Количественные закономерности проявления адаптивной реакции и радиационного гормезиса у популяций дрожжевых клеток
На правах рукописи
ГОРШКОВА Татьяна Александровна КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ПРОЯВЛЕНИЯ АДАПТИВНОЙ РЕАКЦИИ И РАДИАЦИОННОГО ГОРМЕЗИСА У ПОПУЛЯЦИЙ ДРОЖЖЕВЫХ КЛЕТОК 03.00.01 – радиобиология и 03.00.16 - экология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Обнинск – 2007 Диссертация выполнена в биофизической лаборатории Отдела исследования комбинированных воздейст вий ГУ «Медицинский радиологический научный центр Российской академии медицинских наук» Научные руководители:
доктор биологических наук, профессор Петин Владислав Георгиевич;
кандидат биологических наук Комарова Людмила Николаевна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук Борейко Алла Владимировна доктор биологических наук, профессор Сынзыныс Борис Иванович
Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной ра диологии и агроэкологии Россельхозакадемии
Защита диссертации состоится 24 апреля 2007 г. в 11.00 час.
на заседании диссертационного совета Д 001.011.01 при ГУ «Медицинский радиологический научный центр Российской академии медицинских наук» по адресу: 249036, Калужская обл., г. Обнинск, ул. Коро лёва, 4.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ–МРНЦ РАМН
Автореферат разослан 21 марта 2007 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Палыга Г.Ф.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования. В современной радиобиологии и радиоэкологии наиболее акту альным направлением в настоящее время является изучение эффектов малых доз. Это определяется рас ширением сфер использования ионизирующих излучений в промышленности и медицине и, следователь но, связано с необходимостью реальных оценок последствий радиационных аварий для больших когорт населения, а также для природных сообществ значительных регионов планеты. Проблема малых доз атомной радиации возникает при экстремальных ситуациях, приводящих к радиоактивному загрязнению больших территорий, также она является актуальной для рабочих урановых рудников, предприятий по переработке урановых руд, получению вторичного ядерного горючего, отработке отходов АЭС. В связи с этим закономерности действия ионизирующего излучения как природного, так и антропогенного эколо гического фактора, на биологические объекты требуют детального изучения на всех уровнях организации биологических систем. Многочисленные накопленные в литературе факты о биологическом воздействии ионизирующей радиации в малых дозах свидетельствуют как о позитивном (Кузин, 1995), так и о нега тивном их влиянии на ранние и отдаленные эффекты у облученных клеток, организмов, популяций, со обществ (Зайнуллин, Таскаев, 2005). До настоящего времени отсутствует целостное представление о ме ханизмах, формирующих эффекты малых доз (Эйдус, 1996;
Боднарчук, 2002). Спектр реакций на облуче ния у многоклеточных организмов во многом определяется индивидуальными особенностями функцио нирования их иммунной и других надклеточных систем (Liu, 2003), тогда как изучение данной проблемы на одноклеточных организмах, к которым относятся использованные в настоящей диссертационной рабо те дрожжи Saccharomyces cerevisiae, позволяет вычленить закономерности и механизмы действия малых доз облучения, проявляющиеся на клеточном и популяционном уровнях. Для одноклеточных организмов, менее радиочувствительных чем многоклеточные, эволюционировавших в условиях на порядки менявше гося радиационного фона, мало изучены диапазоны доз и мощностей доз, вызывающих эффекты горме зисного увеличения сроков жизни клеток и их адаптивной реакции на последующее облучение. В связи с этим актуальной представляется также оценка вклада генотипа клеток в характер их реакции на облуче ние, изучение особенностей динамики гибели и размножения клеток, подвергшихся облучению, исследо вание совместного действия на клетки ионизирующей радиации и другого экологического фактора – тем пературы, определение роли радиорезистентности отдельных клеток в устойчивости к облучению кле точной популяции в целом.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы является выявление количественных закономер ностей формирования эффектов радиационного гормезиса и адаптивного ответа у дрожжевых клеток под действием острого и пролонгированного облучения.
Для достижения данной цели необходимо решить следующие задачи:
1–изучить закономерности динамики отмирания дрожжевых клеток после однократного острого облу чения в малых и больших дозах;
2–исследовать зависимость изменения динамики отмирания клеток в облученных и контрольных по пуляциях от дозы облучения и температуры инкубирования;
3–оценить зависимость отмирания клеток после облучения от их способности репарировать радиаци онные повреждения ДНК;
4–установить зависимость степени проявления адаптивной реакции популяции клеток в логарифмиче ской фазе развития от мощности дозы предварительного пролонгированного облучения и от величины дозы острого адаптирующего воздействия;
5–выявить величины диапазонов доз и мощностей доз предварительного облучения, вызывающих по следующий адаптивный ответ у Saccharomyces cerevisiae, 6–выяснить зависимость величины адаптивного ответа от временнго интервала между облучениями в адаптирующей и тестирующей дозах;
7–подтвердить важность непрерывного хронического воздействия естественного радиационного фона как экологического фактора в экспериментах по отмиранию дрожжевых клеток при снижении интенсив ности фонового излучения.
Научная новизна работы.
– Впервые получены данные о замедлении скорости отмирания клеток Saccharomyces cerevisiae, остро и пролонгированно облученных в различных дозах, в том числе вызывающих гибель значительной части клеток популяции, и инкубированных в непитательной среде;
– показаны увеличение скорости гибели клеток Saccharomyces cerevisiae при 30-кратном снижении ра диационного фона и замедление отмирания клеток в популяции при хроническом воздействии ионизи рующей радиации с мощностями доз, на порядки превосходящими фоновые значения;
– проведено сравнительное изучение влияния генотипических особенностей дрожжевых клеток раз ных штаммов, инкубированных при различных температурах, на изменение сроков их гибели после воз действия облучения. Отмечено возможное участие немишенных, не связанных с повреждением молекулы ДНК событий в проявлении гормезисного замедления отмирания клеток;
– установлены границы диапазона доз и мощностей доз, вызывающих адаптивный ответ дрожжевых клеток на последующее облучение. Обнаружено существование адаптивной реакции у клеток, выживших после предварительного облучения как в малых, так и в высоких дозах, вызывающих гибель значитель ной части популяции.
Практическая значимость. Полученные экспериментальные данные могут иметь практическую зна чимость для прикладной радиобиологии, радиоэкологии, медицинской радиологии, а также для прогно зирования отдаленных последствий облучения. Обнаруженные и описанные в данной работе эффекты могут иметь значение для разработки математических моделей динамики развития популяций организ мов, отличающихся высокой радиорезистентностью, в ответ на действие природных или вызванных ан тропогенно повышенных уровней радиации. Результаты работы имеют также фундаментальное значение, дополняя современный уровень представлений об особенностях и вероятных механизмах таких эффектов малых доз, как гормезисное увеличение средней продолжительности жизни и адаптивный ответ.
Структура и объем диссертации.
Работа изложена на 154 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, главы, содержащей результаты экспериментальных иссле дований, обсуждения результатов исследования, выводов и списка литературы, содержащего 228 источ ников, из которых 90 опубликованы на русском языке и 138 – на английском. Результаты работы иллюст рированы 8 таблицами и 34 рисунками.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на III Международной научно-практической конференции «Медико-дозиметрические регистры – основа регламентации радиационной безопасности профессионалов и населения» (Омск, 2004), XL научных чтениях памяти К.Э.Циолковского (Калуга, 2005), V съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2006), IX Российской научной конференции «Радиационная защита и радиационная безопасность в ядерных технологиях» (Обнинск, 2006).
Диссертация апробирована на заседании кафедры биологии Обнинского Государственного Техниче ского Университета Атомной Энергетики (ИАТЭ) 13 декабря 2006 г. и на межлабораторной научной конференции экспериментального радиологического сектора ГУ-МРНЦ РАМН 21 декабря 2006 г.
Основные положения, выносимые на защиту:
– проявление радиационного гормезиса по критерию уменьшения скорости отмирания клеток в попу ляциях после облучения в малых и больших дозах ионизирующего излучения у дрожжей различных гено типов, инкубированных при нескольких температурах;
– зависимость выраженности адаптивного ответа облученных популяций дрожжевых клеток от вели чины, мощности адаптирующей дозы, временнго интервала между облучениями;
– возможность проявления адаптивного ответа клетками, облученными в высоких дозах или с высоки ми мощностями доз, вызывающими остановку размножения и гибель части клеток популяции.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объект исследования. В данной работе были использованы следующие штаммы Saccharomyces cere visiae: диплоидный штамм дикого типа Т1 (RAD/RAD), радиочувствительный мутант Т4 (rad2/rad rad54/rad54), дикий диплоидный штамм XS800 (RAD/RAD) и мутантный по репарации радиационных по вреждений штамм XS1898 (rad52-1/rad52-1). В качестве биологического теста была выбрана выживае мость, определяемая по способности клеток образовывать макроколонии при 30 оС на плотной питатель ной среде в чашках Петри.
Источники ионизирующего излучения и условия облучения. В работе использовали -излучение изотопов 60Со (установки «Исследователь» с мощностью дозы порядка 3300 Гр/ч, «Луч» с мощностью до зы от 10-2 до 70 Гр/ч, «Фотон» с мощностью дозы 10-6 – 10-5 Гр/ч) и 137Cs (установка «Панорама» с мощ ностью дозы 10-4 – 10-2 Гр/ч). Варьирьвание мощности дозы на установках «Луч», «Панорама», «Фотон» осуществляли изменением расстояния от источника. На установке «Исследователь» давали только острые дозы свыше 20 Гр. Острое облучение производили при комнатной температуре, время острого воздейст вия составляло от нескольких секунд до 25 мин. Пролонгированное воздействие ионизирующего облуче ния, продолжительность которого в зависимости от условий опыта варьировало от 2,5 - 24 ч до 30 сут., осуществляли с использованием суховоздушного термостата с температурой 30 оС. Контрольные суспен зии во время облучения подопытных образцов находились в аналогичных температурных условиях при фоновых значениях ионизирующей радиации, составлявших в среднем около 10-7 Гр/ч. В опыте по изуче нию влияния пониженного радиационного фона на отмирание клеток использовали специальную низко фоновую камеру, изготовленную из свинца, выплавленного до начала эпохи ядерных испытаний. Камера, вмещавшая пробы, помещенные в термостат с температурой 30 оС, обеспечивала снижение мощности до зы редкоионизирующего компонента естественного радиационного фона до 0,3·10-8 Гр/ч.
Методика и условия экспериментов. В многодневных опытах по изучению старения и отмирания дрожжевых клеток использовали клеточные суспензии на основе дистиллированной воды с начальной концентрацией клеток порядка 106 клеток/мл, которую определяли при помощи камеры Горяева. После острого облучения, термостатирования при t=30, 37 и 40 оС, либо хронического облучения при темпера туре 30 оС осуществляли разведение суспензий и посев клеток в чашки Петри на поверхность плотной питательной среды. В опытах по исследованию действия 24-часового адаптирующего облучения на по пуляции клеток, находящиеся в логарифмической фазе роста, использовали клеточные суспензии в жид кой питательной среде состава: 2 % глюкозы, 0,2 % дрожжевого экстракта, 1 % пептона, 96,8 % дист. во ды. Начальная концентрация клеток, подобранная с использованием камеры Горяева, составляла 102 – клеток/мл в зависимости от условий облучения, определявших степень размножения и гибели клеток.
После прекращения пролонгированного облучения концентрации размножившихся клеток составляли – 107 клеток/мл суспензии. Для последующего острого облучения концентрацию клеток в пробах по не обходимости доводили до уровня 106 клеток/мл, разбавляя суспензию достаточным количеством свежей жидкой питательной среды. После облучений и соответствующих разведений в дистиллированной воде клетки высевали в чашки Петри на поверхность плотной питательной среды. В экспериментах с острым и 2,5 – 5-часовым пролонгированным адаптирующим воздействием ионизирующего излучения на расту щие популяции Saccharomyces cerevisiae клетки культивировали в течение 7 – 8 ч при температуре 30 оС для достижения ими середины логарифмической фазы. Концентрация клеток в питательной среде состав ляла не больше 106 клеток/мл суспензии. Клетки облучали адаптирующими дозами и помещали на вос становление в термостат с температурой 30 оС. Спустя 1 – 24 ч концентрации размножившихся в жидкой питательной среде клеток приводили к уровню 106 клеток/мл и облучали тестирующими острыми доза ми. Учет выживаемости клеток осуществляли по описанному выше методу макроколоний.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Закономерности замедления отмирания облученных дрожжевых клеток Эксперименты проводили на клетках диких и мутантных по способности к репарации штаммов, вы держиваемых после облучения в дистиллированной воде при температурах 30, 37 и 40 оС.
На рис. 1 представлены кривые отмирания облученных и интактных клеток дикого штамма Т1 в непи тательной среде. Из рис. 1.А видно, что острое облучение дрожжей в дозе, снижающей выживаемость клеток до 75 %, приводило к значительному замедлению скорости отмирания выживших после облучения клеток по сравнению с необлученным контролем. Это видно как по увеличению «плеча» на кривых отми рания, т. е. продолжительности накопления субповреждений, неэффективных для гибели большей части клеток популяции, так и с уменьшением наклона экспоненциальных участков этих кривых. На рис. 1.Б выживаемость клеток, переживших облучение, нормирована к 100 %. При такой форме сопоставления кривых выживаемости становится возможным анализ эффективности воздействия ионизирующего излу чения для гормезисного увеличения сроков жизни клеток облученной популяции.
Экспериментальные данные по замедлению отмирания выживших после облучения клеток различных генотипов по сравнению с интактными клетками в данной диссертационной работе получены в диапазоне доз от 13 до 1200 Гр. Впервые явление замедления отмирания показано не только после предварительных малых доз, но и после воздействия в больших дозах, когда выживает малая часть популяции.
Рис. 1. А – зависимость отмирания контрольных () и облученных в дозе 130 Гр () дрожжевых клеток штамма Т1 в непита тельной среде при 37оС. Б – та же зависимость при нормировании выжившей после облучения части популяции к 100 %. О пока зателях k и t см. в тексте В качестве основной количественной характеристики, отражающей процесс замедления гибели облу ченных клеток, введен коэффициент замедления отмирания клеток (k), определяемый отношением про должительности отмирания облученных и контрольных клеток, рассчитанным для некоторого изоэффек тивного уровня (например, для выживаемости клеток, равной 10 %). Для сопоставления интервалов вре мени после облучения, в течение которого отмирание контрольной и облученной клеточных популяций происходит не по экспоненциальному закону, введен показатель : отношение продолжительности вре мени, которой соответствует «плечо» на кривой отмирания клеток облученной популяции к аналогично му временному промежутку для интактных клеток. Введен также показатель приращения времени (t0), необходимого для снижения количества живых клеток в популяции в «е» раз, где е – основание нату ральных логарифмов. Этот показатель для кривых отмирания отражает наклон линейной части графиков зависимости выживаемости от времени выдерживания клеток в непитательной среде. Способ расчета критерия k и показателя t0 отражен на рис. 1.
О благоприятном воздействии ионизирующего излучения на выживаемость клеток облученной попу ляции по сравнению с необлученным контролем свидетельствуют повышенные показатели ( 1,0), t0 обл. (по сравнению с соответствующим t0-контр.) и критерий k ( 1,0). Указанные параметры кривых от мирания, полученные в трех основных сериях экспериментов для штаммов дикого типа (Т1 и XS800) и мутанта (Т4), сведены в таблице.
Таблица. Зависимость кинетики отмирания клеток Saccharomyces cerevisiae от генотипа, дозы облучения и температуры последующего инкубирования в непитательной среде Т1 (дикий тип) XS800 (дикий тип) Т4 (рад. мутант) Штамм 1 2 3 4 5 6 7 8 доза, Гр 130 670 1200 580 580 580 50 50 выживае- 75,0 20,1 5,2 15,1 15,1 15,1 20,0 20,0 20, мость, % ± 5,2 ± 4,3 ± 1,9 ± 1,6 ± 1,6 ± 1,6 ± 5,0 ± 5,0 ± 5, температу 37 37 37 30 37 40 30 37 ра, оС 3,0 2,0 2,0 1,0 2,0 1,0 2, - ± 0,4 ± 0,2 ± 0,4 ± 0,2 ± 0,2 ± 0,3 ± 0, t0-контр., 9,0 2,7 3,5 3,3 3,0 1,5 3,0 3,1 1, сут. ± 1,0 ± 0,5 ± 0,6 ± 0,4 ± 0,4 ± 0,4 ± 0,6 ± 0,4 ± 0, 12,5 4,3 8,5 8,5 4,0 2,8 7,7 4,6 2, t0-обл., сут.
± 1,0 ± 0,3 ± 1,0 ± 1,5 ± 0,3 ± 0,3 ± 0,5 ± 0,3 ± 0, 1,9 1,7 2,1 1,7 1,6 1,4 1,6 1,5 1, k ± 0,2 ± 0,3 ± 0,3 ± 0,3 ± 0,2 ± 0,4 ± 0,1 ± 0,2 ± 0, Из приведенных данных видно, что эффект радиационного гормезиса по критерию снижения скорости отмирания клеток в популяции характерен не только для диких штаммов, для которых существуют меха низмы пострадиационной репарации повреждений ДНК, но и для мутантного штамма, возможности вос становления которого после воздействия ионизирующего излучения ограничены. Параметры кривых от мирания клеток при одинаковых условиях для всех трех штаммов совпадают в пределах статистической вариабельности (как, например, в столбцах 2, 5 и 8). Это свидетельствует о возможном участии немишен ных событий в проявлении гормезиса, если рассматривать молекулу ДНК как основную мишень для квантов.
При изучении зависимости динамики отмирания клеток от дозы (столбцы 1 – 3), было отмечено за медление процессов отмирания выживших клеток даже в случае облучения в дозе, вызывающей гибель большей части клеточной популяции. При отсутствии закономерного изменения параметра k с дозой, с увеличением дозы угол расхождения кривых отмирания облученных и интактных клеток даже несколько возрастал. Это свидетельствует о некотором снижении чувствительности к факторам, вызывающим ста рение и отмирание, у клеток, переживших не только малую, но и высокую дозу облучения, и о переходе выжившей фракции клеток в новое, стабильное состояние.
При воздействии на клетки острого облучения в разных дозах и дополнительного экологического фак тора – повышенной температуры было выявлено (столбцы 4 – 9), что клетки, инкубированные после предварительного облучения при температурах 30, 37 и 40 оС, в целом демонстрируют более медленный темп отмирания, чем контроль. Коэффициент замедления отмирания для уровня выживаемости 10% при всех изменениях температуры остается достаточно стабильным в пределах статистической вариабельно сти, отражая слабую зависимость динамики отмирания облученных клеток от температуры инкубирования.
При исследовании влияния длительного хронического облучения на популяции дрожжевых клеток бы ло выявлено, что отмирание клеток в условиях 30-кратного снижения радиационного фона происходит до значительно меньшего уровня выживаемости, чем при фоновом или даже при повышенном уровне радиации (это видно на рис. 2). Данный факт указы Выживаемость, % вает на важность непрерывного хронического воздействия естественного ра диационного фона Земли как экологического фактора для поддержания про цессов нормальной жизнедеятельности организмов.
Рис. 2. Кривая зависимости выживаемости диплоидных дрожжей Saccharomyces cerevisiae XS1898, инкубированных в непитательной 0, 10 -2 10 1 10 2 10 10 -1 10 0 10 Радиационный фон среде при температуре 30 оС в течение одного месяца, от мощности дозы хронического облучения, нормированной к интенсив ности редкоионизирующего компонента естественного радиационного фона (10-7 Гр/ч) Из литературы известно (Булдаков, Калистратова, 2003;
Luckey, 1991), что острые дозы, влияющие на увеличение средней продолжительности жизни, лежат в том же диапазоне, что и дозы, вызывающие адаптивный ответ на последующее облучение. Как показано в настоящем исследовании, эта закономер ность может быть выявлена и для дрожжевых клеток.
Проявление адаптивной реакции делящихся дрожжевых клеток В сериях экспериментов были изучены закономерности зависимости величины адаптивного ответа от дозы, мощности дозы, продолжительности облучения, длительности интервала между адаптирующим и поражающим облучением для клеток популяций Saccharomyces cerevisiae дикого диплоидного штамма XS800, находящихся в жидкой питательной среде в логарифмической фазе роста.
Влияние мощности дозы пролонгированного адаптирующего облучения на последующий адаптивный ответ в широком диапазоне мощностей доз – от 10-5 до 70 Гр/ч – исследовано впервые.
На рис. 3 представлены типичные для данной серии опытов кривые выживаемости интактных и адап тированных с мощностями доз 10-4 и 10 Гр/ч клеток при повторном воздействии -излучения в тести рующих острых дозах от 80 до 1400 Гр. Показан расчет основного параметра – фактора изменения дозы (ФИД) – это отношение равноэффективных доз тестирующего облучения для адаптированной и кон трольной популяций клеток, например, для уровня выживаемости 10 %.
100 10-4 Гр/ч Выживаемость, % 10 Гр/ч Выживаемость, % ФИД=1, 10 ФИД=2, 1 A Б 0, 0, 0 200 400 600 800 1000 1200 0 200 400 600 800 1000 1200 Доза острого облучения, Гр Доза острого облучения, Гр Рис. 3. Адаптивная реакция адаптированных в течение 24 ч диплоидных дрожжевых клеток () штамма XS800 в логарифмиче ской фазе роста по сравнению с контролем (). А – мощность дозы предварительного облучения 10-4 Гр/ч;
Б – мощность дозы 10 Гр/ч Начиная с мощности дозы 10-4 Гр/ч, являющейся пороговой для проявления эффекта, величина адап тивного ответа, оцениваемая по параметру ФИД, растет до некоторого предела мощности адаптирующей дозы, находящегося в области около 10 Гр/ч. Далее с увеличением мощности дозы наблюдается снижение показателя ФИД для адаптированной и контрольной клеточных популяций. Общий характер изменения параметра ФИД в связи с увеличением мощности дозы адаптирующего излучения отражен на рис. 4.
Мощность дозы 10 Гр/ч не является критической для роста популяции, она не останавливает его, но в значительной степени тормозит. В представляемой диссертационной работе впервые показана возмож ность проявления адаптивной реакции у клеток после предварительного облучения с высокими мощно стями доз, вызывающего значительное снижение скорости размножения облученной клеточной популя ции или даже преобладание гибели клеток над размножением при длительном культивировании популя ции в жидкой питательной среде.
Рис. 4. Зависимость фактора изменения до зы (ФИД) от мощности дозы 24-часового адаптирующего воздействия при адаптивном ответе облученных клеток штамма XS 3 в логарифмической фазе роста по сравне нию с контролем ФИД10% Сходный тип проявления закономерностей адаптивной реакции был обнаружен и при предваритель ном действии острого облучения в качестве адаптирующего. Был исследован широкий диапазон предва рительных доз – от 10-2 до 103 Гр. Фрагменты результатов серии экспериментов, отражающих закономер но10 и10 10 10 10 10 а10 ивной реакции дрожжевыми клетками в диапазоне адаптирующих доз 1 сГр – ст проявления ад пт 10 10 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 Гр, представлены на рис.дозы, Гр/ч овании полученных данных построены пары кривых «доза – эффект», Мощность адаптирующей 5. На осн для каждой из которых сопоставлены уровни равноэффективных доз и рассчитаны ФИД10%.
Выживаемость, % Выживаемость, % 80 Гр 0,1 Гр ФИД=1,4 ФИД=3, Б А 0, 0, 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 Доза повторного острого облучения, Доза повторного острого облучения Рис. 5. Адаптивная реакция клеток штамма XS800 в логарифмической фазе роста, облученных в острых адаптирующих дозах (), по сравнению с неадаптированным контролем (). Продолжительность между облучениями – 4 ч, t=30 оС. Величины адап тирующих доз для А – 0,1 Гр (пороговая доза), для Б – 80 Гр (доза, инициирующая максимальное проявление адаптивного отве та) В серии экспериментов по изучению острого адаптирующего воздействия -излучения на клетки Sac charomyces cerevisiae было выявлено, что пороговая доза для острого адаптирующего облучения состав ляет около 10 сГр, для области доз 50 – 160 Гр существует экстремум в проявлении адаптивной реакции, а после увеличения адаптирующей дозы выше 800 Гр адаптивный ответ клеток популяции невозможен.
Получены данные о зависимости величины адаптивного ответа делящихся клеток XS800 от длитель ности промежутка между острыми облучениями – адаптирующим и тестирующим. Результаты исследо вания отражены на диаграмме на рис. 6. Показано, что существует оптимальный для формирования адап тивного ответа промежуток времени, после которого наблюдается снижение резистентности клеток к по следующему облучению. Этот результат также важен для экологии, свидетельствуя о большей эффективности хронического воздействия фактора для проявления эффекта по сравнению с острым его приложением.
Рис. 6. Зависимость выживаемости клеток штам повторного облучения, % Выживаемость после ма XS800 в логарифмической фазе роста, остро облученных в адаптирующей дозе 80 Гр и облу ченных в последующей тестирующей дозе 500 Гр (столбцы 1-6, 24), от продолжительности времени между облучениями.
Столбец «К»–выживаемость контроля, однократ но облученного в дозе 500 Гр.
выросших макроколоний, % выросших макроколоний, % К 1 2 3 4 5 0 2 4 6 Время, ч Количество Количество 60 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 Время, сутки Время, сутки Рис. 7. Зависимость количества (%) макроколоний, образованных облученными дрожжевыми клетками штамма XS800, от продолжительности их роста на твердой питательной среде. А. Клетки, находящиеся в логарифмической стадии роста, предвари тельно облучены в адаптирующей дозе в течение 24 часов при мощности дозы 7 Гр/ч ;
последующая тестирующая доза состав ляла 2200 Гр (). Контрольная популяция дрожжевых клеток не подвергалась предварительному хроническому облучению ().
Б. Клетки, находящиеся в логарифмической стадии роста, облучены только в тестирующей дозе 1200 Гр (), а также в этой же тестирующей дозе после предварительного острого облучения клеток в адаптирующих дозах 80 Гр () и 160 Гр ().
Обнаружен эффект ускорения деления клеток и формирования макроколоний при высеве на плотную питательную среду у предварительно адаптированных клеток после тестирующего облучения по сравне нию с клетками, облученными только в тестирующей дозе. Данную закономерность наблюдали как после хронического облучения в адаптирующей дозе (это отражено на рис. 7. А), так и после предварительного острого воздействия на клетки -излучения (что видно на рис. 7. Б). Возможно, данный эффект можно объяснить феноменом стимуляции клеток к делению под воздействием ионизирующего излучения.
Таким образом, в работе количественно описаны эффект проявления замедления скорости гибели кле ток в облученных популяциях дрожжей и реакция адаптивного ответа предварительно облученных кле ток на последующее облучение.
ВЫВОДЫ 1. Получены экспериментальные данные, демонстрирующие эффект радиационного гормезиса на по пуляциях дрожжевых клетках различного генотипа. Этот эффект проявлялся в замедлении отмирания выживших после облучения клеток по сравнению с интактными клетками. Впервые показано, что горме зисные эффекты могут быть выявлены не только в области малых доз, как это традиционно предполага ется, но и после больших доз ионизирующего излучения, когда доля погибших клеток составляет 80-95%.
Этот факт имеет большое значение для проблем экологии, указывая на возможные механизмы восстанов ления природных популяций микроорганизмов после поражающего действия ионизирующего излучения.
2. Для количественного описания эффекта гормезиса введен коэффициент замедления отмирания кле ток, определяемый отношением продолжительностей отмирания облученных и контрольных клеток и рассчитанный для некоторого изоэффективного уровня. В соответствии с этим параметром, выжившие после облучения клетки, отмирали почти в 2 раза медленнее контрольных (1,9 ± 0,2). В исследованном диапазоне доз (13 – 1200 Гр) этот параметр не зависел от дозы, в которой были облучены популяции кле ток, а также от температуры (30-40 °С) пострадиационного культивирования клеток.
3. Показана возможность замедления скорости гибели в популяциях облученных клеток диких штам мов и штаммов, частично дефектных по способности репарировать радиационные повреждения ДНК. По скольку традиционно молекула ДНК рассматривается в качестве одной из главных мишеней в клетке, по глощение энергии в которой приводит к регистрируемым радиационным эффектам, полученные нами данные свидетельствует о возможном участии немишенных событий в проявлении гормезиса.
4. Степень выраженности адаптивного ответа облученных популяций дрожжевых клеток на после дующее воздействие ионизирующего излучения зависит от величины и мощности адаптирующей дозы.
Выявлена возможность проявления адаптивного ответа клетками, облученными в высоких дозах или с высокими мощностями доз, вызывающими остановку размножения и гибель части клеток популяции. Эти данные имеют непосредственное значение для экологии, указывая на возможные механизмы повышения устойчивости природных популяций микроорганизмов к поражающему действию ионизирующего излу чения.
5. Впервые детально изучены количественные закономерности проявления адаптивной реакции попу ляций дрожжевых клеток. Показано, что адаптивный ответ при пролонгированном облучении ионизи рующим излучением начинается при мощности дозы порядка 10-4 Гр/ч, максимален при 10 Гр/ч, далее с ростом мощности дозы снижается. Пороговая доза для острого адаптирующего облучения составляет около 1 сГр, для области доз 50 – 160 Гр существует экстремум в проявлении адаптивной реакции, после увеличения адаптирующей дозы выше 800 Гр адаптивный ответ популяции клеток невозможен.
6. На дрожжевых клетках подтверждена зависимость величины адаптивной реакции от временнго интервала между адаптирующим и тестирующим облучениями: существует оптимальный для формиро вания адаптивного ответа промежуток времени, после которого наблюдается снижение резистентности клеток к последующему облучению. Этот результат также важен для экологии, указывая на важность не прерывного хронического воздействия естественного радиационного фона Земли на биоту.
7. Дальнейшее подтверждение этому выводу получено в экспериментах по отмиранию дрожжевых клеток при очень низких интенсивностях ионизирующего излучения. Показано, что при 30-кратном сни жении естественного радиационного фона отмирание клеток происходит быстрее по сравнению с естест венным радиационным фоном. Эти данные являются прямым указанием на значимость естественного ра диационного фона Земли для биосферы в целом.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Петин В.Г., Морозов И.И., Кабакова Н.М., Горшкова Т.А. Некоторые эффекты радиационного гормезиса бактериальных и дрожжевых клеток // Радиационная биология. Радиоэкология. – 2003. – Т. 43, № 2. – С.
176-178.
2. Горшкова Т.А., Кабакова Н.М., Жураковская Г.П. Сохранение радиобиологических характеристик восста новленных клеток: Тез. докл. Третья международная научно-практическая конференция «Медико дозиметрические регистры – основа регламентации радиационной безопасности профессионалов и населе ния». – Омск, 2004. –С. 64.
3. Комарова Л.Н., Горшкова Т.А. Влияние облучения ионизирующей радиацией на отмирание дрожжевых клеток разного генотипа: Тез. докл. Сороковые научные чтения памяти К.Э Циолковского «Научное творчество К.Э. Циолковского и современное развитие его идей. – Калуга: ИП Кошелев А.Б. – 2005. – С.
101-102.
4. Горшкова Т.А., Комарова Л.Н., Кабакова Н.М., Петин В.Г. Особенности проявления адаптивной реак ции дрожжевых клеток на действие ионизирующего излучения: Тез. докл. Пятый съезд по радиацион ным исследованиям. – Москва. – 2006. – Т. 1. – С. 144.
5. Горшкова Т.А. Некоторые закономерности адаптивного ответа растущих популяций Saccharomyces cere visiae на действие ионизирующего излучения // Радиация и риск. – 2006. – Т. 15. – № 1-2. – С.59-67.
6. Горшкова Т.А. Особенности адаптивного ответа делящихся клеток Saccharomyces cerevisiae на действие -излучения: Тез. докл. Девятая российская научная конференция «Радиационная защита и радиационная безопасность в ядерных технологиях». Обнинск, изд-во ФЭИ. – 2006. – С. 437-438.
Доктору биологических наук БОРЕЙКО А.В.
Старшему научному сотруднику Лаборатории радиационной биологии Объединённого института ядерных исследований 141980, Московская обл., гор.Дубна, ул. Ж.Кюри, Глубокоуважаемая Алла Владимировна!
Диссертационный совет Д 001.011.01 при ГУ Медицинском радиологическом научном центре РАМН (гор. Обнинск) рекомендовал Вас в качестве официального оппонента диссерта ции ГОРШКОВОЙ Татьяны Александровны на тему: « Количественные закономерности прояв ления адаптивной реакции и радиационного гормезиса у популяций дрожжевых клеток», пред ставленной к защите на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специаль ностям 03.00.01 – радиобиология и 03.00.16 – экология.
Защита диссертации назначена на 24 апреля 2007 г. в 11.00 час.
В отзыве просьба оценить актуальность избранной темы, степень обоснованности научных положений, выводов и рекомендаций, сформулированных в диссертации, их достоверность и но визна, а также дать заключение о соответствии диссертации критериям, установленным пунктом 8 «Положения о порядке присуждения учёных степеней» Постановления Правительства Россий ской Федерации от 30.01.2002 г. № 74.
Ваш отзыв в 2-х экземплярах, обязательно с датой подписания и заверенный по месту рабо ты, желательно иметь в диссертационном совете не позже 13 апреля с.г.
С целью получения Вами причитающегося гонорара за оппонирование в день защиты дис сертации, направляем 2 экземпляра договора между ГУ МРНЦ РАМН и Вами, который просьба внимательно заполнить с двух сторон, полностью отвечая на поставленные вопросы, но не проставляя даты подписания договора и акта приёмки, и возвратить в диссертационный совет не позже 10 апреля с.г.
Приложение: 1. Диссертация – 1 том;
2. Автореферат диссертации – 1 экз.
3. Договор – 2 экз.
С уважением.
Зам. председателя диссертационного совета профессор САЕНКО А.С.
(Исп.Палыга Г.Ф., Тел. (48439)7-47-80) Доктору биологических наук СЫНЗЫНЫСУ Б.И., профессору кафедры экологии Обнинского гос. технического университета Атомной энергетики МОиН РФ 249020, гор.Обнинск Калужской обл., Студгородок, Глубокоуважаемый Борис Иванович!
Диссертационный совет Д 001.011.01 при ГУ Медицинском радиологическом научном центре РАМН (гор. Обнинск) рекомендовал Вас в качестве официального оппонента диссерта ции ГОРШКОВОЙ Татьяны Александровны на тему: « Количественные закономерности прояв ления адаптивной реакции и радиационного гормезиса у популяций дрожжевых клеток», пред ставленной к защите на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специаль ностям 03.00.01 – радиобиология и 03.00.16 – экология.
Защита диссертации назначена на 24 апреля 2007 г. в 11.00 час.
В отзыве просьба оценить актуальность избранной темы, степень обоснованности научных положений, выводов и рекомендаций, сформулированных в диссертации, их достоверность и но визна, а также дать заключение о соответствии диссертации критериям, установленным пунктом 8 «Положения о порядке присуждения учёных степеней» Постановления Правительства Россий ской Федерации от 30.01.2002 г. № 74.
Ваш отзыв в 2-х экземплярах, обязательно с датой подписания и заверенный по месту рабо ты, желательно иметь в диссертационном совете не позже 13 апреля с.г.
С целью получения Вами причитающегося гонорара за оппонирование в день защиты дис сертации, направляем 2 экземпляра договора между ГУ МРНЦ РАМН и Вами, который просьба внимательно заполнить с двух сторон, полностью отвечая на поставленные вопросы, но не проставляя даты подписания договора и акта приёмки, и возвратить в диссертационный совет не позже 10 апреля с.г.
Приложение: 1. Диссертация – 1 том;
2. Автореферат диссертации – 1 экз.
3. Договор – 2 экз.
С уважением.
Зам. председателя диссертационного совета профессор САЕНКО А.С.
(Исп.Палыга Г.Ф., Тел. (48439)7-47-80) ДИРЕКТОРУ Всероссийского НИИ сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии Россельхозакадемии академику РАСХН, профессору АЛЕКСАХИНУ Р.М.
249030, гор. Обнинск Калужской обл., Киевское шоссе, 109- км.
Глубокоуважаемый Рудольф Михайлович!
Диссертационный совет Д 001.011.01 при ГУ «Медицинский радиологический научный центр РАМН» (гор. Обнинск) рекомендовал руководимое Вами учреждение в качестве ведущей организации для отзыва по диссертации ГОРШКОВОЙ Татьяны Александровны на тему: « Ко личественные закономерности проявления адаптивной реакции и радиационного гормезиса у популяций дрожжевых клеток», представленной к защите на соискание ученой степени кандида та биологических наук по специальностям 03.00.01 – радиобиология и 03.00.16 – экология.
Защита диссертации назначена на 24 апреля 2007 г. в 11.00 час.
В отзыве просьба отразить значимость для науки и практики полученных автором диссертации ре зультатов и выводов, конкретные рекомендации по их использованию, а также дать заключение о соответ ствии диссертации критериям, установленным пунктом 8 «Положения о порядке присуждения учёных сте пеней» Постановления Правительства Российской Федерации от 30.01.2002 г. № 74.
Утверждённый Вами или Вашим заместителем отзыв ведущей организации в 2-х экземплярах вместе с диссертацией ГОРШКОВОЙ Т..А. желательно иметь в диссертационном совете не позже 13 апреля с.г.
Приложение: 1. Диссертация – 1 том;
2. Автореферат диссертации – 1 экз.
С уважением.
Зам. директора ГУ МРНЦ РАМН по научной работе, Зам. председателя диссертационного совета профессор САЕНКО А.С.
(Исп.Палыга Г.Ф., тел (48439)7-47-80) БЮЛЛЕТЕНЬ БЮЛЛЕТЕНЬ Диссертационный совет Д 001.011.01 Диссертационный совет Д 001.011. К заседанию совета 24 апреля 2007 г., № 6 К заседанию совета 24 апреля 2007 г., № Фамилия, имя, отчество Достоин учёной Результаты Фамилия, имя, отчество Достоин учёной Результаты соискателя степени голосования соискателя степени голосования Кандидата Кандидата биологических биологических наук наук ГОРШКОВА ГОРШКОВА Да Да по специальностям по специальностям Татьяна Татьяна 03.00.01 - радио 03.00.01 - радио Александровна Александровна Нет Нет биология и биология и 03.00.16 – эколо 03.00.16 – эколо гия.
гия.
Бюллетень не подписывается. В графе «Результаты голосования» Бюллетень не подписывается. В графе «Результаты голосования» вычеркнуть ненужное. вычеркнуть ненужное.
БЮЛЛЕТЕНЬ БЮЛЛЕТЕНЬ Диссертационный совет Д 001.011.01 Диссертационный совет Д 001.011. К заседанию совета 24 апреля 2007 г., № 6 К заседанию совета 24 апреля 2007 г., № Фамилия, имя, отчество Достоин учёной Результаты Фамилия, имя, отчество Достоин учёной Результаты соискателя степени голосования соискателя степени голосования Кандидата Кандидата биологических биологических наук наук ГОРШКОВА ГОРШКОВА Да Да по специальностям по специальностям Татьяна Татьяна 03.00.01 - радио- 03.00.01 - радио Александровна Александровна Нет Нет биология и биология и 03.00.16 – эколо- 03.00.16 – эколо гия.
гия.
Бюллетень не подписывается. В графе «Результаты голосования» Бюллетень не подписывается. В графе «Результаты голосования» вычеркнуть ненужное. вычеркнуть ненужное.