Влияние аутоантител к тиреоидным гормонам на зависимые от тиреоидного статуса физиологические функции у крыс.

на правах рукописи

ЦВИРКУН ДАРЬЯ ВИКТОРОВНА ВЛИЯНИЕ АУТОАНТИТЕЛ К ТИРЕОИДНЫМ ГОРМОНАМ НА ЗАВИСИМЫЕ ОТ ТИРЕОИДНОГО СТАТУСА ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ У КРЫС.

03.00.13 – "Физиология"

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2007

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова (заведующий кафедрой – профессор А.А. Каменский).

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

кандидат биологических наук А.А. Мартьянов НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ:

академик РАМН, профессор, доктор биологических наук И.П. Ашмарин.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук Р.А. Данилова кандидат биологических наук И.Ю. Шамакина Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН

Защита диссертации состоится «21» мая 2007 года в 15-30 на заседании диссертационного совета Д501.001.93 биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова по адресу: Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « » апреля 2007 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Б.А. Умарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В клинической практике давно известны различные заболевания, связанные с появлением антител к собственным антигенам организма. Значительную часть работ, посвященных изучению таких заболеваний, составляют исследования аутоиммунных заболеваний щитовидной железы, связанных с образованием антител (АТ) к различным ее компонентам – к тироглобулину, пероксидазе щитовидной железы, рецептору ТСГ. Еще с 60-х годов 20 века известно, что наряду с перечисленными появляются и АТ, связывающие тиреоидные гормоны – тироксин и трииодтиронин (Sakata et al., 1985). К настоящему времени наличие аутоантител к тиреоидным гормонам описано при тиреоидных патологиях, сопровождающихся как гипер-, так и гипотиреозом (Staeheli et al., 1975;

Ikekubo et al., 1978;

Sakata et al., 1985;

Nakamura, 1993;

Ogawa, 1994 et al;

Ruggeri et al., 2002). Кроме того, антитиреоидные АТ нередко обнаруживаются и у здоровых людей (Isozaki et al., 1985;

Sakata et al., 1994) и при аутоиммунных заболеваниях нетиреоидного характера: ревматоидном артрите (Ruggeri et al., 2002), синдроме Сьегрена (Sakata et al., 1987;

Ozgen et al., 2001;

Ruggeri et al., 2002), системной красной волчанке (Sakata et al., 1987;

El-Sherif et al., 2004). Вместе с тем, роль АТ к тиреоидным гормонам в настоящее время остается не изученной.

В эксперименте на животных образование антител к собственным антигенам организма индуцируют методом активной иммунизации, который позволяет вызвать иммунный ответ не только к макромолекулам, но и к низкомолекулярным соединениям (Erlanger, 1973;

Ковалев, Полевая, 1982), для чего их ковалентно присоединяют к чужеродным белкам, имеющим большую молекулярную массу. С помощью иммунизации можно моделировать аутоиммунные заболевания, что важно для изучения их патогенеза. Кроме того, в последнее время аутоантитела рассматриваются не только как патологический фактор, но и как регуляторные молекулы, а метод активной иммунизации - как способ глубокого, направленного и длительного воздействия на физиологический статус организма (Ашмарин и Гомазков, 1989;

Ashmarin et al., 1990;

Полетаев, 2002).

В предыдущих работах нашей группы было показано, что активная иммунизация крыс ковалентным конъюгатом Т3 с белком-носителем приводит к образованию анти-Т3-аутоантител и к изменениям, которые можно охарактеризовать как умеренный гипертиреоз (Мартьянов и др., 1998;

Волкова и др., 2000).

Цель работы. Целью настоящей работы являлось дальнейшее изучение регуляторной или патологической роли антител и физиологических изменений, происходящих в организме животных после иммунизации к гормонам щитовидной железы трииодтиронину (Т3) и тироксину (Т4), к тиролиберину (ТРГ), а также сочетанной иммунизации к Т3 и тироглобулину (ТГ).

Задачи исследования.

1. Изучить влияние иммунизации к Т3 на физиологический статус организма крысы.

2. Оценить влияние иммунизации к Т3 на состояние крыс с экспериментальным гипотиреозом.

3. Оценить влияние иммунизации к Т4 на ряд физиологических показателей и сравнить его с изменениями, происходящими после иммунизации к Т3.

4. Оценить влияние иммунизации к ТРГ на некоторые физиологически показатели и сравнить его с изменениями, происходящими после иммунизации к Т3.

5. Оценить влияние иммунизации к ТГ и сочетанной иммунизации к Т3 и ТГ на некоторые физиологически показатели, сравнить его с изменениями, происходящими после иммунизации к Т3.

Научная новизна. Проведена комплексная оценка состояния организма крысы после индукции антителогенеза к Т3, Т4, ТРГ и сочетанной иммунизации к Т3 с ТГ. АТ как к Т3 и Т4, так и к ТРГ оказывают стимулирующее (гипертиреоидное) влияние. Подтверждено принципиальное положение о регуляторной роли АТ к гормонам при отсутствии в их действии выраженного патологического компонента. В целом роль АТ можно охарактеризовать как депонирующую и буферно-стабилизирующую. Высказано предположение о том, что конъюгат является не только индуктором антителогенеза, но и источником гормона.

Теоретическое и практическое значение. Стимулирующее влияние АТ к гормонам щитовидной железы и ТРГ вносит существенный вклад в понимание аутоиммунных процессов. Аутоантитела к малым регуляторным молекулам следует рассматривать наряду с транспортными белками, как фактор накопления гормонов в кровотоке с возможностью последующей диссоциации комплексов и реализации гормональной функции. В перспективе длительное направленное воздействие с помощью антител на ту или иную гормональную функцию может найти практическое применение (в ветеринарии и медицине).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Иммунизация крыс к Т3 и Т4 приводит к образованию аутоантител к гормонам и последующему сдвигу тиреоидного статуса в сторону умеренного гипертиреоза.

2. Образующиеся после иммунизации антитела к Т3 и Т4 не вызывают явной патологии щитовидной железы у крыс, а, вероятно, выступают в роли стабилизирующего фактора, способного депонировать тиреоидные гормоны.

3. Сочетанная иммунизация к Т3 и тироглобулину оказывает более выраженное действие по сравнению с иммунизацией отдельно к Т3, что свидетельствует о возможном участии ТГ в образовании антигормональных антител.

4. Иммунизация крыс к тиролиберину приводит к существенному повышению уровня свободного Т4 в крови, то есть образующиеся антитела оказывают стимулирующее действие на всю гормональную ось.

Апробация материалов диссертации. По основным результатам диссертационной работы были сделаны доклады на Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», посвященной 240-летию ММА им. И.М.Сеченова (Москва, 1998), Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2000», Секция «Биология» (Москва, 2000), II Российском Конгрессе по патофизиологии «Патофизиология органов и систем. Типовые физиологические процессы (Экспериментальные и клинические аспекты)» (Москва, 2000), XVIII съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Казань, 2001), VI Всероссийском симпозиуме и школе-семинаре молодых ученых и учителей «Растущий организм: адаптация к физической и умственной нагрузке» (Казань, 2002), III Российском Конгрессе по патофизиологии «Дизрегуляционная патология органов и систем (экспериментальная и клиническая патофизиология)» (Москва, 2004), XIX съезде физиологического общества им.

И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, методики, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Основной материал изложен на страницах машинописного текста, содержит рисунков.

Библиография включает источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Эксперименты выполнены на белых беспородных крысах. Животных содержали в условиях вивария – при естественном освещении и с постоянным доступом к воде и пище. В каждой клетке содержали крыс из опытной и контрольной групп. Всего проведено 9 серий экспериментов.

Синтез конъюгатов гормонов с белками проводили согласно методике Егорова с соавторами (1991). Конъюгат Т3 с белком-носителем – бычьим сывороточным альбумином (БСА) синтезировали с помощью 1-этил-3-(3 диметиламинопропил) карбодиимида (КДИ, «Sigma», США). Реагенты брали в следующем молярном соотношении: белок:КДИ:Т3=1:200:40. Навеску БСА растворяли в воде из расчета 5 мг/мл, Т3 («Sigma», США) растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) из расчета 20 объемных процентов от раствора белка (2мг/200мкл ДМСО). К раствору белка добавляли Т3 и приблизительно треть КДИ при постоянном перемешивании. Инкубировали в течение 30 мин при постоянном перемешивании и комнатной температуре. Остатки КДИ добавляли в реакционную смесь в 0.5мл воды, после чего перемешивали 3 часа при комнатной температуре в темноте и оставляли на сутки при +4°С. Затем конъюгат диализовали против 0.9% NaCl. Соотношение гормон:белок в конъюгате составляло 5:1 моль. По такой же схеме синтезировали Т4-БСА, а также конъюгаты Т3 и T4 с крысиным сывороточным альбумином (КСА). Для получения конъюгатов Т3-БСА с разным молярным соотношением гормон:белок применяли модифицированную методику, в которой изменяли пропорции реагентов и режим инкубации реакционной смеси. Конъюгат тиролиберина (ТРГ, «Sigma», США) с БСА синтезировали с помощью КДИ, молярное соотношении реагентов белок:КДИ:гормон=1:1000:100 (Мартьянов, 1992).

Спектрофотометрический анализ проводили для определения концентрации белка в растворе конъюгата и соотношения гормон:белок на спектрофотометре (Shimadzu, Япония) в диапазоне 200–400нм, основываясь на калибровочных графиках для БСА и Т3 и значениях максимумов поглощения белка при 280нм, а для Т3 и Т4 – при 300нм.

Иммунизацию животных проводили конъюгатами Т3, Т4 и ТРГ с БСА, а также бычьим ТГ («Sigma», США). Иммуногены смешивали с полным адьювантом Фрейнда («Sigma», США или «MP Biomedicals», США) в соотношении 1:1. При первичной иммунизации вводили 600мкг конъюгата на килограмм массы тела (по белку) подкожно в четыре точки спины животного в объеме 200мкл эмульсии. При поддерживающей иммунизации (через 1 месяц) 300мкг/кг в том же объеме. В некоторых случаях проводили вторую поддерживающую иммунизацию - в той же дозе через две недели после первой.

Крысам контрольной группы вводили раствор БСА с адьювантом (соотношение 1:1), в те же сроки и в тех же дозах.

Для получения сыворотки кровь у крыс брали в разные сроки после окончания цикла иммунизации: от двух недель до нескольких месяцев после последнего введения иммуногена. Кровь после взятия помещали на +37С (30– 40 мин), а затем на +4°С (1.0–1.5 часа), после чего центрифугировали 10 мин при 5000 об./мин. Сыворотки хранили при -20С.

С помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) определяли наличие антител к Т3, Т4 и ТГ в сыворотках крови крыс, а также их специфичность. Содержание антител выражали в величине титра – максимального разведения, при котором реакция антиген-антитело (АГ-АТ) для сывороток крыс опытной группы превышала контрольные значения в два раза.

Анализ проводили на стандартных 96-луночных микропланшетах по следующей схеме:

1. Сорбция антигена. В качестве антигена, сорбированного в лунках планшета, использовали конъюгаты Т3-КСА, Т4-КСА или ТГ в 50мМ фосфатно солевом буфере (рН7.2-7.4, ФСБ). Инкубировали ночь при +4С.

2. Специфическая реакция АГ-АТ. В лунки микропланшета вносили ряд разведений сыворотки крови в ФСБ с Tween 80 и инкубировали 60 мин при +37С.

3. Реакцию иммунных комплексов с антивидовыми анти-IgG-антителами, меченными пероксидазой хрена («Sigma», США или Предприятия по производству бакпрепаратов НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, Москва, Россия), проводили 60 мин при +37С.

4. Цветную ферментативную реакцию проводили при комнатной температуре (30 мин) с раствором хромогена - 0.7мМ АБТС (2,2’-азино-бис-(3 этилбензтиазолин-6-сульфоновая кислота) двуаммонийная соль, «MP Biomedicals», США,) и 2.8мМ Н2О2 в Na-ацетатном буфере (30мМ, рН4.5).

Оптическую плотность при 405нм измеряли на планшетном фотометре (Multiskan EX, Финляндия).

Для определения специфичности антител проводили конкурентный ИФА по сходной схеме. В качестве конкурирующих гаптенов использовали Т3, Т4, фенилаланин и тирозин в концентрациях от 10-4 до 10-10 моль.

Определение содержания свободного Т4 в сыворотке крови проводили совместно с сотрудником кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ М.А. Рябининой с помощью иммуноферментных тест-наборов фирмы «Иммунотех» согласно стандартной методике фирмы производителя.

Гистологический анализ щитовидной железы. Через 5 и 30 суток после последнего введения антигена у крыс под наркозом (нембутал 40 мг/кг) выделяли щитовидную железу. Ткань фиксировали в растворе Карнуа (12-18 часов, +4°С), затем отмывали и обезвоживали путем последовательной инкубации в 70%, 96% и абсолютном этиловом спирте (1, 1 и 3 часа соответственно, +4°С). Для достижения эффекта просветления препараты инкубировали в хлороформе (40 мин, +4°С). Далее материал инкубировали в смеси хлороформа с парафином (соотношение 1:1, 8-12 часов, +37°С), а затем в чистом парафине (3 часа, +60°С), после чего ткани заливали в блоки с расплавленным парафином, содержащим 3-5% пчелиного воска. Срезы толщиной 5 мкм (микротом МТ-57, Россия) помещали на предметные стекла и депарафинизировали по стандартной методике. Депарафинизированные срезы окрашивали гематоксилином и эозином и заключали в канадский бальзам под покровное стекло.

Функциональное состояние щитовидных желез определяли по: плотности фолликулов на срезах (3 среза железы от каждой крысы, увеличение Х45);

средней площади фолликулов (50 фолликулов на каждом срезе, по 3 среза от крысы, увеличение Х90);

высоте фолликулярного эпителия (7 клеток из одного фолликула, 40-50 фолликулов для каждого животного, увеличение Х90).

За ростом и развитием животных следили с помощью взвешивания на протяжении всего эксперимента не реже, чем один-два раза в неделю.

Регистрацию ЭКГ и расчет частоты сердечных сокращений (ЧСС) проводили с помощью подкожных электродов на оригинальной установке. ЧСС у бодрствующих свободноподвижных крыс измеряли либо в течение 30 мин в условиях «домашней» клетки, либо по следующей схеме: в первый день делали фоновую запись ЧСС в «домашней» клетке – 60 мин, потом крысу пересаживали в новую камеру для адаптации к условиям второго экспериментального дня и регистрировали ЭКГ в течение 4 часов. Во второй экспериментальный день: делали часовую фоновую запись в «домашней» клетке, а затем - 4 часа в камере, где поддерживалась температура 4-6°С.

Электроды вживляли под нембуталовым наркозом (45 мг/кг) не позднее, чем за 2 суток до проведения опыта. Перед записью ЭКГ крыс адаптировали к условиям эксперимента не менее 30 мин. При регистрации ЭКГ в наркозе операцию вживления электродов проводили под эфирным наркозом за 2 суток до опыта, а сам опыт - под нембуталовым наркозом (40 мг/кг), запись начинали через 15 мин после введения наркоза, продолжительность записи 60 мин.

Для определения содержания глюкозы брали кровь (150 мкл) у бодрствующих свободноподвижных крыс перед помещением в новые (термонейтральные или холодные) условия и сразу после опыта. Для этого за двое суток до эксперимента животным, кроме электродов для регистрации ЭКГ, вживляли катетер в бедренную артерию. Концентрацию глюкозы в крови определяли ортотолуидиновым методом (реактивы фирмы ООО «ЭКОлаб», Россия).

Измерение температуры тела. Длительную регистрацию ректальной температуры и температуры кожи хвоста проводили с помощью медно константановых термопар на оригинальной установке в Институте Химической физики им. акад. Н.Н. Семенова РАН под руководством д.б.н. Т.Г. Емельяновой. Запись в комфортных и холодных окружающих условиях продолжалась 2.5 часа, в жарких - 3 часа.

Чувствительность к острой кислородной недостаточности оценивали в условиях гипобарической гипоксии. Для этого крысу помещали в стеклянный сосуд, из которого насосом откачивали воздух при его ограниченном поступлении извне. В сосуде создавались условия эквивалентные высоте тыс. метров над уровнем моря, что соответствует содержанию 5 % О2 во вдыхаемом воздухе. Регистрировали время потери позы в условиях гипоксии (Тпп) и время до первого агонального вдоха крысы (Тж), затем крысу извлекали и отмечали время восстановления позы (Твп).

Выделение митохондрий из гомогенатов печени крыс проводили по стандартной методике. Все манипуляции проводили на льду при +4°С.

Количество белка в пробе митохондрий определяли по методу с бицинхониновой кислотой (натриевая соль бицинхониновой кислоты в смеси с ионами меди (Cu1+) в соотношении 50:1;

Smith, 1985). Для построения калибровочной кривой использовали белковый стандарт БСА 1мг/мл («Sigma», США). Оптическую плотность при 562нм измеряли на спектрофотометре (Hitachi, Япония).

Содержание цитохромов сс1 и аа3 определяли на двухлучевом спектрофотометре «Аминко DW-2000» (США) по характрным пикам поглощения - сс1 при 550/554нм, аа3 при 605/620нм. Поглощение суспензии митохондрий измеряли в диапазоне длин волн 500-650нм, ширина щели 2нм, скорость 1нм/сек, концентрация белка 0.7 мг/мл, длина оптического пути 1 см.

Содержание цитохромов в пробе рассчитывали по методике Muraoka с соавторами (1972) и нормировали на 1 мг белка.

Кальциевую емкость митохондрий определяли как количество (в наномолях) CaCl2, необходимое для необратимого снижения мембранного потенциала митохондрий, энергизованных 5 мМ сукцинатом калия в присутствии 2 µМ ротенона. Мембранный потенциал определяли по распределению сафронина О по методу Akerman (1976). Контроль полноты разобщения митохондрий кальцием проводили добавлением 1 µМ FCCP (carbonyl cyanide 4-(trifluoro-methoxy)phenylhydrazone;

«Sigma», США).

Концентрацию кальция в растворе CaCl2 определяли титрованием хелатором кальция EGTA (Ethylene glycol-bis(-aminoethyl ether) N,N,N,N-tetraacetic acid;

«Sigma», США) в присутствии мурексида. Кд комплекса EGTA с кальцием принимали равной 10-5М.

Для оценки рефлекторной деятельности спинного мозга крыс проводили регистрацию М-ответа и Н-рефлекса в мышцах стопы при раздражении большеберцового нерва (n. tibialis) в подколенной области (Gozariu et al., 1998) под эфирным наркозом. Электромиограмму регистрировали игольчатыми серебряными электродами. Раздражение большеберцового нерва проводили прямоугольными импульсами длительностью 0.5 мс с частотой 1 Гц. Для контроля рефлекторной природы ответа в конце опыта перерезали большеберцовый нерв проксимальнее стимулирующих электродов и убеждались в том, что М-ответ сохранился, а Н рефлекс - пропал. Данные обрабатывали с помощью компьютерной программы MiniAnalysis.

Масса сердца и щитовидной железы. В конце каждой серии экспериментов у крыс в состоянии глубокого наркоза (нембутал 50 мг/кг) аккуратно вырезали щитовидную железу (вместе с участком трахеи) и сердце.

Органы промывали в 0.9% NaCl, подсушивали фильтровальной бумагой и взвешивали. Данные пересчитывали на 100 г веса животного.

Моделирование гипотиреоза. Гипотиреоз у крыс вызывали тиреостатиком мерказолилом («Акрихин», Россия), который давали животным в питьевой воде: первые 2 недели - 0.02%-й раствор, а далее - 0.01%.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием непараметрических критериев Манна-Уитни (U-тест) и Вилкоксона, параметрического t-теста. В тексте и таблицах данные представлены как среднее ± ошибка среднего.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Влияние иммунизации к Т3 на состояние организма крысы Содержание антител к Т3 в сыворотке крови определяли для оценки эффективности иммунизации. У самцов титр антител варьировал в пределах 1/1000 до 1/128000, что отражает не только индивидуальную чувствительность животных, но и динамику антителогенеза - титр антител был максимальным через 2-3 недели после последнего введения иммуногена. АТ к Т3 выявлялись и через 280 дней, хотя их титр был значительно ниже – около 1/50. У самок титр антител был практически таким же, как и у самцов. Оценка специфичности АТ показала, что антитела могут связывать не только Т3, но и тироксин (в меньшей степени) и практически не взаимодействуют с L-тирозином и фенилаланином.

Таким образом, иммунизация крыс конъюгатом Т3-БСА приводит к образованию специфических антител к Т3, причем их содержание сохраняется на достаточно высоком уровне в течение нескольких недель и даже месяцев.

Содержание свободного Т4 в сыворотке крови контрольных животных (самцы) колебалось в пределах от 24.6±1.1 до 34.7±1.3 пмоль/л. У крыс, иммунизированных к Т3, уровень свТ4 был в среднем в 2 раза выше, чем в контроле. У самок, иммунизированных к Т3, выраженность эффекта даже несколько больше (Рис.1). Таким образом, иммунизация крыс к Т3 приводит к значительному увеличению содержания свТ4, которое сохраняется длительное время, а наблюдаемые в разные периоды после иммунизации колебания содержания гормона, вероятно, отражают развитие иммунного ответа. Кроме того, известно, что содержание общего Т3 у иммунизированных Т3-БСА крыс в 3 раза выше, чем в контроле, но его значительная часть (около 80%) связана с антителами (Мартьянов и др., 1998).

Масса щитовидной железы. Несмотря на циркуляцию в кровотоке АТ к Т3 и значительное изменение уровня свТ4 изменений массы щитовидной железы не наблюдали. Такой результат свидетельствует об отсутствии патологического влияния антигормональных АТ на состояние железы.

По результатам гистологического исследования секреторная активность щитовидной железы возрастала (Табл.1) как через 5, так и через 30 дней после окончания цикла иммунизации, о чем свидетельствуют увеличение плотности фолликулов и высоты фолликулярного эпителия, а также уменьшение средней площади фолликулов (Хэм и Кормак, 1983). В целом такое, на первый взгляд, парадоксальное повышение секреторной активности железы при ее неизменной массе и высоком содержании гормона в крови находит подтверждение и в работах других авторов, которые иммунизировали животных к Т4 и Т3 (Joseph et al., 1987) и к другому низкомолекулярному гормону - тестостерону, который имеет сходство с тиреоидными гормонами по особенностям транспорта в кровотоке и механизмам действия на клетки мишени (Nieschlag et al., 1973;

Wickings and Nieschlag, 1978;

Auclair et al., 1995).

БСА Т3-БСА-самцы 350 Т3-БСА-самки % от контроля 11 дней 15 дней 17-18 дней 35-38 дней 36-40 дней 42-53 дня Дни после окончания цикла иммунизации Рисунок 1. Содержание свободного Т4 в сыворотке крови крыс. По оси абсцисс – дни после окончания цикла иммунизации;

по оси ординат – процент от среднего значения в контроле.

Рост и развитие животных оценивали в 8 сериях экспериментов по приросту массы тела. Иммунизация крыс к Т3 не влияла на интенсивность роста животных, а наблюдавшиеся кратковременные (до 1.5 недель) незначительные изменения массы тела, скорее всего, связаны с высвобождением молекул Т3 из вводимого конъюгата (дополнительно смотри гипотиреоз).

Таблица 1. Результаты гистологического исследования щитовидных желез крыс, иммунизированных к Т3 (* - р0.05 по сравнению с группой БСА) 5 дней после окончания 30 дней после окончания цикла иммунизации цикла иммунизации БСА Т3-БСА БСА Т3-БСА n=3 n=5 n=4 n= Плотность 136.5±9.9 203.8±23.7* 106.7±7.6 211.5±19.9* фолликулов Средняя площадь 57.8±4.2 31.6±5.6* 54.3±4.4 35.2±2.2* фолликула, мкм Высота фолл.

7.7±0.4 10.4±0.6* 7.6±0.3 10.8±0.3* эпителия, мкм Частоту сердечных сокращений (ЧСС) изучали у бодрых, свободноподвижных животных и в состоянии наркоза. В состоянии наркоза через 5 недель после окончания цикла иммунизации частота сердцебиений у иммунизированных к Т3 крыс была достоверно выше, чем в контроле: средняя за 60 мин регистрации ЧСС в группе БСА – 265.9±8.8 уд/мин, в группе Т3-БСА – 309.4±9.7 уд/мин (р=0.01).

В другой серии экспериментов исследовали влияние иммунизации на ЧСС через 8 и более недель после окончания цикла иммунизации. ЧСС у иммунизированных к Т3 крыс в привычных условиях не отличалась от контрольных значений ни в первый, ни во второй экспериментальные дни (Рис.2А,Б). После помещения животных в новые экспериментальные условия происходило небольшое повышение сердечного ритма как в контрольной, так и в опытной группах, однако более выраженное повышение ЧСС наблюдали у крыс группы Т3-БСА в течение всех 4-х часов регистрации – в среднем на 26 уд/мин по сравнению с 10 уд/мин в контроле. После помещения в холодные условия (4°С) происходило значительное повышение ЧСС у животных, как в контрольной, так и в опытной группах – в среднем на 127 и 136 уд/мин соответственно, то есть ЧСС в группе Т3-иммунизированных крыс была выше, чем в контроле.

Содержание глюкозы в крови животных двух групп не различалось ни до, ни после помещения в новые экспериментальные условия (фоновый уровень в контроле – 89.0±2.4 мг%, в группе Т3-БСА – 87.1±2.8 мг%). А помещение на 4 часа на холод приводило к снижению содержания глюкозы в группе БСА приблизительно на 4% (р=0.04), а в группе Т3-БСА на 5% (р=0.07) по сравнению с исходным уровнем.

В целом можно заключить, что иммунизация к Т3 приводит к некоторому увеличению ЧСС у крыс, как в состоянии наркоза, так и у бодрствующих животных, то есть изменения носят гипертиреоидный характер. А отсутствие выраженной разницы в реакции на холодовой стресс у крыс контрольной и опытной групп является положительным моментом, поскольку иммунизация не оказывает патологического действия на работу сердца и содержание глюкозы в крови, несмотря на значительное увеличение активности щитовидной железы и содержания свТ4.

А. 1 день БСА, n= Т3-БСА, n= ЧСС, уд/мин 0 30 60 20 50 80 110 140 170 200 Время от начала записи, мин Б. 2 день ЧСС, уд/мин БСА, n= Т3-БСА, n= 0 30 60 20 50 80 110 140 170 200 Время от начала записи, мин Рисунок 2. Динамика ЧСС у крыс. А. - в «домашней» клетке (60 мин) и при помещении в новые термонейтральные условия (240 мин);

Б. - в «домашней» клетке (60 мин) и при помещении в холодные условия (+4оС, 240 мин).

Рисунок 3. Ректальная температура (А.) и температуры кожи хвоста (Б.) у крыс при разных температурных условиях окружающей среды.

Температура тела (Рис.3). В комфортных термонейтральных условиях (25-27°С) ректальная температура (Тр) у иммунизированных Т3-БСА самцов не отличалась от контроля, а температура кожи хвоста (Ткх) была значительно выше, чем в контроле, то есть у крыс опытной группы происходит увеличение теплопродукции, которое не носит драматического характера и полностью компенсируется усилением теплоотдачи. В холодных условиях (4-6°С) достоверных различий по Тр между животными двух групп не было, хотя Ткх снижалась несколько быстрее в течение первых 50 минут у крыс группы Т3 БСА. В условиях умеренной жары (30-31С) у крыс опытной группы повышается Тр и Ткх. Такая реакция на тепло может быть связана как с повышенной теплопродукцией у животных группы Т3-БСА, которую в данных условиях не способна скомпенсировать увеличенная теплоотдача, так и с дополнительным действием иммобилизации.

Масса сердца. У крыс, иммунизированных к Т3, относительная масса всего сердца и его отделов не отличалась от контрольных значений, что является положительным признаком и свидетельствует об отсутствии патологического действия иммунизации, поскольку из литературных данных известно, что введение Т3 или Т4 крысам приводит к существенному увеличению относительной массы сердца по сравнению с эутиреоидным контролем, в то время как медикаментозный гипотиреоз приводит, напротив, к ее снижению (McAllister et al., 1995;

Foley et al., 2001;

Soukup et al., 2001).

Чувствительность к гипобарической гипоксии изучали спустя недели после цикла иммунизации для оценки интенсивности дыхания у животных. По времени до первого агонального вдоха (Тж) животных делили на подгруппы – низкоустойчивых (Тж5 мин), среднеустойчивых (5-25мин) и высокоустойчивых (Тж25 мин). В группе БСА были только низко- и среднеустойчивые крысы (44% и 56% соответственно). В группе Т3-БСА низкоустойчивых и среднеустойчивых животных было поровну, то есть наблюдали некоторое повышение чувствительности к гипоксии, высокоустойчивых крыс в этой группе также не было. По показателям времени потери и восстановления позы животные двух групп существенно не отличались.

Содержание цитохромов сс1 и аа3 в митохондриях печени и кальциевую емкость митохондрий определяли для оценки влияния иммунизации к Т3 на состояние митохондрий (минимум 13 недель после окончания цикла иммунизации). Результаты представлены в Табл.2. У иммунизированных к Т3 крыс содержание цитохромов сс1 и аа3 было таким же как в контроле, одновременно с этим наблюдалось значительное снижение кальциевой емкости митохондрий – в среднем на 48%. Полученные данные хорошо согласуются с описанной выше повышенной чувствительностью к острой гипоксии иммунизированных к Т3 крыс, поскольку общая потребность организма в кислороде во многом зависит от дыхания митохондрий.

Рефлекторную деятельность спинного мозга изучали приблизительно через 9 месяцев после последней иммунизации. Иммунизация к Т3 не приводила к явному изменению рефлекторного ответа.

Таблица 2. Содержание цитохромов сс1 и аа3 и кальциевая емкость митохондрий (* - р0.05 по сравнению с группой БСА) Кальциевая емкость, Цитохром сс1, Цитохром аа3, Группа нмоль Са2+/мг белка мкмоль/мг белка мкмоль/мг белка БСА, n=4 0.08±0.02 0.03±0. 86.8±6. Т3-БСА, n=4 0.09±0.01 0.03±0. 45.3±2.2* Т4-БСА, n=4 0.20±0.5* 0.05±0. 25.2±7.7* Обобщая все описанные в этой части работы данные можно заключить, что появление антител, активация работы щитовидной железы и значительное увеличение уровня свТ4 в результате иммунизации к Т3 не сопровождается нарушениями ростовых процессов, работы сердца и терморегуляции в комфортных температурных условиях. Некоторое увеличение частоты сердцебиений, чувствительности к гипоксии и чувствительности митохондрий к кальцию говорят в пользу мягкого гипертиреоидного действия иммунизации.

Влияние иммунизации к Т3 на состояние крыс с экспериментальным гипотиреозом Уровень антител к Т3. Иммунизацию самцов крыс, получавших с питьевой водой мерказолил, проводили конъюгатами Т3-БСА с разным соотношением гормон:белок. Титр АТ к Т3 был тем выше, чем больше трииодтиронина было связано с белком и составлял в группе Т3 БСА(5:1)/гипотиреоз 1/1700-1/4500, Т3-БСА(8:1)/гипотиреоз – 1/1000-1/25120, Т3-БСА/гипотиреоз(13:1) – 1/3800-1/48000.

Содержание свободного Т4 в сыворотке крови. Прием мерказолила приводил к существенному снижению содержания свТ4 в крови у крыс – в среднем в 2 раза (Табл.3), то есть у животных развивался значительный гипотиреоз. Иммунизация к Т3 на фоне гипотиреоза приводила к увеличению содержания свТ4 до уровня значительно превышающего нормальные величины и характерного для иммунизированных эутиреоидных крыс.

Масса щитовидной железы у крыс контрольной группы (мерказолил+БСА в качестве иммуногена) была значительно увеличена по сравнению с нормотиреоидным контролем (вода+БСА). Иммунизация к Т3 на фоне гипотиреоза не приводила к существенным изменениям массы щитовидной железы.

Таблица 3. Содержание свТ4 в сыворотке крови крыс (в пмоль/л, ** - р0.001 по отношению к соответствующей группе БСА, ## - р0.001 отличие между двумя контрольными группами) БСА Т3-БСА БСА/гипотиреоз Т3-БСА/гипотиреоз 38.5±3.4 67.1±4.7** 20.9±2.8## 78.1±4.2** Рост и развитие. Экспериментальный гипотиреоз приводил к стабилизации массы тела животных практически на одном уровне (Рис.4).

Иммунизация к Т3 на этом фоне стимулировала рост крыс. Стимуляция начиналось практически сразу после введения Т3-БСА и продолжалось 1.0-1. недели. Более выраженным действием обладал конъюгат, в котором содержание гормона было наибольшим. Можно предполагать, что такое временное ускорение темпов роста с последующей стабилизацией массы тела на новом уровне связано с постепенным высвобождением Т3 из введенного конъюгата, который играет роль не только иммуногена, но и временного депо и источника гормона.

Чувствительность к гипоксии. Напомним, что в нормотиреоидных группах по Тж крысы разделились на две подгруппы – низко- и среднеустойчивых. В группе БСА/гипотиреоз распределение животных было иным – большинство составили высокоустойчивые животные, которых не было среди нормотиреоидных крыс, - 73% (Тж25 мин), низкоустойчивых было 18% и только 9% группы составляли среднеустойчивые крысы. Иммунизация к Т существенным образом изменила картину, в группе Т3-БСА/гипотиреоз, как и в нормотиреоидном контроле преобладали среднеустойчивые крысы (64%), высокоустойчивых было 27%, низкоустойчивых – 9% от всей группы. По показателям времени потери и восстановления позы животные существенно не различались. Таким образом, при гипотиреозе у животных значительно повышается устойчивость к острой кислородной недостаточности, что обусловлено снижением уровня обмена веществ и тканевого дыхания.

Иммунизация к Т3 на этом фоне как бы переводит животных из разряда высокоустойчивых в разряд среднеустойчивых, что характерно для нормотиреоидного контроля.

В целом можно заключить, что иммунизация к Т3 на фоне экспериментального гипотиреоза оказывает мягкое антигипотиреоидное действие, что может быть обусловлено двумя причинами: слабой активацией железы, поскольку на фоне значительного тиреостатического действия мерказолила она и не может быть сильной и тем, что АТ препятствуют инактивации гормона в крови и выведению его из организма.

Влияние других иммуногенов на состояние организма крысы:

Т4-БСА Уровень антител к Т4 спустя 6-7 недель после окончания цикла иммунизации у крыс группы Т4-БСА был ниже, чем у животных той же экспериментальной серии, но иммунизированных к Т3, и составил 1/1000 - 1/4000.

Содержание свободного Т4 в сыворотке крови у иммунизированных к Т4 крыс было увеличено более существенно по сравнению с группой Т3-БСА – в среднем в 3 раза относительно контрольной БСА группы. Большее увеличение свТ4 по сравнению с группой Т3-БСА может быть связано как с выходом Т4 из конъюгата, так и с разным временем полужизни Т4 и Т3 в крови.

БСА/эутиреоз БСА/гипотиреоз Т3-БСА(13:1)/гипотиреоз Т3-БСА(8:1)/гипотиреоз Т3-БСА(5:1)/гипотиреоз Масса тела, г 01.сен 21.окт 10.дек 29.янв 20.мар 09.май Даты Рисунок 4. Динамика массы тела у гипотиреоидных крыс до и после иммунизации. По оси абсцисс - даты;

по оси ординат - масса тела. Стрелками отмечено введение иммуногена.

Масса щитовидной железы, несмотря на более существенный сдвиг содержания свТ4 в крови животных, не изменялась, что не удивительно, поскольку иммунизация к физиологически более активному Т3 также не имела выраженного зобогенного действия.

Частота сердечных сокращений в состоянии наркоза через 1.0-1. месяца после окончания цикла иммунизации у крыс группы Т4-БСА, в отличие от Т3-БСА, практически не изменялась. Отмечалась лишь тенденция к повышению ЧСС: в группе БСА (n=5) она составляла 265.9±8.8, а в группе Т4-БСА (n=4) - 281.4±7.7 уд/мин (р=0.175).

Масса сердца у крыс группы Т4-БСА не отличалась от контроля.

Температуру тела у животных, иммунизированных к Т4, измеряли через 7 недель после окончания цикла иммунизации (Рис.5). Тр в комфортных термонейтральных условиях у этих крыс была достоверно выше контрольных значений на протяжении всей трехчасовой записи, а Ткх не отличалась от контроля. Такое действие можно объяснить более значительным по сравнению с группой Т3-БСА увеличением содержания свТ4 в крови, который не только имеет собственное действие на процессы обмена веществ и термогенез, но и является источником физиологически более активного Т3.

Содержание цитохромов сс1 и аа3 в митохондриях печени и кальциевая емкость митохондрий. Результаты представлены в Табл.2. У крыс, иммунизированных к Т4, в отличие от группы Т3-БСА, значительно увеличивалось содержание сс1. Содержание аа3 было одинаковым во всех экспериментальных группах. Кальциевая емкость митохондрий у животных, иммунизированных к Т4, снижалась еще более существенно, чем в группе Т3-БСА, – в среднем на 71% по сравнению с контролем.

Обобщая результаты этого раздела и сравнивая их с полученными при иммунизации к Т3, можно заключить, что направленность изменений физиологических показателей полностью совпадает у животных обеих групп и имеет гипертиреоидный характер. Некоторое различие в выраженности эффектов иммунизации к Т4 и к Т3 может быть связано как с разной степенью их физиологической активности, так и с возможной разницей в чувствительности тканей к ним.

ТРГ-БСА Содержание свободного Т4 в сыворотке крови при иммунизации крыс к тиролиберину увеличивалось, хотя и в меньшей степени, чем после иммунизации к Т3 и Т4, (Табл.3). Отнести это повышение к прямому действию ТРГ, выщепляющегося из конъюгата, на уровень тиреотропного гормона, а, следовательно, и свТ4 нельзя, поскольку ТРГ является короткоживущим пептидом, а измерение содержания свТ4 проводили через 5 недель после окончания цикла иммунизации. Этот факт, возможно, наиболее важен в настоящем исследовании, поскольку подтверждает гипотезу о стимулирующем действии образующихся после иммунизации АТ и их модулирующем влиянии на активность гормона. Такое заключение представляется правомерным, поскольку уровень свободного тироксина в крови лишь опосредовано связан и с вводимым конъюгатом, и с антителами к ТРГ.

Рисунок 5. Температура тела у самцов крыс в термонейтральных условиях окружающей среды (группа Т4-БСА).

Таблица 3. Содержание свободного тироксина в сыворотке крови (пмоль/л, * - р0.05, ** - р0.001 по сравнению с группой БСА) БСА ТРГ-БСА Т3-БСА Самцы 34.2±1.3 38.1±1.0* 77.7±6.7** Самки 29.6±1.7 39.6±1.8* 81.4±6.7** ТГ и Т3-БСА+ТГ Уровень антител. У животных, иммунизированных смесью Т3-БСА с ТГ, антитела образуются к обоим антигенам, титр антител к ТГ составляет 1/33000– 1/128000, а анти-Т3 АТ - 1/8000-1/48500. Надо отметить, что титр АТ к Т3 был выше, чем у животных той же экспериментальной серии, но иммунизированных просто Т3-БСА (1/4600-1/31000). Через 280 дней после завершения цикла иммунизации такая картина сохранялась, но уровень антител значительно понизился – анти-ТГ-антитела выявлялись на уровне 1/1000 1/6000, анти-Т3-антитела - 1/50-1/300. Таким образом, можно заключить, что совместное введение Т3-БСА с ТГ усиливает иммунный ответ на гормон по сравнению с иммунизацией только Т3-БСА. Это согласуется с литературными данными о появлении АТ к тиреоидным гормонам в крови иммунизированных к ТГ животных, что может свидетельствовать о том, что АТ к тиреоидным гормонам образуются в результате развития иммунного ответа на ТГ или его фрагменты, содержащие гормон-продуцирующие сайты (Sakata et al., 1985;

Savin et al., 1990;

Erregragui et al., 1996). Введение крысам в качестве иммуногена бычьего ТГ также индуцирует образование специфических АТ.

Рост и развитие. Сочетанное введение тироглобулина с Т3-БСА приводило к значительному замедлению темпов роста крыс, что, возможно, свидетельствует о более жестком воздействии сочетанной иммунизации.

Введение бычьего ТГ не влияло на ростовые процессы.

Частоту сердечных сокращений измеряли у крыс в комфортных температурных условиях и на холоду (8 недель от последнего введения иммуногена). В группе ТГ наблюдалась сходная с Т3-БСА картина как в привычных условиях, так и при помещении в новые термонейтральные или холодные условия. Отличий от контроля по уровню глюкозы в крови ни в привычных, ни в новых термонейтральных условиях в этой группе не было. У крыс, иммунизированных смесью Т3-БСА с ТГ, наблюдались более выраженные изменения в отличие от Т3-БСА и ТГ групп. У них ЧСС даже в «домашней» клетке была выше по сравнению с контролем (Рис.6А,Б). При помещении в новые условия сердечный ритм у этих крыс изменился в такой же степени, как и в группе Т3-БСА: ЧСС была значительно выше, чем в контроле на протяжении всех 4-х часов регистрации. У животных группы Т3-БСА+ТГ во второй экспериментальный день в «домашней» клетке уровень глюкозы был достоверно ниже по сравнению с контролем, чего не наблюдали в первый день.

При помещении крыс группы Т3-БСА+ТГ в холодные условия ЧСС возросла на 117 уд/мин по сравнению с фоном, то есть в меньшей степени, чем у контроля (БСА – на 127 уд/мин). В целом же частота сердцебиений у крыс Т3-БСА+ТГ, по прежнему, оставалась на более высоком уровне, чем в группе БСА. Кроме того, у животных этой опытной группы наблюдали достоверное по сравнению с контролем и с фоном снижение уровня глюкозы в крови. Меньшее увеличение ЧСС при помещении на холод у животных группы Т3-БСА+ТГ по сравнению с контролем можно считать положительным моментом, поскольку это свидетельствует о том, что система находится в равновесии, но просто на новом уровне ЧСС, то есть подтверждает отсутствие выраженного патологического действия иммунизации.

А. 1 день БСА, n= 550 ТГ, n= Т3-БСА+ТГ, n= ЧСС, уд/мин 0 30 60 20 50 80 110 140 170 200 Время от начала записи, мин Б. 2 день ЧСС, уд/мин БСА, n= ТГ, n= 300 Т3-БСА+ТГ, n= 0 30 60 20 50 80 110 140 170 200 Время от начала записи, мин Рисунок 6. Динамика ЧСС у крыс. А. - в «домашней» клетке (60 мин) и при помещении новые термонейтральные условия (240 мин);

Б. - в «домашней» клетке (60 мин) и при помещении в холодные условия (+4С, 240 мин).

Масса сердца и щитовидной железы. У крыс группы ТГ даже через месяцев после последней иммунизации относительная масса левого желудочка и всего сердца была значительно увеличена по сравнению с контролем. В группе Т3-БСА+ТГ, также как у Т3-БСА крыс, никаких отличий от контрольных значений по этому показателю не было. Щитовидная железа не отличалась по массе от контроля и между животными опытных групп.

Изучение рефлекторной деятельности спинного мозга через 9 месяцев после последней иммунизации показало, что в обеих описываемых в этом разделе опытных группах латентный период М-ответа практически не отличался от контрольных значений. Сходную картину наблюдали и с Н-рефлексом в группе ТГ. У крыс, которым вводили Т3-БСА в сочетании с тироглобулином, латентный период Н-рефлекса был достоверно меньше по сравнению с контролем, то есть рефлекторный ответ на электрический стимул развивался быстрее, чем у крыс других экспериментальных групп, что характерно для гипертиреоза.

Обобщая результаты, описанные в этой части работы можно заключить, что иммунизация к ТГ не оказывает серьезного влияния на изученные показатели, в то время как совместное введение ТГ с Т3-БСА приводит к существенному изменению этих показателей в сторону гипертиреоза, причем это действие выражено в большей степени, чем при иммунизации к Т отдельно.

ВЫВОДЫ 1. Иммунизация крыс к гормону щитовидной железы трииодтиронину путем подкожного введения ковалентного конъюгата T3-БСА в смеси с полным адьювантом Фрейнда приводит к развитию двухфазного эффекта: у крыс наблюдаются признаки гипертиреоза, обусловленные, выходом гормона из конъюгата (первая фаза), а затем развиваются продолжительные (недели, месяцы) изменения, связанные с образованием аутоантител к Т3 (вторая фаза).

2. Изучение физиологических параметров после иммунизации к Т3 показало следующее: значительно возрастает содержание свТ4;

масса тела и ее прирост не меняется;

ЧСС повышается;

температура тела в термонейтральных условиях не меняется за счет усиления теплоотдачи;

изменений содержания цитохромов сс1 и аа3 в митохондриях не происходит, но существенно повышается чувствительность митохондрий к кальцию;

масса сердца и щитовидной железы практически не меняется.

3. Иммунизация крыс к Т3 на фоне гипотиреоза, вызванного тиреостатиком мерказолилом, приводит к улучшению состояния животных.

4. Иммунизация крыс к гормону щитовидной железы тироксину приводит к появлению в крови анти-Т4-антител и к изменениям той же направленности, что и после иммунизации к Т3, и по таким показателям, как содержание свТ4, температура тела и кальциевая емкость митохондрий влияние иммунизации к тироксину более выражено.

5. Иммунизация к тиролиберину вызывает увеличение содержания свободного тироксина в сыворотке крови крыс.

6. Совместное введение тироглобулина и Т3-БСА в качестве комплексного иммуногена приводит к образованию антител к ТГ и Т3 и вызывает более выраженные физиологические изменения, чем введение обоих иммуногенов по отдельности.

7. Иммунизация к тиреоидным гормонам, тиролиберину и к Т3 в сочетании с тироглобулином не оказывает патологического действия, а индуцирует образование антител, играющих регуляторную роль. В эксперименте на животных появление такого рода антител приводит к формированию нового гормонального статуса с признаками умеренного гипертиреоза. Роль аутоантител при этом можно охарактеризовать как буферно-депонирующую.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Волкова Н.В., Васильева Т.В., Цвиркун Д.В., Обухова М.Ф., Мартьянов А.А. Увеличение секреторной активности щитовидной железы у крыс после иммунизации трийодтиронин-альбуминовым конъюгатом.//Вестн.

Моск. Ун-та сер.16, Биологияю-2000.–N3.–С.10- 2. Плотников Е.Ю., Высоких М.Ю., Цвиркун Д.В., Казаченко А.В., Кирпатовский В.И., Зоров Д.Б. Митохондриальная регуляция продукции активных форм кислорода и азота в клетках почки крысы при ишемии/реперфузии.//ДАН. Биохим., Биофиз., Мол.Биол.-2005.-Т.400,N5. С.1- 3. Волкова Н.В., Цвиркун Д.В., Васильева Т.В., Мартьянов А.А. Увеличение секреторной активности щитовидной железы у крыс после иммунизации к трийодтиронину.//В сб.:«Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Материалы Конференции молодых ученых России с международным участием, посвященной 240-летию ММА им.И.М.Сеченова).-М.,1998.-С.402- 4. Мартьянов А.А., Волкова Н.В., Цвиркун Д.В., Обухова М.Ф., Вакулина О.П., Емельянова Т.Г., Васильева Т.В. Иммунизация крыс трийодтиронином, конъюгированным с чужеродным белком, приводит к умеренному гипертиреозу.//В сб.:XVII Съезд физиологов России. Тезисы докладов.-Ростов-на-Дону,1998.-С.372- 5. Цвиркун Д.В., Волкова Н.В. Иммунизация к трийодтиронину облегчает экспериментальный гипотиреоз у крыс.//В сб.:Материалы Международной конф. студентов и аспирантов по фундаментальным наукам«Ломоносов 2000»,Секция«Биология».-М.:МГУ,2000.-Вып.4.-С.78- 6. Мартьянов А.А., Волкова Н.В., Цвиркун Д.В., Обухова М.Ф. Аутоантитела к трийодтиронину вызывают у крыс умеренный гипертиреоз и оказывают нормализующее действие при тиретоксикозе и гипотиреозе.//В сб.:Тезисы докладов II Российского Конгресса по патофизиологии «Патофизиология органов и систем.Типовые физиологические процессы».-М.,2000.-С. 7. Мартьянов А.А., Цвиркун Д.В., Волкова Н.В., Обухова М.Ф. Изменения тиреоидного статуса организма крысы после иммунизации трииодтиронин альбуминовым конъюгатом.//В сб.:XVIII Съезд Физиологического общества им.И.П.Павлова. Тезисы докладов.-Казань,2001.-С. 8. Цвиркун Д.В., Мартьянов А.А. Возрастные особенности аутоиммунной регуляции тиреоидного статуса и чувствительности к фармакологическим воздействиям у крыс.//В сб.:Тезисы VI Всероссийского симпозиума и школы семинара молодых ученых и учителей «Растущий организм:адаптация к физической и умственной нагрузке».-Казань,2002. С.173- 9. Цвиркун Д.В., Мартьянов А.А. Влияние иммунизации крыс к трийодтиронину на физиологический статус организма.// XIX Съезд Физиологического общества им.И.П.Павлова, Екатеринбург 2004г. Тезисы докладов. Росс. физиол. ж. им.И.М.Сеченова.-2004.-Т.90,N8.-Ч.2.-С. 10. Мартьянов А.А., Цвиркун Д.В. Влияние иммунизации крыс к трийодтиронину на гормональный и физиологический статус организма.//В сб.:Тезисы докладов III Российского Конгресса по патофизиологии «Дизрегуляционная патология органов и систем».-М.,2004.-С.104- Благодарности:

Обуховой М.Ф. НИИ Нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН Емельяновой Т.Г. НИИ Химической физики им. Н.Н. Семенова РАН Рябининой М.А. Кафедра химической энзимологии, Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова Высоких М.Ю. НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского