис. 2. Влияние различных агентов на флуоресценцию DCF в пленках эпидермиса из листьев гороха. Добавки: 100 мкМ менадиона, 100 мкМ Н2О2, 200 мкМ НСТ, 100 мкМ ТМФД, 100 мкМ ДФИФ, 5 мМ аскорбата.
Действие антиоксидантов на H2O2-зависимую флуоресценцию DCF.
Антиоксиданты NAC и тролокс (водорастворимое производное -токоферола) подавляли и предотвращали менадион-индуцированное образование DCF в пленках эпидермиса из листьев гороха (рис. 3). Они подавляли также CN– –индуцированное разрушение ядер устьичных и эпидермальных клеток (рис. 4).
Рис. 3. Влияние антиоксидантов на флуоресценцию DCF, индуцированную менадионом. Добавки: 100 мкМ менадиона, 5 мМ NAC, 100 мкМ тролокса, 10 нМ MitoQ, мкМ Н2О2.
Рис. 4. Влияние NAC и тролокса на CN––индуцированное разрушение ядер в клетках эпидермиса из листьев гороха. Пленки эпидермиса после инфильтрирации с NAC или тролоксом преинкубировали 15 мин, затем добавляли KCN, вновь проводили инфильтрацию.
Разрушение ядер устьичных клеток регистрировали через 20 ч инкубации пленок эпидермиса в темноте или на свету. Разрушение эпидермальных клеток регистрировали через 1 ч инкубации в темноте. Добавки: 2,5 мМ KCN, 5 мM NAC, 100 мкМ тролокса.
Испытано действие производного убихинона 2,3-диметокси-п бензохинонилдецилтрифенилфосфония (MitoQ) на ПКС у растений. MitoQ представляет собой убихинон, ковалентно связанный с децилтрифенилфосфонием. Этот проникающий катион избирательно, по градиенту мембранного потенциала, накапливается в митохондриях.
На клетках животных показано, что MitoQ реагирует с дыхательной цепью митохондрий, проявляет свойства антиоксиданта и защищает клетки от гибели, вызванной Н2О2.
Восстанавливаясь дыхательной цепью, MitoQ избирательно блокирует окислительное повреждение митохондрий (Кelso et al., 2001). MitoQ подавлял и предотвращал образование DCF, вызванное менадионом, но не Н2О2 (рис. 3).
Влияние ингибитора флавиновых ферментов хинакрина на Н2О2-зависимую флуоресценцию DCF. В зависимости от концентрации АФК в клетках происходит активация или ингибирование различных ферментов. Хинакрин в испытанных концентрациях не оказывал влияние на дыхание и фотосинтетическое выделение О2 (Самуилов и др., 2006), но подавлял рост флуоресценции, вызванный менадионом и Н2О2. Добавленная каталаза, не проникающая в клетки, подавляла и предотвращала рост флуоресценции DCF, вызванный добавленным Н2О2 (рис. 5). Эти результаты позволяют предположить, что NADPH-оксидаза плазматической мембраны, чувствительная к хинакрину (Van Gestelen et al., 1997), генерирующая О2· и активирующаяся при действии менадиона и Н2О2, может быть ответственна за рост флуоресценции DCF. На клетках животных известен эффект АФК индуцированного образования АФК (Zorov et al., 2005).
Рис. 5. Влияние хинакрина на флуоресценцию DCF в пленках эпидермиса из листьев гороха. Добавки: 100 мкМ Н2О2, 2 ед. активности/мл каталазы, 50 мкМ хинакрина.
Влияние генераторов синглетного кислорода на Н2О2-зависимую флуоресценцию DCF. Гербициды диурон (3,4-дихлорофенил)-1,1-диметилмочевина) и бромоксинил (3,5 дибром-4-гидроксибензонитрил), ингибирующие перенос электронов в ФСII, вызывали образование DCF в клетках, устойчивое к добавке каталазы, но чувствительное к НСТ (рис.
6). Диурон и бромоксинил индуцируют образованием триплетного хлорофилла в результате рекомбинации зарядов между восстановленным феофитином и реакционным центром Р680, это ведет к образованию 1О2 (Rutherford et al., 2001). БР и TMRE, фотосенсибилизирующие генерацию синглетного кислорода, предотвращали распад ядер УК, вызванный СN. БР на свету сам по себе не усиливал флуоресценцию DCF (рис. 7 линия 1). Последующая добавка NADH вызывала рост выхода флуоресценции DCF (рис. 7, линия 1), что свидетельствует, по видимому, о функционировании апопластной пероксидазы. НСТ подавлял увеличение флуоресценции DCF в ответ на добавку NADH. В отсутствие БР NADH не влиял на флуоресценцию DCF и на менадион-индуцированный рост его флуоресценции (рис. 7, линии 2, 3).
Ядра устьичных клеток окрашиваются PI при инкубации эпидермиса с БР на свету (данные не представлены). Доля флуоресцирующих ядер в темноте была значительно ниже, чем на свету, и не отличалась от контрольной величины (без добавок). В присутствии KCN, индуктора апоптоза, происходил распад ядер, и флуоресцирующие фрагменты ДНК давали свечение объема, ограниченного клеточной стенкой. Распад клеточных ядер, вызываемый CN–, на свету предотвращался БР.
Рис. 6. Влияние диурона (DCMU) и бромоксинила на флуоресценцию DCF в клетках эпидермиса из листьев гороха. Добавки: 10 мкМ DCMU, 200 мкМ НСТ, 2 ед. активности/мл каталазы, 100 мкМ бромоксинила.
Рис. 7. Влияние БР на флуоресценцию DCF в клетках эпидермиса из листьев гороха.
Добавки: 20 мкМ БР, 10 мМ NADH, 200 мкМ НСТ, 100 мкМ менадиона.
Оксиметрические данные показывают, что преинкубация насечек листьев гороха с БР в течение 1 ч значительно снижала скорость фотосинтетического выделения О2 (рис. 8). Это может быть связано с тем, что 1О2, генерируемый БР, вызывает расщепление белков D1 и D фотосистемы II хлоропластов (Окаda et al., 1996), ингибируя фотосинтез, подобно DCMU и бромоксинилу. При этом нарушается функция ФСII хлоропластов, и исчезает ее вклад в ПКС.
Блокирование ФСII посредствам бромоксинила или диурона значительно снижало CN–– индуцированное разрушение ядер устьичных клеток на свету (рис. 9).
Рис. 8. Действие БР и БО на дыхание и фотосинтетическое выделение О2 насечками листьев (НЛ) гороха. Линия 1 – контроль, линии 2 и 3 – БР, линия 3 – нормирована с линией 1 по скорости дыхания. НЛ в дистил воде без БР (линия 1) или 100 мкМ БР (линия 2) подвергали вакуум-инфильтрации и затем инкубировали 1 ч на белом свету. Вк и Вык – включение и выключение света.
Добавки: НЛ массой 20–25 мг/мл, 100 мкМ БО. Скорости поглощения О2 (эндогенное дыхание) и фотосинтетического выделения О2 в контроле составляли 400–800 и 280– мкмоль/г НЛ. Добавки: 100 мкМ БО.
Рис. 9. Влияние диурона и CN–-индуцированную бромоксинила на гибель УК из листьев гороха. Инкубация с КСN-20 ч. Добавки: 10 мкМ диурона, мкМ бромоксинила, 200 мкМ НСТ, 2,5 мМ КСN.
Вклад различных АФК в CN– –индуцированное разрушение ядер устьичных клеток в эпидермисе из листьев гороха. Апоптоз устьичных клеток, индуцированный CN–, зависит от H2O2 усиливал CN––индуцированный АФК (Самуилов и др., 2000). Какова природа АФК?
апоптоз устьичных клеток в эпидермисе из листьев гороха, регистрируемый по разрушению клеточных ядер (таблица 1). Ещё большее разрушение ядер наблюдалось от комбинации H2O2 и NADH – субстратов пероксидазы клеточной стенки растений, вызывающей образование О2· и H2O2 (Yokota, Yamazaku, 1977;
Halliwell, 1978). NADH сам по себе вызывал некоторое разрушение ядер устьичных клеток. Разрушение ядер устьичных клеток при воздействии CN– или CN– + H2O2 полностью снималось НСТ. Сам по себе НСТ не влиял на состояние ядер устьичных клеток. Восстановленный НСТ накапливался в клетках в виде кристаллов формазана. Маннитол использовали в качестве ловушки для ·ОН. Он снижал CN–-индуцированное разрушение ядер устьичных клеток. Другой ловушкой для ·ОН является этиловый спирт. Он тоже снижал разрушение ядер, вызванное CN–. БР вызывал небольшое разрушение ядер в темноте, но не на свету. БР и TMRE, фотосенсибилизирующие генерацию 1O2, подавляли цианидное разрушение клеточных ядер на свету. Это подавление снималось добавленным NADH, который реагирует с O2 с образованием О2·. В темноте БР не оказывал влияние на CN–-индуцированное разрушение ядер, а на свету предотвращал его. Сходный, но менее выраженный эффект на свету оказывал TMRE. Предотвращение апоптоза, вызванного CN– в присутствии БР на свету, снималось NADH.
Таблица 1. Влияние соединений, стимулирующих или подавляющих образование различных АФК, на состояние устьичных клеток гороха Добавлен Разрушение ядер УК (%) в присутствии Тестируемая ные Условия реагентов + KCN или АФК опыта реагентов реагенты KCN + H2O2* KCN Темнота, 18 ч 0 35,0 ± 3,0 НСТ Свет, 18 ч 0 68,8 ± 3,9 О2· Темнота, 18 ч 0 87,0 ± 3,0* НСТ + H2O Свет, 18 ч 0 99,0 ± 1,0* Темнота, 18 ч 0 35,0 ± 3,0 87,0 ± 3, H2O Свет, 18 ч 0 68,8 ± 3,9 99,0 ± 1, H2O H2O2 + Темнота, 20 ч 54,3 ± 8,6 25,3 ± 1,5 NADH Свет, 20 ч 44,2 ± 2,9 79,0 ± 2,0 Темнота, 20 ч 0 42,5 ± 3,0 14,7 ± 2, Маннитол ОН· Свет, 20 ч 0 75,7 ± 5,0 42,0 ± 4, Этанол Свет, 24 ч 0 81,7 ± 4,4 24,5 ± 4, Темнота, 16 ч 2,8 ± 1,5 21,2 ± 2,3 20,6 ± 2, БР Свет, 23 ч 0 94,2 ± 4,0 1,0 ± 1, TMRE Свет, 19 ч 0 64,9 ± 4,3 41,8 ± 6, O БР + NADH Свет, 23 ч 0 94,2 ± 4,0 75,6 ± 3, Темнота, 20 ч 21,5 ± 7, NADH Свет, 20 ч 23,6 ± 8, Действие ингибиторов энергетического обмена на образование АФК. Гибель клеток может быть программируемой (апоптоз, аутофагия) и непрограммируемой (некроз). Форма гибели клеток во многом определяется их энергетическим состоянием. Клетка, обедненная АТР, погибает через некроз. Апоптоз зависит от АТР. Устьичные клетки погибали через апоптоз при действии разобщителя окислительного и фотосинтетического фосфорилирования (Дзюбинская и др., 2006). Ингибирование гликолиза посредством ДГ тоже вызывало апоптоз. Опыты с применением PI показали, что комбинация ХКФ и ДГ вызывала нарушение клеточных мембран, некротическую гибель клеток, при этом клеточные ядра УК сохранялись – признак некроза.
DCMU предотвращал CN–-индуцированный апоптоз устьичных клеток, но такой эффект снимался разобщителем ХКФ (Дзюбинская и др., 2006). Некоторые из испытанных ингибиторов энергетического обмена (ХКФ, DCMU и особенно БГ), как показывают данные с DCF, увеличивают выход флуоресценции красителя (рис. 10). ХКФ, по-видимому, ускоряет гидролиз диацетата DCFH. Зависимый от Н2О2 и ХКФ (величина рК составляет 5,95) рост флуоресценции красителя, измеряемый в отсутствие пленок эпидермиса, замедлялся или прекращался при рН 5,0 или 8,0. Действие DCMU связано с генерацией 1О2 и последующим окислением NAD(P)H (внутриклеточного) с образованием О2· и Н2О2 (Petrat et al., 2003). Ингибирование альтернативной оксидазы митохондрий растений гидроксаматами (БГ) усиливает образование О2· (Саmacho et al., 2004) и Н2О2. Согласно предположению, изложенному ранее (Самуилов и др., 2002;
2003), апоптоз УК регулируется редокс-состоянием пластохинона на участке о b6f цитохромного комплекса хлоропластов. Если пластохинон на участке о окислен или вытеснен конкурентным ингибитором, апоптоз УК предотвращается. Вызванное ХКФ снятие действия DCMU (рис. 11), подавляющего апоптоз устьичных клеток в присутствии CN–, может быть вызвано изменением редокс-состояния пластохинона: стимулируя циклический перенос электронов с участием фотосистемы I и b6f-комплекса, разобщитель влияет на компоненты циклической цепи, переводит пластохинон на участке о в менее окисленное состояние и, одновременно подавляя фотосинтетическое и окислительное фосфорилирование (но не субстратное фосфорилирование при гликолизе), включает ПКС. Из рис. 11 видно также, что комбинация DCMU и антимицина А, ингибирующих фотосинтетический перенос электронов в хлоропластах миксотиазола и бензилгидроксамата, ингибирующих дыхание митохондрий, ингибитора гликолиза ДГ и разобщителя ХКФ в течение 20 ч на свету не вызывает разрушение ядер УК. Смесь была дополнена цианидом, чтобы подавить разложение Н2О2 с участием каталазы и пероксидаз. Это вызывало разрушение ядер.
Рис. 10. Действие ингибиторов энергетического обмена на образование DCF из DCFH в пленках эпидермиса из листьев гороха. Добавки: 100 мкМ менадиона, 1мМ Н2О2, 10 мкМ ХКФ, 2, мМ КСN, 10 мкМ DCMU, 10 мМ ДГ, мкМ миксотиазола (Микс), 5 мМ бензилгидроксамата, 5 мкМ антимицина А (Ант).
Рис. 11. Разрушение ядер устьичных клеток в эпидермисе из листьев гороха на свету при действии ингибиторов энергетического обмена. Пленки эпидермиса после инфильтрации с 10 мкМ DCMU, 10 мкМ ХКФ, 5 мкМ миксотиазола, 5 мМ бензилгидроксамата, 5 мкМ антимицина А и мМ ДГ инкубировали 30 мин в темноте, затем, где указано, проводили инфильтрацию с 2, мМ КCN и инкубировали 20 ч на свету.
Влияние CN– на H2O2-зависимое образование DCF: данные флуоресцентной микроскопии. CN– обладает множественным действием: ингибирует гемовую каталазу и пероксидазы, в том числе аскорбатпероксидазу хлоропластов, цитохром c-оксидазу митохондрий, Сu,Zn- супероксиддисмутазу, инактивирует рибулозо-1,5 + – бисфосфаткарбоксилазу/оксигеназу, подавляя регенерацию NADP из NADPH. CN ингибировал Н2О2-зависимое образование DCF в клетках листьев гороха. После добавления KCN и DCFH DA, флуоресценция DCF наблюдалась в хлоропластах и вокруг них (локализацию хлоропластов определяли по флуоресценции хлорофилла), а также в области ядра клетки (Bartoli et al., 1977;
Patton et al., 1980;
Kuroda et al., 2005).
Образование АФК в митохондриях. DCF в хлоропластах и клеточных ядрах флуоресцирует и в отсутствие CN– (рис. 12, а). При изменении глубины оптического среза хлоропласты становились невидимыми, свечение DCF в ядерной зоне усиливалось, появлялись светящиеся сферические структуры (рис. 12, б). Этиловый эфир тетраметилродамина вызывал яркое свечение сферических структур (рис. 12, в, г), которое исчезало при обработке пленок эпидермиса протонофорным соединением ХКФ, снимающим мембранный потенциал – (рис.
12, д). Таким образом, сферические структуры, по данным флуоресценции DCF генерирующие H2O2 (рис. 12, а, б), представляют собой митохондрии;
снятие разобщителем окислительного фосфорилирования полностью тушит флуоресценцию TMRE. TMRE не вызывал свечения хлоропластов.
Рис. 12. Флуоресценция DCF, TMRE и 2 хлорофилла (Хл) в устьичных клетках в эпидермисе из листьев гороха: а, б – а флуоресценция хлорофилла и DCF;
два оптических среза, различающиеся глубиной в 2 мкм;
инкубация с 20 мкМ DCF – 5 мин;
в, г – флуоресценция хлорофилла в б хлоропластах и TMRE в сферических структурах;
два оптических среза, различающиеся глубиной в 2 мкм;
инкубация с 2 мкМ TMRE – 1 ч;
д – в протонофор ХКФ подавляет накопление флуоресцирующего TMRE в сферических структурах, и они становятся невидимыми. – изображение в проходящем свете, 2 – флуоресценция хлорофилла в хлоропластах, г 3 – флуоресценция DCF или TMRE, 4 – наложение изображений 2 и 3. Стрелкой показана область клеточного ядра.
Масштабная линейка – 5 мкм.
д Менадион и Н2О2: действие на рост и на состояние нуклеоидов А. variabilis.
Флуоресцентная микроскопия показала, что добавление Н2О2 вызывает разрушение нуклеоидов в клетках А. variabilis (рис. 13 а) и лизис клеток цианобактерии (рис.13 б, в). Н2О2 и менадион вызывали рост выхода флуоресценции DCF (рис. 13 г), который подавлялся антиоксидантами NAC и тролоксом. Н2О2 и менадион укорачивали нити клеток трихома А. variabilis.
Рис. 13. Действие Н2О2 и менадиона на клетки А.variabilis. а – разрушение нуклеоидов (данные флуоресцентной микроскопии). Инкубация на свету с менадионом и Н2О2 – 20 ч. ДНК в клетках окрашивали 20 мкМ DAPI (инкубация – 1 ч). Стрелками показаны безнуклеоидные клетки. Маркер – 2 мкм. Добавки: 100 мкМ менадиона, 10 мМ Н2О2;
б, в – влияние Н2О2 и менадиона на рост клеток. В контроле (без добавок) по данным спектрофотометрии при 540 нм наблюдался рост клеток. Исходная величина D540 0,46. Представлены данные о величинах D540, через 19 и 41,5 ч инкубации Н2О2 и менадионом;
г (1, 2, 3) – влияние антиоксидантов на образование DCF из DCFH, вызванное Н2О2 и менадионом. Добавки: 1 мМ NAC, 100 мкМ тролокса, 100 мкМ менадион;
1 мМ Н2О2.
Влияние ингибитора синтеза белка линкомицина на клетки А.variabilis.
Общим механизмом ПКС бактерий является автолиз, распад клеток с участием гидролаз пептидогликана (автолизинов) (Самуилов, 2000;
Lewis, 2000). Лизис клеток бактерий, вызванный антибиотиками осуществляется по программируемому механизму. При действии антибиотиков (пенициллина, ванкомицина) происходит индукция автолиза. Снижение активности муреиновых гидролаз, напротив, предотвращает автолиз, индуцированный пенициллином (Lewis, 2000;
Rice, Bayles, 2003). Линкомицин вызывал гибель клеток А. variabilis с признаками автолиза.
Выводы 1. По флуоресценции дихлорфлуоресцеина (DCF) зарегистрировано образование Н2О2 в пленках эпидермиса из листьев гороха, кукурузы и клетках цианобактерии А. variabilis.
2. Цианид вызывал апоптозное разрушение ядер замыкающих клеток устьиц в эпидермисе, изолированном из листьев гороха. Действие СN– усиливалось Н2О2. Нитросиний тетразолий, окисляющий О2·, предотвращал разрушение ядер УК, вызванное СN– или СN– + Н2О2.
Катионное производное убихинона 10-(6-убихинолил)децилтрифенилфосфоний, избирательно аккумулирующееся в митохондриях, предотвращало СN– –индуцированное разрушение ядер устьичных клеток и подавляло Н2О2-зависимое образование 2,7 дихлорфлуоресцеина в эпидермисе из листьев гороха, вызванное менадионом. Маннитол и этанол, ловушки ·ОН, уменьшали CN– -индуцированный апоптоз. Н2О2, ·ОН, а также ресурсы О2·, используемые для генерации H2O2, участвуют в СN–-индуцированном апоптозном распаде ядер устьичных клеток.
3. Хинакрин, ингибитор флавиновых ферментов, подавлял флуоресцентный ответ DCF на добавление Н2О2 или менадиона. Хинакрин не влиял на дыхание и фотосинтетическое выделение О2 насечками листьев гороха. Возможно, NADPH-оксидаза плазматической мембраны функционирует в качестве источника АФК в программированной гибели клеток.
4. Краситель бенгальский розовый (БР), фотосенсибилирующий образование синглетного кислорода (1O2) в сочетании с NADH, окисляемым 1O2 с образованием О2·, на свету вызывал рост выхода флуоресценции DCF, чувствительный к НСТ. Эти результаты позволяют предполагать функционирование пероксидазы клеточной стенки в качестве источника активных форм кислорода.
5. БР и этиловый эфир тетраметилродамина, ингибиторы фотосистемы II диурон и бромоксинил, фотосенсибилизирующие генерацию синглетного кислорода, подавляли СN– индуцированное разрушение клеточных ядер на свету. Это подавление предотвращалось добавленным NADH, субстратом пероксидазы. Инкубация насечек листьев с БР на свету снижала скорость фотосинтетического выделения О2 и создавала проницаемость устьичных клеток для иодистого пропидия. Синглетный кислород, генерируемый БР на свету, по видимому, вызывает некроз устьичных клеток, выводя из строя фотосистему II хлоропластов.
6. Н2О2 и менадион вызывали увеличение флуоресценции DCF в клетках А. variabilis и разрушение нуклеоидов клеток. Линкомицин, ингибитор синтеза белка у бактерий, вызывал разрушение клеток А. variabilis с признаками автолиза.
7. Активные формы кислорода участвуют в программированной гибели клеток растений и разрушении нуклеоидов клеток А. variabilis. Источниками АФК в ПКС клеток растений, по видимому, являются NADPH-оксидаза плазматической мембраны, хлоропласты, митохондрии, ядро устьичных клеток, а также апопластная пероксидаза.
По материалам диссертации опубликованы следующие работы:
1. Самуилов В.Д., Киселевский Д.Б., Синицын С.В., Шестак А.А., Лагунова Е.М., Несов А.В. (2006) Н2О2 усиливает CN- –индуцированный апоптоз в листьях гороха. Биохимия, 71, с.481–492.
2. Дзюбинская Е.В., Киселевский Д.Б., Лобышева Н.В., Шестак А.А., Самуилов В.Д.
(2006). Гибель устьичных клеток в эпидермисе листьев при нарушении энергообеспечения.
Биохимия, 71, с.1383–1391.
3. Васильев Л.А., Воробьев А.А., Дзюбинская Е.В., Несов А.В., Шестак А.А., Самуилов В.Д. (2007). Вызванная CN гибель клеток в листьях растений. Биохимия, 72, с.707–713.
4. Шестак А.А., Молчанова Д.В. Флуориметрическое изучение образования АФК в клетках листьев гороха. Молодые исследователи – регионам: Материалы всероссийской научной конференции студентов и аспирантов. Тезисы докладов в 2-х томах.- Вологда: ВоГТУ, 2005.-Т.I. – с. 5. Шестак А.А., Молчанова Д.В. Образование АФК при воздействии на электронтранспортные цепи митохондрий и хлоропластов. Тезисы докладов международной конференции «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия», Вологда, 2005. с. 187–188.
6. Nesov A.V., Kuznetsova J.E., Shestak А.А., Kiselevsky D.B. Reactive oxygen species and their sources in programmed death of pea guard cells. Тезисы докладов международной конференции «Российская биоэнергетика: от молекул к клетке», Москва, МГУ, 2005. с.54.
7. Шестак А.А., Булахов А.В. Флуориметрическое определение образования активных форм кислорода в эпидермальных пленках из листьев гороха. Тезисы докладов XIII международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов -2006», Москва, 2006, с.250.
8. Киселевский Д.Б., Шестак А.А., Несов А.В., Кузнецова Ю.В. Влияние ингибиторов флавиновых ферментов и Са2+ на индуцируемую цианидом гибель устьичных клеток гороха.
Международная научная конференция “Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных экосистемах” 16–19 мая 2006 г, Москва. Сборник тезисов, с.78–79.
9. Булахов А.В., Молчанова Д.В., Шестак А.А, Киселевский Д.Б. Разрушение нуклеоидов в клетках Anacystis nidulans при окислительной обработке. Тезисы докладов XIV международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов -2007», Москва, 2007, с. 3–4.
10. Киселевский Д.Б., Васильев Л.А., Дзюбинская Е.В., Шестак А.А., Самуилов В.Д.
Программируемая гибель клеток растений: действие производного убихинона mitoQ, избирательно аккумулируемого митохондриями. Тезисы международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 2007, с. 261– 11. Шестак А.А., Киселевский Д.Б., Самуилов В.Д. Образование синглетного кислорода в фотосистеме II хлоропластов и его участие в программируемой гибели устьичных клеток гороха. Материалы докладов международной конференции (в трех частях). Часть 2.
«Современная физиология растений: от молекул до экосистем», Сыктывкар, 2007, с. 434.
12. Nesov A.V., Shestak А.А., Kiselevsky D.B., Samuilov V.D. Effect of qunacrine and diphenylene iodonium, flavin enzymes inhibitors, on programmed cell death of pea guard cells.
Proceedings of the I (IX) conference of young botanists in Saint-Petersburg. St.Petersburg, 2006, р.228–229.
13. Kuznetsova J.E., Shestak А.А., Kiselevsky D.B., Samuilov V.D. The role of Са 2+ in the generation of reactive oxygen species and programmed cell death induced in plants. Proceedings of the I (IX) conference of young botanists in Saint-Petersburg. St.Petersburg, 2006, р.226–227.
14. Kiselevsky D.B., Shestak A.A., Sinitsyn S.V., Nesov A.V., Samuilov V.D. Cyanide th induced apoptosis in pea leafs. 14 European Bioenergetics Conference EBEC, Moscow State University, Moscow, 22–27 July 2006.
Abstract
book, p. 499.