Кирилл александрович изучение молекулярно-генетических факторов, участвующих в регуляции длины теломер у drosophila melanogaster.

На правах рукописи

УДК 577.214.4:575.22 ПРОСКУРЯКОВ КИРИЛЛ АЛЕКСАНДРОВИЧ Изучение молекулярно-генетических факторов, участвующих в регуляции длины теломер у Drosophila melanogaster.

Специальность 03.00.26 – молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидат биологических наук

Москва 2008

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН, в группе Структурно-функциональной организации генома Drosophila melanogaster

Научный консультант:

кандидат биологических наук Мельникова Л.С.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Любомирская Н.В.

кандидат биологических наук Лазебный О.Е.

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН.

Защита диссертации состоится «_» 2008 года в _ часов на заседании диссертационный совет Д002.037.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан «_» 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета канд.фарм.наук Грабовская Л.С. 

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы:

Теломеры – это специализированные ДНК-белковые комплексы, находящиеся на концах линейных хромосом. Основной функцией теломер является обеспечение стабильности эукариотического генома. В настоящее время доказано, что поддержание строго определенного размера теломер критично для жизнедеятельности организма. Изменение длины теломер тесно связано с опухолеобразованием и старением клетки. Поэтому изучение механизмов контроля определенной длины теломер является актуальной научной задачей.

У большинства высших эукариот теломеры состоят из простых повторов G-богатой последовательности, а их удлинение обеспечивается специальным ферментом – теломеразой.

У Drosophila melanogaster теломеры состоят из мобильных элементов типа LINE, ориентированных «голова к хвосту» - HeT-A, TART и TAHRE.

Основными структурными единицами нормальной теломеры являются: 1) Терминальный комплекс, формирующийся на конце хромосомы и защищающий его от ферментов репарации;

2) Теломерный хроматин, который формируется на последовательностях теломерной ДНК.

Данные структуры играют основную роль в процессе регуляции длины и стабильности теломер.

Несколько лет назад были получены линии Drosophila melanogaster, которые несли терминальные делеции. Было установлено, что терминально делетированные хромосомы дрозофилы также как и хромосомы с нормальными теломерами способны устойчиво поддерживаться в течение многих поколений. Кроме того, было показано, что HeT-A и TART элементы способны присоединяться к концам терминально делетированных хромосом. Эти данные свидетельствуют что у Drosophila melanogaster на концевых последовательностях терминально делетированных хромосом формируется нормальный теломерный хроматин и собирается терминальный белковый комплекс. Поэтому терминально делетированные хромосомы дрозофилы могут служить удобной модельной системой для изучения механизмов поддержания стабильной длины теломер и поиска составляющих компонентов специфических теломерных структур.

Данные, полученные в нашей лаборатории в течение нескольких последних лет, свидетельствуют, что теломерный хроматин, формирующийся у Drosophila melanogaster на концевых последовательностях ДНК длиной 4-5 т.п.н. обладает особыми свойствами. Однако вопрос о том, как - позитивно или негативно - влияет теломерный хроматин на сборку субтеломерных белковых комплексов, до сих пор остается открытым. В настоящей работе мы   изучили, каким образом теломерный хроматин влияет на репрессию, вызываемую белками группы Polycomb, которые участвуют в формировании субтеломерного хроматина.

Гены, контролирующие длину теломер, в настоящее время неизвестны. Несколько лет назад у Drosophila melanogaster были найдены два доминантных генетических фактора, влияющие на удлиннение теломер – это Telomere elongation (Tel) и Enhancer of terminal gene conversion (E(tc)). В представленной работе с помощью одной и той же модельной системы было проведено сравнение свойств генетических факторов Tel и E(tc).

Цели и задачи исследования:

Основными целями данной работы являлись: 1) изучение влияния теломерного хроматина на формирование субтеломерных белковых комплексов;

2) функциональное сравнение генетических факторов Tel и E(tc), влияющих на удлинение теломер Drosophila melanogaster.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Создать модельные системы, позволяющие исследовать свойства теломерного хроматина и сравнить недавно открытые мутации Enhancer of terminal gene conversion и Telomere elongation.

2. Выяснить как теломерный хроматин влияет на формирование репрессионного комплекса белков группы Polycomb.

3. Определить участником какого механизма поддержания длины теломер (присоединения мобильных элементов к концу хромосомы или конверсии/рекомбинации) является доминантный генетический фактор Telomere elongation.

Научная новизна и практическое значение работы:

В представленной работе впервые было показано, что особая структура теломерного хроматина негативно влияет на формирование репрессионного Polycomb-зависимого комплекса. Полученные результаты позволяют предположить, что существует антогонизм между теломерным и субтеломерным (PcG-зависимым) хроматином.

Кроме того, были функционально разделены новые генетические факторы Telomere elongation (Tel) и Enhancer of terminal gene conversion (E(tc)), участвующие в контроле длины теломер у дрозофилы. Было установлено, что локализованные в одном и том же районе хромосомы 3 Tel и E(tc) являются разными мутациями. Также, впервые было показано, что на второй хромосоме в линии Gaiano присутствует неизвестный генетический фактор, участвующий в контроле длины теломер.

Несмотря на различия в структуре теломер, у теломеразозавимых организмов и у дрозофилы существуют общие механизмы, обеспечивающие поддержание стабильного   размера теломер. Во-первых, эксперименты, проведенные на дрожжах и млекопитающих, доказали, что при инактивации теломеразы у данных организмов индуцируется альтернативный механизм удлинения теломер, связанный с процессами конверсии\рекомбинации. В том числе, альтернативные механизмы удлинения теломер часто реализуются в раковых клетках. Во-вторых, в последнее время было найдено, что некоторые консервативные белки, участвующие в репарации ДНК, также принимают участие в формировании терминального комплекса, как у дрожжей и млекопитающих, так и у дрозофилы. Поэтому данные, полученные при изучении теломер дрозофилы помогают понять закономерности процесса регуляции длины теломер у различных эукариотических организмов и выявить основные белки, формирующие теломерный комплекс.

Апробация работы:

Основные результаты диссертационной работы были представлены на международной конференции молодых ученых Young Scientist Forum (Вена, 2007), на 32-ой конференции FEBS (Вена, 2007), на международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007).

Публикации:

По теме диссертационной работы опубликованы две научные статьи и тезисы, представленные на трех конференциях.

Структура и объем работы:

Диссертация изложена на 88 страницах, включает 2 таблицы, 18 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 112 источников.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

1. Выбор базовой модельной системы для изучения свойств Polycomb–зависимого хроматина.

Ген polyhomeotic – один из генов группы Polycomb (PcG), которая включает около локусов, играющих важную роль в процессе нормального развития дрозофилы и действующих как репрессоры гомеозисных генов (Jurgens, 1985). Известно, что PcG гены кодируют белки, которые влияют на компактизацию хроматина (Pirrotta & Rastelli, 1994) и связываются с особыми сайтами, названными Polycomb group Response Elements (PREs), найденными в регуляторных областях гомеозисных генов (Simon et al., 1993).

Несколько лет назад в нашей лаборатории было показано, что в результате встраивания Р элемента в ген polyhomeotic возникает новый аллель php1 (Belenkaya et al., 1998). Аллель php   кодирует химерный белок P-Polyhomeotic (P-Ph), состоящий из ДНК-связывающего домена транспозазы Р-элемента и белка Polyhomeotic, у которого на N-конце отсутствуют аминокислот. Белок P-Ph связывается с последовательностью Р-элемента и рекрутирует другие PcG белки, что приводит к образованию функционального репрессионного комплекса, т.е. в этом случае концевые последовательности Р-элемента выступают в роли PRE. Таким образом, если Р-элемент встраивается перед промотором гена yellow, в присутствии мутации php1 наблюдается репрессия транскрипции этого гена. Ген yellow отвечает за окраску кутикулярных структур дрозофилы. В норме тело, крылья и щетинки у мухи имеют темную окраску. При php1-зависимой репрессии тело и крылья дрозофилы становятся более светлыми, а щетинки приобретают вариабельную окраску (часть щетинок окрашена, а часть неокрашена). Сильная степень репрессии выражается в полном отсутствии окраски кутикулярных структур – тело, крылья и щетинки у мух светло-желтые.

Как упоминалось ранее, у дрозофилы теломерный хроматин может формироваться на любой неспецифичной последовательности ДНК. Ранее было показано, что теломерный хроматин, образующийся на концах терминально делетированных хромосом, негативно влияет на активность транспозазы Р-элемента (Melnikova et al., 2004). Чтобы выяснить, влияет ли теломерный хроматин на степень php1-зависимой репрессии, мы использовали линии Drosophila melanogaster, в которых концевые последовательности ДНК, формирующие нормальную теломеру, отсутствовали, и концы Х хромосом находились в кодирующей или регуляторной области гена yellow (линии yTD) (Mason et al., 1984;

Biessmann & Mason, 1988).

Локус yellow определяет пигментацию кутикулы, при этом степень пигментации прямо коррелирует с уровнем транскрипции, что позволяет визуально оценивать экспрессию гена.

Энхансеры гена yellow, отвечающие за окраску тела и крыльев, расположены на расстоянии около 1 т.п.н. перед промотором гена, а энхансер, отвечающий за окраску щетинок находится в интроне (Рис. 1). Поэтому, когда в линиях, несущих терминальные делеции, отсутствуют дистальные энхансеры, мухи имеют фенотип y2 - тело и крылья остаются желтыми, а щетинки окрашены. Однако необходимо отметить, что вследствие негативного влияния теломерного хроматина, энхансеры гена yellow неактивны, если они находятся на расстоянии менее 4 т.п.н.

от конца терминально делетированной хромосомы (Mikhailovsky et al., 1999).

Таким образом, степень пигментации кутикулы прямо кореллирует с расстоянием до конца терминально делетированной хромосомы: чем больше расстояние между энхансерами и концом хромосомы – тем темнее у мух тело и крылья.

  Ген yellow находится на дистальном конце Х хромосомы. Гемизиготные самцы или гомозиготные по yTD-хромосоме самки не выживают, так как между геном yellow и теломерой находятся несколько жизненно важных генов.

Рис. 1. Схема строения линии yTD1. Обозначения: направление транскрипции гена yellow показано горизонтальной стрелкой над осью координат. Экзоны гена обозначены черными горизонтальными прямоугольниками. Энхансеры тела (Т), крыльев (Кр) и щетинок (Щ) обозначены серыми овалами. H – HindIII, K – KpnI, B – BamHI, N – NcoI, S – SpeI, R - EcoRI. Серыми горизонтальными стрелками обозначены праймеры для ПЦР-анализа. Вертикальная стрелка обозначает место обрыва Х хромосомы в линии yTD1. Отрезок под осью координат - фрагмент гена yellow, использованный для гибридизации с ДНК полученных производных линий.

Ниже приведены результаты Саузерн-блот анализа линии yTD1, буквы над изображением обозначают использованные рестриктазы. Для гибридизации использовали фрагмент BamHI-SpeI из кодирующей части гена yellow.

Поэтому для поддержания терминально делетированных хромосом используют различные балансерные линии. Для проведения экспериментов нами была выбрана линия yTD1wa/y ac w. В балансерной линии y ac w последовательности гена yellow отсутствуют, но сохраняется нормальная теломера. Поэтому хромосома y ac w не мешает молекулярному и фенотипическому анализу гомологичной хромосомы, несущей терминальную делецию. Мухи линии yTD1/y ac w имели неокрашенные (светло-желтые) тело, крылья и щетинки, что говорит об отсутствии транскрипции гена yellow. С помощью Саузерн-блот анализа мы установили, что в описываемой линии отсутствует вся регуляторная область гена yellow, включая промотор (Рис. 1).

  2. Получение терминально делетированных хромосом, содержащих Р-элемент в предпромоторной области гена yellow.

Терминально делетированная хромосома может удлиняться при помощи генной конверсии, что позволяет получить измененные последовательности ДНК в нативном положении гена yellow (Melnikova & Georgiev, 2005). Это возможно, если матрица для конверсии частично гомологична оборванной хромосоме, но содержит в своем составе некую новую последовательность. В качестве матрицы для терминальной генной конверсии мы использовали линию дрозофилы y2s14w, в которой P-элемент размером 1200 п.н. встроился перед промотором гена yellow в положение – 69 п.н. относительно сайта начала транскрипции гена (Belenkaya et al., 1998) (Рис. 2). Самки из линии yTD1/y ac w и самцы из линии y2s14 w были скрещены между собой.

Рис. 2. Схема строения мутантного аллеля y2s14. Ориентация Р-элемента указана стрелкой внутри обозначающего его треугольника. -69 п.н. – расстояние от Р-элемента до сайта начала транскрипции гена yellow.

Х – XhoI. Остальные обозначения смотри рис. 1.

Целью этого скрещивания являлось получение производных линий, в которых Р-элемент, встроенный в предпромоторную область гена yellow, должен был находиться на разном расстоянии от конца терминально делетированных хромосом. Ранее было показано, что теломерный хроматин супрессирует генную конверсию, которая потенциально возможна при возникновении терминальной делеции (Melnikova et al., 2004). Поэтому для повышения вероятности конверсионных событий в исходные линии дополнительно вводилась мутация E(tc), которая увеличивает частоту терминальной генной конверсии в десятки раз.

Полученные гетерозиготные самки yTDwa/ y2s14w были скрещены с самцами y2s14w. Линия yTD1wa/ y2s14w поддерживалась на протяжении трех поколений, в течение которых происходили конверсионные события. Затем самки yTD1wa/ y2s14w1 были скрещены с самцами   ywphp1. В потомстве этого скрещивания были получены мухи с разной степенью php1 зависимой репрессии.

Самки yTD1wa/ ywphp1 с полностью окрашенными или вариабельными щетинками были отобраны и индивидуально скрещены с самцами y ac w. Саузерн-блот анализ полученных производных линий (Рис. 3) выявил прямую корелляцию между эффектом, который мутация php1 оказывала на окраску щетинок и расстоянием от P-элемента до конца терминально делетированной хромосомы. Полученные результаты позволили нам разделить производные линии на 4 класса (A, B, C, D).

3. Анализ php1-зависимой репрессии в полученных производных линиях Drosophila melanogaster.

Самки класса А - yTD-Awa/ywphp1, имели фенотип y2. В этом случае терминальный обрыв хромосомы находился на расстоянии 100 – 500 п.н. по отношению к сайту встраивания Р элемента в аллеле y2s14 (Рис. 3, табл. 1 класс А).

Рис. 3. а – Схематичное изображение линий с терминально делетированной Х хромосомой, использованных в работе. Обозначения: Пунктирными отрезками обозначены районы, в которых были картированы терминальные обрывы - вертикальные стрелки над осью координат - у соответствующих классов производных линий. Остальные обозначения смотри рис. 1 и рис. 2. б – Картирование терминальных обрывов хромосом в полученных производных линиях разных классов. ДНК производных линий была обработана рестриктазой BamHI, для гибридизации был использован фрагмент HindIII-BamHI из гена yellow.

  Однако несмотря на присутствие Р-элемента в предпромоторной области гена yellow, в отобранных линиях класса А php1-зависимая репрессия отсутствовала. Возможно, в данном случае на последовательностях Р-элемента не собирался репрессионный комплекс.

Таблица 1. Влияние расстояния между Р-элементом и концом терминально делетированной хромосомы на Polycomb-зависимую репрессию гена yellow.

Класс Генотип линии Окраска щетинок TD-A A (100-500 п.н.) + y /y ac yTD-A/y php1 + yTD-A/ y2s11php1 + yTD-B/y ac B (2-3,5 тпн) + yTD-B/y php1 слабо вариабельная yTD-B/ y2s11php1 слабо вариабельная yTD-C/y ac C (5-6 тпн) + yTD-C/y php1 средне вариабельная yTD-C/ y2s11php1 средне вариабельная yTD-D/y ac D (8 тпн) + yTD-D/y php1 сильно вариабельная yTD-D/ y2s11php1 неокрашены yhTD (10 тпн) yhTD /y ac + yhTD /y php1 сильно вариабельная yhTD / y2s11php1 неокрашены y2s14/y php контроль сильно вариабельная y2s14/ y2s11php1 неокрашены Пояснение: В скобках указано расстояние между Р-элементом и терминальным обрывом хромосомы.

Окраска щетинок: + - щетинки полностью окрашены как у мух дикого типа;

слабо вариабельная - неокрашены 10-20% щетинок и волосков;

средне вариабельная - неокрашены 30-60% щетинок и волосков;

сильно вариабельная - неокрашены 80-90% щетинок и волосков;

неокрашены - все щетинки и волоски светло-желтого цвета (фенотип y1).

Чтобы проверить данное предположение, мы попытались воспроизвести известный феномен кооперативной репрессии, который выражается в усилении активности слабого PRE при наличие сильного PRE на гомологичной хромосоме. Для этого был использован аллель y2s11 (Belenkaya et al., 1998), содержащий две копии Р-элемента перед промотором гена yellow в положении – 69 п.н. относительно сайта начала транскрипции (Рис. 4).

В присутствии мутации php1 Рс-G комплекс, который собирается на двух Р-элементах, вызывает полную репрессию транскрипции гена yellow. Поэтому последовательности Р элементов в аллеле y2s11 выступают в роли эффективного PRE. У гетерозиготных самок y2s14/ y php1 тело и крылья слабо окрашены, а окраска щетинок сильно вариабельная, тогда как гетерозиготные самки y2s14/ y2s11php1 имеют фенотип y1 (неокрашенные тело, крылья и щетинки) (табл. 1 контроль).

  Наблюдаемое в этом случае усиление репрессии in trans обусловлено взаимодействием PсG комплексов, собирающихся на Р-элементах гомологичных хромосом. Однако в гетерозиготных линиях yTD-A/ y2s11php1 щетинки у мух оставались полностью окрашенными, следовательно, даже мощный репрессионный комплекс на гомологичной хромосоме не усиливает репрессию в линиях, где P-Ph ассоциированный белковый комплекс, вероятно, не может связаться с последовательностью Р-элемента, расположенного практически на конце хромосомы.

У гетерозиготных самок yTD-Bwa/ywphp1, отнесенных нами к классу B, в окраске щетинок наблюдалась слабая вариабельность, а терминальный обрыв находился на расстоянии 2 – 3, т.п.н. от места встраивания Р-элемента. Однако аллель y2s11php1 не усиливал репрессию in trans (Рис. 3, табл. 1 класс B).

В линиях класса C расстояние между концом терминально делетированной хромосомы и Р-элементом составляло около 5 т.п.н. В этом случае у гетерозиготных самок yTD-Cwa/ywphp часть щетинок была неокрашена (средняя степень вариабельности), т.е. наблюдалась частичная php1-зависимая репрессия. Однако эта репрессия не усиливалась, даже если линии yTD-C скрещивались с аллелем y2s11php1(Рис. 3, табл. 1 класс С). Вероятно, в классах В и С связывание репрессивного белкового комплекса с последовательностью Р-элемента, расположенного близко к концу хромосомы было очень нестабильным.

Рис. 4. Схема строения мутантного аллеля y2s11w. Ориентация двух Р-элементов указана стрелками внутри обозначающего их треугольника. Остальные обозначения смотри рис. 1 и рис. 2.

Для полного восстановления php1-зависимой репрессии требуется, чтобы расстояние между Р-элементом и местом терминального обрыва хромосомы было не менее 8 т.п.н. В линиях, отнесенных нами к классу D - yTD-D размер последовательности, зачитанной с помощью терминальной генной конверсии составлял от 8 до 12 т.п.н. В этом случае энхансеры гена yellow, также как и Р-элемент, находились на большом расстоянии от конца хромосомы, поэтому окраска тела, крыльев и щетинок у мух была сравнима с диким типом. У   гетерозиготных самок yTD-D wa/ ywphp1 тело и крылья светлели, а щетинки становились сильно вариабельными в той же степени как в контрольной линии y2s14/ywphp1. Если же в положении in-trans присутствовала хромосома y2s11php1 (yTD-D/ y2s11php1), мухи имели фенотип y1 (Рис. 3, табл. 1 класс D). Следовательно, в данном случае на последовательности Р-элемента собирался функциональный репрессионный комплекс.

Интересно, что в одной из производных линий с максимальной степенью php1-зависимой репрессии рестриктная карта последовательности ДНК, находящейся между Р-элементом и концом терминально делетированной хромосомы частично не совпадала с рестриктной картой гена yellow (Рис. 5).

Рис. 5. Схематичное изображение линии yhTD. Место присоединения HeT-A элемента в аллеле yhTD показано вертикальной стрелкой над осью координат. HeT-A элемент обозначен черной горизонтальной стрелкой. Ниже приведены результаты Саузерн-блот анализа линии yhTD, обработанной различными рестриктазами. Для гибридизации использовали фрагмент HindIII-HindIII из регуляторной части гена yellow (черный горизонтальный отрезок под осью координат). Остальные обозначения смотри рис. 1, рис. 2. и рис.3.

На основании дополнительного Саузерн-блот анализа было выдвинуто предположение, что в данном случае к последовательности гена yellow, зачитанной при терминальной конверсии, присоединился HeT-A элемент, поэтому линия получила название yhTD. ПЦР с использованием праймеров из регуляторной области гена yellow и 5' нетранслируемой области HeT-A элемента позволила амплифицировать фрагмент ДНК в месте предполагаемого присоединения. В дальнейшем амплифицированный фрагмент был клонирован в плазмиду   pBluescript II SK(+) и просеквенирован. Полученные результаты подтвердили, что в линии yhTD терминальный фрагмент ДНК является последовательностью HeT-A элемента.

4. Выбор базовой модельной системы для сравнения свойств мутаций Telomere elongation (Tel) и Enhancer of terminal gene conversion (E(tc)).

Ранее в нашей лаборатории было показано, что у дрозофилы удлинение теломер может происходить по трем механизмам: с помощью транспозиции мобильных элементов на конец хромосомы;

с помощью генной конверсии и с помощью рекомбинации между теломерными повторами (Kahn et al., 2000). В 2002 году у Drosophila melanogaster были найдены два доминантных генетических фактора, влияющие на удлиннение теломер– это Telomere elongation (Tel) (Siriaco et al., 2002) и Enhancer of terminal gene conversion (E(tc)) (Melnikova & Georgiev, 2002). Мутация Tel, выделенная из природной линии Gaiano, существенно увеличивает количество мобильных элементов HeT-A и TART в теломерных районах хромосом. Мутация Tel была идентифицирована при помощи in situ гибридизации политенных хромосом линии Oregon, несущей хромосому 3 из линии Gaiano, с фрагментами ДНК HeT-A и TART элементов. Поэтому неизвестно, какой именно механизм – присоединение новых ретротранспозонов или конверсия/рекомбинация между гомологичными последовательностями мобильных элементов – привел к увеличению количества HeT-A и TART (Siriaco et al., 2002).

В отличие от Tel, мутация E(tc), обнаруженная нами в лабораторной линии y w, практически не влияет на присоединение HeT-A и TART элементов, но значительно повышает частоту терминальной генной конверсии. Функциональная роль E(tc) изучалась при помощи линий с терминально делетированной Х хромосомой, в которых терминальный обрыв находился в регуляторной области гена yellow (yTD*) (Melnikova & Georgiev, 2002).

С помощью генетической рекомбинации оба фактора, Tel и E(tc), были локализованы в районе 91-93 хромосомы 3R. Этот район включает более 320 т.п.н. и 27 описанных на настоящий момент генов. Возникает вопрос: являются ли Tel и E(tc) одной и той же мутацией или это мутации в различных генах? Если мы имеем дело с одной и той же мутацией, то разница в природе наблюдаемых событий (присоединения мобильных элементов и терминальная генная конверсия) обусловлена модельной системой и методами исследования, при помощи которых был обнаружен соответствующий генетический фактор.

Чтобы выяснить, может ли Tel также как E(tc) вызывать увеличение частоты терминальных генных конверсий, мы решили протестировать мутацию Tel в обычно используемой нами модельной системе. Для этого мы заменили аутосомы в выбранных для работы линиях yTD*/y w на хромосому 2(G2/G2) или 3(G3/G3) из линии Gaiano. С помощью   yTD*/y генетических скрещиваний были получены контрольные линии w;

CyO/If;

TM6,Tb/MKRS,Sb, в которых все аутосомы являлись балансерными хромосомами, то есть не несли какие-либо факторы, влияющие на изменение длины теломер;

линии yTD*/y w;

G2/G2;

TM6,Tb/MKRS,Sb, которые несли хромосому II из линии Gaiano и линии yTD*/y w;

CyO/If;

G3/G3, которые несли хромосому III из линии Gaiano.

5. Получение линий дрозофилы, несущих терминально делетированные хромосомы и аутосомы из линии Gaiano.

Изначально были использованы 3 линии, в которых концы терминально делетированных хромосом находились на расстоянии -80 п.н.( yTD-80), -100 п.н.( yTD-100), -140 п.н.( yTD-140) от сайта начала транскрипции гена yellow (Рис. 6).

Рис. 6. Схематичное изображение линий с терминальными делециями yTD-80, yTD-100, yTD-140. Обозначения:

вертикальными стрелками обозначены места обрывов Х хромосомы в соответствующих линиях. Пунктирными линиями обозначены различные фенотипы от y1 до y2, не окрашенные аристы – А-. TATA-бокс (Т) обозначен квадратом, +1 – начало транскрипции. С – ClaI, G – BglII. Ниже приведены результаты Саузерн-блот анализа линий yTD-80, yTD-100, yTD-140, над изображением обозначены использованные рестриктазы. Для гибридизации использовали фрагменты BamHI-ClaI, BamHI-SpeI из кодирующей части гена yellow. Остальные обозначения смотри рис. 1 и рис. 3.

  В исходных линиях yTD* терминальный обрыв хромосомы находился в непосредственной близости от промотора гена yellow, отсутствовали энхансеры, отвечающие за пигментацию тела и крыльев, но в интроне гена присутствовал энхансер, отвечающий за окраску щетинок, поэтому мухи имели неокрашенные тело и крылья и вариабельно окрашенные щетинки – фенотип уv.

В таких линиях присоединение содержащего промотор HeT-A элемента к концам терминально делетированных хромосом приводит к появлению мух, у которых все щетинки становятся полностью окрашенными - фенотип у2 (Kahn et al., 2000). В используемых линиях хромосома yTD* была сбалансирована хромосомой y w, т.к. гомозиготные по терминально делетированной хромосоме мухи не выживают. Аллель y w не мешает фенотипическому анализу, т.к. вследствие замены нуклеотида в ATG кодоне ген yellow не экспрессируется.

Однако в линии yTD*/ y w хромосома, несущая аллель y w, может служить матрицей для терминальной генной конверсии (Mikhailovsky et al., 1999). Поэтому удлинение хромосомы yTD* может происходить как с помощью присоединений мобильных элементов, так и с помощью терминальных конверсий. Появление в результате конверсии перед промотором гена yellow последовательности размером до 1700 п.н. также приводит к возникновению у фенотипа. После введения в линии yTD-80, yTD-100 и yTD-140 аутосом из линии Gaiano и балансерных хромосом в потомстве были отобраны отдельные самки, имеющие фенотип у2.

Необходимо отметить, что такие самки появились только в линиях yTD*/y w;

CyO/If;

G3/G3.

6. Анализ природы производных линий, полученных на фоне мутации Tel.

Скрестив отобранных самок, имеющих фенотип у2 с самцами у ac w, у которых на Х хромосоме отсутствовали последовательности гена yellow, мы получили индивидуальные производные линии дрозофил. Чтобы выяснить, какое именно событие – терминальная генная конверсия или присоединение мобильного элемента явилось причиной изменения фенотипа в полученных линиях, структура терминально делетированных хромосом в этих линиях была изучена с помощью Саузерн-блот анализа и ПЦР-анализа с использованием праймеров из промоторной области гена yellow и из 5' нетранслируемой области HeT-A и TART элементов (Рис. 7).

Всего нами было протестировано 132 индивидуальные линии. Полученные результаты показали, что генетический фактор Tel, находящийся в линии Gaiano на хромосоме вызывает два типа событий. Было установлено, что в 39 производных линиях удлинение хромосомы произошло вследствие присоединения мобильного элемента к концу терминально делетированной хромосомы, в остальных же 93 линиях при помощи терминальной генной конверсии.

  Рис. 7. а) Схематичное изображение линий с терминальными делециями yTD-80, yTD-100, yTD-140. Положение терминальных обрывов указано по отношению к балансерной хромосоме y w, черными стрелками изображены возможные присоединения мобильных элементов, а пунктирной стрелкой - терминальная генная конверсия, приведены исходные и производные фенотипы от y1 до y+. Окрашенные аристы – А+, не окрашенные аристы – А-. S-SalI. Остальные обозначения смотри рис. 1 и рис. 6. б) Результат Саузерн-блот анализа потомства производных от yTD-80, yTD-100 и yTD-140 линий с фенотипом у2(А-). Мембрана была последовательно сгибридизована с двумя районами гена yellow. Звездочками отмечены линии, в которых происходили присоединения Het-A элемента, нижняя размытая полоса соответствует расстоянию от сайта EcoRI до конца хромосомы.

7. Анализ соотношения частоты терминальной генной конверсии и присоединений мобильных элементов к концу хромосомы в созданной модельной системе.

Чтобы выяснить, как в присутствии доминантного фактора Tel соотносятся частота конверсионных событий и частота присоединений мобильных элементов к концу хромосомы, мы использовали две полученные производные линии, в которых мухи имели фенотип у2 и неокрашенные аристы, а терминальный обрыв хромосомы находился на расстоянии -900 п.н.( yTD-900) и -1100 п.н.( yTD-1100) от сайта начала транскрипции гена yellow, то есть в непосредственной близости от энхансеров тела и крыльев (Рис. 8а).

  Рис. 8. а) Схематичное изображение линий с терминальными делециями yTD-900, yTD-1100. Многоточием обозначены конверсии, не приводящие к изменению фенотипа. б) Саузерн-блот анализ потомства индивидуальных самок yTD-900/y1w1;

Cy0/If;

TM6,Tb/MKRS,Sb с исходным фенотипом у2(А-). в) Саузерн-блот анализ потомства контрольных линий yTD-900/yTD-1100/y1w1;

Cy0/If;

TM6,Tb/MKRS,Sb. г) Пример Саузерн-блот анализа производных линий yTD-900/yTD-1100/y1w1;

Cy0/If;

GIII/GIII. ДНК линий обрабатывалась рестриктазой BamHI. Мембраны, показанные на Рис. 8а и 9б, гибридизовались с фрагментом BamHI-HindIII из регуляторной части гена yellow, на Рис. 8г дополнительно с фрагментом y5-y6. Остальные обозначения смотри рис. 1, рис. 5 и рис. 7.

  Ранее было показано, что при присоединении HeT-A или TART элемента к концам терминально делетированных хромосом, расположенным в этой области, окраска тела и крыльев не изменяется, но полностью восстанавливается окраска арист (Savitsky et al., 2002).

Также было показано, что при появлении на конце терминально делетированной хромосомы энхансеров тела и крыльев, мухи становятся более темными.

Уровень пигментации кутикулы прямо кореллирует с размером зачитанной при конверсии последовательности – чем больше расстояние от энхансеров до конца хромосомы, тем темнее тело и крылья – фенотипы уr и у+ (Mikhailovsky et al., 1999) (Рис. 8а). Таким образом, мы можем фенотипически различать, какой именно механизм привел к удлинению хромосомы в потомстве выбранных линий. В линии yTD-900 и yTD-1100 нами были введены хромосомы 2 и 3 из линии Gaiano, а также балансерные хромосомы. Затем из производных каждой линии нами были отобраны по 3 самки, которые имели только вторую (G2/G2) или третью (G3/G3) хромосому из линии Gaiano или же полностью стабилизированные аутосомы (CyO/If;

TM6,Tb/MKRS,Sb).

Далее был проведен фенотипический анализ потомства этих самок. Все мухи, имеющие темную окраску тела и крыльев или окрашенные аристы были отобраны.

ПЦР-анализ с использованием праймеров из различных участков гена yellow и из 5' нетранслируемой области HeT-A элемента подтвердил, что различные обнаруженные в потомстве фенотипы соответствуют разным механизмами удлинения терминально делетированной хромосомы.

Потомство каждой линии с неизмененным фенотипом (у2, неокрашенные аристы) было размножено и в следующем поколении был проведен количественный анализ частоты присоединений HeT-A элементов и терминальных генных конверсий (Табл. 2).

Среди потомства контрольных линий yTD*/y w;

CyO/If;

TM6,Tb/MKRS,Sb мы обнаружили только 3 самки с темными аристами, то есть частота присоединений мобильных элементов к отдельному концу хромосомы в этих линиях не отличалась от нормальной, которая варьирует в пределах от 10-1 до 10-4 (Biessmann et.al. 1992;

Kahn et.al. 2000;

Golubovsky et.al. 2001).

Саузерн-блот анализ выявил, что в контрольных линиях происходила постепенная деградация конца хромосомы (Рис. 8б). Этот результат подтверждает, что модельная хромосома yTD* не содержит какие-либо мутации, влияющие на изменение длины теломер.

В двух линиях yTD*/y w;

G2/G2;

TM6,Tb/MKRS,Sb также были найдены только 2 самки, у которых к концу терминально делетированной хромосомы присоединился HeT-A элемент.

Однако в остальных четырех линиях, несущих хромосому 2 из линии Gaiano, наблюдалось небольшое увеличение частоты транспозиций мобильных элементов к концам терминально   делетированных хромосом (Табл. 2). Во всех линиях yTD*/y w;

CyO/If;

G3/G3 удлинение терминально делетированных хромосом происходило с высокой частотой при помощи обоих механизмов - присоединений HeT-A элементов и терминальных генных конверсий - что было подтверждено молекулярными методами анализа (Рис. 8в, табл. 2).

Таблица 2. Анализ соотношения частот транспозиций мобильных элементов к концу хромосомы и терминальных генных конверсий в присутствии мутации Tel.

Генотип линии yTD* Общее Количество самок Количество количество самок фенотипа у2, окра- самок фенотипов уr- у+, в линии шенные аристы (% от общего коли- (% от общего чества) количества) yTD-900/1/y w;

контроль 945 1 (0,1) yTD-900/2/y w;

контроль 450 - yTD-900/3/y w;

контроль 832 - yTD-1100/1/y w;

контроль 778 1 (0,1) TD-1100/ /y w;

контроль 287 - y TD-1100/ /y w;

контроль 985 1 (0,1) y TD-900/ /y w;

G2/G2 1178 41 (3,5) y TD-900/ /y w;

G2/G2 961 1 (0,1) y yTD-900/3/y w;

G2/G2 1274 9 (0,7) yTD-1100/1/y w;

G2/G2 789 1 (0,1) yTD-1100/2/y w;

G2/G2 1330 12 (0,9) yTD-1100/3/y w;

G2/G2 583 24 (4,1) yTD-900/1/y w;

G3/G3 450 12 (2,7) 41 (9,1) yTD-900/1/y w;

G3/G3 800 94 (11,8) 4 (0,5) yTD-900/3/y w;

G3/G3 860 195 (22,7) 87 (10) yTD-1100/1/y w;

G3/G3 973 161(16,5) 12 (1,2) TD-1100/ /y w;

G3/G3 1168 306 (26,2) 27 (2,3) y TD-1100/ /y w;

G3/G3 688 124 (18,0) 57 (8,3) y Пояснение: В описании генотипа использованных линий контроль обозначает балансерные хромосомы (CyO/If;

TM6,Tb/MKRS,Sb);

G2/G2 – введена хромосома 2 из линии Gaiano (G2/G2;

TM6,Tb/MKRS,Sb);

G3/G3 – введена хромосома 3 из линии Gaiano (CyO/If;

G3/G3).

Кроме того нами были протестированы несколько производных линий, имевшие исходный фенотип у2 и неокрашенные аристы. Было установлено, что длина терминально делетированных хромосом у мух с неизмененным фенотипом различна (Рис. 8г). В линиях   yTD*/y w;

CyO/If;

G3/G3 происходили как длиные терминальные конверсии, приводившие к появлению мух с фенотипом уr или у+, так и короткие конверсии размером до 500-700 п.н., которые не приводили к изменению фенотипа. Поэтому подсчитанная частота терминальных конверсий может быть несколько ниже реальной. Также был проведен анализ потомства нескольких отобранных во втором поколении самок G3/G3, имевших темную окраску тела и крыльев. Было обнаружено, что в нескольких производных линиях к концам удлиненных в результате конверсии хромосом присоединились HeT-A элементы. Таким образом, введение мутации Tel в yTD* линии, которые обычно используются нами как модельная система для изучения влияния различных факторов на изменение длины теломер, не приводит к предпочтению конверсионного механизма удлинения теломер.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Антогонизм между теломерным и Polycomb – зависимым хроматином на конце терминально делетированных хромосом у Drosophila melanogaster.

Основной структурой, обеспечивающей стабильность теломер является особый теломерный хроматин. Именно с ним ассоциировано большинство белков, участвуюших в регуляции длины теломер. В настоящее время наиболее хорошо изучена структура теломерного хроматина Saccharomyces cerevisiae, что связано с небольшим размером теломер у этих дрожжей (Louis, 1995). Структура теломерного хроматина у дрозофилы в настоящий момент практически не изучена. Однако в течение нескольких последних лет были проведены исследования, которые позволяют предположить, что у дрозофилы размер последовательностей, на которых формируется теломерный хроматин составляет 4-5 т.п.н.

Кроме того, эта структура обладает особыми свойствами. Теломерный хроматин препятствует взаимодействию между регуляторными элементами, расположенными на конце хромосомы, но не препятствует связыванию транскрипционных факторов с промотором и даже облегчает его (Savitsky et al., 2003;

Melnikova et al., 2008). Также теломерный хроматин препятствует связыванию транспозазы с концами Р-элемента, расположенного на конце хромосомы (Melnikova et al., 2004). Таким образом, теломерный хроматин дрозофилы негативно влияет на сборку либо стабильность одних белковых комплексов, сайты для которых находятся в зоне его действия, но в то же время может способствовать функционированию других, т.е. не обладает репрессорным эффектом.

Известно, что у всех эукариотических организмов непосредственно к теломерам примыкают особые субтеломерные повторяющиеся последовательности, с которыми ассоциирован специфический белковый комплекс (Kamnert et al., 1997). В формировании субтеломерного хроматина у дрозофилы участвуют белки группы Polycomb, обладающие   репрессорными свойствами (Pirrotta et al., 1994). Предполагается, что именно с функционированием PcG – комплексов связан известный репрессорный эффект субтеломерных районов (Karpen & Spradling, 1992;

Wallrath & Elgin, 1995;

Gryderman et al., 1999). Следовательно, теломерный хроматин отличается от субтеломерного хроматина и перицентрического гетерохроматина, которые репрессируют транскрипцию эухроматиновых генов. Возможно, репрессивный субтеломерный гетерохроматин и теломерный хроматин функционально антагонистичны. Поэтому вопрос о том, как - позитивно или негативно влияет теломерный хроматин на сборку субтеломерных белковых комплексов, представляет особый интерес.

В представленной работе мы использовали модельную систему, в которой Р-элемент был встроен перед промотором гена yellow и находился на различном расстоянии от конца терминально делетированной хромосомы. Последовательности гена yellow, находящиеся на конце хромосомы имеют свойства реальной теломеры. Это связано с тем, что теломерные белки дрозофилы не требуют специфичных сайтов связывания и могут образовывать теломерный комплекс на любой терминальной последовательности ДНК.

В использованной модельной системе Р-элемент в присутствии мутантного аллеля php являлся местом связывания белков группы Polycomb (PcG). Таким образом, мы изучили, как теломерный хроматин, образующийся на концевых последовательностях гена yellow, влияет на формирование репрессионного Polycomb-зависимого комплекса, который собирается на последовательностях Р-элемента и ассоциирован у дрозофилы с субтеломерными повторами.

Полученные результаты свидетельствуют, что расстояние между концом терминально делетированной хромосомы и Р-элементом в используемой модельной системе является основным фактором, от которого зависит формирование белкового PcG-комплекса. Если расстояние между концом хромосомы и Р-элементом составляло менее 4 т.п.н. то область формирования теломерного хроматина включала в себя последовательность Р-элемента и формирование Polycomb-зависимого репрессионного комплекса было подавлено. При увеличении расстояния до 5-6 т.п.н. зона сборки теломерного хроматина непосредственно граничила с зоной сборки PcG-комплекса. Наблюдаемая в этом случае слабая репрессионная активность свидетельствует, что близость последовательностей, обладающих свойствами теломер, негативно влияет на формирование репрессионного комплекса. Хорошо выраженная Polycomb-зависимая репрессия наблюдалась нами только если расстояние от конца хромосомы до Р-элемента возрастало до 8 т.п.н.. Вероятно, Pс-G комплекс в присутствии мутации php1 может стабильно связываться с последовательностью Р-элемента и взаимодействовать с таким же комплексом, находящимся на гомологичной хромосоме, только   если расстояние между ним и теломерным комплексом, который формируется на конце хромосомы достаточно велико.

Если предположить, что у дрозофилы как и у дрожжей на конце хромосомы формируется Т-петля, то полученные нами результаты можно объяснить следующим образом: вероятно, в линиях класса А репрессионный PcG-зависимый комплекс не может собираться, т.к Р элемент находится в зоне сборки белкового комплекса, замыкающего Т-петлю (так называемой D-петли). В линиях класса B Р-элемент располагается внутри Т-петли. Он становится более доступным, но сборка репрессионного комплекса все еще сильно затруднена. В линиях класса C Р-элемент уже находится за пределами Т-петли. Однако ее близость влияет на сборку репрессионного комплекса. В случае класса D Р-элемент находится на значительном расстоянии от предполагаемой Т-петли. Связыванию репрессионных белков ничто не мешает, поэтому наблюдается максимальная степень Polycomb-зависимой репрессии. Таким образом, полученные нами результаты являются косвенным доказательством формирования Т-петли на конце хромосом у дрозофилы.

Отсутствие разницы в степени php1-зависимой репрессии в линиях yTD-D, полученных путем терминальной генной конверсии и в линии yhTD, где к концу хромосомы присоединился HeT-A элемент, позволяет сделать вывод, что степень php1-зависимой репрессии в терминально делетированных линиях напрямую зависит от расстояния до конца хромосомы и не зависит от природы концевой последовательности ДНК.

Полученные в представленной работе результаты свидетельствуют, что между теломерным и субтеломерным (Pc-G-зависимым) хроматином существует антагонизм.

Для понимания природы этого явления необходимо подробное изучение состава терминального белкового комплекса и теломерного хроматина, механизмов их образования, поддержания и функциониования.

2. Функциональное разделение генетических факторов Telomere elongation (Tel) и Enhancer of terminal gene conversion (E(tc)), участвующих в регуляции длины теломер у Drosophila melanogaster.

Терминально делетированные хромосомы Drosophila melanogaster являются наиболее удобной модельной системой как для поиска белков, которые образуют структуру теломерного хроматина или входят в состав терминального комплекса, так и для изучения влияния мутаций в различных генах на изменение длины теломер. В течение нескольких последних лет при успешном использовании этой модельной системы в нашей лаборатории было показано, что несколько белков играют негативную роль в регуляции удлинения последовательностей ДНК на конце делетированной хромосомы. Однако мутации в генах,   кодирующих эти белки, влияют на различные механизмы, участвующие в поддержании длины теломер.

Недавние исследования показали, что основной фактор, определяющий структуру гетерохроматина, HP1 (heterochromatin protein 1) связывается с теломерами и необходим для их функционирования (Fanti et.al., 1998). Снижение концентрации белка HP1 в клетках приводит к слиянию теломер и резко снижает стабильность хромосом (Fanti et.al., 1998).

Белок НР1 также присутствует на концах терминальных делеций. Недавно было 2- продемонстрировано, что мутации в гене Su(var), кодирующем HP1, в гетерозиготном состоянии увеличивают более чем в 100 раз частоту HeT-A и TART присоединений к концу делетированной хромосомы (Savitsky et.al., 2002).

Два белка Ku70 и Ku80 являются высококонсервативными. Они были найдены у всех эукариот. Гетеродимер Ku70/Ku80 - это основной компонент белкового комплекса, осуществляющего репарацию ДНК (Pastwa & Blasiak, 2003). Неожиданно у дрожжей Ku белки были найдены на концах хромосом, а затем было доказано, что данные белки играют важную роль в метаболизме дрожжевых теломер. Недавно было показано, что Ku комплекс также участвует в регуляции длины теломер у млекопитающих и у растений (Bertuch & Lundblad, 2003). Ранее в нашей лаборатории было показано, что Ku белки связываются с концами теломер дрозофилы и участвуют в формировании терминального комплекса. Мутации в генах, кодирующих Ku70 и Ku80 влияли как на частоту транспозиций мобильных элементов так и на частоту терминальной генной конверсии (Melnikova et al., 2005).

В отличие от Su(var)2-5 мутаций и мутаций в генах Ku70/ Ku80, мутация Enhancer of terminal gene conversion (E(tc)), впервые описанная в нашей лаборатории, существенно увеличивает частоту удлинений терминальной ДНК при помощи генной конверсии, но не влияет на частоту транспозиций HeT-A и TART элементов к концу хромосомы (Melnikova et al., 2005). В настоящее время неизвестно, в каком гене находится мутация E(tc) и какой белок кодирует этот ген.

Недавно была описана новая доминантная мутация, названная Telomere elongation (Tel), стимулирующая удлинение теломер (Siriaco et.al., 2002). Мутация Tel была обнаружена в линии Gaiano, изолированной из природной популяции (Siriaco Drosophila et.al., 2002).Однако, механизм удлинения теломер, в котором участвует Tel не известен.

Предполагается, что Tel может прямо или косвенно увеличивать активность обратной транскриптазы, которая обеспечивает транскрипцию HeT-A и TART элементов. Также возможно, что Tel может кодировать продукт, который увеличивает доступность РНК HeT-A и TART элементов для обратной транскриптазы или же является посредником в процессе   транспозиций к концам хромосом. Кроме того не отрицается, что Tel является участником механизма конверсии/рекомбинации на концах хромосом. Ген, в котором находится мутация Tel и белок, который этот ген кодирует также неизвестны. Интересно, что Tel и E(tc) картированы в одной области третьей хромосомы. Таким образом, мутации Tel и E(tc) имеют различное происхождение, но могут оказывать сходный эффект на удлинение теломер.

В представленной работе, совместив метод, при помощи которого был обнаружен доминантный фактор Tel и модельную систему, в которой был обнаружен E(tc), мы функционально разделили эти две мутации. Ранее было показано, что именно мутация Tel, находящаяся на хромосоме III из линии Gaiano вызывает существенное увеличение HeT-A и TART элементов на концах хромосом (Siriaco et.al., 2002). При введении хромосомы III из линии Gaiano в линии с терминально делетированными хромосомами было показано, что удлинение конца хромосомы может происходить как с помощью транспозиций мобильных элементов, так и путем терминальной генной конверсии. Таким образом, хромосома III из линии Gaiano, содержащая мутацию Tel, проявляет более широкие функции, чем мутация E(tc). Какой-либо другой генетический фактор, кроме Tel, находящийся на хромосоме III и увеличивающий частоту присоединений HeT-A и TART элементов в настоящее время неизвестен. Поэтому полученные данные позволяют утверждать, что Tel и E(tc) – это не одна и та же мутация.

Нужно заметить, что мутация Tel также как E(tc) индуцирует только относительно короткие удлинения терминальной ДНК у Drosophila. Мы предполагаем, что короткие присоединения терминальной ДНК вызваны генной конверсией, а не механизмом сходным с BIR - нереципроктной рекомбинационно-зависимой репликацией, которая является эффективным механизмом репарации поврежденных хромосом. Ране было показано, что BIR может вызывать очень большие удлинения ДНК (KRAUS et al., 2001). Возможно, что события, инициированные BIR у S. Cerevisiae, могут не отличаться от возникающих во время генной конверсии. Однако, репликация ДНК в случае генной конверсии является менее эффективной, наблюдается высокий уровень диссоциации ДНК-полимеразы с матрицей. Поэтому мы предполагаем, что наблюдаемые нами события вызваны именно терминальной генной конверсией, использующей последовательности на гомологичной хромосоме в качестве матрицы.

Суммируя полученные данные, можно предположить, что хромосома III из линии Gaiano содержит оба генетических фактора - Tel и E(tc), которые находятся в районе 91-93, а хромосома III из лабораторной линии y w - только E(tc). Также можно предположить, что Tel и E(tc) являются аллельными вариантами одного и того же гена. Для физического разделения   этих генетических факторов необходимы дальнейшие молекулярно-генетические исследования, позволяющие выявить гены из района 91-93 хромосомы 3R, нарушения в которых влияют на изменение длины теломер.

Интересно также отметить, что при введении в используемую модельную систему хромосомы II из линии Gaiano наблюдалось некоторое увеличение частоты присоединений мобильных элементов к концам терминально делетированных хромосом. Полученный результат демонстрирует, что вторая хромосома из линии Gaiano содержит слабый, возможно рецессивный, генетический фактор, участвующий в контроле длины теломер. Возможно, это мутация в каком-либо гене, функциональная связь которого с регуляцией удлинения теломер еще не установлена. Однако нельзя отрицать возможность того, что обнаруженный фактор это слабая мутация в гене Su(var)2-5, кодирующем белок НР1. Вероятно, этот фактор не был найден одновременно с Tel, т.к. модельная система, в которой ранее тестировалась хромосома II из линии Gaiano, была менее чувствительной по сравнению с используемой нами в представленной работе.

ВЫВОДЫ 1. Созданы оригинальные модельные системы, позволяющие выявить новые свойства теломерного хроматина и сравнить свойства недавно открытых мутаций Enhancer of terminal gene conversion и Telomere elongation, влияющих на регуляцию длины теломер у Drosophila melanogaster.

2. Доказано, что теломерный хроматин негативно влияет на формирование репрессионного белкового PcG-комплекса, что свидетельствует о наличии антагонизма между теломерным и субтеломерным Polycomb-зависимым хроматином.

3. Впервые показано, что доминантный генетический фактор Telomere elongation, участвует в различных механизмах поддержания длины теломер, он влияет как на присоединение мобильных элементов к концу хромосомы, так и терминальную генную конверсию.

4. Продемонстрировано, что доминантные генетические факторы Enhancer of terminal gene conversion и Telomere elongation не являются одной и той же мутацией.

5. Впервые показано, что вторая хромосома Drosophila melanogaster из линии Gaiano содержит генетический фактор, участвующий в контроле длины теломер.

  Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Проскуряков К.А., Мельникова Л.С. Антогонизм между теломерным и Polycomb – зависимым хроматином на конце терминально делетированных хромосом у Drosophila melanogaster. Генетика. 2008. Т. 44. №11. С. 1562-1566.

2. Проскуряков К.А., Мельникова Л.С. Функциональное разделение генетических факторов Telomere elongation (Tel) и Enhancer of terminal gene conversion (E(tc)), участвующих в регуляции длины теломер у Drosophila melanogaster. Доклады Академии Наук. 2008. Т. 421.

№3 С. 406-410.

3. Проскуряков К.А., Георгиев П.Г., Мельникова Л.С. Активация промотора на конце терминально делетированной хромосомы у Drosophila melanogaster. Сборник материалов международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии». Томск, 9-12 мая, 2007. С. 149.

4. K. Proskuryakov, P. Georgiev and L. Melnikova Promoter activation at the end of the terminally truncated chromosome in Drosophila melanogaster. The FEBS journal. 2007. V. 234. I.

s1. P. 72.

5. K. Proskuryakov, P. Georgiev and L. Melnikova Promoter activation at the end of the terminally truncated chromosome in Drosophila melanogaster. Abstracts of the 7th Young Scientist Forum: Molecular Networks, Vienna, Austria, 5-7 July, 2007. P. 44.