Участие аквапоринового гомолога aqpz в реакции цианобактерии synechocystis на гиперосмотический стресс
На правах рукописи
ШАПИГУЗОВ Алексей Юрьевич УЧАСТИЕ АКВАПОРИНОВОГО ГОМОЛОГА aqpZ В РЕАКЦИИ ЦИАНОБАКТЕРИИ SYNECHOCYSTIS НА ГИПЕРОСМОТИЧЕСКИЙ СТРЕСС 03.00.12 – Физиология и биохимия растений
АВТОРЕФЕРАТ
ДИССЕРТАЦИИ на соискание учёной степени кандидата биологических наук
МОСКВА-2003
Работа выполнена в Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН в Отделе Молекулярных основ внутриклеточной регуляции и биотехнологии фотоавтотрофных биосинтезов, г. Москва и в Национальном Институте Общей Биологии в Лаборатории клеточной регуляции, г. Оказаки, Япония.
НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:
доктор биологических наук, профессор Лось Дмитрий Анатольевич ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:
доктор биологических наук Трофимова Марина Сергеевна доктор биологических наук Еланская Ирина Владимировна ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:
Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН
Защита состоится «23» декабря 2003 г. в 11 часов на заседании Диссертационного совета К 002.210.01 при Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу:
127276, г. Москва, ул. Ботаническая, 35. Факс: (095) 977-80-
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН.
Автореферат разослан «20» ноября 2003 г.
Учёный секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук М.И. Азаркович
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Аквапорины – недавно открытый класс трансмембранных канальных белков, представители которого обеспечивают транспорт воды через клеточные мембраны (Agre & Kozono, 2003).
Представители класса аквапоринов встречаются во всех крупных таксонах живых организмов. Многие из этих белков интенсивно исследуются in vitro, однако сложность количественной оценки активности аквапоринов затрудняет изучение их роли in vivo.
Пресноводная цианобактерия Synechocystis, геном которой содержит один ген, гомологичный аквапорину (Calamita et al., 1995), представляется удобным объектом для оценки роли аквапоринов в клеточной реакции на гиперосмотический стресс. В гиперосмотических условиях среды вода выходит из клетки через плазматическую мембрану, и в то же время в клетке развивается стрессовый ответ, наблюдаемый как на уровне клеточного метаболизма, так и на уровне генной экспрессии. Исследование Synechocystis с помощью метода электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) (Blumwald et al., 1983) позволяет количественно оценить динамику изменения объема цитоплазмы клеток и исследовать роль аквапорина в развитии клеточной стрессовой реакции.
Цели и задачи работы. Целью работы являлось изучение роли продукта гомологичного аквапорину гена aqpZ пресноводной цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 в клеточном ответе на гиперосмотический стресс.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
1. Создание мутантного штамма Synechocystis с инактивированным геном аквапорина.
2. Исследование вклада AqpZ в трансмембранный перенос воды у Synechocystis in vivo.
3. Определение роли продукта гена aqpZ в реакции клетки Synechocystis на гиперосмотический стресс.
4. Изучение влияния делеции гена aqpZ на генную экспрессию в условиях гиперосмотического стресса.
Научная новизна. Впервые изучена функция аквапорина AqpZ при реакции клеткок Synechocystis на стрессовые условия и показано участие AqpZ в регуляции генной экспрессии при гиперосмотическом стрессе. Метод ЭПР, использованный для анализа изменения цитоплазматического объема, является перспективным способом изучения свойств индивидуальных аквапоринов цианобактерий in vivo.
Научно-практическое значение. Полученные результаты могут быть использованы для дальнейшего изучения механизмов развития стрессового ответа на гиперосмотический стресс и роли аквапоринов in vivo. Взаимосвязь водного баланса клетки и организма с внутриклеточными процессами, в том числе с генной экспрессией, в значительной степени определяется активностью аквапоринов, поэтому дальнейшее изучение этих белков представляется перспективным для многих прикладных областей.
Апробация работы. Материалы, вошедшие в диссертационную работу, были представлены на Международной конференции «Растения под влиянием стрессов окружающей среды», Москва, 2001;
Международном симпозиуме по молекулярной генетике и биотехнологии, Москва, 2001;
Европейском симпозиуме по молекулярной биологии цианобактерий, Стокгольм, 2002.
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано работ в отечественных и зарубежных изданиях.
Структура диссертации. Диссертация состоит из разделов: Введение, Обзор литературы, Объекты и методы исследований, Результаты и их обсуждение, Заключение, Выводы, Литература. Работа изложена на странице машинописного текста, включает 23 рисунка, 2 таблицы;
список литературы включает 170 наименований.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Штаммы цианобактерий. Штамм цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 был предоставлен Национальным Институтом Общей Биологии (NIBB, Оказаки, Япония). Мутантный штамм aqpZ(-) с инактивированным геном аквапорина был получен путем сайт-специфического мутагенеза с использованием кассеты устойчивости к антибиотику спектиномицину.
Создание рекомбинантного штамма. В геноме Synechocystis была найдена единственная копия гена, гомологичного аквапорину (Calamita et al., 1995). Амплификация фрагмента, включающего в себя этот ген (aqpZ или slr2057 в соответствии с классификацией CyanoBase, www.kazusa.org/cyano/) с фланкирующими областями, проводилась на геномной ДНК Synechocystis при помощи праймеров wchF, 5’-ACCGTTGCCGCTGTAAAGGC, и wchR, 5’ CAGATAGTTGCGGATAGTGC, ДНК-полимеразой AmpliTaqGold (Perkin Elmer, США). Полимеразная цепная реакция (ПЦР) включала в себя предварительную денатурацию ДНК (2 мин, 96°С);
30 циклов, состоящих из последовательных стадий: (а) денатурации ДНК (1 мин, 96°С), (б) отжига праймеров (1 мин, 50°С) и (в) синтеза цепи ДНК (3 мин, 72°С);
после чего проводился дополнительный синтез цепи ДНК в течение 10 мин при 72°.
Полученный в результате ПЦР фрагмент был лигирован в pT7-t/a вектор (Novagen, США). Кассета устойчивости к спектиномицину была получена из плазмиды pAL (Prentki et al., 1984) путем гидролиза рестриктазой Sma I и вставлена по двум сайтам Eco47 III, находящимся в кодирующей части гена aqpZ (Рис. 1а).
Рестрикция и лигирование ДНК проводились ферментами фирмы Fermentas (Литва), согласно протоколам фирмы-изготовителя.
Трансформация клеток цианобактерий. Трансформация клеток Synechocystis проводилась методом Вильямса (Williams, 1988). Клетки из мл интенсивной культуры осаждались центрифугированием и Eco0109 I 1 2 M Eco47 III Eco47 III Eco52 I Hind III Hind III Hind III Hind III ApaL I Sac II Mun I Msc I Msc I Msc I Spe I Nco I Nco I Ssp I Pvu I Pvu I Dra I Bal I Bal I Bal I wchF aqpZ wchR т.п.н.
0,5 1,0 1,5 2, Spres а) б) Рисунок 1. Создание мутанта с разрушенным геном аквапорина (aqpZ).
(а) Ген aqpZ с фланкирующими областями амплифицирован с использованием праймеров wchL и wchR (указаны стрелками). С помощью рестриктазы Eco47 III из гена удален участок кодирующей последовательности, вместо которого вставлена кассета устойчивости к спектиномицину (Spres). (б) Электрофорез амлифици рованных фрагментов ДНК при проверке степени сегрегации хромо сом: 1 – фрагмент, амплифицированный из геномной ДНК дикого типа (отрицательный контроль);
2 – фрагмент, амплифицированный из геномной ДНК мутанта;
М – метчик молекулярных масс ДНК.
ресуспендировались в 2 мл среды BG11. К суспензии добавляли 5-10 мкг ДНК, инкубировали 4 часа в темноте, затем 10 часов на свету. После этого клетки высевали на чашки с агаризованной средой BG11, содержащей 5 мкг мл- спектиномицина. Первичные клоны последовательно пересевали с увеличением концентрации антибиотика от 5 до 30 мкг мл-1. Полученные рекомбинантные штаммы растили на среде, содержащей 30 мкг мл- спектиномицина.
Сегрегация хромосом у мутантного штамма aqpZ(-) проверялась полимеразной цепной реакцией с использованием ExTaq DNA Polymerase (TaKaRa Co. Ltd., Киото, Япония). Условия реакции были следующими:
предварительная денатурация ДНК (2 мин, 96°С);
30 циклов, состоящих из (а) денатурации ДНК (1 мин, 96°С), (б) отжига праймеров (1 мин, 55°С) и (в) синтеза цепи ДНК (5 мин, 72°С);
дополнительный синтез ДНК (10 мин, 72°С).
Для проверки также использовались праймеры wchF и wchR (Рис. 1б).
Условия культивирования. Аксеничные культуры цианобактерий поддерживались на агаризованной среде BG11 (с содержанием агарозы 1, %), забуференной 20 mM HEPES-NaOH, pH=7,5 (Stainer et al. 1971) на чашках Петри при температуре 34°С и постоянном освещении люминесцентными лампами интенсивностью 70 мкМ квантов света м-2c-1. Мутант поддерживался на среде с добавлением спектиномицина до концентрации 30 мкг мл-1.
Интенсивные культуры выращивались в плоскопараллельных сосудах в жидкой среде BG11, забуференной 20 mM HEPES-NaOH, pH=7,5, при температуре 34°С, постоянном освещении лампами накаливания интенсивностью 70 мкМ квантов света м-2c-1 и аэрации стерильной газо воздушной смесью, обогащенной CO2 до концентрации 1 %. Культуры выращивались при данных условиях до плотности ОП750= 0,8-1, (контрольные условия) и затем переносились в экспериментальные условия.
Условия гиперосмотического стресса создавались с помощью добавления к среде культивирования 5 М раствора сорбита в среде BG11 до конечной концентрации 0,5 М. Выбор данного вещества для создания гипреосмотических условий связан с тем, что сорбит не проникает внутрь клетки через плазматическую мембрану и, насколько это известно, не оказывает какого-либо существенного влияния на клетку через ее поверхностные рецепторы.
Измерение цитоплазматического объема клеток. Цитоплазматический объем клеток был определен с помощью метода электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) (Blumwald et al., 1983). Суспензию исследуемых клеток объемом 40 мкл, содержащую реагенты для проведения исследования ЭПР, в том числе 1,0 mМ свободный радикал 1-оксил-2,2,6,6, тетраметилпиперидин (ТЕМПО), 20 mМ K3[Fe(CN)6]3 и 75 mM Na2Mn-ЭДТА, запаивали в стеклянный капилляр. Спектры ЭПР снимались на спектрометре ESP 300E (Bruker, Карлсруэ, Германия) при комнатной температуре. При этом в качестве контроля использовался капилляр, заполненный 1,0 mM раствором ТЕМПО. Измерения проводились в темноте в следующих условиях: частота модуляции поля 100 кГц, частота микроволн 11,72 ГГц, амплитуда модуляции 0,4 мT, мощность микроволн 10 мВт, временная постоянная 80 мс, скорость сканирования 0,4 ГГц.
Измерение активности фотосистемы II. Электрон-транспортная активность фотосистемы II определялась in vivo при 32°С по свето индуцированному выделению кислорода с помощью кислородного электрода Кларка (Hansatech Instruments, Кингс-Линн, Великобритания). Индуцирующий свет (с интенсивностью 2 mМ квантов света м-2c-1 на поверхности кюветы) от лампы накаливания пропускался через красный светофильтр R-60 (Toshiba, Токио, Япония) и фильтр НА-50 (Hoya Glass, Токио, Япония), поглощающий инфракрасное излучение. Выделение кислорода измерялось в присутствии 1,0 mМ 1,4-бензохинона или 1,0 mМ 2,6-дихлоро-1,4-бензохинона в качестве искусственного акцептора электронов.
Измерение активности фотосистемы I. Электрон-транспортная активность фотосистемы I определялась in vivo при 32°С по свето индуцированному поглощению кислорода с помощью кислородного электрода Кларка (Hansatech Instruments, Кингс-Линн, Великобритания). Индуцирующий свет (с интенсивностью 2 mМ квантов света м-2c-1 на поверхности кюветы) от лампы накаливания пропускался через красный светофильтр R-60 (Toshiba, Токио, Япония) и фильтр НА-50 (Hoya Glass, Токио, Япония), поглощающий инфракрасное излучение. Активность фотосистемы I измерялась в присутствии 15 мкМ DCMU (дихлорфенилдиметилмочевины), 5 mМ аскорбата натрия, 0,1 mМ TMPD (N,N,N’,N’-тетраметил-р-фенилендиамина) и 0,1 mМ метилвиологена (Allakhverdiev et al., 2000).
Выделение РНК. Выделение РНК проводили согласно Kiseleva et al.
(2000). Для этого 50 мл суспензии клеток Synechocystis (ОП750= 0,8-1,0) фиксировали с помощью добавления равного объема охлажденного этанола, содержащего 5 % фенола. Клетки осаждали центрифугированием в течение мин при 4000 об мин-1 при температуре 4°С (центрифуга К-23, Германия).
Осадок ресуспендировали в 1 мл буфера ТЕ 50/100 (50 mМ Трис-НСl, pH 7.5, 100 mМ ЭДТА), переносили в пробирки, осаждали центрифугированием, замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С. Перед выделением нуклеиновых кислот осадок ресуспендировали в 0,5 мл 50/100 ТЕ буфера и инкубировали с 0,5 мл фенола, насыщенного ТЕ, 10 мин при 65°С. Затем смесь центрифугировали в течение 3-5 мин и супернатант дважды обрабатывали смесью фенола с хлороформом (1:1). Нуклеиновые кислоты осаждали двойным объёмом этанола, разделяли путём осаждения РНК в LiCl (Sambrook et al. 1989).
Микрокомплектный анализ экспрессии генов (DNA microarray).
Выделенную из клеток РНК очищали от остаточных количеств ДНК с помощью ДНКазы I (Nippon Gene, Токио, Япония). Для реакции обратной транскрипции использовали следующую реакционную смесь: 100 ед. обратной транскриптазы AMV Reverse Transcriptase XL (TaKaRa Co. Ltd., Киото, Япония), 1х реакционный буфер, смесь дезоксирибонуклеотидилтрифосфатов с низким содержанием dCTP (2 mM dCTP, 5 mM dTTP, 5 mM dGTP, 5 mM ATP), 3 mM Cy3-dCTP (или Cy5-dCTP), (Amersham Pharmacia Biotech, Швеция), пМ случайного гексамерного праймера, 100 ед. ингибитора РНКаз (RNasin I, TaKaRa Co. Ltd., Киото, Япония), 20 мкг общей РНК. Су3 и Су5 – флуорофоры с различными спектрами поглощения и эмиссии. РНК, выделенную из контрольного образца, метили Cy5-dCTP, выделенную из экспериментального образца - Cy3-dCTP. Реакцию обратной транскрипции проводили при 42°С часа. Не включившиеся в цепь кДНК нуклеотиды удаляли путем гель фильтрации на колонках Centri-Sep (Princeston Separations, США) (Kanesaki et al., 2002;
Yamaguchi et al., 2002). Полученную меченую кДНК освобождали от РНК щелочным гидролизом (200 mM NaOH 40 минут при 65°С) с последующей нейтрализацией щелочи 3 М ацетатом натрия (рН 5,5) и переосаждением спиртом (Heller et al., 1997;
Ye et al., 2000).
Цианочипы версии 1.4 (CyanoCHIP v. 1.4) были предоставлены компанией TaKaRa. Микрочипы прегибридизовали в буфере, содержащем, 4х SSC, 0,2 % SDS, 5х раствор Денхардта, 100 нг мл-1 ДНК спермы лосося, при температуре 65°С 1 час. Гибридизацию проводили при тех же условиях в течение 12 часов.
Гибридизованные чипы отмывали в 2х SSC (1х SSC содержит 150 mM NaCl и 15 mM цитрата натрия) при комнатной температуре, 2х SSC 10 мин при 60°С, затем в 0,2х SSC и 0,1 % SDS 10 мин при 60°С и в 0,2х SSC 2 мин при комнатной температуре.
Сканирование микрочипов проводили на сканере GMS418 (Affimetrix, США). Определение интенсивности сигналов индивидуальных генов проводили при помощи программы AutoGene V. 4.1 software (BioDiscovery, Лос-Анджелес, США). Интенсивность сигнала каждого гена нормализовали по сумме интенсивностей сигналов всех генов за исключением генов рибосомальной РНК. Затем рассчитывали изменения в количестве транскрипта каждого гена по отношению к общему уровню мРНК. Все эксперименты проводили в двух-трёх повторностях.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Гиперосмотический стресс: относительные изменения цитоплазма тического объема клеток aqpZ(-) мутанта и дикого типа. Изменения цитоплазматического объема исследуемых штаммов проводились методом ЭПР. Этот метод представляется одним из наиболее эффективных способов оценки цитоплазматического объема клеток цианобактерий. В случае других возможных подходов, таких как измерение упакованного (внешнего) объема клеток, либо непосредственная визуализация фиксированных клеток при помощи электронной микроскопии, исследование упирается в значительные трудности. С одной стороны, наличие у цианобактерий механически прочной клеточной стенки не позволяет судить по внешнему объему клетки об объеме ее цитоплазмы. В условиях гиперосмотического стресса объем пространства, ограниченного цитоплазматической мембраной, может значительно сокращаться (см. ниже), в то время как жесткая клеточная стенка сохраняет свой объем (данные не представлены). В случае метода электронной микроскопии проблемы с определением цитоплазматического объема клеток возникают на стадии фиксации препарата, когда под действием формальдегида нарушается целостность цитоплазматических мембран.
Суть метода ЭПР состоит в том, что свободный радикал ТЕМПО, окисленный под действием K3[Fe(CN)6]3, легко проникает через цитоплазматическую мембрану и достигает равновесия во всех фазах суспензии клеток. Na2Mn-ЭДТА является тушителем парамагнитного эффекта радикала ТЕМПО. При этом диффузия Na2Mn-ЭДТА через цитоплазматическую мембрану крайне затруднена, и, таким образом, ТЕМПО, растворенный в цитоплазме клеток, не подвергается тушению. По разности сигнала ЭПР в условиях наличия, либо отсутствия тушителя можно судить об изменениях внутреннего объема клеток in vivo.
После создания условий гиперосмотического стресса с помощью добавления сорбита до конечной концентрации 0,5 М цитоплазматический объем клеток дикого типа снижался примерно в два раза за 5-10 мин за счет выхода воды из клеток во внешнюю среду, в то время как в клетках мутантного штамма практически не наблюдалось изменения объема (Рис. 2).
На основании этих данных можно предположить, что продукт гена aqpZ цитоплазматический объем (%) Рисунок 2. Относительные изменения цито плазматического объема клеток 0 60 0 60 120 дикого типа ( ) и мутанта aqpZ(-) ( ) время инкубации (мин) в в ходе инкубации в условиях присутствии 0,5М сорбита гиперосмотического стресса.
задействован в быстром выходе воды из клеток Synechocystis в условиях гиперосмотического стресса. При этом вклад липидного бислоя в водную проницаемость цитоплазматической мембраны этого организма оказывается несущественным, по крайней мере, на ранних стадиях клеточного ответа на гиперосмотический стресс.
Эти данные согласуются с исследованиями действия ртутных ингибиторов аквапоринов на клетки Synechococcus. Их применение сильно затрудняло сжатие клеток этого организма в ответ на гиперосмотический стресс (Allakhverdiev et al., 2000).
Изменения активности фотосистем в клетках мутанта aqpZ(-) и дикого типа в условиях гиперосмотического стресса. Была проведена оценка электрон-транспортной активности фотосистем I и II в клетках дикого типа и aqpZ(-) мутанта в течение инкубации этих штаммов в гиперосмотических условиях.
В клетках дикого типа активность обеих фотосистем существенно снижалась в первые 20-30 мин гиперосмотического стресса и оставалась пониженной в течение более чем 2 часов, что свидетельствует о значительных изменениях в жизнедеятельности клеток дикого типа на начальных этапах адаптации к гиперосмотическим условиям культивирования. В дальнейшем активность фотосинтеза в клетках дикого типа постепенно восстанавливалась (Рис. 3, 4). С другой стороны, электрон транспортная активность обеих фотосистем практически не изменялась в клетках мутанта aqpZ(-) в течение первого часа гиперосмотического стресса.
В дальнейшем, однако, наблюдалось ингибирование обеих фотосистем (Рис.
3, 4).
Корреляция, наблюдаемая между процессами изменения цитоплазматического объема исследуемых штаммов (Рис. 2) и активности их фотосистем, позволяет предположить, что внутренний объем, либо форма клетки может каким-то образом влиять на механизмы адаптации, в том числе на процессы фотосинтетического транспорта электронов.
относительная активность относительная активность фотосистемы II (%) фотосистемы I (%) 75 50 25 0 60 0 60 0 60 120 0 60 время инкубации (мин) в время инкубации (мин) в присутствии 0,5М сорбита присутствии 0,5М сорбита Рисунок 3. Относительные изменения Рисунок 4. Относительные изменения активности фотосистемы II в активности фотосистемы I в клетках дикого типа ( ) и клетках дикого типа ( ) и мутанта aqpZ(-) ( ) в ходе мутанта aqpZ(-) ( ) в ходе инкубации в условиях гипер- инкубации в условиях гипер осмотического стресса. осмотического стресса.
Фенотипическая маскированность мутации в гене aqpZ при стандартных условиях культивирования. С помощью метода микрокомплектного анализа экспрессии генов можно проанализировать изменения в концентрации мРНК каждого индивидуального гена Synechocystis. Мы провели сравнение генной экспрессии у штаммов дикого типа и aqpZ(-) мутанта при их интенсивной культивации в стандартных условиях. На диаграмме, представленной на рисунке 5, положение каждой точки по оси ординат определяется отношением уровня экспрессии определенного гена в мутантном штамме к уровню экспрессии того же гена в штамме дикого типа. Большая часть генов сконцентрирована вокруг прямой y=1 в пределах интервала у(0,5;
2), определяющего ошибку данного метода.
Тем не менее, ряд точек выходит за рамки этого интервала. Снизу видна одна точка, соответствующая собственно гену aqpZ. Около 20 точек соответствуют генам, экспрессия которых в мутантном штамме более чем вдвое превосходит экспрессию в диком типе. Эти точки, расположенные выше прямой y=2, соответствуют генам рибосомальных белков sll1799-sll1813 и ssl3432-ssl3437, которые входят в состав одного оперона и кодируют белки обеих субъединиц рибосомы. Скорее всего, индукция рибосомальных генов в мутанте aqpZ(-) не связана с действием мутации, но определяется поддержанием культуры мутанта на антибиотике спектиномицине. Это вещество, связывающееся с малой субъединицей рибосомы, является ингибитором прокариотической трансляции, и индукция экспрессии ряда рибосомальных белков в мутанте aqpZ(-) может иметь компенсаторное значение.
соотношение интенсивностей сигнала в мутанте aqpZ(-) и диком типе 0, 0,1 0, 0, 0,1 0,01 0,1 относительная интенсивность сигнала Рис 5. Соотношение профилей генной экспрессии у мутанта aqpZ(-) и дикого типа в стандартных условиях культивирования. Серым цветом отмечены гены рибосомальных белков, экспрессия которых индуцирована в клетках мутанта по сравнению с диким типом. Черным обозначен ген aqpZ.
Таким образом, при культивации мутантного штамма в стандартных условиях профилю его генной экспрессии не свойственны какие-либо значительные отклонения от дикого типа.
Изменения генной экспрессии в клетках aqpZ(-) мутанта и дикого типа в условиях гиперосмотического стресса. Известно, что гиперосмо тический стресс вызывает изменения в экспрессии целого ряда генов в клетках Synechocystis (Kanesaki et al., 2002). Для того чтобы выяснить, изменен ли характер генной экспрессии при гиперосмотическом стрессе у мутанта aqpZ(-), был также применен метод микрокомплектного анализа. Мы получили данные по изменениям генной экспрессии в клетках дикого типа и в мутанте aqpZ(-) после 15, 60 и 120 минут культивации этих штаммов в гиперосмотических условиях.
Список генов, экспрессия которых чувствительна к гиперосмотическим условиям, оказался сходным в обоих штаммах. Некоторые из этих генов индуцируются (Рис. 6), а некоторые – претерпевают репрессию (Рис. 8). Для части генов характерна кратковременная индукция на ранней стадии клеточного ответа, тогда как другие гены индуцируются позже, достигая максимума экспрессии через 60 минут и более после добавления сорбита (Рис. 6). Скорее всего, наблюдаемое увеличение концентраций соответствующих мРНК связано с их синтезом de novo, хотя возможность повышения стабильности мРНК также не следует исключать.
В клетках дикого типа около 40 генов демонстрируют кратковременную индукцию более чем в два раза в течение первых 15 минут гиперосмотического стресса. К ним относятся гены некоторых протеаз, в том числе clpB, ген шаперона hspA и несколько генов с неизвестными функциями.
Индукция ряда генов развивается медленнее и имеет более продолжительный характер. Так, через час после добавления сорбита в клетках наблюдается повышенная экспрессия генов шаперонов (dnaJ, dnaK, htpG), шаперонинов (groEL, groEL-2, groES) (Рис. 7) и протеаз (htrA). За счет этого в клетке, очевидно, повышается стабильность белков и обеспечивается их правильное сворачивание. Наблюдается также экспрессия гена супер оксиддисмутазы sodB, продукт которого тоже играет в клетке протектирующую роль, снижая концентрацию активных форм кислорода. Индуцируются и гены некоторых регуляторных белков, в том числе, сигма-фактора РНК полимеразы sigD, и некоторых участников двухкомпонентных сигнальных систем.
Значительную индукцию в клетках дикого типа, но не мутанта, претерпевает ген глюкозилглицеринфосфатсинтазы, ggpS (sll1566), продукт которого участвует в синтезе глюкозилглицерина, одного из основных осмопротекторных веществ у Synechocystis (Engelbrecht et al., 1999).
Экспрессия некоторых генов медленно индуцируется в течение первых минут гиперосмотического стресса и, по-видимому, остается повышенной в течение несколько часов. Вероятно, эти гены отвечают за восстановление активности клеточных процессов на фоне адаптации клеток к изменившимся условиям среды. К ним относятся гены субъединиц АТФ-синтазы и рибосомальных белков. Долгосрочная индукция характерна также для ряда генов, связанных с энергетическим метаболизмом, фиксацией СО2 и биосинтезом гема и для многих генов с неизвестными функциями.
Для клеток aqpZ(-) мутанта характерны примерно те же наборы индуцирующихся генов, однако их индукция сильно ослаблена (к исключеням этой закономерности относится ряд генов рибосомальных белков).
К генам, репрессируемым в клетке в гиперосмотических условиях культивирования, относятся гены компонентов фотосистем I и II и фикобилисомы, ферментов фиксации СО2 (rbcL, rbcS), синтеза хлорофилла;
тиоредоксинов (trxM, trxA), а также сигма-субъединиц РНК полимеразы, в том числе rpoE (slr1545) и rpoF (slr1564). Также значительно снижена экспрессия генов пилинов (pilT, hofG), ряда регуляторных белков, в том числе фитохрома, репрессора lexA (sll1626) и некоторых регуляторов ответа двухкомпонентных систем (slr1584, slr0474, sll0485) (Рис. 8).
Большинство регуляторных белков, участвующих в клеточных сигнальных путях (например, белки двухкомпонентных систем), присутствуют в клетке в низких концентрациях, и метод микрокомплектного анализа оказывается недостаточно чувствительным для регистрации изменения этих концентраций.
Примером промотер-специфических регуляторов транскрипции, sll0416 60 кД sll1566 GgpS 8 sll1514 HspA шаперонин 8 8 относительная 7 7 GroEL- 6 6 индукция 5 5 4 4 3 3 2 2 1 1 0 0 8 0slr1894 ДНК-связы- 8 0 slr1641 ClpB 30 60 90 120 30 60 120 8 0 30 60 90 slr1204 протеаза относительная 7 7 вающий белок HtrA 6 6 индукция 5 5 4 4 3 3 2 2 1 1 0 0 8 0 30 60 90 120 8 0 30 60 90 120 8 0 30 60 90 slr0083 РНК хели sll0927 S-аденозил- sll1085 GlpD относительная 7 7 6 метионинсинтетаза каза CrhR (DeaD) 6 6 индукция 5 MetX 5 4 4 3 3 2 2 1 1 0 0 8 0 30 60 90 120 8 0 30 60 90 120 8 0 30 60 90 slr1330 субъединица slr1675 HypA slr1322 модулятор относительная 7 7 АТФ синтазы AtpE 6 ДНК гиразы TldD индукция 5 5 4 4 3 3 2 2 1 1 0 0 0 30 60 90 120 0 30 60 90 120 0 30 60 90 sll 8 slr1963 sll 10 10 относительная 7 6 индукция 6 6 6 4 1 0 0 0 30 60 120 0 30 60 120 0 30 60 0 30 60 90 120 0 30 60 90 120 0 30 60 90 время инкубации в время инкубации в время инкубации в гиперосмотических гиперосмотических гиперосмотических условиях, мин условиях, мин условиях, мин Рисунок 6. Динамика генной индукции в клетках дикого типа ( ) и мутанта aqpZ(-) ( ) в ходе гипреосмотического стресса (по данным микрокомплектного анализа).
4 sll0897 DnaJ sll0170 DnaK slr0093 DnaJ относительная индукция 0 30 60 90 120 0 30 60 90 4 slr2075 GroES slr2076 GroEL относительная 3 индукция 2 1 sll0430 HtpG 0 30 60 90 120 0 30 60 90 0 30 60 90 120 30 60 90 время инкубации в время инкубации в время инкубации в гиперосмотических гиперосмотических гиперосмотических условиях, мин условиях, мин условиях, мин Рисунок 7. Динамика индукции генов шаперонов в клетках дикого типа ( ) и мутанта aqpZ(-) ( ) в ходе гипреосмотического стресса (по данным микрокомплектного анализа).
существующих в клетке в значительной концентрации, могут, по-видимому, являться альтернативные сигма-факторы РНК полимеразы, экспрессирующиеся в определенных стрессовых условиях. В связи с этим следует отметить выраженную репрессию генов одних сигма-факторов (sigG, sigF, sigH) и индукцию других (sigB) в ходе гиперосмотического стресса, что может являться одной из причин комплексных изменений генной экспрессии.
Экспрессия генов, демонстрирующих репрессию в клетках дикого типа, также репрессирована в aqpZ(-) мутантных клетках, впрочем, она значительно менее выражена количественно.
Таким образом, по данным микрокомплектного анализа, клетки мутанта aqpZ(-) демонстрируют нарушения в реакции на гиперосмотический стресс, выраженные в количественном ослаблении изменений в генной экспрессии, как индукции, так и репрессии. Следует отметить, что отличия в генной экспрессии между клетками дикого типа и мутанта носят количественный, но не качественный характер, то есть, наборы индуцирующихся и репрессирующихся генов в случае обоих штаммов практически одинаковы.
Рисунок 8. Динамика репрессии некоторых генов в клетках дикого типа ( ) и мутанта aqpZ(-) ( ) в ходе гипреосмотического стресса (по данным микрокомплектного анализа).
sll0573 карбамат киназа arcC sll1655 BirA sll1533 PilT репрессия (log10) 1 1 относительная 0, 0,1 0,1 0, ферре- субъеди slr0150 60 90 120 slr183560 90 0 30 0 30 60 90 120 0 доксин PetF ница Р700 PsaB slr0749 ChlL репрессия (log10) 1 1 1 относительная 0, 0,1 0,1 0, сигма slr1564 60 (rpoF) 0 30 120 0 30 60 90 120 0 30 60 90 фактор РНК-полиме- slr0623 тиоредоксин sll1626 репрессор разы SigF TrxA LexA репрессия (log10) относительная 1 1 0, 0,1 0,1 0, slr1545 (rpoE) сигма 0 30 60 90 120 0 30 60 90 120 0 30 60 90 фактор РНК-полиме- slr0473 фитохром sll0947 LrtA разы SigG Phy репрессия (log10) относительная 1 1 1 0, 0,1 0,1 0, 0,01 0,01 0,01 0, ФЕП-синтаза 0 30 60 slr0301 60 90 0 30 120 0 30 60 90 репрессия (log10) slr PpsA sll1009 FrpC относительная 1 1 1 0, 0,1 0,1 0, 0,01 0,01 0,01 0, 0 30 60 90 120 0 30 60 90 120 0 30 60 90 0 30 60 90 120 0 30 60 90 120 0 30 60 90 время инкубации в время инкубации в время инкубации в гиперосмотических гиперосмотических гиперосмотических условиях, мин условиях, мин условиях, мин ЗАКЛЮЧЕНИЕ Мутантный штамм с разрушенным геном аквапоринового гомолога aqpZ демонстрирует нарушенную реакцию на гиперосмотический стресс, созданный с помощью сорбита. С одной стороны, у мутанта резко затруднен выход воды из клетки, с другой стороны, мутантный штамм отличается от клеток дикого типа менее выраженными изменениями фотосинтетической активности и генной экспрессии. Скорее всего, именно неспособность мутанта к быстрому выбросу воды из клетки в гиперосмотических условиях лежит в основе наблюдаемых нарушений. На основании этого заключения можно выдвинуть некоторые предположения относительно механизмов активации клеточного ответа на гиперосмотический стресс.
Влияние гиперосмотического стресса на генную экспрессию изучалась в разных группах организмов (Csonka, 1989;
Hecker & Volker, 2001;
Rep et al., 2000;
Poolman & Glaasker, 1998), причем на роль первичного стимула, ответственного за активацию клеточных систем ответа, претендовали различные аспекты гиперосмотического стресса (Csonka, 1989;
Hoffmann & Dunham, 1995;
Wood, 1999;
Strom & Kaasen, 1993). Так, появление в среде культивирования растворенного осмотического агента вызывает снижение внеклеточного водного потенциала. Кроме того, осмотический агент может непосредственно воздействовать на клетку (как в случае солевого стресса, индуцированного с помощью NaCl), однако, использование сорбита в качестве осмотика позволяет устранить такое специфическое воздействие. Разность водного потенциала по разные стороны плазматической мембраны провоцирует выход воды из клетки. Это, в свою очередь, приводит к уменьшению объема цитоплазмы, деформации клеточных мембран и концентрированию цитоплазмы. Каждое из указанных явлений могло бы лежать в основе активации определенных клеточных сенсорных систем.
Можно предположить, что в клетках Synechocystis присутствуют сенсорные системы (возможно, представленные гистидиновыми киназами двухкомпонентных сигнальных систем или механосенсорными каналами (Johansson et al., 1998)), количественно реагирующие на степень изменений, сопровождающих гиперосмотический стресс. В случае мутанта aqpZ(-), лишенного аквапоринов и, в связи с этим, неспособного к высвобождению воды, эти изменения значительно ослаблены, что и приводит к количественному, но не качественному, ослаблению реакции мутантных клеток.
С другой стороны, полноценная реакция на гиперосмотический стресс может предусматривать активацию в клетках дикого типа дополнительных сенсорных молекул по мере выхода из них воды, в то время как в мутантных клетках эти молекулы будут оставаться неактивными.
Мы предполагаем, что такие гипотетические сенсорные молекулы, чувствительные к изменению формы/объема клетки, являются трансмембранными белками, реагирующими на состояние окружающего их липидного бислоя. Такие белки могут активироваться в результате изменения свойств мембраны при сжатии клетки и стимулировать дальнейшие изменения в генной экспрессии, наблюдаемые в клетках дикого типа, но не характерные для клеток aqpZ(-) мутанта.
Недавние исследования свидетельствуют о том, что некоторые мембраносвязанные сенсорные гистидиновые киназы могут принимать участие в рецепции нескольких различных видов стресса. Это происходит в том случае, если эти стрессы сходно влияют на физическое состояние клеточных мембран (Los and Murata, 2000). Так, трансмембранная гистидиновая киназа Hik33, известная ранее, как сенсор холодового стресса и, по-видимому, активирующаяся благодаря физическим изменениям своего липидного окружения, отвечает также за индукцию ряда генов при гиперосмотическом стрессе (Mikami et al., 2002).
К числу генов, экспрессия которых нарушена в клетках мутантного штамма hik33(-) в условиях гиперосмотического стресса, относятся, например, sll1483, clpB, sigB и htrA. Индукция указанных генов также нарушена в мутанте aqpZ(-). Это говорит о том, что гистидиновая киназа Hik33, скорее всего, является одним из сенсорных белков, участвующих в рецепции гиперосмотического стресса. С другой стороны, Hik33 не может быть единственным существующим сенсором, так как спектр нарушений генной экспрессии отличается в мутантных штаммах hik33(-) и aqpZ(-). Прочих участников активации сигнальных путей в ответ на гиперосмотический стресс еще предстоит найти.
ВЫВОДЫ 1. При стандартных условиях культивирования ген aqpZ (slr2057) не является необходимым для жизнедеятельности Synechocystis sp. РСС 6803. При интенсивной культивации клеток дикого типа и мутанта aqpZ(-) в стандартных условиях штаммы характеризуются сходным профилем генной экспрессии.
2. Продукт гена aqpZ играет существенную роль в обеспечении выхода воды из клетки в условиях гиперосмотического стресса. Водная проницаемость липидного бислоя вносит незначительный вклад в изменение цитоплазматического объема на ранних этапах гиперосмотического стресса.
3. В условиях гиперосмотического стресса мутант aqpZ(-) не демонстрирует снижения электрон-транспортной активности фотосистем I и II, характерного для клеток дикого типа.
4. Набор генов, уровень экспрессии которых изменяется в условиях гиперосмотического стресса, сходен у клеток мутанта aqpZ(-) и дикого типа, однако изменения генной экспрессии в мутанте значительно ослаблены количественно.
5. Выход воды из клетки, обеспеченный продуктом гена aqpZ и сопровождающийся изменениями цитоплазматического объема и клеточной формы, играет важную роль в формировании стрессорного клеточного ответа.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Shapiguzov, A.Yu., Sergeyenko, T.V., Lyukevich, A.A., Allakhverdiev, S.I., Murata, N., Los, D.A. (2001) Aquaporin controls rapid changes in cell volume in Synechocystis under hyperosmotic and salt stresses. Abstr. Intl. Conf. “Plants under environmental stress”. October 23-28, 2001. Moscow, Russia. p. 262.
2. Shapiguzov, A.Yu., Sergeyenko, T.V., Allakhverdiev, S.I., Murata, N., Los, D.A.
(2001) Response of the aquaporin-deficient mutant of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803 to hyperosmotic stress. Abstr. Internat.
Symp. on Molecular Genetics and Biotechnology. November 22-24, 2001.
Moscow, Russia. р. 187-188.
3. Shapiguzov, A., Sergeyenko, T.V., Lyukevich, A., Allakhverdiev, S.I., Murata, N., Los, D.A. (2002) Aquaporin controls osmotically induced volume changes and gene expression in Synechocystis. 5th European Workshop on Molecular Biology of Cyanobacteria. June 10-12, 2002. Stockholm.
4. Shoumskaya, M., Suzuki, S., Shapiguzov, A., Piven, I, Zinchenko, V.V., Los, D.A., Murata, N. (2003) A mutant library of response regulators in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803. 11th International Symposium on Phototrophic Prokaryotes, August 24-29, 2003. Tokyo, Japan. p. 135.
5. Шапигузов, А.Ю. (2004) Аквапорины: строение, систематика и особенности регуляции. Физиология растений 51: 1-11.
6. Shapiguzov, A., Lyukevich, A.A., Allakhverdiev, S.I. Sergeyenko, T.V., Suzuki, I., Murata, N., Los, D.A. (2005) Osmotic shrinkage of cells by water efflux via aquaporins regulates osmostress-inducible gene expression. Microbiology SGM 151: 447-455.