Регуляция апоптоза и пролиферации клеток эпидермоидной карциномы a431 при действии эпидермального фактора роста
На правах рукописи
ГРУДИНКИН Павел Сергеевич РЕГУЛЯЦИЯ АПОПТОЗА И ПРОЛИФЕРАЦИИ КЛЕТОК ЭПИДЕРМОИДНОЙ КАРЦИНОМЫ A431 ПРИ ДЕЙСТВИИ ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Санкт-Петербург 2007 2
Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург
Научный консультант: доктор биологических наук, академик Никольский Николай Николаевич, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Поспелов Валерий Анатольевич, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург кандидат биологических наук Филатов Михаил Валентинович, Санкт-Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН, Санкт-Петербург
Ведущая организация: Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург
Защита состоится 7 декабря 2007 года в 12 ч на заседании диссертацион ного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4. Электронный адрес:
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.
Автореферат разослан 6 ноября 2007 г.
Ученый секретарь кандидат биологических наук диссертационного совета Е.В. Каминская
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы.
Одной из важнейших задач клеточной биологии и медицины является изучение механизмов опухолевой трансформации клеток. Понимание процес сов, лежащих в основе превращения нормальной клетки в трансформирован ную, является базисом для поиска новых методов противораковой терапии.
Особое значение имеют случаи, когда опухолевая клетка при трансформации приобретает особенности, позволяющие селективно индуцировать ее гибель.
Примером является линия эпидермоидной карциномы человека А431, чувстви тельная к действию эпидермального фактора роста (epidermal growth factor, EGF).
Клеточная линия А431 – наиболее популярный объект исследований уче ных, занимающихся передачей сигнала от EGF. Причиной этого служит повы шенная экспрессия рецептора EGF (несколько миллионов молекул на клетку) вследствие амплификации кодирующего его гена (Haigler et al., 1978). Показа но, что именно повышенное количество рецептора в сочетании с аутокринной секрецией одного из его лигандов, TGF, является причиной бесконтрольной пролиферации клеток А431 (Van de Vijver et al., 1991). В то же время, повы шенная экспрессия рецептора EGF приводит к нетипичному ответу на EGF в высоких (наномолярных) концентрациях – ингибированию клеточного роста и гибели клеток. Подобное действие EGF известно для ряда линий трансформи рованных клеток, экспрессирующих повышенное количество рецептора EGF, и редко встречается среди других клеток. Исследование механизмов ответа кле ток А431 на EGF позволит лучше понять механизмы опухолевой трансформа ции, пути возникновения "слабых мест" сигнальных систем опухолевых клеток, которые с необходимостью возникают в процессе трансформации и могут по мочь в уничтожении опухоли, а также механизмы приобретения опухолевыми клетками вторичной устойчивости при селекции на противоопухолевом агенте.
Причины ингибирующего эффекта EGF не вполне ясны – в литературе указывается на значение остановки клеточного цикла (MacLeod et al., 1986;
Fan et al., 1995;
Jakus, Yeudall, 1996;
Ohtsubo et al., 1998) или апоптотической гибели клеток (Gulli et al., 1996;
Chin et al., 1997;
Smida Rezgui et al., 2000;
Anto et al., 2003;
Morazzani et al., 2004) в этом процессе. Не до конца выяснены и сигналь ные пути, приводящие к реализации EGF-зависимого ингибирования прироста популяции клеток А431. Известно, что EGF передает сигнал за счет стимуляции тирозинкиназной активности рецептора EGF и последующей активации ряда сигнальных путей, включая ГТФазы семейств Ras и Rho, MAP-киназы, фосфо липазу C и различные изоформы протеинкиназы C, PI-3-киназу и PKB/Akt, ти розинкиназы семейств Src, JAK и FAK, транскрипционные факторы STAT1, STAT3, STAT5 и NF-B (Schlessinger, 2000). Различные элементы передачи сигнала могут оказывать разное, подчас противоположное, действие на проли ферацию или выживание клеток, и совокупный ответ определяется степенью активации сигнальных путей и их сочетанием. Имеются различные и достаточ но противоречивые данные о роли этих компонентов верхних сигнальных путей в реализации эффектов, вызываемых высокими концентрациями EGF на клетки А431. Так, есть сведения о значении киназы PKC (Toyoda et al., 1998) и NF-B (Ohtsubo et al., 2000), однако наибольшее внимание исследователей привлекает транскрипционный фактор STAT1.
STAT-белки активируются фосфорилированием по тирозину и дополни тельным фосфорилированием по серину, после чего димеризуются, транспор тируются в ядро и активируют транскрипцию генов-мишеней (Bromberg, 2001).
STAT1 чаще всего передает проапоптотический и антипролиферативный сигнал (Battle, Frank, 2002). Эксперименты с использованием доминантно-негативных конструкций (Bromberg et al., 1998) и олигонуклеотидных "ловушек" (Ohtsubo et al., 2000), а также корреляция между ингибирующим клеточный рост эффектом EGF и активацией STAT1 (Chin et al., 1996, 1997;
Bromberg et al., 1998) показали участие STAT1 в вызываемом EGF ингибировании прироста популяции клеток А431. Тем не менее, использованные методы не позволили четко доказать роль STAT1, отделить его от других представителей семейства STAT и установить мишени действия STAT-белков, приводящие к реализации клеточного ответа в данной системе. Дифференциальный подход к изучению транскрипционных факторов семейства STAT важен еще и потому, что для другого представителя семейства, STAT3, доказана центральная роль в зависимой от рецептора EGF супрессии апоптоза, являющейся необходимым компонентом трансформиро ванного фенотипа разнообразных опухолей, экспрессирующих повышенные количества рецептора EGF (Karni et al., 1999;
Garcia et al., 2001;
Rubin Grandis et al., 1998). Проверка универсальности данной модели и ее применимости к клет кам А431 также является неисследованной и актуальной задачей.
Цель и задачи исследования.
Цель работы состояла в изучении регуляции апоптоза и пролиферации клеток эпидермоидной карциномы А431 эпидермальным фактором роста.
В работе были сформулированы следующие экспериментальные задачи:
1. установить биологические эффекты, вызываемые эпидермальным фактором роста на клетки эпидермоидной карциномы А431;
2. идентифицировать сигнальные пути, необходимые для проявления проапоп тотического эффекта эпидермального фактора роста;
3. определить механизмы формирования устойчивости клеток к проапоптотиче скому действию эпидермального фактора роста;
4. методом РНК-интерференции установить роль транскрипционных факторов STAT1 и STAT3 в ответе клеток A431 на действие эпидермального фактора роста;
5. исследовать участие STAT1 и STAT3 в накоплении регуляторов клеточного цикла и апоптоза при действии эпидермального фактора роста на клетки А431.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Эпидермальный фактор роста вызывает остановку клеточного цикла и даль нейшую апоптотическую гибель клеток эпидермоидной карциномы А431.
2. Рецептор эпидермального фактора роста, киназы Src-семейства, MAP-киназа p38 и транскрипционный фактор STAT1, но не STAT3, необходимы для проявления проапоптотического эффекта эпидермального фактора роста.
3. Приобретенная в результате селекции устойчивость клональных вариантов клеток А431 к действию эпидермального фактора роста вызвана уменьше нием количества транскрипционного фактора STAT1.
4. В накоплении ингибитора циклин-зависимых киназ p21waf1 и ингибитора апоптоза Bcl-XL при действии эпидермального фактора роста в клетках A участвует транскрипционный фактор STAT3.
Научная новизна работы.
В работе впервые проведен подробный анализ причин ингибирования прироста популяции клеток A431 при действии EGF и показана основопола гающая роль апоптотической гибели клеток с последующим откреплением от субстрата в этом процессе. При помощи РНК-интерференции впервые одно значно доказана роль транскрипционного фактора STAT1 (но не STAT3) в про ведении проапоптотического сигнала. Впервые показан механизм приобретения клетками устойчивости к действию EGF за счет снижения экспрессии STAT1, а также возможность реверсии EGF-устойчивого фенотипа за счет экспрессии STAT1. Впервые показано значение STAT3 в накоплении p21waf1 при действии на клетки EGF. Впервые отмечена роль MAP-киназы p38 в EGF-зависимой ин дукции гибели клеток A431.
Теоретическое и практическое значение работы.
В работе показано, что апоптотическая гибель является основным резуль татом действия EGF на клетки А431. Для этого ответа необходима интеграция множественных сигнальных путей и молекул, в том числе тирозинкиназы ре цептора EGF, транскрипционного фактора STAT1, нерецепторных тирозинки наз Src-семейства, МАР-киназы p38. STAT3 не нужен для проведения проапоп тотического сигнала после обработки EGF, но участвует в накоплении белков с антиапоптотической функцией – Bcl-XL и p21waf1. Доказано, что приобретение устойчивости трансформированных клеток с повышенной экспрессией рецеп тора эпидермального фактора роста к высоким дозам EGF может быть связано со снижением содержания STAT1. Чувствительность к действию EGF возвра щается при повышении экспрессии STAT1.
Полученные результаты закладывают основу для дальнейшего изучения молекулярных механизмов проапоптотического действия EGF при трансформа ции клеток, вызванной повышенной экспрессией рецептора EGF. Данные по механизмам индукции апоптоза могут быть полезны в разработке методов про тивоопухолевой терапии, а анализ причин устойчивости клональных вариантов позволяет прогнозировать возможные осложнения. Новые клеточные линии, полученные в работе, можно использовать в дальнейших исследованиях пере дачи сигнала с участием STAT-белков. Материалы диссертации могут быть ис пользованы в учебных лекционных курсах по клеточной биологии.
Апробация работы.
По теме диссертации опубликовано 4 статьи и сделано 5 стендовых сооб щений на всероссийских конференциях. Основные положения диссертации бы ли доложены и обсуждались на научных семинарах Отдела внутриклеточной сигнализации и транспорта, Лаборатории молекулярных основ дифференциров ки клеток и Отдела клеточных культур Института цитологии РАН.
Объем и структура диссертации.
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описа ния материалов и методик, результатов, обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 165 ссылок. Материалы дис сертации изложены на 138 страницах текста и иллюстрированы 37 рисунками.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА Культивирование клеток.
В работе использованы клетки эпидермоидной карциномы человека А431 (Россий ская коллекция клеточных культур, Институт цитологии РАН), а также клональные вариан ты 1а, 8а и 11а, полученные Гудковой и Сорокиным (1989) путем селекции обработанных 1 метил-3-нитро-1-нитрозогуанидином клеток А431 в присутствии EGF. Клетки культивиро вали в среде ДМЕ (Панэко, Россия), содержащей 10 % сыворотки эмбрионов коров (РАА, Австрия) и 80 мкг/мл гентамицина (KRKA, Словения). Для экспериментов клетки рассевали на чашки в плотности 1,1104 клеток в 0,18 мл среды на 1 см2. Через 16-18 ч добавляли нг/мл EGF. Ингибиторы киназ добавляли за 40 мин до стимуляции EGF. При длительных экспериментах ингибиторы добавляли через каждые сутки, чтобы компенсировать их дегра дацию.
Плазмиды.
Плазмиды, кодирующие кДНК STAT1 и STAT1(Y701F), и вектор pCAGGS-neo были любезно предоставлены д-ром Т. Хирано (Университет Осаки, Япония). Вектор mU6pro был подарен д-ром Д.Л. Тернером (Университет Мичигана, США). Ген устойчивости к неоми цину амплифицировали из плазмиды pRc-CMV и субклонировали между сайтами рекстрик ции ApaI и HindIII вектора mU6pro с использованием ПЦР-праймеров TAC CGG GCC CGA ATT CTG TGG AATGTG и TTTAAG CTT CCG GCT CGT ATG TTG TGT G. Следующие синтетические олигонуклеотиды длиной 49 п.н., кодирующие миРНК, отжигали попарно и клонировали между рестрикционными сайтами BbsI и XbaI: TTT GAT ACT TCA GGG GAT TCT CAG GGA GAA TCC CCT GAA GTA TCT TTT T и CTA GAA AAA GAT ACT TCA GGG GAT TCT CCC TGA GAA TCC CCT GAA GTA T для STAT1 человека (соответствует 2332-2350 п.н. последовательности GenBank NM_007315);
TTT GAA GGC GTG ATT CTT CCC ACA GTG GGA AGA ATC ACG CCT TCT TTT T и CTA GAA AAA GAA GGC GTG ATT CTT CCC ACT GTG GGA AGA ATC ACG CCT T для STAT3 человека (соответствует 568-586 п.н. последовательности GenBank NM_139276);
TTT GAA GAA GTC GTG CTG CTT CAT GGA AGC AGC ACG ACT TCT TCT TTT T и CTA GAA AAA GAA GAA GTC GTG CTG CTT CCA TGA AGC AGC ACG ACT TCT T для отсутствующего в клетках А белка EGFP (enhanced green fluorescent protein – улучшенный зеленый флуоресцентный бе лок медузы) (последовательность по Yu et al., 2002). Нуклеотидные последовательности по лученных конструкций проверяли секвенированием с использованием праймеров GCT ACA TTT TAC ATG ATA GGC TTG G (U6-forward) и CAC AGG AAA CAG CTA TGA CCA T (M13-rev).
Трансфекции.
Для проведения трансфекций клетки рассевали в плотности 3,5105 клеток на лунку 24-луночной платы в 500 мкл среды. Трансфекции проводили с помощью реагента Липо фектамин2000 (Invitrogen, США) согласно протоколу изготовителя. Через 12-16 ч после трансфекции среду меняли на свежую, еще через сутки клетки рассевали и селектировали стабильные линии на 1 мг/мл антибиотика G-418 (Invitrogen, США).
Электрофорез и иммуноблоттинг.
Клетки дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и лизировали в течение 10 мин в PBS с добавлением 1 % Тритона Х-100, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ NaF, 1 мМ Na3VO4 и коктейля протеазных ингибиторов (Sigma, США). При выявлении активной каспазы 3 пла вающие клетки лизировали вместе с прикрепленными. Белки разделяли методом SDS электрофореза в полиакриламидном геле, а затем проводили их электроперенос на нитро целлюлозную мембрану. Окрашивание антителами проводили в соответствии со стандарт ными протоколами Bio-Rad Laboratories с использованием коньюгированных с пероксида зой хрена вторичных антител и реакции усиленной хемилюминесценции. Для контроля рав ного количества белка в пробах проводили окрашивание антителами против тубулина или -актина.
Антитела.
В работе были использованы первичные антитела против следующих эпитопов: ре цептор EGF (клон 29.1, Sigma), фосфотирозин (clone PY-20, BD Pharmingen, США), pY рецептор EGF (Cell Signaling Technology, США), STAT1 (моноклональные, BD Pharmingen), STAT3 (моноклональные, BD Pharmingen), STAT5 (поликлональные, Cell Signaling Technology), pY701 STAT1 (Cell Signaling Technology), pY705 STAT3 (Cell Signaling Technology), pY694 STAT5 (Cell Signaling Technology), pS727 STAT1 (любезно предостав лены д-ром А. Ларнером (Институт Лернера, Кливленд, США), pS727 STAT3 (Cell Signaling Technology), ERK 1, 2 (Santa Cruz Biotechnologies, США), pT202/pY204 ERK 1,2 ("pERK", поликлональные, Cell Signaling Technology), активная (расщепленная по Asp175) каспаза (Cell Signaling Technology), тубулин (клон B-5-1-2, Sigma), -актин (клон AC-74, Sigma).
Оценка жизнеспособности клеток (MTT).
Количественную оценку жизнеспособности клеток проводили с использованием реа гента МТТ (Sigma, США), который в живых клетках восстанавливается митохондриальны ми гидрогеназами до формазана пурпурного цвета. Для экспериментов клетки выращивали на 96-луночных платах и инкубировали 2 ч в 50 мкл 0,715 мг/мл раствора МТТ в среде ДМЕ с сывороткой в СО2-инкубаторе. По истечении этого времени среду заменяли на ДМСО и измеряли оптическую плотность раствора при 570 нм на приборе UNIPLAN ("Пикон", Рос сия). В каждом опыте использовали 5-6 повторностей для каждой точки. Среднее значение оптической плотности лунок нормализовали к среднему значению оптической плотности лунок на момент добавления EGF. По результатам 2-5 независимых экспериментов были вычислены средние значения относительной оптической плотности и стандартные отклоне ния.
Подсчет числа клеток.
Прикрепленные клетки снимали раствором химотрипсина в растворе Версена. При необходимости подсчета открепившихся клеток их осаждали из среды культивирования и подсчитывали отдельно. Подсчет клеток осуществляли в камере Горяева каждые 24 ч в те чение 3 сут. В каждом опыте использовали 2 повторности для каждой точки. Среднее зна чение числа клеток нормализовали к среднему значению числа клеток на момент добавле ния EGF. По результатам 2-3 независимых экспериментов были вычислены средние значе ния относительного числа клеток и стандартные отклонения.
Микроскопия.
Клетки, выращенные на покровных стеклах, а также открепленные клетки фиксиро вали 4 %-ным формалином, окрашивали DAPI (1 мкг/мл). Препараты фотографировали на микроскопе Leica DMRE (Германия) фотоаппаратом Nikon Coolpix в режимах флуоресцент ной и фазово-контрастной микроскопии.
Анализ олигонуклеосомной фрагментации ДНК.
Апоптотическую гибель клеток оценивали электрофоретически по появлению фрак ции экстрахромосомной ДНК. Для этого прикрепленные клетки трипсинизировали, объеди няли с открепленными и подсчитывали в камере Горяева. Равные количества клеток (2,5105) лизировали на льду в течение 15 мин в гипотоническом буфере следующего соста ва: 5 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 0,5 % Тритона Х-100 и 100 мМ ЭДТА. Клеточные лизаты цен трифугировали, надосадочную жидкость отбирали в отдельные пробирки, в которые добав ляли NaCl до конечной концентрации 0,15 M и РНКазу А до 100 мкг/мл, а затем инкубиро вали 1 ч при 37 °С. После этого в пробы добавляли SDS до конечной концентрации 0,5 % и протеиназу К до 200 мкг/мл и инкубировали 2 ч при 56 С. Затем осуществляли депротеини зацию хлороформом и осаждение ДНК. Электрофорез проводили в 2 %-ном агарозном геле в трис-боратном буфере, рН 8,0. После электрофореза гель окрашивали бромидом этидия и фотографировали при ультрафиолетовом освещении.
Проточная цитометрия.
Клетки анализировали на проточном цитофлуориметре ACR1400 (Bruker, Франция).
Вычисления были проведены с использованием программ WinList и ModFit LT (Verity Software House, США). Во всех случаях использовался фильтр по параметрам фронтальное светорассеяние – боковое светорассеяние.
а: Распределение клеток по фазам клеточного цикла (окраска иодидом пропидия):
Прикрепленные клетки трипсинизировали, соединяли с плавающими (если указано), фиксировали 50 %-ным этанолом при –20 °C и промывали PBSE (PBS, содержащий 1 мМ ЭДТА) дважды. Фиксированные клетки ресуспендировали в PBSE, содержащем 50 мкг/мл иодида пропидия и 50 мкг/мл РНКазы А, и инкубировали 30 мин при 37 °C.
б: Количество пройденных клеточных циклов (мечение CFDA-SE):
Перед посевом трипсинизированные клетки инкубировали 5 мин в суспензии в бес сывороточной среде ДМЕ, содержащей 2,5 мкМ сукцинимидного эфира диацетата карбок сифлуоресцеина (CFDA-SE, Invitrogen, США). После двух промывок в среде ДМЕ с сыво роткой клетки рассевали в плотности 1,1104 клеток в 0,18 мл среды на 1 см2. Через 12-14 ч добавляли 200 нг/мл EGF. Через 2 сут прикрепленные клетки трипсинизировали, фиксиро вали 50 %-ным этанолом при –20 °C и дважды промывали PBSE.
в: Поздние стадии апоптоза (реакция TUNEL):
Прикрепленные клетки трипсинизировали, соединяли с плавающими, фиксировали 50 %-ым этанолом при –20 °C и промывали PBSE дважды. Сайты неспецифического связы вания блокировали инкубацией в 5 %-ном растворе БСА в PBSE в течение 2 ч, а затем снова промывали PBSE и преинкубировали в буфере для TDT (terminal deoxynucleotidyl transferase – терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза) (Fermentas, Литва) 30 мин. После этого клетки инкубировали в буфере для TDT, содержащем 25 мкМ биотинилированного dUTP (Sigma), 250 мкМ dATP (Сибэнзим, Россия) и 0,5 ед/мкл TDT (Fermentas) 2,5 ч при 37 °C.
Реакцию останавливали добавлением ЭДТА до 15 мМ. После этого промывали PBSE и до бавляли смесь, содержащую 50 мг/мл БСА, авидин, конъюгированный с FITC, и 100 мкг/мл РНКазы A (Sigma) в PBSE на 1 ч при комнатной температуре.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. EGF индуцирует остановку клеток А431 в фазах клеточного цикла G2 и G1 и последующую апоптотическую гибель (Бурова и др., 2001;
Гру динкин и др., 2003;
Grudinkin et al., 2007).
Известно, что EGF в достаточно высоких концентрациях (более 1 нг/мл) вызывает торможение прироста популяции и гибель клеток А431 (Gill and Lazar, 1981). Различные авторы объясняли это явление индукцией блоков кле точного цикла (MacLeod et al., 1986;
Fan et al., 1995;
Jakus and Yeudall, 1996;
Ohtsubo et al., 1998) или стимуляцией апоптоза (Gulli et al., 1996;
Chin et al., 1997;
Smida Rezgui et al., 2000;
Anto et al., 2003;
Morazzani et al., 2004), при этом ни в одной из работ не были одновременно изучены оба процесса. Нами был проведен анализ пролиферации клеток методом проточной цитофлуориметрии.
Мечение клеток флуоресцентным красителем CFDA-SE позволяет отделить пролиферирующие клетки, интенсивность флуоресценции которых уменьшает ся вдвое при каждом делении (и, соответственно, пик распределения на гисто грамме флуоресценция-количество смещается влево по сравнению с только что помеченными клетками), от блокированных или задержанных в цикле клеток (Lyons, 2000). В нашем случае воздействие EGF приводило к задержке деления большей части популяции клеток А431 (рис. 1А). Анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла показал, что при действии EGF уменьшается доля клеток А431 в фазе S и увеличивается доля клеток в фазах G2/M и (в меньшей степени) G1 (рис. 1Б), что в совокупности с данными мечения CFDA-SE позво ляет говорить о блоке клеточного цикла в фазах G2 и G1. В то же время EGF вызывал значительное увеличение доли клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК, что свидетельствует о стимуляции клеточной гибели. При действии EGF наблюдалось уменьшение числа клеток, детектируемое как прямым подсчетом (рис. 1В), так и методом МТТ (рис. 1Г). При действии EGF клетки теряли ха рактерную эпителиальную морфологию и округлялись (рис. 1Д). Тем не менее, окраска ДНК клеток реагентом DAPI выявила только незначительное количест во апоптотических клеток (с ядрами, содержащими фрагменты конденсирован ного хроматина) среди клеток, остающихся прикрепленными, в то время как практически все клетки, открепившиеся от подложки, имели ядра с характерной апоптотической морфологией (рис. 1Е). Мы полагаем, что апоптоз, вызываемый EGF в клетках А431, сопровождается быстрым откреплением клеток. В этих ус ловиях число открепившихся клеток должно коррелировать с интенсивностью апоптотической гибели клеток. Действительно, процент открепившихся клеток A431 резко возрастал при воздействии EGF (рис. 1Ж). Индукция апоптоза при обработке клеток А431 EGF была также подтверждена методами детекции экс трахромосомной ДНК (рис. 1З), иммуноблотом с использованием антител про тив активной (расщепленной) каспазы 3 (рис. 1И) и проточной цитофлуори метрией с использованием реакции TUNEL, позволяющей обнаружить апопто тические клетки путем детекции образующихся при апоптозе разрывов ДНК (рис. 1К).
Таким образом, в использованных в работе условиях EGF вызывает в клетках А431 остановку клеточного цикла в фазах G2 и G1, но конечным ре зультатом действия EGF является индукция апоптоза, сопровождающегося от креплением клеток от субстрата.
Рис. 1. EGF вызывает апоптотическую гибель клеток А431.
Клетки А431 рассевали в плотности 1,1104 клеток на см2 и через 16-24 ч (12 14 ч для панели А) добавляли 200 нг/мл EGF. А: Проточная цитофлуориметрия:
разбавление метки CFDA-SE. Показано распределение по флуоресценции CFDA-SE клеток, фиксированных непосредственно после мечения ("Исходно"), и клеток, культивировавшихся в течение 2,5 сут ("EGF" – из них 2 сут в присутствии EGF). Б:
Проточная цитофлуориметрия: распределение по фазам клеточного цикла. Через суток культивирования в отсутствие ("Контроль") или в присутствии ("EGF") EGF клетки (вместе с открепившимися) окрашивали иодидом пропидия. Показан про цент гиподиплоидных (Sub-G1) клеток и распределение диплоидных клеток по фа зам клеточного цикла. В: Ежедневный подсчет количества клеток. Г: Количество жизнеспособных клеток оценивалось каждые сутки при помощи реакции МТТ. Д:
Микрофотографии клеток в фазово-контрастном режиме через 2 сут после добавле ния EGF. Е: Типичная морфология ядер прикрепленных и открепившихся клеток при окраске DAPI. Показаны микрофотографии флуоресценции ядер обработанных EGF клеток через 3 сут после добавления EGF. Ж: Ежедневный подсчет процента открепившихся клеток. З: Детекция экстрахромосомной ДНК через 2 сут после об работки EGF. И: Иммуноблоттинг тотальных лизатов клеток через 2 сут после об работки EGF, выявление активной (расщепленной) каспазы 3. К: Проточная цитоф луориметрия: реакция TUNEL. Показано распределение клеток по интенсивности флуоресценции, отражающей результат реакции TUNEL, через 2 сут культивирова ния в отсутствие ("Контроль") или в присутствии ("EGF") EGF.
2. Исследование клональных вариантов клеток А431, устойчивых к действию EGF.
Перспективным методом исследования проведения сигнала, вызывающего снижение численности популяции лиганд-чувствительных клеток, является ис пользование клональных вариантов, устойчивых к действию лиганда. Путем се лекции клеток в присутствии EGF или антител против рецептора EGF (Buss et al., 1982;
Behzadian and Shimizu, 1985;
Fan et al., 1995) возможно выделить кло ны клеток А431, устойчивых к действию EGF. В настоящей работе мы исполь зовали клональные варианты 1а, 8а и 11а, полученные Гудковой и Сорокиным селекцией в присутствии EGF и 1-метил-3-нитро-1-нитрозогуанидина (Гудкова и Сорокин, 1989). Все три линии демонстрировали значительно меньшую чув ствительность к EGF по сравнению с материнской линией А431 (рис. 2).
2.1. В клетках клональных вариантов 1а, 8а и 11а снижено количество и фосфорилирование транскрипционного фактора STAT1 (Грудинкин и др., 2003).
Анализ различных сигнальных белков методом иммуноблоттинга показал, что основным отличием устойчивых клональных вариантов 1а, 8а и 11а от ис ходной линии А431 является значительно меньшее содержание транскрипцион ного фактора STAT1 в клональных вариантах (рис. 3). EGF-зависимое фосфо рилирование STAT1 по тирозину практически не детектировалось в клональ ных вариантах. Экспрессия и фосфорилирование других белков не были пред Рис. 2. Клональные варианты 1а, 8а и 11а клеток А431 устойчивы к действию EGF.
Клетки А431 и их селектированные в присутствии EGF клональные варианты 1а, 8а и 11а культивировали без EGF или в присутствии 200 нг/мл EGF. Количество жизнеспо собных клеток оценивалось каждые сутки при помощи МТТ.
Рис. 3. В клетках клональных вариантов 1а, 8а и 11а, устойчивых к действию EGF, снижено количество и фосфорилирование транскрипционного фактора STAT1.
Клетки А431 и их клональные варианты 1а, 8а и 11а рассевали в плотности 8104 клеток на см2 и через ч добавляли 200 нг/мл EGF на срок 10 мин. Тотальные лизаты клеток анализировали при помощи иммуноблот тинга.
метом столь больших различий, хотя количества STAT3 и рецептора EGF тоже были снижены (рис. 3). Можно предположить, что наблюдаемое в клональных вариантах снижение количества и фосфорилирования STAT1 является механизмом приобретения устойчивости клеток к действию EGF и свидетельствует о важности STAT1 в про ведении от EGF сигнала, направленного на ин дукцию гибели клеток А431.
2.2. Трансфекция STAT1 возвращает клеткам клонального варианта 8а чувстви тельность к действию EGF (Grudinkin et al., 2007).
С целью доказать важность снижения ко личества STAT1 в устойчивых к действию EGF клональных вариантах мы стабильно трансфици ровали клетки одного из клональных вариантов, 8а, плазмидами, кодирующими STAT1 дикого типа или доминантно негативный STAT1 (STAT1F;
тирозин 701 заменен на фенилаланин), или пустым вектором в качестве контро ля. Полученные линии далее обозна чены 8а-STAT1, 8а-STAT1F и 8а mock соответственно. Методом им муноблоттинга доказано увеличение количества STAT1 в клетках 8а STAT1 и 8а-STAT1F при неизменном уровне экспрессии дру гих белков, при этом фосфорилирование STAT увеличивалось в клетках 8а-STAT1 и еще сильнее подавлялось в клетках 8а-STAT1F (рис. 4). Анализ количе ства жизнеспособных клеток при дей ствии EGF показал, что клетки 8а Рис. 4. Экспрессия STAT1 в клональ mock и 8а-STAT1F сохранили устой ном варианте 8а.
чивость к действию EGF, характер Клетки А431, 8а, а также 8а, трансфи ную для клеток линии 8а, в то время цированные пустым вектором pCAGGS (8a как клетки, трансфицированные mock), STAT1 дикого типа (8a-STAT1) или STAT1 с мутацией Y701F (8a-STAT1F) об- STAT1 дикого типа, оказались EGF рабатывали и анализировали, как на рис. 3. чувствительными (рис. 5). Таким об Рис. 5. Экспрессия STAT1 в клональном варианте 8а возвращает клеткам чувстви тельность к действию EGF.
Клеточные линии, как на рис. 4. Эксперимент, как на рис. 2.
Рис. 6. Ингибиторы рецептора EGF, киназ Src-семейства и p38 MAP-киназы предотвращают индукцию клеточной гибели при действии EGF на клетки A431.
А: Клетки А431 рассевали в плотности 1,1104 клеток на см2 и через 20 ч добавляли ингибиторы киназ, а еще через 40 мин – 200 нг/мл EGF. Для компенсации деграда ции ингибиторов те же количества добавляли дополнительно каждые 24 ч. Количе ство жизнеспособных клеток оценивалось ежедневно при помощи реакции МТТ. Б:
Клетки рассевали и обрабатывали, как в А, и через 2 сут после добавления EGF фо тографировали в фазово-контрастном режиме. В: Клетки А431 рассевали в плотно сти 8104 клеток на см2 и через 20 ч добавляли киназные ингибиторы, а еще через 40 мин – 200 нг/мл EGF на 10 мин. Тотальные лизаты клеток анализировали при помощи иммуноблоттинга. Г: Проточная цитофлуориметрия: разбавление метки CFDA-SE. Показано распределение по флуоресценции CFDA-SE клеток, фиксиро ванных непосредственно после мечения ("Исходно"), и клеток, культивировавших ся в течение 2,5 сут (из них 2 сут в присутствии EGF и (или) ингибиторов киназ). Д:
Проточная цитофлуориметрия: распределение по фазам клеточного цикла. Клетки А431 рассевали и обрабатывали, как в А. Через 2 сут клетки окрашивали иодидом пропидия. Показан процент гиподиплоидных (Sub-G1) клеток и распределение ди плоидных клеток по фазам клеточного цикла.
разом, устойчивость клональных вариантов клеток А431 к действию EGF может быть обращена за счет введения способного фосфорилироваться по тирозину STAT1. Это доказывает, что уменьшение количества и фосфорилирования STAT1 является механизмом приобретения устойчивости клеток А431 к дейст вию EGF и свидетельствует о важности STAT1 в проведении от EGF сигнала, направленного на снижение численности популяции клеток А431.
3. Ингибирование тирозинкиназы рецептора EGF и тирозинкиназ се мейства Src защищает клетки A431 от действия EGF, а ингибирование МАР-киназы р38 блокирует EGF-индуцируемый апоптоз при сохранении блоков клеточного цикла (Василенко и др., 2001;
Grudinkin et al., 2007).
Для проверки роли различных сигнальных путей в выживании и пролифе рации клеток A431 мы использовали ингибиторный анализ. Известно, что бло кирование функции рецептора EGF химическим ингибитором или антителами может нейтрализовать действие EGF на клетки А431, но большие дозы блоки рующего агента приводят к гибели клеток независимо от действия EGF вслед ствие ингибирования необходимой для выживания клеток A431 передачи сиг нала от аутокринно-секретируемого TGF (Gulli et al., 1996;
Busse et al., 2000).
В наших экспериментах ингибиторы тирозинкиназы рецептора EGF compound 56 (2мкМ) и тирфостин AG1478 (5 мкМ) спасали клетки A431 от гибели и пре дотвращали изменение морфологии клеток при действии EGF (рис. 6А, Б), од нако AG1478 в концентрации 10 мкМ индуцировал гибель клеток даже без EGF, что соответствует описанной выше концепции.
В то время как киназная активность рецептора EGF важна для активации всех EGF-стимулируемых путей, активность тирозинкиназ семейства Src необ ходима для EGF-зависимой активации транскрипционных факторов семейства STAT, но не других сигнальных путей (Olayioye et al., 1999). В наших экспери ментах compound 56 и тирфостин AG1478 ингибировали фосфорилирование ре цептора EGF, ERK, STAT1, STAT3 и STAT5, в то время как ингибитор киназ семейства Src CGP77675 супрессировал фосфорилирование только STAT1 и, в мньшей степени, STAT3 (рис. 6В). Подобно ингибиторам рецептора EGF, CGP77675 предотвращал гибель и морфологические изменения клеток A при действии EGF (рис. 6А, Б), что свидетельствует о важности киназ Src семейства и подтверждает гипотезу об участии STAT1 (или STAT3) в EGF индуцируемой гибели клеток А431.
Кроме того, мы показали влияние на клетки А431 ингибиторов еще двух сигнальных путей – PI-3 киназы и МАР-киназы p38. Ингибитор PI-3 киназы LY294002 тормозил рост клеток без EGF и не препятствовал EGF индуцируемой гибели. В отличие от EGF или высоких концентраций AG1478, LY294002 вызывал не уменьшение, а стаби лизацию количества клеток, не инициировал округление, способствовал замедлению де ления клеток и накоплению клеток в фазе G (рис. 6 А, Б, Г, Д). Таким образом, PI-3 кина за является необходимой для пролиферации клеток А431, и ее ингибирование вызывает блок клеточного цикла в фазе G1, что соот ветствует данным литературы (Busse et al., 2000).
Ингибитор МАР-киназы p38 SB сам по себе не оказывал влияния на клетки А431, но в комбинации с EGF он частично обращал эффект EGF, вызывая стабилизацию количества клеток, способствовал уменьше нию количества межклеточных контактов и появлению отростков клеток (рис. 6 А, Б).
При этом задержка деления клеток (рис. 6 Г) и падение доли клеток, находящихся в S фазе, были еще более выражены по сравне нию с действием EGF без ингибитора, а на копления гиподиплоидной популяции клеток не происходило (рис. 6 Д). Исходя из этого, Рис. 7. Снижение количества STAT1 или STAT3 в клетках А431 методом РНК интерференции.
Клетки А431, нетрансфицированные или стабильно трансфицированные плазмида ми, экспрессирующими миРНК против белков STAT1 ("sh-STAT1"), STAT3 ("sh-STAT3") и контрольного белка EGFP ("sh-EGFP"), рассевали в плотности 1,1104 клеток на см2 и ли зировали через 16-24 ч или после дополнительного культивирования 2 сут в присутствии 200 нг/мл EGF. Тотальные лизаты клеток анализировали при помощи иммуноблоттинга.
Рис. 8. Уменьшение количества STAT1, но не STAT3, снижает чувствительность клеток А431 к EGF.
Клеточные линии, как на рис. 7. Эксперимент, как на рисунке 2.
можно сделать вывод о том, что из событий, индуцируемых EGF в клетках А431, апоптоз, но не блоки клеточного цикла, требует передачи сигнала через МАР-киназу р38.
4. Исследование роли транскрипционных факторов STAT1 и STAT3 в EGF-индуцируемом апоптозе клеток A431 методом РНК-интерференции Совокупность изложенных выше данных указывает на роль STAT1 или STAT3 в регуляции апоптоза клеток. Для того чтобы достоверно установить значение каждого из транскрипционных факторов STAT1 и STAT3 в клетках A431, мы сконструировали плазмиды на основе вектора mU6pro (Yu et al., 2002), экспрессирующие малые интерферирующие РНК (миРНК), направлен ные против STAT1 или STAT3, а также против EGFP (зеленого флуоресцентно го белка, отсутствующего в человеческих клетках) в качестве контроля. Спо собность полученных конструкций направленно снижать уровень соответст вующего STAT-белка была показана в экспериментах по временной трансфек ции в клетках HEK293 (см. дисс.). Поскольку эффективность трансфекции в клетках А431 мала, мы получили постоянные клеточные линии (далее обозна чены sh-STAT1, sh-STAT3 и sh-EGFP). Методом иммуноблоттинга доказано снижение количества (и, соответственно, фосфорилирования) целевого STAT белка при отсутствии изменений в уровне другого STAT-белка или рецептора EGF (рис. 7). Таким образом была продемонстрирована пригодность получен ных клонов для изучения роли STAT1 и STAT3 в клетках А431.
4.1. Направленное снижение количества STAT1, но не STAT3, значи тельно уменьшает чувствительность клеток A431 к проапоптотическому действию EGF (Grudinkin et al., 2007).
Используя два различных метода, реакцию МТТ (рис. 8) и подсчет клеток (см. дисс.), мы исследовали рост клеток со сниженным количеством STAT1 или Рис. 9. Уменьшение количества STAT1, но не STAT3, снижает долю гипо диплоидных клеток А431 при действии EGF.
Клеточные линии, как на рис. 7.
Клетки культивировали 2 сут в присутст вии ("EGF") или в отсутствие ("Кон троль") EGF. Прикрепленные и открепив шиеся клетки объединяли, фиксировали, окрашивали иодидом пропидия и анали зировали методом проточной цитофлуо риметрии. Процент гиподиплоидных кле ток (Sub-G1) и распределение диплоидных клеток по фазам клеточного цикла вычис ляли в программе ModFit LT.
STAT3 в контроле и в присутствии EGF. Оба метода дали одинаковые результа ты: уменьшение количества STAT1 или STAT3 не влияло на прирост клеток в контроле, а при действии EGF клетки sh-STAT1, но не sh-STAT3 или sh-EGFP, приобретали устойчивость к EGF – клетки sh-STAT1 продолжали делиться в присутствии EGF. Методом проточной цитофлуориметрии не было выявлено различий в распределении клеток разных линий по циклу в контроле, однако при действии EGF мы наблюдали отсутствие характерного для линии А431 на копления гиподиплоидных клеток у линии sh-STAT1 (рис. 9), что говорит об уменьшении EGF-зависимой гибели клеток при снижении количества STAT1.
Процент открепившихся клеток при действии EGF также был значительно меньше в линии sh-STAT1 (рис. 10А). Наконец, методами детекции экстрахро мосомной ДНК (рис. 10Б) и иммуноблотом с использованием антител против активной каспазы 3 (рис. 10В) мы показали отсутствие EGF-зависимого апопто за в клетках sh-STAT1. Полученные результаты свидетельствуют о необходи мости транскрипционного фактора STAT1 для индукции апоптоза в клетках А431 при действии EGF и об отсутствии влияния STAT3 на пролиферацию и выживание клеток А431 как в контроле, так и в присутствии EGF.
4.2. В EGF-зависимое накопление ингибитора циклин-зависимых ки наз p21waf1 и ингибитора апоптоза Bcl-XL в клетках А431 вовлечен транс крипционный фактор STAT3, но не STAT1.
Транскрипционные факторы семейства STAT регулируют апоптоз и про лиферацию путем индукции транскрипции ряда генов, включающих другие транскрипционные факторы, члены семейства Bcl-2, прокаспазы, Fas и FasL, циклины, ингибиторы циклин-зависимых киназ (Bromberg, 2001;
Battle, Frank, 2002). Мы проанализировали EGF-зависимую индукцию антиапоптотического белка Bcl-XL (Cory, Adams, 2002) и ингибитора циклин-зависимых киназ p21waf1, способного также проявлять антиапоптотические свойства (Dotto, 2000).
Гены обоих белков известны как непосредственные мишени транскрипционных Рис. 10. Уменьшение количе ства STAT1, но не STAT3, ингибиру ет EGF-индуцируемый апоптоз кле ток А431.
Клеточные линии, как на рис.
7. А: Клетки культивировали в при сутствии ("EGF") или отсутствии ("Контроль") EGF. Прикрепленные и открепившиеся клетки подсчитывали ежедневно. Б: Детекция экстрахро мосомной ДНК необработанных кле ток и клеток, обработанных 200 нг/мл EGF в течение 2 сут. В: Иммунологи ческое выявление активной (расщеп ленной по Asp175) каспазы 3. В каче стве положительного контроля апоп тоза использовали клетки А431, об работанные 1 мкМ ставроспорина в течение 5 ч.
факторов семейства STAT, при этом Bcl-XL обычно индуцируется фактором STAT3 (Grad et al., 2000), а p21waf1 в большинстве случаев – белком STAT (Chin et al., 1996), но известны случаи его индукции и при участии STAT (Sinibaldi et al., 2000;
Barre et al., 2003). Методом иммуноблоттинга мы показа ли, что как Bcl-XL, так и p21waf1 в клет ках А431 накапливается при стимуля ции EGF (рис. 11). Исследование кле точных линий, экспрессирующих миРНК, выявило снижение накопле ния обоих белков в клетках sh-STAT3, но не в клетках sh-STAT1 (рис. 11).
Таким образом, в клетках А431 в EGF-индуцируемом накоплении как Bcl-XL, так и p21waf1 участвует транс крипционный фактор STAT3. Роль STAT3 в накоплении p21waf1 может показаться неожиданной, так как обычно считается, что его экспрессия в клетках А431 зависит от STAT Рис. 11. Уменьшение количества (Chin et al., 1996;
Ohtsubo et al., 2000).
STAT3, но не STAT1, ингибирует EGF Тем не менее, последнее не было до зависимую экспрессию p21waf1 и Bcl-XL.
казано для действия EGF (в отличие от См. подпись к рис. 7.
интерферона ), и применение метода РНК-интерференции позволило точно установить, какой именно транскрипци онный фактор семейства STAT индуцирует накопление p21waf1 в этом случае.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ В настоящей работе показано, что EGF вызывает в клетках А431 как бло ки клеточного цикла в фазах G2 и G1, так и апоптоз, причем индукция апоптоза оказывается определяющей для ингибирующего влияния EGF. Нами продемон стрировано участие рецептора EGF, тирозинкиназ Src-семейства, МАР-киназы р38 и транскрипционного фактора STAT1 (но не STAT3) в EGF-зависимой сти муляции апоптоза в клетках А431. Можно предположить, что все эти сигналь ные молекулы являются компонентами одного пути: рецептор EGF через кина зы семейства Src индуцирует фосфорилирование STAT1 по тирозину (Olayioye et al., 1999), а МАР-киназа р38 способна фосфорилировать STAT1 по серину (Goh et al., 1999). В отсутствие активности MAP-киназы p38 ингибируется про апоптотический эффект EGF, но при этом сохраняется способность EGF вызы вать остановку в клеточном цикле. Нижележащими компонентами проапопто тического сигнального пути могут являться Fas и FasL, экспрессия которых ин дуцируется белком STAT1 (Xu et al., 1998). Подробно описанные в литературе механизмы независимой от фосфорилирования по тирозину индукции апоптоза транскрипционным фактором STAT1 (Kumar et al., 1997;
Battle and Frank, 2002) вряд ли реализуются при действии EGF на клетки А431, поскольку эксперимен ты с ингибитором Src-киназ и отсутствие эффекта трансфекции STAT1F в клет ки 8а говорят о важности фосфорилирования STAT1 по тирозину в данной сис теме.
Центральная роль STAT1 в индукции EGF-зависимой гибели клеток опи сана и для других опухолевых клеток различного происхождения с повышен ным содержанием рецептора EGF (Bromberg et al., 1998;
Watanabe et al., 2001).
В то же время нами установлено, что в клетках А431 не реализуется характер ный для многих EGF-зависимых опухолевых клеток (Rubin Grandis et al., 1998;
Karni et al., 1999;
Garcia et al., 2001) механизм супрессии апоптоза через актива цию STAT3. Следует подчеркнуть, что STAT3-зависимая индукция двух анти апоптотических белков, Bcl-XL и p21waf1, не оказывает влияния на общую регу ляцию апоптоза в клетках А431. Возможно, STAT3 индуцирует в клетках А также и проапоптотические пути, уравновешивающие антиапоптотические, приводя к отсутствию изменений в интегральном эффекте EGF в линии sh STAT3. Мы полагаем, что биологический эффект активации STAT3 в клетках А431 может выражаться в явлениях, отличных от регуляции пролиферации и апоптоза – например, в регуляции адгезии или миграции клеток.
ВЫВОДЫ 1. Эпидермальный фактор роста вызывает в клетках эпидермоидной карцино мы А431 блоки клеточного цикла в фазах G2 и G1 и дальнейшую апоптоти ческую гибель.
2. Ингибирование активности MAP-киназы p38 приводит к супрессии апопто за, вызываемого эпидермальным фактором роста в клеток А431, при сохра нении блоков клеточного цикла.
3. Для гибели клеток А431 в ответ на действие эпидермального фактора роста необходима активность тирозинкиназ семейства Src.
4. Устойчивость к действию эпидермального фактора роста в клональных ва риантах клеток А431 сопряжена с уменьшением количества и фосфорилиро вания транскрипционного фактора STAT1 и утрачивается при эктопической экспрессии STAT1.
5. Транскрипционный фактор STAT1, но не STAT3, необходим для проявления проапоптотического действия эпидермального фактора роста на клетки А431.
6. В накоплении ингибитора циклин-зависимых киназ p21waf1 и ингибитора апоптоза Bcl-XL при действии эпидермального фактора роста в клетках А участвует транскрипционный фактор STAT3.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Василенко К.П., Грудинкин П.С., Арнаутов А.М., Бурова Е.Б., Никольский Н.Н. Динамика взаимодействия транскрипционного фактора STAT1 с интерна лизованным рецептором ЭФР и кариоферинами в ответ на стимуляцию клеток эпидермальным фактором роста. Цитология. 2001. 43(2): 204-211.
2. Бурова Е.Б., Грудинкин П.С., Бардин А.А., Гамалей И.А., Никольский Н.Н.
Н2О2-индуцируемая активация транскрипционных факторов STAT1 и STAT3:
роль рецептора EGF и тирозинкиназы JAK2. Цитология. 2001. 43(12): 1153 1161.
3. Грудинкин П.С., Багаева В.В., Никольский Н.Н. EGF-индуцируемая переда ча сигнала в клонах клеток эпидермоидной карциномы линии А431. Цитология.
2003. 45(2): 158-161.
4. Grudinkin P.S., Zenin V.V., Kropotov A.V., Dorosh V.N., Nikolsky N.N. EGF induced apoptosis in A431 cells is dependent on STAT1, but not on STAT3. Eur. J.
Cell Biol. 2007. 86(10): 591-603.
Тезисы сообщений на конференциях 5. Арнаутов А.М., Грудинкин П.С., Никольский Н.Н. Получение и характери стика антител к различным участкам кариоферина альфа. Цитология. 2000.
42(3): 259.
6. Василенко К.П., Арнаутов А.М., Грудинкин П.С., Бурова Е.Б., Никольский Н.Н. ЭФР-зависимое образование комплексов фосфорилированного STAT1 с кариоферином альфа. Цитология. 2000. 42(3): 269-270.
7. Грудинкин П.С., Багаева В.В., Никольский Н.Н. Морфологические особен ности ядер апоптотических клеток А431. Цитология. 2002. 44 (9): 872-873.
8. Грудинкин П.С., Никольский Н.Н. Подавление экспрессии транскрипцион ных факторов семейства STAT в клетках A431 при помощи малых интерфери рующих РНК. Цитология. 2005. 47(9): 806.
9. Грудинкин П.С., Никольский Н.Н. Различная роль транскрипционных фак торов STAT1 и STAT3 при стимуляции клеток A431 эпидермальным фактором роста. Цитология. 2006. 48(9): 760.
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ Бурова Е.Б., Грудинкин П.С., Бардин А.А., Гамалей И.А., Никольский Н.Н. Н2О2 индуцируемая активация транскрипционных факторов STAT1 и STAT3: роль рецептора EGF и тирозинкиназы JAK2. Цитология. 2001. 43(12): 1153-1161.
Василенко К.П., Грудинкин П.С., Арнаутов А.М., Бурова Е.Б., Никольский Н.Н. Ди намика взаимодействия транскрипционного фактора STAT1 с интернализованным рецепто ром ЭФР и кариоферинами в ответ на стимуляцию клеток эпидермальным фактором рос та. Цитология. 2001. 43(2): 204-211.
Грудинкин П.С., Багаева В.В., Никольский Н.Н.. EGF-индуцируемая передача сигнала в клонах клеток эпидермоидной карциномы линии А431. Цитология. 2003. 45(2): 158-161.
Гудкова Д. А., Сорокин А. Б. Клеточные штаммы эпидермоидной карциномы А-431 с измененной рецепцией эпидермального фактора роста. Цитология. 1989. 31(3): 319-323.
Anto R.J., Venkatraman M., Karunagaran D. Inhibition of NF-B sensitizes A431 cells to epidermal growth factor-induced apoptosis, whereas its activation by ectopic expression of RelA confers resistance. J. Biol. Chem. 2003. 278: 25490-25498.
Barre B., Avril S., Coqueret O. Opposite regulation of myc and p21waf1 transcription by STAT3 proteins. J. Biol. Chem. 2003. 278: 2990-2996.
Battle T.E., Frank D.A. The role of STATs in apoptosis. Curr. Mol. Med. 2002. 2: 381-92.
Behzadian M.A., Shimizu N. Variant of A431 cells isolated by ricin A-conjugated mono clonal antibody directed to EGF receptor: phosphorylation of EGF receptor and phosphatidylinosi tol. Somat. Cell Mol. Genet. 1985. 11: 579-591.
Bromberg J. F., Fan Z., Brown C., Mendelsohn J., Darnell J. E. Jr. Epidermal growth factor induced growth inhibition requires Stat1 activation. Cell Growth Differ. 1998. 9: 505-512.
Bromberg J.F. Activation of STAT proteins and growth control. BioEssays 2001. 23: 161 169.
Buss J.E., Kudlow J.E., Lazar C.S., Gill G.N. Altered epidermal growth factor (EGF stimulated protein kinase activity in variant A431 cells with altered growth responses to EGF.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1982. 79: 2574-2578.
Busse D., Doughty R.S., Ramsey T.T., Russell W.E., Price J.O., Flanagan W.M., Shawver L.K., Arteaga C.L. Reversible G1 arrest induced by inhibition of the epidermal growth factor re ceptor tyrosine kinase requires up-regulation of p27KIP1 independent of MAPK activity. J. Biol.
Chem. 2000. 275: 6987-6995.
Chin Y. E., Kitagawa M., Kuida K., Flavell R. A., Fu X.-Y. Activation of the STAT signaling pathway can cause expression of caspase 1 and apoptosis. Mol. Cell. Biol. 1997. 17:
5328-5337.
Chin Y. E., Kitagawa M., Su W.-C. S., You Z.-H., Iwamoto Y., Fu X.-Y. Cell growth arrest and induction of cyclin-dependent kinase inhibitor p21WAF1/CIP1 mediated by STAT. Science. 1996.
272: 719-722.
Cory S., Adams J.M. The Bcl-2 family: regulators of the cellular life-or-death switch. Na ture Rev. Cancer. 2002. 2: 647-656.
Dotto G.P. p21WAF1/Cip1: more than a break to the cell cycle? Biochim. Biophys. Acta. 2000.
1471: M43-56.
Fan Z., Lu Y., Wu X., DeBlasio A., Koff A., Mendelsohn J. Prolonged induction of Cip1/WAF p21 /CDK2/PCNA complex by epidermal growth factor receptor activation mediates ligand-induced A431 cell growth inhibition. J. Cell Biol. 1995. 131: 235-242.
Garcia R., Bowman T.L., Niu G., Yu H., Minton S., Muro-Cacho C.A., Cox C.E., Falcone R., Fairclough R., Parsons S., Laudano A., Gazit A., Levitzki A., Kraker A., Jove R. Constitutive activation of Stat3 by the Src and JAK tyrosine kinases participates in growth regulation of human breast carcinoma cells. Oncogene. 2001. 20: 2499-2513.
Gill G.N., Lazar C.S. Increased phosphotyrosine content and inhibition of proliferation in EGF-treated A431 cells. Nature. 1981. 293: 305-307.
Goh K.C., Haque S.J., Williams B.R. p38 MAP kinase is required for STAT1 serine phosphorylation and transcriptional activation induced by interferons. EMBO J. 1999. 18: 5601 5608.
Grad J. M., Zeng X. R., Boise L. H. Regulation of Bcl-XL: a little bit of this and a little bit of STAT. Curr. Opin. Oncol. 2000. 12: 543-549.
Grudinkin P.S., Zenin V.V., Kropotov A.V., Dorosh V.N., Nikolsky N.N. EGF-induced apoptosis in A431 cells is dependent on STAT1, but not on STAT3. Eur. J. Cell Biol. 2007. 86:
591-603.
Gulli L.F., Palmer K.C., Chen Y.Q., Reddy K.B. Epidermal growth factor-induced apop tosis in A431 cells can be reversed by reducing the tyrosine kinase activity. Cell Growth Differ.
1996. 7: 173-178.
Haigler H., Ash J. F., Singer S. J., Cohen S. Visualization by fluorescence of the binding and internalization of epidermal growth factor in human carcinoma cells A-431. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 1978. 75: 3317-3321.
Jakus J., Yeudall W.A. Growth inhibitory concentrations of EGF induce p21WAF1/Cip1 and al ter cell cycle control in squamous carcinoma cells. Oncogene. 1996. 12: 2369-2376.
Karni R., Jove R., Levitzki A. Inhibition of pp60c-Src reduces Bcl-XL expression and reverses the transformed phenotype of cells overexpressing EGF and HER-2 receptors. Oncogene. 1999.
18: 4654-4662.
Kumar A., Commane M., Flickinger T. W., Horvath C.M., Stark G.R. Defective TNF- induced apoptosis in STAT1-null cells due to low constitutive levels of caspases. Science. 1997.
278: 1630-1632.
Lyons A.B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. J. Immunol. Methods. 2000. 243: 147-54.
MacLeod C.L., Luk A., Castagnola J., Cronin M., Mendelsohn J. EGF induces cell cycle ar rest of A431 human epidermoid carcinoma cells. J. Cell. Physiol. 1986. 127: 175-182.
Morazzani M., de Carvalho D.D., Kovacic H., Smida-Rezgui S., Briand C., Penel C.
Monolayer versus aggregate balance in survival process for EGF-induced apoptosis in A431 carci noma cells: Implication of ROS-p38 MAPK-integrin 21 pathway. Int. J. Cancer. 2004. 110:
788-799.
Ohtsubo M., Gamou S., Shimizu N. Antisense oligonucleotide of WAF1 gene prevents EGF-induced cell-cycle arrest in A431 cells. Oncogene. 1998. 16: 797-802.
Ohtsubo M., Takanagi A., Gamou S., Shimizu N. Interruption of NFB-STAT1 Signaling Mediates EGF-Induced Cell-Cycle Arrest. J. Cell. Physiol. 2000. 184: 131-137.
Olayioye M.A., Beuvink I., Horsch K., Daly J.M., Hynes N.E. ErbB receptor-induced acti vation of stat transcription factors is mediated by Src tyrosine kinases. J. Biol. Chem. 1999. 274:
17209-17218.
Rubin Grandis J., Drenning S.D., Chakraborty A., Zhou M.Y., Zeng Q., Pitt A.S., Tweardy D.J. Requirement of Stat3 but not Stat1 activation for epidermal growth factor receptor-mediated cell growth in vitro. J. Clin. Invest. 1998. 102: 1385-1392.
Schlessinger J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 2000. 103: 211-225.
Sinibaldi D., Wharton W., Turkson J., Bowman T., Pledger W. J., Jove R. Induction of WAF1/CIP p21 and cyclin D1 expression by the Src oncoprotein in mouse fibroblasts: role of acti vated STAT3 signaling. Oncogene. 2000. 19: 5419-5427.
Smida Rezgui S., Honore S., Rognoni J.B., Martin P.M., Penel C. Up-regulation of 21 in tegrin cell-surface expression protects A431 cell from epidermial growth factor-induced apoptosis.
Int. J. Cancer. 2000. 87: 360-367.
Toyoda M., Gotoh N., Handa H., Shibuya M. Involvement of MAP kinase-independent protein kinase C signaling pathway in the EGF-induced p21WAF1/Cip1 expression and growth inhibition of A431 cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. 250: 430-435.
Van de Vijver M. J., Kumar R., Mendelsohn J. Ligand-induced activation of A431 cell epidermal growth factor receptors occurs primarily by an autocrine pathway that acts upon receptors on the surface rather than intracellularly. J Biol. Chem. 1991. 266: 7503-7508.
Watanabe G., Kaganoi J., Imamura M., Shimada Y., Itami A., Uchida S., Sato F., Kitagawa M. Progression of esophageal carcinoma by loss of EGF-STAT1 pathway. Cancer J. 2001. 7: 132 139.
Yu J.-Y., DeRuiter S.L., Turner D.L. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. 99: 6047–6052.