Получение рекомбинантного человеческого сывороточного альбумина в метилотрофных дрожжах pichia pastoris.
На правах рукописи
БОБИК ТАТЬЯНА ВЛАДИМИРОВНА ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА В МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖАХ Pichia pastoris.
03.00.23 – биотехнология 03.00.04 – биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Москва – 2009
Работа выполнена в лаборатории биокатализа Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.
Научные руководители:
академик РАН, доктор химических наук, профессор Мирошников А. И.
кандидат биологических наук Пономаренко Н. А.
Официальные оппоненты:
доктор химических наук Сергиев П. В.
член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Деев С. М.
Ведущая организация:
Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН
Защита диссертации состоится « » 2009 года, в часов на заседании Совета Д 501.001.59 по защите докторских и кандидатских диссертаций по химическим наукам при МГУ имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Мо сква, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзи мологии, ауд. 202.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан 2009 года
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук_ И.К. Сакодынская
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Проблема борьбы с массивными кровопотерями является актуальной в современной травматологии и гематологии. Лечебные ме роприятия в этих случаях требуют замещения кровопотери, сопровождаются вве дением в организм больного либо цельной донорской крови, либо препаратов из ее отдельных форменных элементов, либо ее основных белковых компонентов.
Белковый состав крови в наибольшей степени представлен человеческим сыворо точным альбумином (ЧСА), а введение этого белка после массивной кровопотери является важной составной частью неотложной терапии. Препарат альбумина ис пользуют в случаях травматического и послеоперационного шока, ожогов, сопро вождающихся дегидратацией и концентрацией крови, гипопротеинемии и гипо альбуминемии, нефротических синдромов, цирроза печени, гемолитической бо лезни новорожденных, отека мозга и др. Препарат ЧСА также находит все боль шее и большее применение в качестве стабилизирующего агента различных ле карственных препаратов и вакцин, его широко внедряют в дерматологическую и косметологическую практику, используют в системе искусственного кровообра щения. В настоящее время препарат ЧСА, получаемый фракционированием плаз мы донорской крови, не может вырабатываться в неограниченных количествах ввиду дефицитности донорской крови. Кроме того, данный способ получения не избежно включает опасность контаминации инфекционными агентами, такими как вирус гепатита, вирус иммунодефицита человека и т.д. Мировая практика по следнего десятилетия демонстрирует тенденцию отказа от препаратов, получае мых из донорской крови, из-за значительного увеличения их себестоимости, вы званного необходимостью применения дорогостоящих тест-систем и использова ния способов глубокой очистки цельной донорской крови и ее отдельных компо нентов. В этой связи экономически оправданными оказываются белковые препа раты факторов крови, полученные с привлечением современных методов генети ческой и белковой инженерии.
Цель работы и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось создание отечественной технологии получения рЧСА, аналога таковому плазмы крови, как альтернативы производству лекарственных препаратов, получаемых путем фракционирования плазмы донорской крови.
Для этого были поставлены следующие задачи:
1. Создание генно–инженерного штамма метилотрофных дрожжей Pichia pastoris, секретирующего рЧСА в культуральную среду.
2. Оптимизация условий культивирования для увеличения уровня экс прессии рЧСА.
3. Подбор условий для оптимальной очистки целевого белка.
4. Исследование структурно-функциональных характеристик получен ного препарата рЧСА.
5. Исследования биологической активности препарата на модельных животных.
Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящее время в мировой практике четко выражена тенденция к замене препаратов, получаемых из донорской крови, на их рекомбинантные аналоги. Такие прототипы, разраба тываемые рядом зарубежных фармацевтических компаний, уже сегодня находят ся на разных стадиях завоевания мирового рынка. Способы получения препарата рЧСА были запатентованы в разных странах и характеризуются различными способами клонирования и экспрессии генов в клетках-продуцентах, штаммовы ми и видовыми характеристиками продуцирующих культур, способами очистки и качеством самого препарата. В то же время до настоящего момента в России пре парат рЧСА не производился. Впервые на территории Российской Федерации был разработан высокоэффективный процесс получения рЧСА, неотличимого по сво им структурно-функциональным свойствам от природного ЧСА, выделяемого из плазмы крови. Данная работа поддержана грантами Минобрнауки и МО РФ и яв ляется составной частью программы правительства Российской Федерации, при званной сократить существующее технологическое отставание России в области производства современных лекарственных средств.
Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 3 статьи, получен 1 патент. Результаты диссертации были представлены на 2 российских кон ференциях: XVIII зимняя молодежная школа «Перспективные направления физи ко-химической биологии и биотехнологии», (2006, Москва, Российская Федера ция);
научная конференция «VIII чтения памяти академика Ю.А.Овчинникова» (2006, Москва, Российская Федерация).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора лите ратуры, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цити руемой литературы. Диссертация изложена на 119 страницах и содержит 16 рисунков и 11 таблиц.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
.
Создание штамма GS115/ЧСА.
Генетическая конструкция, содержащая кДНК гена ЧСА, была получена на основе вектора pPIC9 (Invitrogen). В состав этого вектора включены следующие элементы генома дрожжей Pichia pastoris дикого типа: нуклеотидная последова тельность промотора, нативного терминатора и сигнала полиаденилирования AOX1 гена алкогольгидрогеназы I, нуклеотидная последовательность гена HIS гистидиниолдегидрогеназы и фрагмент нуклеотидной последовательности 3 не транслируемой области AOX1 гена, служащий для интеграции в AOX1 локус. Век тор pPIC9 позволяет клонировать нуклеотидную последовательность целевого белка вместе с собственной сигнальной последовательностью (для секреции экс прессируемых продуктов), а также способен комплементировать ауксотрофность по гистидину у трансформированных им клеток за счет продукта гена HIS4.
Поли (А)+ РНК, выделенная из образцов биопсии клеток печени доноров, была использована в качестве матрицы для реакции обратной транскрипции с олиго(dT18) праймером. Нуклеотидная последовательность проЧСА была ампли фицирована методом ПЦР с полученной кДНК с использованием специфических олигонуклеотидов, комплементарных 5'- и 3'-концам последовательности проЧСА, соответственно, и содержащих сайты эндонуклеаз рестрикции BamHI и NotI. ПЦР-продукт, содержащий последовательность проЧСА, был обработан эн донуклеазами рестрикции BamHI и NotI и, после очистки из агарозного геля, был объединен в реакции лигирования с аналогично рестрицированным вектором pPIC9. Полученной лигазной смесью трансформировали электрокомпетентные клетки штамма E. coli DH5. Первичный скрининг трансформантов проводили при помощи ПЦР c колоний с использованием специфических олигонуклеотидов.
Плазмидные ДНК отобранных положительных клонов, были проанализированы с помощью рестрикцион ного анализа. Нуклеотид ная последовательность, кодирующая альбумин (V00495), была определе на в составе конструкции pPIC9/ЧСА секвенирова нием по методу Сенгера.
ДНК плазмиды pPIC9/ЧСА была линеа ризована по сайтам BglII, и полученным набором фрагментов ДНК были трансформированы клет ки P. pastoris штамма Рис. 1. Схема получения штамма GS115/ЧСА. (A) Рекомбинация между линеаризованной плазмидной GS155 (Invitrogen, США).
ДНК pPIC9/ЧСА и хромосомной ДНК P. pastoris (B) Схема получения штамма Интегрирование нуклеотидной последовательности, кодирующей человеческий сывороточный альбумин в АОХ 1 локус хромосомной ДНК P. pastoris.
GS115/ЧСА представлена на рисунке 1.
В данном случае интеграция нуклеотидной последовательности рЧСА в АОХ 1 локус хромосомной ДНК P. pastoris происходит за счет гомологичной рекомби нации, приводящей к разрушению AOX1 гена. Хотя последовательность оставше гося интактным AOX2 гена более чем на 97% гомологична последовательности гена AOX1, клетки с разрушенным AOX1 геном растут на метанол-содержащих средах значительно более медленно, чем клетки исходного щтамма. Для них при няты обозначения MutS (имеет слабо выраженный рост на метанолсодержащей среде) и Mut+ (имеет фенотип дикого типа).
В результате визуального контроля по росту на чашках со средой, содержа щей метанол или глюкозу (MM- и MD-агар) среди полученных трансформантов было отобрано несколько клонов со слабо выраженным ростом на MM-агаре. (Muts фенотип). Нали чие нуклеотидной последователь ности проЧСА в дрожжевом гено ме было проанализировано при Рис. 2. Электрофореграмма (А) в 1% помощи метода ПЦР с использова агарозном геле продуктов ПЦР полученных при амплификации со специфических оли нием специфических олигонуклео гонуклеотидов, соответствующих 5’- и 3’ тидов. При использовании в каче концам последовательности проЧСА: (2) геномной ДНК штамма GS115 P. рastoris;
стве матрицы геномной ДНК ре (3) - плазмидной ДНК pPIC9/ЧСА;
(4) - ге комбинантных клонов и плазмид номной ДНК рекомбинантного клона;
(1) маркер молекулярных масс (п.о., ной ДНК вектора pPIC9/ЧСА на Fermentas);
.
блюдали амплификацию фрагмен Авторадиограмма (Б) гибридизации по Саузерну радиоактивно меченого фрагмен тов ДНК, соответствующих после та проЧСА, с геномной ДНК клеток штамма довательности проЧСА (рис.2А). В GS115 P. pastoris (1) и рекомбинантного клона (2), обработанной эндонуклеазами случае геномной ДНК штамма рестрикции BamHI и NotI;
(3) – с плазмид GS115 появление фрагмента не на ной ДНК pPIC9/ЧСА обработанной эндо нуклеазами рестрикции BamHI и NotI;
(4) геномная ДНК фага, обработанная эндо нуклеазой рестрикции HindIII.
блюдалось. Интеграция последовательности, кодирующей проЧСА, в геном P.
pastoris была также подтверждена методом гибридизации по Саузерну. Обрабо танная эндонуклеазами рестрикции BamHI и NotI геномная ДНК рекомбинантных клонов была разделена в агарозном геле, перенесена на мембрану и прогибриди зована с радиоактивно меченым фрагментом проЧСА. На полученной авторадио грамме наблюдали появление фрагмента, соответствующего интегрированной в геном последовательности проЧСА (рис. 2Б). В случае геномной ДНК нетранс формированных клеток штамма GS115 P. pastoris этот фрагмент отсутствовал.
Подбор оптимальных условий аналитической экспрессии.
Для аналитической экспрессии было отобрано несколько трансформантов.
Электрофоретический анализ суммарных белков культуральной среды после за вершения 96 часов экспрессии показал появление секреторного белка имеющего подвижность сходную с таковой ЧСА (М~66.5 кДа), в то время как содержание других белков было незначительно (рис. 3).
По результатам денситометрического анализа для дальнейшей работы был выбран клон GS115/ЧСА_5 с наибольшим уровнем экспрессии целевого белка (15 мг/л). Для повышения выхода целевого продук К 1 та оптимизацию экспрессии проводили по следую щим параметрам: подбор состава культуральной среды, и количество индуктора (метанола), вноси Рис. 3. Электрофореграм- мого в среду на протяжении экспрессии (0.5%, 1%, ма в 8% ПААГ суммарных 1.5%). Выращивание и экспрессию клеток клона белков, секретируемых клетками штамма GS115 P. GS115/ЧСА_5 P. pastoris проводили либо на «бо pastoris, трансформирован гатой» среде (BMGY, BMMY) либо на «бедной» ными вектором pPIC9/ЧСА (1, 2), (К) - препарат ЧСА (BMG, BMM), соответственно. «Богатые» среды промышленного производ помимо всех компонентов «бедных» сред содержа ства (Bayer).
ли 1% дрожжевой экстракт и 2% пептон. Метанол добавлялся до выбранного количества каждые 24 часа.
В ходе данных экспериментов было установлено, что максимальный (40 мг/л) уровень экспрессии ЧСА достигается в случае использования среды BMMY (1 % дрожжевой экстракт, 2% пептон, 100 мM фосфат калия pH 6, 1.34% дрожжевая азотной основа, 1.6 мкМ биотин) и при внесении 1% метанола каждые 24 часа.
Оптимизация экспрессии рЧСА в условиях культивирования в фермен тере.
Дальнейшее увеличение уровня секреции рЧСА клетками клона GS115/ЧСА_5 с фено типом Muts было исследовано при культиви ровании в ферментере. При использовании стандартной методики культивирования Рис. 4. Электрофореграмма в дрожжей P.pastoris, уровень продукции белка 8% ПААГ суммарных белков, секретируемых клетками штамма составил 120 мг/л. Экспрессия проводилась в GS115 P. pastoris, трансформиро течение 96 часов с момента индукции, аликво ванными вектором pPIC9/ЧСА, через 18, 24, 36, 48, 56 и 72 часа с ты экспрессионной культуры отбирались каж момента индукции (2-7), (1) дые 24 часа и анализировались с помощью де препарат ЧСА промышленного производства (Bayer). натурирующего электрофореза в 8% ПААГе (рис. 4) с последующей денситометрией геля и Вестерн-блот анализом (данные не приводятся). Вестерн-блот анализ проводился с использованием антител кролика на альбумин человека. Детекцию осуществляли с использованием антивидовых антител, конъюгированных с пероксидазой хрена. Анализ полученных данных выявил закономерность между накоплением секреторного рЧСА и увеличением доли его высокомолекулярных агрегатов и протеолитических фрагментов процес се культивирования. Также было установлено, что, как и в случае аналитической экспрессии, так и в условиях культивирования в ферментере, максимальный уро вень экспрессии достигался на третьи сутки после индукции, а после 96 часов с момента индукции количество рЧСА в культуральной среде резко уменьшалось.
Как показано ранее, протеолитическая деградация различных секретируемых ре комбинантных белков зависит от концентрации в ней ионов аммония (Kobayashi et all., 2000) и от значения рН среды в процессе культивирования (Whittaker et all., 2000). Использование «модифицированной» культуральной среды, содержащей на начальный момент культивирования 0,6 М ионов NH4+, и поддержание рН сре ды в процессе культивирования на уровне 5.8 ± 0.2, позволило нам значительно снизить протеолиз рЧСА и получить 360 мг/л целевого белка через 190 часов по сле момента индукции (рис.5).
Ранее установлено (Ramon et all., 2007), что на уровень экс прессии рекомбинантного белка клетками MutS фенотипа оказы вает влияние введение углевод ной компоненты в культураль ную среду в процессе культиви рования, после индукции экс Рис. 5. Зависимость количества секрети прессии. В качестве углеводной рующегося альбумина штаммами GS115/ЧСА и GS115/ЧСА2 от времени культивирования в компоненты нами был выбран ферментере при различных условиях.
сорбитол. Экспрессия проводи GS115/ЧСА – экспрессия рЧСА клетками штам ма GS115/ЧСА при использовании стандартной лась в культуральной среде, со методики культивирования;
GS115/ЧСА/NH4+ – держащей в начальный момент экспрессия рЧСА клетками штамма GS115/ЧСА с «модифицированной» культуральной средой;
культивирования 0,6 М ионов GS115/ЧСА/СР - экспрессия рЧСА клетками NH4+, с поддержанием рН среды штамма GS115/ЧСА в ферментере с «модифи цированной» средой и введением сорбитола в на уровне 5.8 ± 0.2. Водный рас качестве углеводной компоненты в процессе твор сорбитола начинали пода роста после индукции;
GS115/ЧСА2/СР - экс прессия штамма GS115/ЧСА2 в ферментере с вать в культуральную среду по «модифицированной» средой и введением сор сле первых шести часов с мо битола в качестве углеводной компоненты в процессе роста после индукции.
мента начала подачи метанола с постоянной скоростью 0,5 г/л/час. Экспрессия проводилась в течение 190 часов, аликвоты культуральной жидкости отбирались каждые сутки и анализировались с помощью денатурирующего электрофореза в 8% ПААГе. Денситометрический анализ полученной электрофореграммы показал, что уровень экспрессии рЧСА составил 1 г/л (рис.5).
Создание штамма GS115/ЧСА2.
Ранее было показано, что увеличение уровня экспрессии может быть достиг нуто путем введения в геном P. pastoris дополнительных копий гена рекомби нантного белка (Huang et all., 2006). Для создания штамма, содержащего две ко пии кДНК гена альбумина в геноме, была получена генетическая конструкция pPICZA/ЧСА на основе вектора pPICZA (Invitrogen). Этот вектор содержит следующие элементы: промотор AOX1 гена, нативный терминатор и сигнал поли аденилирования AOX1 гена дрожжей Pichia pastoris дикого типа, последователь ность гена Sh ble, продукт которого обеспечивает устойчивость трансформантов к зеоцину. Также, этот вектор позволяет клонировать нуклеотидную последова тельность целевого белка вместе с собственной сигнальной последовательностью (для секреции экспрессируемых продуктов).
Фрагмент ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность проЧСА, был амплифицирован методом ПЦР с полученной ранее генетической конструк ции pPIC9/ЧСА с использованием специфических олигонуклеотидов, содержащих сайты эндонуклеаз рестрикции HindIII и NotI, соответственно. ПЦР-продукт, со ответствующий нуклеотидной последовательности проЧСА, был обработан эн донуклеазами рестрикции HindIII и NotI и после очистки из агарозного геля был объединен в реакции лигирования с аналогично рестрицированным вектором pPICZA. Полученной лигазной смесью трансформировали электрокомпетентные клетки штамма E. coli DH5. Отбор и анализ клонов проводили, как описано вы ше для pPIC9/ЧСА. ДНК плазмиды pPICZA/ЧСА была линеаризована по сайту SacI, и полученным набором ДНК-фрагментов были трансформированы клетки штамма GS155/ЧСА_5 P. pastoris. Схема получения штамма GS115/ЧСА2 пред ставлена на рис. 6.
Рис. 6. Схема создания штамма GS115/ЧСА2. (А). Рекомбинация между ли неаризованным вектором pPICZA/ЧСА и хромосомной ДНК P. pastoris. (В). Ин тегрирование второй копии нуклеотидной последовательности, кодирующей ЧСА, в АОХ 1 локус хромосомной ДНК P. pastoris.
Полученные трансформанты были тестированы на Mut+ или Muts фенотип, и среди них были отобраны клоны со слабо выраженным ростом на метанолсодер жащей среде с зеоцином.
Встраивание второй копии нуклеотидной последовательности проЧСА в дрожжевой геном было проанализировано при помощи метода ПЦР с использова нием специфических олигонуклеотидов (рис. 7а). В результате ПЦР с геномной ДНК рекомбинантных клонов и вектора pPICZA /ЧСА образовывались фрагмен ты ДНК размером около 3500 п. о., отсутствующие в случае использования в ка честве матрицы геномной ДНК штамма GS115/ЧСА. (рис. 7б).
Количество интегрированных копий кДНК гена ЧСА было оценено с помо щью ПЦР в режиме реального времени. Частично фрагментированная геномная ДНК рекомбинантных клонов, клеток штаммов GS155/ЧСА и GS155 P. pastoris была использована в качестве матрицы в ПЦР в режиме реального времени со специфическими олигонуклеотидами к последовательности кДНК гена ЧСА. В качестве внутреннего контроля была выбрана нуклеотидная последовательность гена аргининосукцинатлиазы ARG4 генома P. pastoris.
Рис. 7. Анализ интеграции второй копии гена ЧСА при помощи ПЦР: а - уча сток ДНК дрожжевого генома рекомбинантных клонов, амплифицирующийся в результате ПЦР с использованием специфических олигонуклеотидов Р4 и Р5;
б электрофореграмма в 0.8 % агарозном геле продуктов ПЦР полученных при ам плификации со специфических олигонуклеотидов, соответствующих 3’- и 5’ концам последовательности ЧСА: (1) - плазмидной ДНК pPICZA/ЧСА;
(2, 3) геномной ДНК рекомбинантных клонов;
(4) - геномной ДНК штамма GS115/ЧСА P. рastoris;
(М) - маркер молекулярных масс (п.о., Fermentas).
Для расчета эффективности образования ПЦР-продукта для каждой пары специфических олигонуклеотидов ЕHSA и ЕARG4 определяли значение порогового цикла С(Т) в серии ПЦР с последовательным разведением субстрата (Р0 = 16, 8, 4, 2 и 1 нг). Эффективность составила ЕHSA = 1.9 и ЕARG4 = 1.8. Количество копий кДНК гена ЧСА в рекомбинантных клонах было рассчитано относительно коли чества копий в геноме клеток штамма GS155/ЧСА P. pastoris как R = 2*EC(T)1 C(T) n, где С(Т)1 и С(Т)n – это средние значения пороговых циклов для ПЦР с ге номной ДНК клеток штамма GS155/ЧСА и рекомбинантных клонов соответст венно. Отрицательным контролем служила геномная ДНК клеток штамма GS P. pastoris. Согласно полученным данным рекомбинантные клоны содержат в своем геноме 3 или 4 интегрированные копии кДНК гена ЧСА в расчете на дип лоидный геном, в то время как исходный штамм GS115/ЧСА – две. Количество копий гена ARG4 было одинаково во всех образцах и составляло две единицы в расчете на диплоидный геном.
Для аналитической экспрессии было отобрано несколько клонов. По резуль татам денситометрического анализа результатов аналитической экспрессии для дальнейшей работы был выбран клон GS115/ЧСА2_3 с наибольшим уровнем экс прессии целевого белка (60 мг/л). В условиях культивирования в ферментере при использовании «модифицированного» протокола экспрессии (содержание 0,6 М ионов NH4+ в начальный период культивирования, поддержание рН среды на уровне 5.8 и введение в качестве углеводной компоненты сорбитола в культу ральную среду после индукции экспрессии) уровень экспрессии целевого белка составил 1.4 г/л (рис. 5).
Разработка схемы очистки рЧСА из культуральной жидкости.
Схема многостадийной очистки получаемого препарата рЧСА представлена в таблице 1. Указанная последовательность стадий была выбрана как наиболее ко роткая по времени и, одновременно с этим, обеспечивающая наилучшую чистоту белка при максимальном выходе. Данная методика позволяет получать рЧСА, не содержащий детектируемых ДСН-ПААГ посторонних примесей, с выходом около 39%. По данным хроматографического анализа (ВЭЖХ) получаемый таким обра зом рЧСА содержит не более 15% димерной и не более 0.8% полимерной формы рЧСА. Определение суммарного содержания углеводов в препарате показало, что исследуемый препарат практически не содержит примесей гликозилированной формы рЧСА (0,1 %).
Также были опробованы следующие последовательности стадий:
• «термокоагуляция - обработка кислотой – ультрафильтрация – катионооб менная хроматография – анионообменная хроматография - гидрофобная хромато графия – ультрафильтрация – добавление стабилизаторов”, • «ультрафильтрация - термокоагуляция - обработка кислотой – катионооб менная хроматография – гидрофобная хроматография – осаждение в изоточке анионообменная хроматография - ультрафильтрация – добавление стабилизато ров”, Табл. 1. Схема очистки препарата рЧСА.
Доля Углево Выход мономера ды мкг Стадия очистки стадии по Цель проведения стадии очистки рЧСА по на мг ВЭЖХ, % ВЭЖХ, % рЧСА Удаление крупных агрегатов посторон Ультрафильтрация на них белков, удаление компонентов рос мембранах 300 и товой среды, концентрирование кДа, диафильтрация раствора, обессоливание.
- 97,5* Нагревание, Коагуляция посторонних примесей при обработка кислотой, тепловой и кислотной денатурации.
центрифугирование - 78* Отделение остаточных посторонних Катионообменная примесей, диссоциация мультимеров хроматография, рЧСА, образовавшихся при нагревании и обработка обработке кислотой, путем инкубации в тетраборатом натрия 73 79 30 слабощелочной среде.
Гидрофобная Удаление гликозилированной формы хроматография 81 88 5,8 рЧСА, не связывающейся с колонкой.
Удаление мультимеров и части димера Анионообменная рЧСА, связывающихся с аниообменным хроматография, сорбентом, и последующее концентри высаливание 86 96 5,3 рование раствора высаливанием.
Финальное Дальнейшее концентрирование концентрирование и очищенного рЧСА удаление солей, диафильтрация, введение стабилизаторов для добавление долговременного хранения стабилизаторов. 86 77 5,0 стерилизованного раствора.
Примечание: * - определение количества рЧСА проводили по денситометрии электрофо реграммы.
• «ультрафильтрация - термокоагуляция - обработка кислотой – катионооб менная хроматография – гидрофобная хроматография – осаждение в изоточке анионообменная хроматография - ультрафильтрация – добавление стабилизато ров”, • «ультрафильтрация - термокоагуляция - обработка кислотой – анионооб менная хроматография - катионообменная хроматография – гидрофобная хрома тография – осаждение в изоточке - ультрафильтрация – добавление стабилизато ров”, • «ультрафильтрация - термокоагуляция - обработка кислотой – анионооб менная хроматография - катионообменная хроматография – осаждение в изоточке - гидрофобная хроматография - ультрафильтрация – добавление стабилизаторов”.
Все вышеперечисленные способы построения процесса очистки приводили к получению рЧСА приблизительно сходной чистоты, но с существенно более вы соким содержанием димера и мультимеров.
Структурно-функциональные исследования рЧСА.
Данные, полученные при определении N-концевой аминокислотной последо вательности рЧСА (DAHKSEV…) позволяют утверждать, что в процессе секре ции происходит корректное отщепление сигнальной последовательности.
Для подтверждения идентичности первичной структуры полученный реком бинантный белок и его триптический гидролизат были охарактеризованы масс спектрометрически. Молекулярная масса белка определенная методом TOF MALDI составила 66572.6 Да (теоретически рассчитанная – 66504.27 Да). Масс спектрометрический анализ набора триптических пептидов для исследуемого белка позволил определить 15 пептидов, принадлежащих ЧСА. Пептидов, не при надлежащих последовательности ЧСА, при анализе обнаружено не было. Таким образом, исследованная часть аминокислотной последовательности анализируе мого белка полностью идентична ЧСА. Известно, что идентичность вторичных структур рекомбинантного белка и его природного аналога является одним из критериев функциональной активности биотехнологического продукта.
Для подтверждения того, что выделенный рекомбинант ный аналог находится в нативной конформации, был проведен сравнительный анализ спектров кругового дихроизма рекомби нантного белка и альбумина, вы деленного из сыворотки донор Рис. 8. Спектры КД природного (1) и рекомбинантного препаратов (2) в области ской крови. Полученные резуль 250-190 нм. Концентрация белков состав таты позволяют утверждать, что ляла 1.03 мг/мл в 25 мМ фосфатном буфе ре (рН 7.4). вторичная структура рекомби нантного альбумина идентична таковой альбумину плазмы крови человека (рис.
8).
Содержание - и -структур в рекомбинантном альбумине, рассчитанное с помощью программ CONTINLL, CDSSTR и SELCON3 составило 58,9±1,9% спиралей, 4,5±0,5% -слоев и 13±1,2% -изгибов, что согласуется с результатами полученными ранее другими исследователями для природного препарата альбу мина (Wetzel et all., 1980).
ЧСА содержит в своей аминокислотной последовательности 35 остатков цис теина, 34 из которых замкнуты в 17 дисульфидных связей, стабилизирующих тре тичную структуру альбумина. Свободная тиоловая группа цистеина (34Cys) обес печивает около 80% восстановительного потенциала плазмы крови и доступна для ацилирования, нитрозилирования и образования смешанных дисульфидов. В нор ме в плазме крови лишь около 60% ЧСА находится в восстановленной форме, на зываемой меркаптоальбумином. Нами было определено процентное соотношение меркаптоальбумина в препарате ЧСА плазмы крови “Плазмальбумин” (Baxter, США) и полученного рекомбинантного альбумина (табл. 2). Полученные резуль таты показали сходное содержание меркаптоальбумина в анализируемых препа ратах. Несколько пониженное содержание меркаптоальбумина в обоих препара тах может быть связано с образованием дисульфидных связей между альбумином и тиолсодержащими соединениями, используемыми в процессе выделения и очи стки альбумина.
Табл. 2. Процентное содержание меркаптоальбумина в препарате ЧСА плаз мы крови и полученного рекомбинантного альбумина.
Препарат ЧСА Меркаптоальбумин, % “Плазмальбумин” 40,5 ± 2, рЧСА 46,7 ± 3, Катализ является одной из наиболее эволюционно совершенных функций белковой молекулы. Соответствие каталитических характеристик рекомбинантно го белка и его природного аналога является прекрасным свидетельством в пользу адекватного фолдинга и других функциональных свойств биотехнологического продукта. Ранее было показано, что ЧСА обладает слабой эстеролитической ак тивностью (Kurono et all., 1996). Для подтверждения корректности третичной структуры рекомбинантного ЧСА была определены константы псевдо-первого порядка скорости гидролиза пара-нитрофенилацетата (Кнаб.), катализируемых рЧСА и ЧСА, выделенного из донорской крови. Численные значения Кнаб. соста вили (5,55±0,9)10-3 сек-1 и (6,03±0,7)10-3 сек -, соответственно. Полученные данные указывают на соответствие третичных структур исследуемых белков, выраженное в идентичности формирования их каталитических центров.
Важной характеристикой био логической активности рЧСА с точ ки зрения его транспортных функ Рис. 9. Зависимость сигнала флуорес- ций является определение констан ценции от количества добавленного били ты связывания белка с билируби рубина. R – отношение концентраций били рубина и альбумина, F/F0 - отношение сиг- ном. Чтобы охарактеризовать пара нала флуоресценции в присутствии билиру метры связывания рЧСА с билиру бина к сигналу в его отсутствии.
бином фиксированное количество белка (1 мкМ) титровали возрастающими коли чествами билирубина (рис. 9). Полученная изотерма связывания (y = -0,55x + 0,9578, R2 = 0,98) была линеари зована в координатах Скэтчарда (рис. 10).
Значение Ка, рассчитанное по тангенсу угла наклона пря мой в координатах Скэтчарда, составило (4,7 ± 0,7)107 М-1, что соответствует данным, по Рис. 10. Изотерма связывания, линеари лученным для альбумина, вы зованная в координатах Скэтчарда. Q – расчет ная величина, равная (F0-F)/(F0-F1), где F0 – деленного из плазмы крови сигнал флуоресценции в отсутствии билируби (Mateen et all., 2002).
на, F1 – сигнал флуоресценции при R = 1, B – концентрация несвязанного билирубина.
Исследования биологической активности препарата рЧСА.
Для апробации полученного препарата рЧСА была избрана модель острой кровопотери на крысах. Основным критерием терапевтической активности препарата рЧСА в сравнении с препаратом ЧСА, полученным из донорской крови, являлась комплексная оценка состояния подопытных животных по гема тологическим и биохимическим характеристикам. Замещение кровопотери про водили 10 % раствором донорского альбумина в сочетании с физиологическим раствором в соотношении 1:3 (контрольная группа) и 10 % раствором рЧСА в сочетании с физиологическим раствором в соотношении 1:3 (опытная группа).
Определение гематологических показателей у подопытных животных после за мещения острой массивной кровопотери свидетельствует о том, что тенденции восстановления функций крови в обеих группах были идентичны (табл. 3). По сле кровопотери при сниженном количестве гемоглобина развивается компен саторная реакция организма, направленная на увеличение переноса количества газов единицей объема крови. Эта реакция выражалась в увеличении насыще ния эритроцитов гемоглобином и увеличении среднего объема эритроцита и проявлялась в той или иной степени у всех групп животных обеих групп (табл.
3). Анализ исследования красных клеток крови крыс после замещения острой массивной кровопотери рЧСА свидетельствует о способности препарата стиму лировать компенсаторные системы организма на восстановление таких важных показателей крови, как количество эритроцитов и гемоглобин. Анализ пред ставленных данных свидетельствует об отсутствии достоверных изменений между контрольной и опытной группами и указывает на наличие лечебной эф фективности рЧСА.
Табл. 3. Гематологические показатели крови крыс после замещения острой массивной кровопотери в контрольной и опытной группах животных.
После трансфузии До крово Показатели потери через 2 часа через сутки 36,0±0,65 31,6±1, контрольная группа Гематокрит, % 6±0, 33,1±1,64 29,2±1, опытная группа 107,3±1,57 100,5±1, Содержание контрольная группа 149,7±1, гемоглобина, г/л 119,0±3,54 117,1±4, опытная группа 4,52±0,188 4,25±0, Количество контрольная группа 6,42±0, эритроцитов, 1012/л 4,54±0,222 4,56±0, опытная группа 32,9±1,25 38,3±1, Концентрация гемоглобина контрольная группа 32,9±0, в эритроците, % 29,85±0,54 31,8±0, опытная группа 74,6±3,29 67,6±3, Средний объём контрольная группа 72,4±0, эритроцита, мкм3 80,3±2,09 76,0±4, опытная группа 29 6 Число наблюдений, n Биохимические исследования имеют диагностическое значение в случае ис пытания нового препарата, особенно белкового происхождения. Полученные дан ные по изучению биохимических показателей сыворотки крови крыс указывают на то, что рЧСА способен восстанавливать белковый баланс организма в течение 24 часов наблюдения (табл. 4).
Общеклинические исследования мочи крыс, перенесших замещение мас сивной кровопотери, характеризуют функциональную способность почек и со стояние внутренних органов. Показатели деятельности почек крыс после заме щения кровопотери также были схожи в обеих исследуемых группах (табл. 5).
Табл. 4. Биохимические показатели сыворотки крови крыс после замещения острой массивной кровопотери.
Через сутки после кровопотери Показатель До кровопотери контрольная группа опытная группа Мочевина, ммоль/л 4,6±0,329 6,62+0,991 5,3±0, Креатинин, ммоль/л 0,034±0,0026 0,045+0,008 0,056±0, Глюкоза, ммоль/л 6,64±0,428 7,45+ 0,969 8,18±0, Натрий, ммоль/л 140,5±1,09 140,2+1,48 140,4±0, Кальций, ммоль/л 1,263±0,0274 1,255+0,0456 1,262±0, Общий белок, г/л 74,05±1,766 77,2+2,72 72,55±0, Число наблюдений, n 18 6 Табл. 5. Показатели функции почек крыс после замещения острой массив ной кровопотери.
Через сутки после кровопотери Показатель До кровопотери контрольная группа опытная группа Билирубин, ммоль/л 7,5±1,11 7,5±1,45 6±5, Удельный вес, г/л 1,022±0,0011 1,024±0,024 1,026±0, pH 7,5±0,15 7,0±0,32 7,1±0, Белок, г/л 0,546±0,0744 0,983±0,274 0,611±0, Лейкоциты, WBC/л 16,6±5,58 3,05±1,21 3,3±2, Суточный диурез, мл 6,06±1,042 8,32±1,807 6,5±1, Число наблюдений, n 15 6 Таким образом, представленный материал подтверждает способность рЧСА восстанавливать гемодинамические нарушения организма, активно участвовать в восстановлении белкового обмена, способствовать нормализации гематологиче ских характеристик. В результате проведенных экспериментальных исследова ний по изучению специфической активности рЧСА подтверждена возможность применения его в качестве трансфузионного фармакологического препарата с целью ликвидации патологических нарушений, связанных с острой массивной кровопотерей.
ВЫВОДЫ 1. Создан штамм метилотрофных дрожжей Pichia pastoris секретирующий человеческий сывороточный альбумин в культуральную среду.
2. Подобраны оптимальные условия экспрессии ЧСА в условиях культиви рования в ферментере, позволяющие достигнуть уровня экспрессии целе вого белка 1.4 г/л.
3. Разработана схема многостадийной очистки препарата рЧСА, которая по зволяет получать рЧСА с выходом около 39%, содержащего не более 15% димерной и не более 0.8% полимерной формы рЧСА.
4. Показано, что по своим структурным характеристикам, каталитической активности и лиганд-связывающим свойствам получаемый препарат рЧСА неотличим от природного ЧСА, выделяемого из плазмы крови.
5. В результате проведенных экспериментальных исследований по изучению восстановлению функций крови после замещения острой массивной кро вопотери у крыс подтверждена возможность применения полученного препарата рЧСА в качестве трансфузионного фармакологического препа рата.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
:
1. Козырь А.В., Бобик Т.В., Игнатова А.Н., Колесников А.В. (2004). Про дукция Fab-фрагмента ДНК-гидролизующего антитела BV04-01в ме тилотрофных дрожжах Pichia pastoris. Молекулярная биология, 38(6), 1067-75.
2. Бобик Т.В., Воробьев И.И., Пономаренко Н.А., Габибов А.Г., Мирош ников А.И. (2008). Экспрессия человеческого сывороточного альбу мина в метилотрофных дрожжах Pichia pastoris и его структурно функциональный анализ. Биоорган. химия, 34, 56-62.
3. Бобик Т.В., Воробьев И.И., Пономаренко Н.А., Габибов А.Г., Мирош ников А.И. (2008). Высокоэффективный процесс получения рекомби нантного человеческого сывороточного альбумина и его структурно функциональный анализ. Биотехнология, 4, 43-54.
4. Воробьев А.И., Мирошников А.И., Габибов А.Г., Воробьев И.И., Костро мина Т.И., Пономаренко Н.А., Бобик Т.В., Ажигирова М.А., Карякин А.В., Коротаев Г.К. Патент RU 2337966 C2 Российская Федерация, 07.08.2006.
5. Бобик Т.В., Пономаренко Н.А., Мирошников. Получение рекомбинант ного человеческого сывороточного альбумина в эукариотической систе ме. Доклад. XVIII зимняя молодежная школа «Перспективные направле ния физико-химической биологии и биотехнологии», 7-10 февраля (2006), Москва, Российская Федерация. Сборник тезисов, с. 23.