Выделение активных бактериоцинобразующих лактококков и их практическое использование

На правах рукописи

СУЛЬТИМОВА Татьяна Доржиевна ВЫДЕЛЕНИЕ АКТИВНЫХ БАКТЕРИОЦИНОБРАЗУЮЩИХ ЛАКТОКОККОВ И ИХ ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ Специальность 03.00.07 – Микробиология 03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006.

Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Александр Иванович Нетрусов (03.00.23 – биотехнология) кандидат биологических наук Лидия Григорьевна Стоянова (03.00.07 – микробиология)

Официальные оппоненты:

доктор технических наук Нина Васильевна Нефедова кандидат биологических наук Наталья Алексеевна Загустина Ведущее учреждение: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности (ВНИМИ РАСХН).

Защита диссертации состоится 19 декабря 2006 г. в 15 ч 30 мин на заседании диссертационного совета Д 501.001.21 при Московском государственном университете им.

М. В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, д. 1, корп. 12, биологический факультет, аудитория 3А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан «16»ноября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Н. Ф. Пискункова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы В последние годы наблюдается возросший интерес к бактериоцинобразующим лактококкам Lactococcus lactis subsp. lactis, которые вследствие своей безвредности, высокой ферментативной и антимикробной активности являются объектом фундаментальных исследований по созданию новых активных пробиотиков и биологических консервантов.

Одним из главных аспектов этого интереса является возросший спрос потребителей к качеству продуктов питания и их безопасности для здоровья, поскольку широко используемые химические консерванты, увеличивающие срок хранения продуктов питания, вызывают опасения (Ross et al., 1999;

Konings et al., 2000;

O'Sullivan, 2002). С точки зрения специалистов, молочнокислые бактерии, называемые пробиотиками, участвуют во всех физиологических процессах организма. Сегодня использование пробиотических продуктов, способных восстанавливать микробиоту желудочно-кишечного тракта, может вытеснить потребление огромного количества химических лекарственных препаратов (Шаблин, 2001;

Temmreman, 2003;

Киркман, 2004;

Бондаренко и др., 2006).

В настоящее время молочнокислые стрептококки по систематическому положению выделены из группы микроорганизмов рода Streptococcus, включающего и патогенные формы, и под новым названием Lactococcus отнесены к категории «GRAS», куда относятся микроорганизмы, не вызывающие инфекционных заболеваний человека и животных. Наряду с молочной кислотой установлена роль других метаболитов молочнокислых бактерий (МКБ), ингибирующих развитие бактерий: перекиси водорода, уксусной и бензойной кислот, ацетоина, диацетила. Однако ведущее место в объяснении явления антагонизма МКБ отводится специфическим антибиотическим веществам белковой природы – бактериоцинам (Jack et al., 1995;

Parente, Ricciardi, 1999). Синтез бактериоцинов штаммоспецифичен и зависит от активности продуцента и условий его культивирования (Biswas et al., 1991;

De Vuyst, Vandamme, 1993;

Leroy et al., 2001).

Бактериоцины, синтезируемые лактококками, отличаются по молекулярной массе, аминокислотному составу, биологическому действию на ряд микроорганизмов, включая патогенные формы: листерии, бациллы и стафилококки, развивающиеся в продуктах питания в процессе хранения и выделяющие токсины, что является причиной ряда заболеваний.

Наиболее изученным и широко используемым в качестве биологического консерванта является бактериоцин низин, известный как полипептидный антибиотик низин «Nisaplin» (фирма “Aplin & Barrett, Ltd”, Англия). Его используют при приготовлении консервов и пресервов, поскольку при этом снижается длительность термообработки и, следовательно, сохраняются биологическая и пищевая ценности продуктов (Chang et al., 1989;

Nes et al., 1996;

Ross et al., 2002). Бактериоцинобразующие культуры также находят широкое применение при изготовлении молочных продуктов, колбасных изделий и мясных консервов (O'Sullivan, 2002;

Krockel, 2002).

Цель и задачи исследования.

Целью исследования являлось выделение и идентификация бактериоцинобразующих штаммов лактококков из молока и молочных продуктов, и их использование в качестве биоконсервантов.

Для выполнения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Выделение бактериоцинобразующих штаммов из коровьего молока территориальных зон и национального кисломолочного продукта курунга, их идентификация.

2. Изучение физиолого-бихимических свойств выделенных штаммов.

3. Регуляция синтеза бактериоцина составом компонентов ферментационной среды и рН-статированием.

4. Выделение бактериоцина из наиболее перспективного штамма лактококка и изучение его физико-химических свойств.

5. Применение бактериоцинобразующего лактококка в качестве биологического консерванта.

Научная новизна работы 1. Из молока разных территориальных зон России и кисломолочного продукта выделены новые бактериоцинобразующие штаммы с активностью, значительно превышающей активность природных штаммов.

2. Штаммы идентифицированы с использованием классических микробиологических методов и генотипического метода, основанного на анализе сходства нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, как Lactococcus lactis subsp. lactis.

Нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК новых штаммов депонированы в базу данных GenBank под следующими номерами: DQ255951 - DQ255954.

3. Выделен активный штамм 194, синтезирующий комплекс антибиотических веществ широкого спектра действия, в том числе и фунгицидного действия, что является неизвестным свойством для вида Lactococcus lactis. subsp. lactis.

4. Оптимизирована ферментационная среда, позволяющая при сниженном содержании фосфатов повысить уровень образования бактериоцина за счет замены углеводного компонента, а стабилизация уровня рН среды в процессе культивирования позволила повысить уровень активности на 58,5% (6500 МЕ/мл).

5. Проведены исследования по выделению антибиотического комплекса и изучению его компонентного состава. Установлено, что выделенные компоненты не имеют аналогов в компьютерной базе данных биологически-активных веществ.

6. Проведены исследования по использованию штамма 194 для обеззараживания поверхности сырокопченых колбас.

7. Проведена идентификация гриба Aspergillus repens, выделенного с поверхности зараженных сырокопченых колбас.

Практическая значимость Выделенные штаммы пополнили коллекцию активных бактериоцинобразующих культур. Изучена диссоциация продуцента, что облегчает его селекцию при использовании в промышленном производстве. Оптимизирован процесс биосинтеза бактериоцина. Разработан лабораторный регламент на синтез бактериоцина Lactococcus lactis subsp. lactis штамм 194.

Проведены исследования по использованию активного бактериоцинобразующего штамма 194 для увеличения сроков хранения сырокопченых колбас (Акт испытания бактериоцинпродуцирующего штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194 от 16.06.2006 г.).

Проведена идентификация плесневого гриба, вызывающего порчу сырокопченых колбас при хранении.

Апробация результатов Результаты диссертационной работы были представлены и доложены на различных конференциях: на Международном конгрессе “Poverty Food & Health in Welfare” (Lisbon, 2003), ХI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых “Ломоносов-2004” (Москва, 2004), 19-ом Международном симпозиуме ICFMH – FOOD MICRO 2004 (Slovenia, 2004), Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биотехнология микробов» (Москва, 2004), Молодежной школе-конференции «Актуальные проблемы современной микробиологии» (Москва, 2005), Всероссийском симпозиуме с международным участием “Автотрофные микроорганизмы” памяти академика РАН Е. Н.

Кондратьевой (Москва, 2005), 10-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2006).

Положения, выносимые на защиту 1. Выделение и идентификация новых штаммов бактериоцинобразующих лактококков из разных территориальных зон России.

2. Оптимизация синтеза бактериоцина компонентным составом ферментационной среды и рН-статированием.

3. Выделение и изучение компонентного состава нового бактериоцина.

4. Использование нового перспективного штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194 в качестве биологического консерванта при хранении колбасных изделий.

5. Идентификация грибной микрофлоры с поверхности зараженных колбасных изделий.

Публикации По материалу диссертации было опубликовано 10 печатных работ.

Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, их обсуждения, выводов, списка литературы (212 наименований), приложений, которые включают лабораторный регламент на процесс синтеза бактериоцина Lactococcus lactis subsp. lactis штамм 194 и акт испытания бактериоцинобразующего штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194 от 16.06.2006 г. Работа изложена на 168 страницах машинописного текста, включает 17 таблиц и 22 рисунка.

Содержание работы Материалы и методы исследования Для выполнения поставленных цели и задач использовали следующие материалы:

молоко из разных территориальных зон России (городов Москвы, Клина, Улан-Удэ) и бурятский национальный кисломолочный лечебно-профилактический напиток курунга.

Выделение активных бактериоцинобразующих штаммов из молока проводили поэтапно: сначала были выделены кислотообразующие мезофильные, а затем бактериоцинобразующие лактококки (Стоянова и др., 2006). При выделении лактококков из курунги проводили дифференциацию молочнокислых бактерий и дрожжей, составляющих микробиоту курунги: 5% испытуемого материала высевали в жидкую среду МРС следующего состава (%): гидролизат казеина – 1,0;

глюкоза – 2,0;

К2НРО4 3Н2О – 0,2;

дрожжевый экстрат – 0,5;

ацетат Na – 0,5;

MgSO4 H2O – 0,02;

MnSО4 Н20 – 0,005 с добавлением 2,5 мл 0,7% раствора цистeина, 0,1 мл 0,1% сорбиновой кислоты, 0,1 мл Твин- и параллельно на среду Сабуро для выращивания дрожжей, содержащую (%): глюкоза – 4,0;

пептон – 1,0;

агар – 1,8 и 0,01 левомицетина.

Экстракцию бактериоцина из культуральной жидкости проводили смесью ацетон:уксусная кислота:вода в соотношении 5:1:4.

Антибиотическую активность определяли методом диффузии в агар с измерением зоны подавления роста тест-культуры Bacillus coagulans в мм (Егоров, 2004).

Определение молочной кислоты в культуральной жидкости проводили методом титрования (Степаненко, 2005).

Идентификацию молочнокислых микроорганизмов осуществляли на основании морфологических, культуральных, физиолого-биохимических признаков в соответствии с определителем Bergy (2002) и с помощью генотипического метода, основанного на анализе сходства нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК.

Молекулярно-биологические методы.

Осаждение и промывание биомассы, а также выделение нативной хромосомной ДНК проводили, как описано ранее (Лысенко и др., 2001). Для экспериментов по гибридизации ДНК экстрагировали и очищали по методу Мармура (Marmur, 1961). Плазмидную ДНК выделяли по щелочной методике (Anderson, McKay, 1983). Нуклеотидный состав ДНК определяли методом термической денатурации (Owen et al., 1969). Уровень ДНК-ДНК гибридизации определяли методом оптической реассоциации (De Leu et al., 1970).

Рестрикцию плазмидной и геномной ДНК проводили по общепринятым методикам (Маниатис и др., 1984) с использованием эндонуклеаз рестрикции SmaI, PstI, Hind фирмы “Fermentas”, согласно рекомендациям производителя. Электрофорез плазмидной ДНК проводили в агарозном геле в ТБЕ–буфере с использованием агарозы фирмы “Sigma” и «Хеликон» (Маниатис и др., 1984), при напряжении электрического поля 15 B/см, с использованием маркеров ДНК фирмы «Fermentas». Пульс-гель электрофорез геномной ДНК проводили в 1% агарозном геле “Sigma”, при напряжении поля 6 В/см в 0,5 x TBE при 14о С в аппарате CHEF-DRIII фирмы “BioRad”. Выделение тотальной ДНК для полимеразно-цепной реакции проводили с помощью набора для выделения ДНК Wizard Genomic DNA Purification Kit фирмы «Promega», согласно рекомендациям производителя. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с использованием реактивов фирмы «Fermentas», праймеров, специально подобранных нами и синтезированных фирмой «Синтол», с использованием амплификатора “Perkin Elmer”. Компьютерный анализ подбора праймеров проводили с использованием компьютерных программ: NSBI Blast2 – определение гомологии при изучении сиквенсов с соответствующих праймеров, Oligo 6.31 – основной расчёт характеристик ПЦР, возможности образования праймерами дуплексов и вторичных структур, определение мест неспецифического праймирования на матрице, Oligonucleotide Properties Calculator – определение температуры отжига праймеров и их % GC состава. Электрофорез амплифицированных фрагментов ДНК проводили в агарозном геле в ТБЕ–буфере с использованием агарозы фирмы “Sigma”, при напряжении электрического поля 15 B/см, с использованием маркеров ДНК фирмы «Fermentas». Выделение и очистку ДНК из агарозного геля проводили с использованием набора для очистки амплифицированной ДНК фирмы «Sigma» (США), согласно рекомендациям фирмы-производителя. Секвенирование очищенных фрагментов генов 16S рРНК проводили по методу Сэнгера (Senger et al., 1977), используя автоматический секвенатор Beckman Coulter. Для определения частичной нуклеотидной последовательности гена проводилось с использованием праймера 1F.

Филогенетический анализ последовательностей генов 16S рРНК проводили, исходя из анализа результатов секвенирования с помощью компьютерных программ Vector NTI:

ContigExpress, AlignX. Сравнительный анализ и поиск гомологичных последовательностей проводили по базе NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Фенотипическое сходство нуклеотидных последовательностей (400 п.н.) генов 16S рРНК изучаемых штаммов лактококков: 115, 229, 194, МГУ устанавливали в сравнении с референтными штаммами:

Lactococcus lactis subsp. lactis AB118035, AB118037, AB118033, AB118034, AB100798, AB100795, AY675242, L. lactis subsp. cremoris AB100792, полученных из базы данных NCBI (Stevens еt al., 1991).

Ферментативную активность в отношении потребления ряда углеводов, проводили по методу «пестрого ряда».

Потребность выделенных штаммов в ростовых компонентах определяли по методу Ладерберга. Изучали влияние 20 аминокислот, 5 витаминов, пуриновых и пиримидиновых оснований, входящих в разных сочетаниях в среды культивирования, а методом дробного исключения определяли потребность в отдельных ростовых компонентах, способных включаться в метаболизм лактококков и синтез бактериоцина (Стоянова, Егоров, 2000).

Антимикробный спектр действия определяли на разные группы микроорганизмов и грибов, использую в качестве стандартов низин, левомицетин и нистатин. В качестве тест культур использовали микроорганизмы музея кафедры микробиологии МГУ.

Чувствительность к антибиотикам определяли диско-диффузионным методом с использованием дисков, пропитанных антибиотиком в концентрациях 10 - 30 мкг. (Галкина, 1990;

Стоянова, Егоров, 1999).

Изучали диссоциацию штамма 194 на агаровой среде, приготовленной на основе ферментационной среды следующего состава (%): NaCl- 0,2;

KH2PO4 – 2,0;

MgSO4 – 0,02;

глюкоза - 1,0;

дрожжевой автолизат, содержащий 35-40 мг% азота аммония (Баранова, 1974).

Для этого проводили рассев бактериальной суспензии с последующим отбором колоний разной морфологии (Милько,1991). Выделенные колонии подращивали в ферментационной среде и определяли их антибиотическую активность методом диффузии в агар с последующим пересчетом по стандартным растворам низина, левомицетина, нистатина. В качестве тест-культур использовали: для низина - Bacillus coagulans, левомицетина Escherichia coli, для нистатина – Aspergillus niger.

Регуляцию синтеза бактериоцина изучали по влиянию компонентов ферментационной среды на биосинтез бактериоцина. Эксперимент проводили по схеме методом изменения количества или дробного исключения составных компонентов среды:

уменьшения содержания фосфатов в виде КН2РО4 от 2,0 до 0,5%, увеличение содержания или замена углеводного компонента, исключения дрожжевого автолизата, являющегося источником аминного азота, витаминов и нуклеотидных оснований. Динамику роста выделенных штаммов и синтеза бактериоцинов в среде оптимизированного состава изучали в стационарных условиях в течение 30 ч. Биомассу определяли нефелометрически на приборе ФЭК-56 при длине волны 560 нм, рН - потенциометрически.

Влияние рН-статирования на синтез бактериоцина проводили в ферментере фирмы LKB объемом 5 л. Контроль процесса ферментации проводили по измерению оптической плотности культуры и антибиотической активности (Грушина, 1984).

Изучали влияние левомицетина как ингибитора синтеза белка на рост культуры, образование бактериоцина и синтез белка (Hirst, 1981). Левомицетин добавляли в среду культивирования в количестве 100 мг/мл.

Определение белка проводили методом Лоури с помощью спектрофотометра или ФЭК при длине волны максимума поглощения 750 нм (Lowry еt al., 1951).

Лиофилизация штаммов. Культуры молочнокислых бактерий, выращенные на жидкой среде до стационарной стадии роста, центрифугировали с целью отделения клеток, ресуспендировали в защитной среде, содержащий (в г/л): желатины – 10, сахарозы – 100, как криопротекторы. и лиофилизировали на установке фирмы «Крист» марки Бетта А (Германия) под вакуумом при температуре 30С до остаточной влажности 2,5 - 4,0%.

Лиофильно высушенные штаммы хранили в ампулах в условиях бытового холодильника при - 18С. После лиофилизации и в процессе длительного культуры восстанавливали в обезжиренном стерильном молоке (Стоянова Л. Г., Егоров Н. С., 1999;

Стоянова и др., 2004).

Для выделения и очистки бактериоцина, образуемого штаммом Lactococcus lactis subsp. lactis применен ряд растворителей, такие как: ацетон, н.-бутанол, метанол в различных сочетаниях и концентрациях в сравнении с известной смесью для выделения низина, содержащую ацетон:уксусная кислота в соотношении 4:1 на 5 частей культуральной жидкости. Для разделения антибиотического комплекса на фракции и получения хроматографически чистых компонентов водный концентрат экстрагировали органическими растворителями, не смешивающимися с водой, экстракты объединяли, растворитель отгоняли в вакууме на роторном испарителе до получения маслянистого остатка и таким образом получали одну из фракций (А) антибиотического комплекса, образуемого штаммом L. lactis subsp. lactis 194. Для получения фракции В к водному маточнику от экстракции добавляли объема метанола. Выпавший осадок отделяли на стеклянном фильтре и сушили в вакуум эксикаторе в течение суток (Cotter et al., 2006;

Breukink, 2006).

Хроматографический анализ антибиотиков проводили методом тонкослойной хроматографии (TCХ) (Parente, Ricciardi, 1999) на пластинках “Silufol” (Чехия) в системе метанол:вода (96:4) (Воейков, 1992) и колоночной хроматографии. В этих же условиях проводили и препаративную TCХ, используемую для очистки индивидуальных компонентов фракций.

Аналитический и полупрепаративный электрофорез на бумаге Filtrak F- проводили на V-образном приборе Durruma в электролите: 2 н. АсОН (рН 2,4), 550В в течение 2 ч.

Биоавтографию проводили по методике, предложенной Хасе и Келлером (Saavedra et al., 2004) с использованием в качестве тест-организмов Bac. coagulans 429, Bacillus subtilis АТСС 6633.

UV-VIS-спектры снимали на спектрофотометрах Shimadzu 1601C и Hitachi U- (Japan);

Масс-спектры выделенных антибиотиков регистрировали на приборе VISION методом MALDI-TOF в режиме положительных ионов на матрице DHB (2,5-дигидрокси бензойная кислота).

Для изучения возможности применения бактериоцинобразующего штамма 194 в качестве биоконсерванта были проведены испытания по увеличению сроков хранения сырокопченых колбасных изделий: сервелат сырокопченый «Зернистый» ТУ 9213038-510 323-26-03, колбаса сырокопченая «Свиная» ГОСТ 16131-86. Опытные образцы были обработаны культуральной жидкостью с активностью бактериоцина 4000 МЕ/мл, рН 4,2.

Контрольные образцы (без обработки) вышеуказанных колбасных изделий и опытные были заложены на хранение при температуре 100С на 2 месяца. Проведена идентификация грибной плесени с поверхности зараженных колбас с использованием классических микробиологических методов (Raper et al., 1965;

Саттон и др, 2001).

Результаты исследования были статистически обработаны по общепринятой методике с использованием критерия Стьюдента (Р0,05) в программе SigmaPlot 3.02 (Jadel Corporation, США).

Результаты исследования.

Выделение и идентификация мезофильных бактериоцинобразующих лактококков. Из молока разных территориальных зон России и национального бурятского кисломолочного напитка курунга были отобраны наиболее активные бактериоцинобразующие штаммы. Из отобранных 62 колонии из разных продуктов - штамма, обладали наибольшей антибиотической активностью по отношению к тест – культуре B. сoagulans. Из молока молочных комбинатов г. Москвы выделен штамм 115 с активностью 2700 МЕ/мл, г. Клина - штамм 229 с активностью 2500 МЕ/мл, г. Улан-Удэ штамм 194 с активностью 3600 МЕ/мл и из напитка курунга выделен штамм К-205 с активностью 2900 МЕ/мл. В качестве контроля был использован ранее изученный на кафедре микробиологии низинобразующий штамм МГУ с активностью 2000 МЕ/мл (Баранова, 1990).

Исследованы морфологические, культуральные и физиолого-биохимические свойства новых штаммов (табл. 1). Изучение морфологии выделенных штаммов в фазово-контрастном микроскопе показало, что культура представлена кокками, собранными в пары и короткие цепочки разной длины (от 4-х до 7-ми кокков). Бактерии неподвижные, грамположительные.

По морфологии и культуральным свойствам выделенные бактерии близки к мезофильным гомоферментативным лактококкам L. lactis subsp. lactis. На плотных агаровых средах с гидролизатом молока и синтетической среде с фосфатом и дрожжевым автолизатом колонии были круглые блестящие с ровными краями диаметром от 1,5 мм до 3 мм: мелкие колонии у штаммов 115 и 194, а наиболее крупные у 229 и К-205. При глубинном инкубировании лактококки образовывали колонии лодочкообразной формы.

Таблица 1.

Дифференцирующие признаки штаммов L. lactis subsp. lactis Признаки штамм штамм штамм штамм штамм L. lactis subsp. МГУ 194 115 229 К- lactis Преимущественное короткие дипло- короткие цепочки дипло- цепочки расположение цепочки кокки цепочки до 7 кокки до клеток наиболее кокков кокков типичное указано первым Подвижность - - - - - + + + + + + Рост при 10°С - - - - - Рост при 45°С pH 9.6 - - - - - Рост в присутствии + + + + + + 4%NaCl Рост в присутствии - - - - - 6,5%NaCl Образование 90-98% 93% 95% 96% 91% 97% молочной кислоты из глюкозы, %:

Способность к потреблению углеводов Фруктоза + + + + + + Лактоза + + + + + + Маннитол - - - - - + Сахароза + + + + + + Мальтоза + + + + + + Рафиноза - - - - - Отношение к факультативные анаэробы кислороду.

Определитель бактерий Берджи, 2002.

Примечание: знак «+» – обозначает способность к потреблению углеводного субстрата, «-» – отсутствие способности к потреблению.

Свойство потреблять различные углеводы, включая сахара, спирты и органические кислоты лежит в основе отличительных признаков при идентификации молочнокислых бактерий. В результате исследований было установлено, что все выделенные штаммы и штамм МГУ утилизировали глюкозу, лактозу, фруктозу, сахарозу, маннозу, но не утилизировали манитол за исключением штамма К-205 (табл. 1).

Результаты генотипирования по 16S рРНК показали, что все штаммы обнаруживали высокую степень гомологии ДНК (на уровне 98,9 – 100,0%) по отношению к референтным штаммам L. lactis subsp. lactis. Уровень гомологии (в %) между штаммами лактококков по результатам сравнительного анализа последовательностей участка гена 16S рРНК представлен на рис. 1 и подтверждает принадлежность изучаемых бактерий к виду L. lactis subsp. lactis.

L. la c tis s ub s p. la c tis L. la c t i s s u b s p. la c t i s L. la c tis s ub s p. la c tis L. la c t i s s u b s p. la c t i s 1 1 L. la c tis s ub s p. la c tis L. la c t i s s u b s p. la c t i s 2 2 L. la c tis s ub s p. la c tis 1 9 L. la c tis s ub s p. la c tis K L. la c tis s ub s p. c r e m o r is L. la c tis s ub s p. c r e m o r is 0.0 0 Рисунок 1. Дендрограмма генотипического сходства нуклеотидных последовательностей (400 п.н.) генов 16S рРНК изучаемых штаммов лактококков: 115, 229, 194, МГУ в сравнении с референтными штаммами L. lactis subsp. lactis и L. lactis subsp.

cremoris.

Высокий уровень гомологии выявлен между штаммами, выделенными из продуктов Бурятии - 99,6%, а сходство их со штаммами, выделенными из молока московского региона, составило 98,9%. Уровень генетического родства всех изучаемых штаммов по отношению к близкородственному штамму L. lactis subsp. cremoris составил 95,4 – 96,6 %.

Изучение физиолого-биохимических свойств штаммов.

Определены потребности штаммов в отдельных факторах роста (табл. 3). Показано, что все изучаемые штаммы потребляли аргинин, что является таксономическим признаком для гомоферментативных лактококков L. lactis subsp. lactis, а также требовали для своего роста наличия в среде аспарагиновой кислоты и урацила. Тимин, как и аланин были необходимы для роста штаммов 194, 229 и К-205. Штамм МГУ также нуждался в глицине и пролине. Отсутствие глицина не оказывало влияния на рост штаммов, кроме штаммов 194 и МГУ. Штамм 115 отличался весьма ограниченной потребностью в ростовых компонентах, но пролин, аспарагин и урацил стимулировали его рост. В контроле (без ростовых компонентов) рост штаммов не обнаружен, что свидетельствовало об ауксотрофности выделенных штаммов.

Таблица Потребность в отдельных ростовых компонентах L. lactis subsp. lactis штаммов 115, 194, и МГУ.

Ростовые компоненты штамм штамм штамм штамм штамм 115 194 229 К-205 МГУ Аланин - + + + Аргинин + + + + + Аспарагин + + - + Аспарагиновая кислота + + + + + Валин - - + - + Глицин - + - - + Глутамин - + - + + Пролин + - - - + Тимин - + + + Урацил + + + + + Примечание: знак «+» обозначает потребность в ростовом компоненте (отсутствие роста), «-» - отсутствие потребности в ростовом компоненте.

Изучен спектр антибиотического действия (табл. 3) выделенных лактококков.

Установлено, что выделенные активные бактериоцинобразующие штаммы подавляли рост грамположительных бактерий, включая спорообразующие бациллы B. subtilis, B. сoagulans, B. mycoides, микрококки Micrococcus luteus, Micrococcus flavum и Staphylococcus aureus, что характерно для низина A (Nisaplin) и низинобразующего лактококка штамм МГУ. Штамм 115 проявлял незначительную антибиотическую активность на грамотрицательные микроорганизмы, а штамм 229 – только на Alcaligenes faecalis. Однако, штаммы 194 и К-205, выделенные из молока г. Улан-Удэ и лечебно-профилактического продукта курунга, обладали широким спектром антибактериального действия: эффективно подавляли рост как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий: Alcaligenes faecalis, Proteus vulgaris, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens. Эти штаммы проявляли также фунгицидное действие: подавляли рост: Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum, Fusarium oxysporum, Rhodotorula aurantiaca, Candida guilliermondii, что является редким малоизвестным биологическим свойством бактериоцинов, синтезируемым бактериями Lactococcus lactis subsp. lactis.

Таблица Антимикробный спектр действия штаммов лактококков разного происхождения и кисломолочного напитка курунга.

Тесткультура К- Nisa 115 229 194 МГУ Курунга 205 plin Диаметр зон подавления роста, мм Bacillus mycoides 21, 20,0 16,0 19,5 19,5 16.0 17, Bacillus subtilis 12,0 19,0 22,0 22,0 19,0 19,0 20, 18, Bacillus coagulans 21,0 15,0 23,0 22,0 14,0 21, 17, Bacillus cereus 18,5 20,0 21,0 21,0 16,0 18, Micrococcus luteus 21, 21,5 22,0 22,5 19,5 19,0 21, Staphylococcus 16,0 16,0 20,0 20,0 12,0 15,0 20, aureus Alcaligenes 9,0 10,0 12,5 12,5 0,0 0,0 18, faecalis Escherichia coli 15, 12,0 0,0 15,0 14,0 0,0 0, 16, Proteus vulgaris 9,0 0,0 16,5 16,0 0,0 0, Pseudomonas 10,0 0,0 16,5 15,5 0,0 0,0 17, aeruginosa Pseudomonas 9,0 0,0 18,0 16,0 0,0 0,0 14, fluorescens Fusarium 0,0 0,0 16,5 10,0 0,0 0,0 15, oxysporum Penicillum 0,0 0,0 17,5 10,5 0,0 0,0 15, chryzogenum 16, Aspergillus niger 0,0 0,0 21,0 10,0 0,0 0, Rhodotorula 0,0 0,0 19,5 10,0 0,0 0,0 13, aurantiaca Candida 0,0 0,0 21,0 12,0 0,0 0,0 10, guilliermondii Следовательно, имеет место и штаммовая специфичность лактококков по синтезу бактериоцинов, отличающихся биологическим действием. Этим объясняется актуальность данной работы по выделению природных штаммов - продуцентов бактериоцинов.

По результатам изучения чувствительности изучаемых штаммов к антибиотикам (табл. 4), выявлено, что штаммы чувствительны к антибактериальным антибиотикам широкого спектра действия, ингибирующим синтез белка: тетрациклину, доксициклину и левомицетину, в меньшей степени к аминогликозидным антибиотикам: канамицину, неомицину, сизомицину и стрептомицину. Все штаммы чувствительны к антибиотикам, ингибирующим синтез клеточной стенки грамположительных бактерий: пенициллинам и цефалоспоринам, но штамм 194 устойчив к бензилпенициллину. Эти данные подтверждают принадлежность изучаемых бактерий к группе грамположительных бактерий.

Таблица 4.

Чувствительность выделенных штаммов L. lactis subsp. lactis к антибиотикам.

Антибиотик Концентрация в Диаметр зон подавления роста, мм диске, мкг 115 229 194 К-205 МГУ Тетрациклин 30 36,5 33,6 28,5 30,4 35, Доксициклин 10 32,0 34,0 27,5 29,8 34, Левомицетин 30 25,2 32,0 25,5 23,6 26, Рифампицин 10 12,0 0,0 15,0 12,2 0, Олеандомицин 15 21,0 27,0 17,5 18,3 28, Неомицин 30 0,0 0,0 14,0 0,0 0, Стрептомицин 30 12,0 13,3 12,0 0,0 14, Канамицин А 30 14,5 14,0 0,0 11,3 15, Ристомицин А 30 19,5 17,6 13,8 14,4 19, Бензилпенициллин 10 22,6 27,0 0,0 18,5 26, Карбинициллин 10 32,0 29,5 12,0 21,1 30, Оксациллин 10 21,0 18,5 10,0 13,6 17, Цефалотин 30 30,5 30,5 27,0 26,8 31, Цефалексин 30 18,0 28,0 13,0 15,7 28, Сизомицин 10 19,0 16,5 10,0 14,2 17, Метициллин 10 22,0 28,5 0,0 0,0 16, Ампициллин 10 29,0 32,6 20,0 23,4 26, Чувствительность к антибиотическим препаратам может быть следствием их применения в сельскохозяйственной практике. В связи с этим, контроль по данному показателю является необходимым, так как при использовании культур, резистентных к лекарственным препаратам в пищевой и медицинской практике, могут передаваться в макроорганизм плазмиды, несущие гены лекарственной устойчивости, что затрудняет лечение (Tammerman, 2003;

Зигангирова и др., 2006).

Изучение диссоциации штамма 194.

В микробиологических производствах причиной снижения активности продуцентов часто является спонтанная изменчивость штаммов по морфологическим и физиолого биохимическим свойствам. Известно, что при множественных пассажах и неблагоприятных условиях культивирования производственные штаммы могут диссоциировать с преобладанием неактивных клонов. Установлено, что штамм 194 диссоциировал на G (мелкие, прозрачные колонии) и S (крупные, белые колонии) варианты (рис. 2). Вариант G составлял 88,1%, а вариант S - 11,9% от общего количества клеток популяции. По каждому типу колоний определены отличительные физиолого-биохимические свойства (табл. 5).

S-варианты G-варианты Рис. 2. Диссоциация штамма 194 на G и S варианты.

Показано, что наибольшей антимикробной и фунгицидной активностью обладает G вариант. Активность его по низину составила 4500 МЕ/мл, по левомицетину – 3630 МЕ/мл, а фунгицидная активность, рассчитанная по нистатину – 2200 МЕ/мл, что на 5,4, 11,8 и 8,5% (соответственно) выше по сравнению с активностью S-вариантов.

Таблица 5.

Характеристика диссоциантов L. lactis subsp. lactis Свойства G вариант S вариант Морфология мелкие, прозрачные колонии крупные, белые колонии размером 1,5 – 1,8 мм размером 2,2 – 3,0 мм Антибиотическая активность, рассчитанная по: (МЕ/мл) низину 4500 левомицетину 3630 нистатину 2200 Полученные данные позволят проводить селекцию продуцента по целевому признаку.

Регуляция синтеза бактериоцина L. lactis subsp. lactis штаммом На примере перспективного штамма 194, как имеющего наибольшую активность и широкий спектр антимикробного действия, изучали влияние основных компонентов ферментационной среды на рост культуры и синтез бактериоцина.

Как видно из таблицы 5, при уменьшении количества фосфата в среде от 2,0% до 0,5% рост культуры и синтез бактериоцина снижался, а при исключении из среды дрожжевого автолизата как источника аминного азота, рост культуры и синтез бактериоцина приостанавливался.

Таблица 5.

Влияние различных компонентов ферментационной среды на рост и синтез бактериоцина штаммом Lactococcus lactis subsp. lactis ОП540 (17ч.) рН Активность, МЕ/мл Состав среды Контроль (глюкоза + дрожжевой 1,45 4,2 автолизат + 2% KH2PO4) с 1% KH2PO4 1,05 4,0 с 0,5% KH2PO4 0,80 3,9 без KH2PO4 0,32 5,4 без дрожжевого 0,18 6,6 автолизата Существует прямая корреляция между концентрацией фосфора в среде с ассимиляцией углеводов из среды культивирования (Безбородов, 1991;

De Vuyst, Vandamme, 1993;

Chan et al., 2002).

Влияние разных углеводов на синтез бактериоцина штаммом Lactococcus lactis subsp.

lactis 194 представлено на рис. 3. Показано, что на среде с сахарозой уровень антибиотической активности на 25% выше, с маннозой - на 15%, с галактозой, рибозой, фруктозой на 10% выше по сравнению со средой, содержащей глюкозу. Итак, дисахарид сахароза - наиболее благоприятный углевод для синтеза бактериоцина, что согласуется с исследованиями ряда авторов, утверждающих, что синтез бактериоцина низина и способность к утилизации сахарозы кодируется одним геном (De Vuyst et al., 1992;

Klaenhammer, 1993).

Активность, % углевод 1.рибоза 2.арабиноза 3.ксилоза 4.рамноза 5.галактоза 6.лактоза 7.глюкоза 8.сахароза 9.мальтоза 10.раф иноза 11.манноза 12.фруктоза 14.дульцитол 15.маннитол 16.инозитол 17.сорбитол 18.декстрин контроль(без углеводов) Рис. 3. Влияние углеводов на синтез бактериоцина штаммом Lactococcus lactis subsp.

lactis 194.

Следующим этапом работы являлось изучение роста и развития штамма 194 на средах, с низким содержанием фосфатов (0,5% КН2РО4) в сочетании с удвоенным количеством сахарозы или глюкозы. Результаты этого эксперимента показали, что за 9 часов инкубирования в среде с 2% глюкозы уровень активности увеличился на 13,9% по сравнению с основной ферментационной средой, содержащей 2% КН2РО4 и 1% глюкозы. При замене глюкозы на сахарозу уровень антибиотической активности увеличился на 24,6% (табл. 7).

Таблица 7.

Показатели роста культуры и активность бактериоцина штамма 194 Lactococcus lactis subsp. lactis на средах, содержащих 0,5% КН2РО4 и 2,0% глюкозы или 2,0% сахарозы Время Показатели роста культуры и активность бактериоцина культивиро- глюкоза сахароза вания, час рН ОП540 Активность, рН ОП540 Активность, МЕ/мл МЕ/мл 0 6,9 0,10 0 6,8 0,18 3 6,6 0,42 1700 6,6 0,80 6 4,8 0,70 3200 4,8 1,60 9 4,0 1,30 4100 4,2 1,82 12 3,8 1,20 4100 4,0 1,80 Как показали результаты изучения динамики роста в стационарных условиях и развития культуры на оптимизированной среде при периодическом культивировании (рис. 5) максимальное количество бактериоцина накапливалось в ферментационной среде за 9 ч инкубирования, что сопровождалось увеличением биомассы продуцента и снижением рН среды до значения 3,8.

6000 Активность, МЕ/мл 4000 рН, ОП 3000 1000 0 0 3 6 9 12 15 18 21 Время, ч Активность, МЕ/мл ОП540 рH Рис.4. Динамика роста Lactococcus lactis subsp. lactis 194 на оптимизированной среде, содержащей 0,5% KH2PO4 и 2,0% сахарозы.

Таким образом, оптимальной является среда, содержащая (%): KH2PO4 – 0,5;

MgSO4 – 0,02;

NaCl - 0,2;

сахароза - 2,0;

дрожжевой автолизат, содержащий 35 - 40 мг% азота аммония.

Влияние рН-статирования на рост культуры и синтез бактериоцина.

Активная кислотность (рН) среды существенно влияет на развитие микроорганизмов, на характер их обмена и, следовательно, на процесс образования антибиотических веществ.

Изменение рН среды заметно сказывается на активности ферментов микроорганизмов, состоянии промежуточных продуктов, их диссоциации, растворимости. Таким образом, изменение активной кислотности среды значительно воздействует на выход конечных продуктов метаболизма микроорганизмов (Грушина, 1984;

Matsusaki et al., 1996).

Стабилизация уровня рН в процессе ферментации на оптимизированной среде позволило повысить уровень антибиотической активности на 27,5% (табл. 8).

Итак, при оптимизации технологического процесса ферментации бактериоцинобразующая активность штамма повысилась на 58,5% (6500 МЕ/мл).

Таблица Влияние рН-статирования ферментационной среды на рост культуры и синтез бактериоцина Lactococcus lactis subsp. lactis штамм 194.

Время культивиро- Показатели роста культуры и активность вания, час бактериоцина рН ОП540 Активность, МЕ/мл 3 5,9 0,40 4 5,6 0,52 5 6,0 0,80 6 6,0 1,30 7 5,9 1,50 8 5,9 1,60 9 6,0 1,60 10 6,0 1,60 На основании экспериментальных данных, полученных при изучении регуляции синтеза бактериоцина новым перспективным штаммом Lactococcus lactis subsp. lactis разработан лабораторный регламент на технологический процесс синтеза бактериоцина.

Изучение динамики роста и развития штамма 194 показало, что синтез бактериоцина идет параллельно росту продуцента, что согласуется с ранее полученными данными других исследователей (Hurst, 1983;

Yother et al., 2002).

Для подтверждения белковой природы синтезируемого бактериоцина были проведены исследования по влиянию ингибитора синтеза белка - левомицетина на рост продуцента, синтез бактериоцина и белка. На рис. 5 показано, что внесение в среду культивирования левомицетина ингибировало рост и развитие культуры, о чем свидетельствовало снижение оптической плотности культуры, синтеза микробного белка и антибиотической активности культуральной жидкости продуцента. При уменьшении биомассы на 32,3%, синтез белка снизился на 45,2%, а антибиотическая активность культуральной жидкости на 88,5%. При этом изменилась динамика синтеза белка и синтеза бактериоцина. Наблюдали отставание темпа синтеза бактериоцина и белка от роста культуры на 3 – 5 ч.

1,4 ОП540 с добав лением 1, лев омицетина 1 ОП540 без добав ления 0, ОП лев омицетина 0, 0, 0, 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 Время, ч а 0, 0, колличество белка, мкг 0, Количеств о белка, мкг. без добавления в среду 0, левомицетина Количество белка, мкг с левомицетином в среде б 0, 0, 0, 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 Вре мя, ч б активность, МЕ 3500 Актив ность штамма без добав ления лев омицетина, МЕ/мл Актив ность штамма с добав лением 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 Время, ч в Рис. 5. Влияние левомицетина на рост Lactococcus lactis subsp. lactis штамм 194 (а), синтез белка (б), синтеза бактериоцина (в).

Лиофилизация штамма 194 в защитной среде с криопротекторами обеспечивала сохранность физиолого-биохимических свойств штаммов и стабильность в процессе их хранения (Стоянова и др., 2004).

Выделение и очистка бактериоцина из штамма 194.

Бактериоцины накапливаются в основном в культуральной жидкости, но часть их связана с клеточной стенкой продуцента (Hurst, Drag, 1968;

Brotz et al., 1998). Одним из важнейших условий эффективного извлечения бактериоцина из культуральной жидкости является правильный выбор экстрактанта – органического растворителя, который бы избирательно и полно извлекал его из культуральной жидкости, так и из клеточной стенки.

Для этого проведены исследования по выделению и очистке антибиотического комплекса, продуцируемого L. lactis subsp. lactis штаммом 194.

Таблица Физико-химические и биологические свойства компонентов антибиотического комплекса, образуемого штаммом Lactococcus lactis subsp. lactis 194 в сравнении с коммерческим препаратом низина.

Свойства Компоненты 194-А 194-Б 194-В Низин А Мол. масса, (M+H)+, m/z, 3353** 607,5 619,6 (MALDI-MS) 206,8 (С2Н5ОН) 224,8 (С2Н5ОН) 257,0 215,0 (Н2О) UV-VIS спектр, max, нм, (растворитель) (С2Н5ОН) ТСХ (SiO2), Rf в системе: 0,6 0,42 0,0 0, МеОН–Н2О (96:4) Электрофорез на бумаге* в электролите:

рН=2,4, 550 В, 2 час., см 0,0 0,0 7,6 9, Биологический спектр на на на на действия грамположи- грамположи- грамположи- грамположи тельные, тельные тельные тельные грамотрица- бактерии, бактерии, бактерии, тельныебактер включая включая включая ии и грибы термостойкую термостойкую термостойкую Bacillus Bacillus Bacillus coagulans coagulans. coagulans.

Примечания: */ - представлено расстояние, пройденное веществом от стартовой линии к катоду, в см: «0 см» (на линии старта) - электронейтральное вещество;

«7,6 - 9,5 см» (миграция к катоду) – вещество основного характера.

Антибиотический комплекс был разделен на три основные биологически активные фракции, различающиеся между собой по величине Rf в ряде систем растворителей при ТСХ на силикагеле, а также по электрофоретической подвижности при электрофорезе на бумаге в различных электролитах. В системе метанол:вода (96:4), используя метод ТСХ, фракция 194 Б имела Rf=0,42. Гидрофобный компонент 194-В, совпадал по электрофоретической подвижности со стандартным образцом низина: мигрировал к катоду, обладал основными свойствами, был эффективен только против грамположительных бактерий. Компонент 194-А являлся низкомолекулярным гидрофильным соединением и обладал широким спектром антимикробного действия (табл. 9).

Интерес представляла низкомолекулярная фракция 194-А, которая обладала фунгицидным действием, что является редким свойством для бактерий этого вида. Анализ по изучению структуры всех фракции в компьютерной базе данных биологически активных веществ проф. Берди (Венгрия) показал, что данные вещества являются новыми не описанными ранее природными соединениями, не имеющие аналогов.

Использование активного бактериоцинобразующего штамма 194 как биологического консерванта.

Испытания по использованию активного бактериоцинобразующего штамма 194 для увеличения сроков хранения сырокопченых колбасных изделий: сервелат сырокопченый «Зернистый» ТУ 9213038-510-323-26-03, колбаса сырокопченая «Свиная» ГОСТ 16131-86.

показали (рис. 8), что в опытных образцах, обработанных культуральной жидкостью рост плесени не обнаружен, колбаса по органолептическим показателям (внешний вид, запах, вкус) соответствовала требованиям вышеуказанных нормативных документов.

Штамм Lactococcus lactis subsp. lactis 194 продуцировал бактериоцин, обладающий фунгицидным действием и может быть рекомендован для хранения колбасных изделий.

Из обсемененных колбасных изделий выделен плесневый гриб. Идентификация его классическими микробиологическими методами показала, что данный гриб относится к сумчатым грибам аскомицетам рода Aspergillus (рис. 9).

1 2 Рис. 8. Влияние обработки культуральной жидкостью Lactococcus lactis subsp. lactis 194 на обсемененность колбасных изделий (1 - без обработки;

2 - с обработкой).

На плотном субстрате гриб Aspergillus repens образовывал характерные округлые, пушистые колонии с белым ободком и светло-зеленым центром. Колонии состоят из большого количества ветвящихся нитей, называемых гифами. На свободных концах плодоносящих гифов видны конидии, формирующиеся на поверхности конидиеносца, составляя иногда длинные цепочки наподобие бус.

Стеригма с конидиями споры конидиеносец вегетативные гифы Рис. 9. Конидиеносец и споры плесневого гриба Aspergillus repens Плесневые грибы распространены повсеместно. Особенно много их в почве и в местах с повышенной влажностью. Это объясняет появление гриба на поверхности колбас в процессе хранения в промышленных холодильниках в условиях повышенной влажности и недостаточной циркуляции воздуха в камерах при созревании колбасных изделий.

На рис. 10 показаны зоны ингибирования роста гриба Aspergillus repens штаммами Lactococcus lactis subsp. lactis 194, К-205, 115 и МГУ.

штамм 194 (G-вариант) штамм К-205 штаммМГУ раствор низаплина (4000МЕ/мл) штамм 194 (S-вариант) штамм Рис. 10. Зоны ингибирования штаммов L. lactis subsp. lactis 194, К-205, 115 и МГУ на чашке с тест-организмом Aspergillus repens, выделенный с поверхности зараженных колбасных изделий.

На основании полученных экспериментальных данных можно сделать следующие выводы:

Выводы:

1. Из свежего коровьего молока разных территориальных зон и национального бурятского кисломолочного продукта курунги выделены четыре активных бактериоцинобразующих штамма мезофильных лактококков 115, 194, 229 и К-205 с уровнем активности от 2500 до 3600 МЕ/мл, что значительно превышало уровень активности прежде выделенных природных штаммов лактококков.

2. С использованием классических микробиологических методов и генотипического метода, основанного на анализе сходства нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, штаммы идентифицированы как Lactococcus lactis subsp. lactis Нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК новых штаммов депонированы в базу данных GenBank под следующими номерами: DQ255951 - DQ255954.

3. На примере активного бактериоцинобразующего штамма 194 изучена регуляция синтеза бактериоцина. Оптимизирована ферментационная среда по фосфору, азоту и углеводному компоненту, что позволило, наряду с рН-статированием, увеличить выход бактериоцина на 58,6% (до 6500 МЕ/мл).

4. Из активного штамма 194 выделен антибиотический комплекс, представляющий собой сложную смесь биологически активных компонентов. Основой антибиотического комплекса являлась водо-растворимая фракция В, близкая по Rf и биологическому действию к низину. Средний компонент Б – обладал действием только на грамположительные микроорганизмы. Фракция А - низкомолекулярное гидрофильное соединение, обладающее широким спектром антимикробного действия. Все выделенные компоненты комплекса являются новыми не описанными ранее природными соединениями, не имеющие аналогов в базе данных биологически активных веществ проф. Берди (Венгрия).

5. Показана возможность использования штамма 194, обладающего фунгицидным действием, в качестве консерванта для увеличения срока хранения сырокопченых колбас.

Проведена идентификация плесневого гриба, вызывающего порчу сырокопченых колбас при хранении.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Стоянова Л.Г., Сультимова Т.Д., Нетрусов А.И. Влияние фосфата и углеводов на синтез низина Lactococcus lactis subsp. lactis штамм 194 // Вестн. Моск. Ун-та, 2003, сер. 16, Биология, №4, С. 17-22.

2. Stoyanova L., Netrusov A., Egorov N., Sultimova T. New bacteriocin of Lactococcus lactis subsp. lactis for food safety. International Congress “Poverty Food & Health in Welfare”, July 1-4, Lisbon, Portugal, 2003, p. 121.

3. Стоянова Л.Г., Сультимова Т.Д., Нетрусов А.И. Создание банка лиофильных бактериоцинпродуцирующих молочнокислых бактерий. Материалы международной конференции «Сохранение генетических ресурсов» г. Санкт-Петербург, 19-22 октября, г.// Цитология, 2004, том 46, №10, с. 865-866.

4. Сультимова Т.Д. Синтез бактериоцина Lactococcus lactis subsp. lactis штамм 194.

Тезисы докладов Х1 международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых “Ломоносов-2004”, 12-15 апреля 2004, секция Биология // М., 2004, стр. 149.

5. Stoyanova L.G., Netrusov A.I., Sultimova T.D., Dibirasulaev M.A., Dibirasulaev D.M.

New bacteriocin from fusant strain of Lactococcus lactis for meat preservation. 19th International ICFMH Symposium – FOOD MICRO 2004. September 12 –16, 2004, Slovenia, р.61.

6. Стоянова Л.Г., Сультимова Т.Д. Изучение физиолого-биохимических свойств бактериоцинпродуцирующего штамма 194 Lactococcus lactis subsp. lactis. Тезисы Всероссийсикого симпозиума с международным участием «Биотехнология микробов» 20- октября 2004 г. // М., Изд-во Макс-Пресс, 2004 г., стр. 87.

7. Сультимова Т.Д., Стоянова Л.Г., Ботина С.Г. Скрининг бактриоцинпродуцирующих штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis // Тезисы Молодежной школы-конференции «Актуальные проблемы современной микробиологии», ИНМИ, 1- ноября 2005 г. // М., Изд-во Макс-Пресс, 2005 г. стр. 107.

8. Сультимова Т Д., Стоянова Л.Г., Нетрусов А.И. Изучение антимикробного спектра действия национального молочнокислого напитка курунги // Тезисы из материалов Всероссийского симпозиума с международным участием “Автотрофные микроорганизмы” памяти академика РАН Е. Н. Кондратьевой, МГУ им. М. В. Ломоносова, биологический фак т, 21-24 декабря 2005 г. // М., изд-во Макс-пресс, 2005 г. стр. 45.

9. Сультимова Т.Д., Стоянова Л.Г., Нетрусов А.И. Изучение бактериоцинпродуцирующей активности у диссоциантов нового штамма 194 Lactococcus lactis subsp. lactis. // 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых 17-21 апреля г. // Пущино, 2006 г., стр. 398.

10. Стоянова Л.Г., Сультимова Т.Д., Ботина С.Г., Нетрусов А.И. Выделение и идентификация бактериоцинпродуцирующих штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis из свежего молока // Прикладная биохимия и микробиология, 2006, №5, С. 234-238.

Автор выражает благодарность к. б. н., ст. н. с. Федоровой Г. Б. ГНУ Научно– исследовательского института по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе РАМН за помощь в выделении и изучении физико-химических свойств компонентов антибиотического комплекса.