Распределение лектинов в талломе листоватых лишайников в связи с особенностями их морфоструктурной организации

На правах рукописи

Феоктистов Александр Сергеевич «Распределение лектинов в талломе листоватых лишайников в связи с особенностями их морфоструктурной организации» Специальность 03.02.12 – микология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2010 Диссертационная работа выполнена на Биологическом факультете Московского Государственного Университета имени М.В.Ломоносова

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Е. С. Лобакова Консультант: кандидат биологических наук, доцент А. В. Киташов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Т. С. Калебина доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник А. В. Пчелкин

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН

Защита состоится «28» мая 2010 г. в 15.30 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.46 в Московском Государственном Университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, г. Москва, ГСП-2, Ленинские Горы, МГУ, Биологический факультет.

Факс: (495) 939-43-

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан «27» апреля 2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета, к. б. н. М. А. Гусаковская Актуальность проблемы. Лишайники до настоящего времени представляют собой классический объект изучения различных аспектов функционирования симбиотических организмов как специализированных надорганизменных систем, сформированных генетически разными партнерами [Rikkinen, 2002]. Тем не менее, экспериментальных работ в лихенологии сравнительно не много, особенно в области физиолого биохимических механизмов, обеспечивающих узнавание партнеров, формирования уникальной морфофизиологической структуры таллома лишайника и взаимодействия мико- и фотобионта (циано- и/или фикобионтов). Ключевую роль в образовании лишайникового симбиоза играют химические механизмы дистантного и контактного узнавания партнеров [Rai et al., 2000], которые различны при взаимодействии гриба с микроводорослями и цианобактериями. Контакт микобионта с фикобионтом осуществляется при участии ABP-белков (algae-binding proteins) путем белок-белкового связывания, а взаимодействие с цианобионтом обеспечивают лектины [Petit et al., 1983;

Stocker-Worgotter, 2001], белки или гликопротеины, связывающие с высокой специфичностью олигосахаридные остатки. Предполагают, что связывание лектинов с компонентами клеточной стенки цианобактерий может запускать процессы их клеточной дифференцировки [Kardish et al., 1991]. Агглютинины двухкомпонентных цианолишайников Peltigera canina, Nephroma laevigatum, Parmelia michauxiana охарактеризованы как лектины гликопротеидной природы с молекулярной массой 20- кДа [Petit et al., 1983;

Kardish et al., 1991;

Howe, Barrett, 1970]. Однако в литературе отсутствуют данные о пространственном распределении лектинов в талломах лишайников.

Основные работы по изучению процессов селективного взаимодействия партнеров в талломах лишайников выполнены на двухкомпонентных фико- и цианолишайниках.

Предполагают, что в случае трехкомпонентных лишайников, с различной морфоструктурной локализацией цианобионта в талломе, система узнавания и взаимодействия партнеров более сложна [Gassmann, Ott, 2000].

Целью работы явилась характеристика лектинов листоватых лишайников в связи с морфоструктурными и физиологическими особенностями строения таллома.

Задачи исследования:

1. Выделить и охарактеризовать лектин таллома трехкомпонентного лишайника Peltigera aphthosa (L.) Willd.

2. Провести сравнительный анализ распределения лектинов в талломах двухкомпонентного цианолишайника Peltigera scabrosa Th. Fr. и трехкомпонентных лишайников Peltigera aphthosa (L.) Willd и Nephroma arcticum (L.) Torss. с различной локализацией цефалодиев.

3. Изучить особенности зональной топографии цефалодиев на поверхности таллома лишайника Peltigera aphthosa.

4. Определить сродство лектина лишайника Peltigera aphthosa к свободноживущим цианобактериям.

Научная новизна. Впервые выделен и охарактеризован лектин гликопротеиновой природы из трехкомпонентного лишайника P. aphthosa. Показано, что распределение лектина в талломе этого лишайника связано с его морфологией.

Установлено, что апикальные зоны таллома характеризуются максимальной: 1) средней концентрацией лектина и 2) вариабельностью, а базальные зоны таллома минимальной его концентрацией. Выявлены различия в картинах распределения лектинов в талломах листоватых лишайников с разной локализацией цианобактерий. Установлено, что в двухкомпонентном цианолишайнике P. scabrosa содержится максимальное количество агглютининов, и большая их часть сосредоточена в апикальной зоне. В трехкомпонентном лишайнике с внешними цефалодиями P. aphthosa лектины распределены по всему таллому с некоторым увеличением их концентрации в апикальной зоне. В талломе трехкомпонентного лишайника с внутриталломными цефалодиями N. arcticum агглютинины практически отсутствуют и обнаруживаются лишь в местах локализации цианобионта.

Установлено, что средняя площадь цефалодиев таллома трёхкомпонентного лишайника P. aphthosa максимальна в медиальной, а минимальна - в апикальной зонах таллома. Впервые показано, что число и суммарная площадь цефалодиев линейно зависят от площади таллома.

Практическое значение. Предложен метод выделения и очистки лектинов из талломов листоватых лишайников, который может быть использован в биотехнологии для получения препаратов лектинов - специфических меток для обнаружения олигосахаридных остатков, а также лекарственных коньюгатов для доставки действующего вещества к специфическим мишеням.

Разработан новый подход к анализу физиологического состояния талломов листоватых лишайников и сравнению активности их участков, который может быть использован в лихенологических исследованиях и биоиндикации.

Результаты работы внедрены в систему биологического образования.

Предложенные методы используются при проведении летней практики студентов курса биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, лекционных курсах «Общая симбиология», «Экспериментальная симбиология».

Апробация работы. Результаты исследования были представлены и обсуждены на заседании кафедр физиологии микроорганизмов и микологии и альгологии биологического факультета МГУ, Юбилейной конференции, посвященной 85-летию кафедры микологии и альгологии МГУ им. М. В.

Ломоносова, «Микология и альгология – 2004» (Москва, 2004), XI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов – 2004» (Москва, 2004), VIII молодежной конференции ботаников (Санкт-Петербург, 2004), Международной конференции «Грибы в природных и антропогенных экосистемах», посвященной 100-летию начала работы профессора А. С. Бондарцева в Ботаническом институте им. В. Л. Комарова РАН, (Санкт-Петербург, 2005), Всероссийском симпозиуме с международным участием «Автотрофные микроорганизмы (памяти академика РАН Е.Н. Кондратьевой)» (Москва, 2005), Международной конференции, посвященной 200-летию Казанской ботанической школы, (Казань, 2006), Международной конференции, посвященной 75-летию Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова «Грибы и водоросли в биоценозах — 2006» (Москва, 2006), I (IX) международной конференции молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2006), Х научной конференции Беломорской биологической станции МГУ (ББС МГУ, 2006), Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем» (Саратов, 2007), XVI международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф, 2008), VII конференции молодых ученых и специалистов, посвященной Дню космонавтики и к 45-летию ГНЦ РФ-ИМБП РАН, (Москва, 2008) и Всероссийской научной конференции с международным участием «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2009).

Публикации. Всего по материалам диссертации опубликовано 14 работ, среди них 2 статьи в реферируемых журналах, рекомендованных ВАК для публикации соискателей ученой степени кандидата наук, и 5 статей, опубликованные в материалах международных конференций. Экспериментальные данные, представленные в диссертации, получены лично соискателем и опубликованы в соавторстве с руководителями и сотрудниками, работавшими совместно с автором в процессе выполнения работы.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на стр.

машинописного текста, состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, списка цитированной литературы, включающего 138 наименований (из них 125 на иностранных языках).

Работа содержит 2 таблицы и иллюстрирована 18 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы Обзор посвящен анализу молекулярных и биохимических аспектов взаимодействия в лишайниках гетеротрофного (микобионта) и фототрофных (циано– и/или фикобионта) компонентов в зависимости от их сочетания в талломе [Paulsrud, 2001]. Представлены данные о роли цианобактерий в симбиозах с растениями и грибами. Проанализированы вопросы узнавания, селективности и специфичности взаимодействия, взаимной адаптации партнеров в процессах формирования и размножения лишайников. Представлены современные данные об участии лектинов в формировании морфоструктуры талломов двухкомпонентных цианолишайников.

Глава 2. Материалы и методы Объектом исследования служил двухкомпонентный лишайник Peltigera scabrosa Th. Fr. и трехкомпонентные лишайники Peltigera aphthosa (L.) Willd. и Nephroma arcticum (L.) Torss. Все объекты относятся к сем. Peltigeraceae, но различаются локализацией цианобактерий в талломе. Образцы таллома лишайников собирали на полуострове Киндо, Карелия, в окрестностях Беломорской биологической станции им. Н. А. Перцова МГУ им. М. В. Ломоносова (географические координаты 66°34' с. ш., 33°08' в. д.) в июне и августе 2003- гг.

Концентрацию лектинов определяли с помощью реакции гемагглютинации (РГА) с полуторными разведениями и эритроцитами человека с поверхностными антигенами группы B (III) Rh+ [Феоктистов и др., 2009]. Для характеристики содержания лектинов в талломе использовали удельную гемагглютинирующую активность (ГАА), определяемую по формуле ГАА= T * m, где T – титр агглютинина, а m – масса фрагмента таллома, использованного для выделения агглютинина.

Первичное выделение лектинов осуществляли путем высаливания белков кристаллическим (NH 4 ) 2 SO 4 [Wang and Ng, 2004] из водной фазы гомогенатов талломов лишайников в фосфатно-солевом буфере (PBS).

Для очистки препарата лектина использовали гель-фильтрацию на сефадексе G-100 [Sarangi et al., 2006] и ионообменную хроматографию на диэтиламиноэтилцеллюлозе и карбоксиметилсефадексе [Wang and Ng, 2004]. В полученных фракциях измеряли концентрацию белков спектрофотометрическим методом в полосах 206 и 280 нм и концентрацию лектинов с помощью реакции гемагглютинации.

Для препарирования талломов и учета серологических реакций использовали бинокулярный микроскоп МБС-10 (Россия).

Для определения состава и функциональности лектина очищенный препарат инкубировали с растворами трипсина, пепсина для разрушения белкового компонента лектина и с KIO 4 для разрушения углеводной части. Затем диализовали против PBS и ставили РГА [Petit et al., 1983]. Исчезновение активности рассматривали как доказательство наличия и функциональной активности соответствующей части.

Размеры и морфологию биополимеров в препарате лектина исследовали с помощью атомно-силовой микроскопии. Для этого водные растворы лектина, очищенные с помощью ионообменной хроматографии, помещали на слюдяную подложку размером 5х5 мм, инкубировали 3 минуты и отмывали в деионизированной воде (SuperQ) 5 мин. Затем высушивали, обдували сжатым воздухом и исследовали на атомном зондовом микроскопе Solver P47H (NT-MDT, Москва) по стандартной методике [Thormann et al., 2007]. Сканирование проводили полуконтактным методом с частотой 1,8 Гц.

Состав белков исследовали с помощью электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия в 10% полиакриламидном геле [Cavada et al., 2003].

Препарат лектина кипятили 5 минут с буфером для образцов, содержащим SDS (нередуцирующие условия) или SDS и меркаптоэтанол (редуцирующие условия).

Гели окрашивали Кумасси синим R-250 [Gonzalez et al., 2006] и сканировали на планшетном сканере.

Для определения стабильности лектина применяли кипячение раствора лектина, последовательное замораживание при температуре -20°С и оттаивание при комнатной температуре, инкубацию под ультрафиолетовым излучением. Для оценки изменения агглютинирующей активности ставили РГА. Кроме того, изучали стабилизирующее действие на структуру лектина ионов кальция и магния [Fontaniella et al., 2004].

Определяли стабильность лектина в талломах лишайников при хранении их в высушенном состоянии. Для этого в течение полугода ежемесячно отбирали пробы и ставили РГА.

Специфичность лектина изучали с помощью ингибирования реакции гемагглютинации моносахаридами [Echemendia-Blanco et al., 2009].

Форму таллома и расположение на нем цефалодиев фиксировали фотографически с помощью Canon EOS 400D со штатным объективом.

Для изучения распределения лектина в талломах лишайников их разрезали по единой схеме на 16 частей (4х4). Каждый фрагмент гомогенизировали с физиологическим раствором (0,89% NaCl), после чего с водной фазой ставили реакцию гемагглютинации.

Для изучения прямой агглютинации цианобактерии отмывали от культуральной жидкости физиологическим раствором и концентрировали центрифугированием. Затем клетки инактивировали путем серии последовательных замораживаний при температуре -20°С и оттаиваний при комнатной температуре, после чего ставили реакцию с экстрактом лишайника, аналогичную РГА, используя вместо суспензии эритроцитов суспензию цианобактерий той же концентрации.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программ Statistika 7, Excel 2003, MySQL 5, ROOT 5 и Python 2.3.7. Все эксперименты были поставлены в 5-15 повторностях.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Глава 3. Выделение и очистка агглютинина Методом гель-фильтрации из водных экстрактов таллома лишайника P.

aphthosa выделена агглютинирующая фракция, соответствующая белковым молекулам с молекулярной массой 60 кДа. Очистку препарата агглютинина проводили с помощью ионообменной хроматографии. Максимальный выход и чистоту агглютинина удалось получить при использовании катионообменной смолы.

Чистота препарата и молекулярная масса выделенного агглютинина оценивалась также с помощью атомно-силовой микроскопии. В полученном Рис. 1. Изображения атомно-силовой микроскопии препарата лектина лишайника P. aphthosa:

а – глобулы диаметром 25 нм (60-70 кДа);

б – крупные конгломераты (110-120 кДа) препарате агглютинина (рис. 1) преобладали глобулы диаметром 25 нм (а), что соответствует белковым молекулам массой около 60-70 кДа. На их долю приходится около 92% частиц, обнаруженных на изображениях. По-видимому, они представляют собой нативное состояние лектина. Кроме того, в препарате агглютинина обнаружена минорная фракция (8%) крупных глобул (б), предположительно соответствующих белковым молекулам массой около 110- кДа, представляющие собой, по-видимому, конгломераты лектина.

Электрофорез в полиакриламидном геле и буфере с SDS выявил две заметные полосы, окрашиваемые Кумасси G-250, соответствующие молекулярным массам и 17 кДа. Согласно интегральным денситометрическим измерениям, полосы, соответствующие 15 кДа, содержали меньше белка, чем полосы, соответствующие 17 кДа. По-видимому, более легкие молекулы представляют собой лектин с редуцированной углеводной частью. Подобное фрагментирование молекул лектина может являться следствием кипячения препарата с буфером для образца при подготовке проб для электрофореза. Соотношение молекулярной массы лектина, определенной при электрофоретическом разделении, и оцененной по результатам гель-фильтрации и атомно-силовой микроскопии, свидетельствует о том, что в нативном виде лектин представляет собой тетрамер, что согласуется с данными литературы о строении лектинов, в том числе лектинов грибов [Wimmerova et al., 2003].

Количество и расположение полос в гелях, полученных при разделении препарата лектина в редуцирующих и нередуцирующих условиях, не различаются.

Это может свидетельствовать о том, что одиночный лектиновый домен представляет собой единую белковую или гликопротеидную глобулу [Lieth et al., 1998].

Рис. 2. Изменение гемагглютинирующей активности препарата лектина лишайника P. aphthosa после воздействия различных факторов Глава 4. Характеристика гемагглютинирующей активности выделенного лектина Инкубация препарата лектина с трипсином и пепсином приводила к исчезновению его гемагглютинирующей активности (рис. 2), что указывает на наличие в его составе белковой части и ее функциональной необходимости. Кроме того, это свидетельствует о наличии на поверхности молекулы агглютинина лизин аргининовых детерминант и ароматических аминокислот.

Агглютинирующая активность пропадала при воздействии на лектин перйодатом калия (рис. 2), окисляющего сахара, но слабо влияющего на белковый компонент [Kardish et al., 1991], это свидетельствует о наличии и функциональной значимости в составе лектина углеводной части. Полученные данные позволяют заключить, что лектин лишайника P. aphthosa имеет гликопротеиновую природу, причём как его белковый, так и углеводный компоненты необходимы для проявления гемагглютинирующей активности, что характерно для большинства лектинов [Gabius, 1997].

Высокотемпературная обработка препарата лектина приводила к исчезновению его агглютинирующей активности (рис. 2), вызываемому, наиболее вероятно, диссоциацией лектинового тетрамера и/или потерей связи между углеводным и белковым компонентами, либо внутримолекулярной денатурацией и изменением пространственно-конформационной его структуры. Серия последовательных замораживаний и оттаиваний препарата лектина не приводила к исчезновению его агглютинирующей активности (рис. 2). Экофизиологическое Рис. 3. Ингибирование реакции гемагглютинации моносахаридами (определение специфичности лектина лишайника P. aphthosa) значение такого характера температурной устойчивости может быть связано с климатическими условиями обитания исследованного вида лишайников.

Лишайники высоких широт обладают известной способностью переживать отрицательные температуры и быстро восстанавливать физиологическую активность при появлении жидкой воды [Smith et al., 1998].

Минимальная концентрация агглютинина, в которой он вызывает гемагглютинацию, составляет 0,1 мг/мл в пересчете на общий белок, что хорошо согласуется с данными литературы об активности лектинов свободноживущих и лихенизированных грибов [Petit et al., 1983;

Kardish et al., 1991;

Sage, Vasquez, 1967].

Ионы Ca 2+ и Mg 2+ в концентрации 0,5 М повышают ГАА полученного лектина в 1,5–2 раза (рис. 2). Аналогичная зависимость активности некоторых классов лектинов, в особенности С-лектинов, от ионов двухвалентных металлов описана ранее [Gabius, 1997]. Присутствие двухвалентных катионов может быть необходимо для организации центра связывания лектинов либо оказывать общее стабилизирующее влияние на их структуру [Drickamer, 1996].

Методом ингибирования РГА сахарами, являющимися распространенными гаптенами лектинов, установлена высокая специфичность выделенного агглютинина к D-галактозе (рис. 3). Остальные моносахариды не оказывали воздействия на связывание эритроцитов полученным агглютинином. Совокупность описанных свойств позволяет отнести обнаруженные агглютинины лишайника P.

aphthosa к лектинам.

Специфичность лектина лишайника к D-галактозе косвенно указывает на его возможную роль в формировании таллома. Известно, что инициация различных синцианозов осуществляется подвижной жизненной формой цианобактерий – гормогониями [Paulsrud, 2001], для которых показано связывание с лектинами специфически взаимодействующими с D-галактозой [Schussler et al., 1997]. Таким образом, роль выделенного лектина, вероятнее всего, заключается в узнавании и связывании компетентных видов цианобактерий.

Глава 5. Гетерогенность распределения лектина в талломе листоватых лишайников Получены усредненные картины распределения агглютинирующей активности в талломах типичных представители листоватых лишайников:

трёхкомпонентных — P. aphthosa и N. arcticum — и двухкомпонентного цианолишайника P. scabrosa.

Данные лишайники различаются локализацией (рис. 4) и функцией цианобактерий в талломе. В двухкомпонентном цианолишайнике P. scabrosa цианобионт выполняет функцию основного фотобионта. В этих условиях цианобактерии занимают всю зону фотобионта и ориентированы преимущественно на фотосинтез и обеспечение симбиоза сахарами. При этом фиксация атмосферного азота и обеспечение сообщества связанным азотом становится второстепенной функцией. Содержание гетероцист в двухкомпонентных цианолишайниках близко к таковому у свободноживущих цианобактерий [Dahlman and Palmqvist, 2003].

Напротив, в трехкомпонентных лишайниках цианобактерии локализованы в 0,900 0,650 нет ГААср Рис. 4. Морфологические различия листоватых лишайников: а). двухкомпонентный цианолишайник;

б). трехкомпонентный лишайник с внешними цефалодиями;

в). трехкомпонентный лишайник с внутриталломными цефалодиями.

(ВК – верхняя кора, СФ – слой фотобионта, Ц- цефалодий;

ЦБ- цианобионт, ФБ – фикобионт) цефалодиях и играют роль диазотрофного компонента симбиоза. Лишайники P.

aphthosa и N. arcticum отличаются расположением цефалодиев: у P. aphthosa они расположены на поверхности таллома и способны формироваться в разных зонах в течение всей жизни таллома [Paulsrud, Lindblad, 1998], а у N. arcticum цефалодии внутренние, находящиеся в толще таллома на уровне слоя фикобионта, поэтому инициация симбиоза с цианобактериями в этом случае происходит исключительно на апикальном крае [Lehr et al., 2000].

Максимальные и минимальные значения ГАА для P. aphthosa составляли 1,558 и 0,134, соответственно, а для P. scabrosa – 1,820 и 0,269, соответственно.

Средние значения ГАА также были больше для P. scabrosa по сравнению P.

aphthosa и составляли 0,900 и 0,650, соответственно (рис. 4).

Мы предполагаем, что лектин участвует в регуляции количества и физиологического состояния цианобактерий в талломе. Кроме того, он может осуществлять узнавание цианобактерий компетентного штамма. Ввиду этого, существует необходимость поддержания определенной концентрации лектина по всему таллому.

Биомасса цианобактерий в талломе P. scabrosa больше, чем в P. aphthosa [Dahlman, Palmqvist, 2003]. Большие значения ГАА в талломе P. scabrosa по сравнению с P. aphthosa могут объясняться необходимостью взаимодействовать с большим числом цианобактерий.

В талломе N. arcticum лектин обнаруживается только в участках, содержащих цефалодии, и ГАА в них не превышает 0,005. В отличие от P. aphthosa трехкомпонентный лишайник N. arcticum образует внутриталломные цефалодии.

Согласно господствующей теории, цефалодии этого типа образуются только на растущем крае, а в более старых участках таллома увеличиваются только по площади, но не образуют новых структур содержащих цианобактерии [Lehr et al., 2000]. Поэтому необходимость в регуляции активности цианобактерий по всему Рис. 5. Гемагглютинирующая активность участков таллома P. aphthosa с цефалодиями и без цефалодиев таллому отсутствует. Узнавание и установление контактов между компонентами лишайника происходит только во вновь образуемых цефалодиях.

В участках таллома с цефалодиями P. aphthosa уровень ГАА на 62% выше, чем в участках таллома, лишенных их (рис. 5). Цианобактерии в талломе этого лишайника локализованы в цефалодиях;

под этими структурами отсутствует слой фикобионта. Поэтому наличие агглютинирующей активности в участках таллома с цефалодиями и без них свидетельствует о принадлежности лектина микобионту – компоненту лишайника, присутствующего во всех структурах таллома. Кроме того, большее содержание агглютинина в цефалодиях является косвенным доказательством его участия во взаимодействии микобионта с цианобионтом, что согласуется с высказанными ранее предположениями о роли лектина в цианолишайниках [Stocker-Worgotter, 2001].

С помощью реакции прямой агглютинации одноклеточных цианобактерий (рис. 6) удалось показать способность полученного препарата лектина из таллома лишайника P. aphthosa связывать свободноживущие неазотфиксирующие цианобактерии, не участвующие в формировании симбиозов с грибами. Этот факт предполагает наличие подходящих углеводных детерминант на поверхности данных цианобактерий. Сила агглютинации различалась для выбранных видов цианобактерий и во всех случаях была ниже, чем при агглютинации эритроцитов.

По-видимому, именно эволюционная отдаленность человека от цианобактерий, а также широкое разнообразие углеводных эпитопов эритроцитов, сравнительно с цианобактериальными, объясняет более высокую гемагглютинирующую, а не агглютинирующую активность. Титр агглютинации Synechocystis sp. выше, чем титр агглютинации Synechococcus sp. в 2 раза (рис. 6). Это свидетельствует о различной агглютинируемости цианобактерий, а значит и различном уровне лектинового сигнала в этих взаимодействиях. Подобные различия могут быть достаточны для селекции видов и штаммов при образовании симбиоза. Природа выявленных различий, по-видимому, заключается в различном составе и структуре поверхностных структур этих цианобактерий, определяющих количество и Рис. 6. Прямая агглютинация цианобактерий препаратом лектина лишайника P. aphthosa доступность углеводных детерминант, связываемых лектином. Нитчатые цианобактерии рода Nostoc, являющиеся цианобионтом во многих лишайниках, включая P. aphthosa, P. scabrosa и N. arcticum, как правило, обладают хорошо развитыми поверхностными структурами (мощным полисахаридным чехлом), поэтому можно предположить, что сила взаимодействия с ними лектина из таллома лишайника P. aphthosa будет заметно больше, чем со свободноживущими одноклеточными цианобактериями.

Уровень ГАА в разных зонах талломов P. aphthosa и P. scabrosa значительно различается (рис. 7), но прослеживается общая тенденция его возрастания к апикальным участкам (рис. 8). Доля лектинов от суммарной белковой фракции экстрактов таллома P. aphthosa максимальна в апикальной зоне и убывает к базальной (рис. 9). Этот параметр хорошо коррелирует с ГАА, поэтому ГАА можно принять, как адекватный параметр для выражения концентрации лектинов в определенной области таллома.

а) б) Рис. 7. Усредненное двумерное распределение лектина в талломе P. aphthosa (а) и P. scabrosa (б) Рис. 8. Продольный профиль изменения гемагглютинирующей активности (а) и ее стандартного отклонения (б) в талломе лишайника P. aphthosa Рис. 9. Доля лектина от общего белка в апикальной (А), медиальной (М) и базальной (В) зоне таллома лишайника P. aphthosa Повышенная концентрация лектина в нарастающих апикальных зонах может способствовать образованию цефалодиев, обеспечивая специфичное контактное взаимодействие микобионта с гормогониями цианобактерий. В медиальной и базальной зонах таллома цефалодии уже сформированы, а значит, отсутствует необходимость в дальнейшей реинициации симбиоза. В медиальной зоне таллома лишайника лектин может выполнять функцию регулятора численности и физиологического состояния цианобактерий в цефалодиях, а также ограничивать распространение гормогоний цианобактерий по поверхность таллома вне цефалодиев.

Для апикального края таллома лишайника P. aphthosa характерна морфологическая и физиологическая полиморфность. Установлено, что крупные лопасти, оканчивающиеся двумя долями, на апикальном крае таллома имеют два пика концентрации лектина, соответствующие вершинам меньших лопастей (рис.

10, а). Лопасти того же размера, но не подразделенные на меньшие, обладают единственным пиком ГАА на краю (рис. 10, б). Таким образом, апикальные края талломов сложной морфологии имеют несколько пиков агглютинации, соответствующих точкам нарастания и ветвления лопасти. Повышенная концентрация лектина вблизи участков роста таллома, по-видимому, обеспечивает специфическое взаимодействие микобионта с компетентными азотфиксирующими цианобактериями. Вероятен также механизм двухсторонней регуляции количества лектина и ростовой активности таллома. В этом случае высокая концентрация лектина приводит к увеличению биомассы цианобактерий в этой области и повышению количества свободного минерального азота, что в свою очередь является сигналом, разрешающим активное нарастание гиф и деление фикобионта.

Исчерпание доступных источников азота в растущем участке таллома может Рис. 10. Диаграммы гетерогенности гемагглютинирующей активности на апикальном краю таллома лишайника P. aphthosa: а – двулопастной, б – однолопастной участок таллома приводить к увеличению синтеза лектина, способствующего привлечению азотфиксирующих цианобактерий.

Для отображения вариации агглютинирующей активности в различных точках лопастей у разных талломов построен профиль величины стандартного отклонения ГАА во всей выборке изученных нами лопастей (рис. 7). Т. к. количество лектина в апикальной и базальной части таллома сильно различается, стандартное отклонение отнесено к среднему значению ГАА в соответствующей точке и представлено в процентах. Наибольшая вариабельность ГАА обнаружена в апикальной и базальной части талломов. Каждое физиологическое состояние участка таллома характеризуется определенным уровнем активности лектинов, поэтому вариации этого показателя максимальны в областях, способных иметь широкий спектр физиологических состояний. В апикальной зоне происходит нарастание таллома и активное формирование новых цефалодиев [Dahlman, 2003]. В базальной зоне происходит отмирание таллома, сопровождающееся диссоциацией симбиоза.

Высокий уровень вариабельности концентрации лектина в этой зоне определяется отличием участков сохраняющих физиологическую активность и участков отмирающего таллома. Кроме того, в базальной зоне таллома может наблюдаться вторичный рост (формирование точек роста новых лопастей) и образование цефалодиев. Медиальная часть, обладающая наименьшей вариабельностью агглютинирующей активности, является, по-видимому, наиболее стабильной зоной лишайника.

Подобное пространственное распределение описано для многих симбиотических факторов в лишайниках и растительных синцианозах: установлено возрастание от апикальных участков к базальным интенсивности азотфиксации [Hill, 1989;

Rai, 1990], размера клеток [Hill, 2001], доли гетероцист [Janson et al., 1993], концентрации нитрогеназы в клетках цианобионта и концентрации глутаматдегидрогеназы микобионта [Rai et al., 2002]. Обратная зависимость показана для интенсивности фотосинтеза [Janson et al., 1993], скорости деления и роста клеток, а также концентрации глутаминсинтетазы в клетках цианобионта [Hill, 2001]. Подобные различия неоднократно связывались с физиологической активностью компонентов в различных частях симбиотической системы [Rai et al., 2000;

Janson et al., 1993;

Hill, 2001;

Bergman et al., 1992].

Глава 6. Распределение цефалодиев по поверхности таллома листоватых лишайников На основании анализа данных о расположении цефалодиев на талломах P.

aphthosa установлено, что средний размер цефалодиев на поверхности таллома не связан с его площадью. Это указывает на то, что микобионт способен регулировать рост цианобионта в зависимости от потребности симбиоза в азотных соединениях и условий среды. Кроме того, средний размер цефалодиев отличается в разных зонах таллома (рис. 11). Средняя площадь цефалодиев максимальна в медиальной области и минимальна в апикальной. Для формирования цефалодия на поверхности таллома достаточно взаимодействия микобионта с одним гормогонием азотфиксирующей цианобактерии [Goffinet and Bayer, 1997], который после прикрепления делится, под контролем микобионта, дифференцируется, образуя цефалодий. Таким образом, с течением времени размер цефалодиев увеличивается. В процессе апикального нарастания таллома цефалодии образуются на активном крае [Dahlman, 2003], а к моменту достижения ими крупных размеров оказываются в медиальной зоне. В базальной части таллома наблюдается деградация и разрушение части цефалодиев, и формирование цианобактериями подвижных гормогоний, которые участвуют в образовании новых цефалодиев. Деградация некоторых крупных цефалодиев и образование новых мелких в базальной зоне определяет небольшое снижение средней площади цефалодиев в ней по сравнению с медиальной.

Обнаружена прямая зависимость между площадью таллома и суммарной площадью цефалодиев, а также между площадью таллома и числом цефалодиев на нем (рис. 12). Коэффициенты корреляции для этих параметров составляют 0,93 и 0,89, соответственно. Таким образом, в процессе роста таллома увеличивается количество цефалодиев, что указывает на необходимость реинициации симбиоза с цианобактериями и формирования цефалодиев в растущих областях.

Биомасса азотфиксирующих цианобактерий, способная обеспечить единицу площади таллома связанным азотом, постоянна для различных лопастей, но может изменяться в пределах отдельной лопасти. Для оценки этого параметра для каждой зоны таллома вычисляли отношение средней площади цефалодия к квадрату среднего расстояния до десяти ближайших цефалодиев, представленное на рис. как плотность покрытия таллома цефалодиями. Она оказалась минимальной в Рис. 11. Средняя площадь цефалодиев и плотность покрытия таллома цефалодиями в апикальной (А), медиальной (М) и базальной (В) зоне лишайника P. aphthosa Рис. 12. Связь количества цефалодиев и их суммарной площади с площадью таллома лишайника P. aphthosa апикальной зоне и максимальной в базальной. В апикальной части формирующиеся цефалодии имеют малый размер, однако расстояние между ними относительно велико. Можно предположить наличие в талломе лишайника регуляторного механизма, предотвращающего чрезмерное образования цефалодиев, избыток и разрастание которых привели бы к дисбалансу компонентов в медиальной и базальной зоне. Вероятно, что в непосредственной близости от точек активного нарастания таллома плотность цефалодиев увеличена аналогично возрастанию содержания лектина в этих областях (рис. 7). Плотность покрытия цефалодиями медиальной зоны на 4% ниже, чем базальной, но на 40% выше, чем апикальной.

Подобное распределение цефалодиев указывает на то, что после специфичного закрепления азотфиксирующих цианобактерий на поверхности таллома, их деления, дифференцировки и формирования цефалодиев в лишайнике поддерживается соотношение компонентов на постоянном уровне. Это косвенно свидетельствует о наличии регуляторных механизмов, позволяющих динамически контролировать биомассу цианобактерий в талломе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Контактное взаимодействие между микобионтом и фотобионтом (цианобактериями и/или микроводорослями) является ключевым событием для образования, развития и функционирования таллома лишайника. Известно, что главную роль во взаимодействии микобионта с цианобионтом при формировании таллома двухкомпонентного цианолишайника играют лектины [Petit et al., 1983;

Stocker-Worgotter, 2001]. Однако значение лектинов в формировании трехкомпонентного лишайника до настоящего времени не изучалось.

Нами впервые выявлены различия в содержании и распределении лектинов в талломах листоватых лишайников с разной локализацией цианобактерий.

Установлено, что в двухкомпонентном цианолишайнике P. scabrosa содержится максимальное количество агглютининов, в то время как в талломе трехкомпонентного лишайника с внутриталломными цефалодиями N. arcticum агглютинины практически отсутствуют. Картины распределения лектинов в талломе двухкомпонентного цианолишайника P. scabrosa и трехкомпонентном лишайнике с внешними цефалодиями P. aphthosa очень близки. В обоих видах лектины распределены по всему таллому, причем их максимальные концентрации достигаются в апикальных зонах, вблизи растущего края, и уменьшаются в сторону базальной зоны.

Показано, что в участках таллома P. aphthosa с цефалодиями, местах компактной локализации азотфиксирующих цианобактерий, уровень лектина выше, чем в участках таллома, лишенных их. Под цефалодиями отсутствует слой фикобионта, поэтому наличие агглютинирующей активности в участках таллома с цефалодиями и без них свидетельствует о принадлежности лектина микобионту – компоненту лишайника, присутствующего во всех структурах таллома. Сходные данные получены для N. arcticum, трехкомпонентного лишайника с внутриталломными цефалодиями. Основная часть таллома этого лишайника не проявляет ГАА. Только участки с цефалодиями, в которых локализуются азотфиксирующие цианобактерии, ее проявляли. Подобные сходства в распределении лектинов в трехкомпонентных лишайниках указывают на их возможную роль во взаимодействии между мико- и цианобионтом.

С помощью прямой агглютинации свободноживущих цианобактерий удалось показать способность лектина, полученного из таллома лишайника P. aphthosa, связывать свободноживущие неазотфиксирующие цианобактерии, не участвующие в формировании симбиозов с грибами. Это свидетельствует о наличии подходящих углеводных детерминант на поверхности данных цианобактерий. Титр агглютинации Synechocystis sp. оказался вдвое выше, чем титр агглютинации Synechococcus sp., что свидетельствует о различной агглютинируемости цианобактерий и уровне лектинового сигнала в этих взаимодействиях. Природа выявленных различий, по-видимому, заключается в специфическом составе и строении поверхностных структур этих цианобактерий, определяющих количество и доступность углеводных детерминант, связываемых лектином. Нитчатые цианобактерии рода Nostoc, являющиеся цианобионтом во многих лишайниках, включая P. aphthosa, P. scabrosa и N. arcticum, как правило, обладают хорошо развитыми поверхностными структурами (мощным полисахаридным чехлом), поэтому можно предположить, что сила взаимодействия с ними лектинов микобионта будет заметно больше, чем со свободноживущими одноклеточными цианобактериями.

ВЫВОДЫ 1. Агглютинин лишайника P. aphthosa представляет собой гликопротеин массой около 15 кДа, в нативной форме, возможно, образующий гомотетрамер.

Полученный агглютинин термолабилен, устойчив к замораживанию, специфичен к D-галактозе. В присутствии ионов кальция и магния проявляет повышенную гемагглютинирующую активность.

2. Количество агглютинина в талломах лишайников P. aphthosa, P. scabrosa и N. arcticum коррелирует с особенностями их морфоструктурной организации.

Максимальная концентрация агглютининов выявлена в талломе двухкомпонентного цианолишайника P. scabrosa, а минимальная – в талломе трехкомпонентного лишайника N. arcticum с внутриталломными цефалодиями.

3. Топография распределения лектина в лишайнике P. aphthosa зависит от зоны таллома. Апикальная зона характеризуются максимальной средней концентрацией лектина и наивысшей вариабельностью ее значений, а базальная зона - минимальной его концентрацией.

4. Распределение и площадь поверхностных цефалодиев таллома трёхкомпонентного лишайника P. aphthosa зависят от зоны таллома. Средний размер цефалодиев не связан с общей площадью таллома, но их число и суммарная площадь линейно зависят от его площади.

5. Концентрация лектина и распределение цианобактерий на поверхности таллома лишайника P. aphthosa зависят от морфологической зоны. Полученные данные указывают на возможную роль лектинов в узнавании азотфиксирующих цианобактерий и регуляции их физиологии в составе симбиоза.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в реферируемых журналах, рекомендованных ВАК для публикации соискателей ученой степени кандидата наук 1. Феоктистов А.С., Киташов А.В., Лобакова Е.С. Характеристика лектинов трехкомпонентного лишайника Peltigera aphthosa (L.) Willd.// Вестник Московского Университета, сер. 16, Биология, 2009, N 1, М., 2009. С. 26–30.

2. Киташов А.В., Феоктистов А.С., Лобакова Е.С. Особенности распределения лектинов по талломам листоватых цианолишайников// Бюллетень московского общества испытателей природы, отдел биологический, т. 114, вып. 2, 2009, прил. 1 (Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах), М., МАКС Пресс, 2009. С. 58-60.

Статьи, опубликованные в материалах международных конференций 3. Феоктистов А. С., Киташов А. В., Лобакова Е. С. Влияние условий азотного питания на синтез лектина лишайника Peltigera aphthosa (L.) Willd.// Труды XVI международной конференции и дискуссионного научного клуба «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии», Киев, 2008. С. 156-158.

4. Феоктистов А. С., Кожушный А. П., Киташов А. В., Лобакова Е. С. Влияние внешних условий на лектиновую активность микобионта лишайника Peltigera aphthosa// Грибы и водоросли в биоценозах — 2006. Материалы международной конференции, посвященной 75-летию Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова (Москва, 31 января – 3 февраля 2006 г.), М., 2006. С. 163-164.

5. Феоктистов А. С., Киташов А. В., Лобакова Е. С. Изучение лектинового взаимодействия в талломе лишайника Peltigera aphthosa// Вопросы общей ботаники:

традиции и перспективы: Материалы международной научной конференции, посвященной 200-летию Казанской ботанической школы (23-27 января 2006 г.), ч. 1, Казань, 2006. С.

252-254.

6. Феоктистов А. С., Киташов А. В., Лобакова Е. С. Вариабельность агглютинирующей активности таллома лишайника Peltigera aphthosa (L.) Willd., влияние внешних факторов// Материалы I (IX) Международной Конференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге (21-26 мая 2006 года), СПб., ГЭТУ, 2006.

7. Феоктистов А. С., Киташов А. В., Лобакова Е. С. Изучение лектинового взаимодействия в талломе Peltigera aphtosa (L.) Willd.// Грибы в природных и антропогенных экосистемах. Труды международной конференции, посвященной 100 летию начала работы профессора А. С. Бондарцева в Ботаническом институте им. В. Л.

Комарова РАН (Санкт-Петербург, 24-28 апреля 2005 г.), т. 2, СПб., 2005. С. 260-263.

Прочие публикации 8. Феоктистов А. С., Киташов А. В., Лобакова Е. С. Роль лектина лишайника Peltigera aphthosa (L.) Willd. в адаптации симбиоза к условиям азотного питания// Материалы VII конференции молодых ученых и специалистов, посвященной Дню космонавтики и к 45 летию ГНЦ РФ-ИМБП РАН, М., 2008.

9. Феоктистов А. С., Киташов А. В., Лобакова Е. С. Роль лектина в физиологии лишайника Peltigera aphthosa (L.) Willd.// Всероссийская конференция с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем» 25–27 сентября 2007 г. Материалы конференции, Саратов, Научная книга, 2007.

10. Киташов А. В. Кожушный А. П., Феоктистов А. С., Нургазиева Д. К., Лобакова Е. С.

Влияние факторов внешней среды на активность лектинов в талломах трехкомпонентных лишайников// Материалы Х научной конференции Беломорской биологической станции МГУ: Сборник статей, М., «Гриф и К», 2006. С. 146-150.

11. Феоктистов А. С., Киташов А. В., Лобакова Е. С. Физиолого-биохимические основы лектинового взаимодействия в талломе лишайника Peltigera aphthosa// Автотрофные микроорганизмы (памяти академика РАН Е.Н. Кондратьевой): Всероссийский симпозиум с международным участием, Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 21-24 декабря 2005: Материалы, М., МАКС Пресс, 2005. С. 73.

12. Феоктистов А. С., Киташов А. В., Лобакова Е. С. Распределение агглютининов в талломе Peltigera aphtosa (L.) Willd.// Материалы VIII Молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге (17-21 мая 2004 года), СПб., СПГУТД, 2004. С. 88-89.

13. Феоктистов А. С., Киташов А. В., Лобакова Е. С. Пространственно-временные характеристики распределения агглютининов в талломе Peltigera aphtosa// Тезисы докладов XI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов – 2004», секция «Биология» (12-15 апреля, г. Москва), М., МГУ, биологический факультет, 2004. С. 163-164.

14. Феоктистов А. С., Киташов А. В., Лобакова Е. С. Изучение гемагглютинирующей активности участков таллома Peltigera aphtosa// Микология и альгология – 2004.

Материалы юбилейной конференции, посвященной 85-летию кафедры микологии и альгологии МГУ им. М. В. Ломоносова, М., «Прометей» МПГУ, 2004. С. 139-140.