Участие гликозидаз клеточной стенки в формировании низко температурной устойчивости озимых злаков
3На правах рукописи
ТРОФИМОВА ОКСАНА ИГОРЕВНА Участие гликозидаз клеточной стенки в формировании низко температурной устойчивости озимых злаков 03.00.12 - физиология и биохимия растений
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Казань 2007 4
Работа выполнена в лаборатории механизмов роста растительных клеток Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук
Научный консультант: кандидат биологических наук Заботин Алексей Иванович (КИББ КазНЦ РАН, г. Казань)
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Чиков Владимир Иванович (КИББ КазНЦ РАН, г. Казань) доктор биологических наук, профессор Шакирова Фарида Миннихановна (институт биохимии и генетики, УНЦ РАН, г. Уфа)
Ведущая организация: Казанский Государственный Университет им. В.И. Ульянова-Ленина
Защита состоится «_» _ 2007 г. в час. на заседании диссертаци онного совета К 002.005.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Казанском институте биохимии и биофизики КазНЦ РАН по адресу Казань, ул. Лобачевского 2/31, а/я – 30.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке Казанского научного центра РАН
Автореферат разослан «_» _ 2007 г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук А.Б. Иванова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. В формировании низкотемпературной устойчивости в про цессе осенней закалки принимают участие все клеточные компартменты. События, имеющие место на уровне протопласта в ходе термоиндуцированных изменений клет ки, в целом, хорошо охарактеризованы. При этом, представления о процессах, проис ходящих в клеточной стенке под действием низких температур, а также ее роли в низ котемпературной устойчивости ещё только формируются. Будучи многокомпонентной системой, клеточная стенка участвует в росте и развитии клеток и вовлекается в такие процессы, как устойчивость к различным неблагоприятным воздействиям среды (Tabu chi, Matsumoto, 2001;
Piro et al., 2003). Являясь динамичным клеточным компартмен том, клеточная стенка непрерывно претерпевает значительные изменения состава и структуры. Неизбежно образуемые при этом фрагменты полисахаридов вовлечены в регуляцию процессов жизнедеятельности растений. Так, например, хорошо известно, что олигосахаридные продукты являются активными элиситорами защитных реакций при патогенной инфекции (Albersheim et al., 1983). Выделенные эндогенные в послед нее десятилетие олигосахариды, повышающие морозостойкость растений, открывают новый этап в развитии представлений о механизмах формирования адаптационных процессов (Заботина и др., 1998, 2003).
Одним из основных аргументов для формирования представлений о клеточной стенке, как о динамичной структуре, является присутствие в ней большого спектра ферментов. Среди них наиболее распространён класс гидролаз, к которому относятся гликозидазы. Показано, что они участвуют в модификации клеточной стенки в процес се роста клеток, созревания плодов (Masuda еt al., 1985, Ranwala et al., 1992), а также в защитных реакциях растений в ответ на действие патогенов (Seo et al., 1995). Эти фер менты вовлечены также в процессы модификации полисахаридов клеточной стенки в ходе низкотемпературной адаптации (Заботин и др., 1998), что представляет для нас наибольший интерес. Особого внимания заслуживает участие гликозидаз в катаболи ческих реакциях, исследование которых актуально как с точки зрения их роли в обра зовании регуляторных молекул (Тарчевский, 2001), так и особенностей формирования морозостойкости растительного организма.
Цель и задачи исследования. Целью работы является характеристика вовлечен ности гликозидаз клеточной стенки в формирование морозостойкого состояния расте ний.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
1. Провести сравнительное исследование активности гликозидаз проростков раз личных по устойчивости сортов пшеницы и ржи при формировании низкотемператур ной устойчивости.
2. Оценить влияние олигосахаридной фракции, индуцирующей морозостойкость, на активность гликозидаз клеточной стенки проростков озимой пшеницы.
Оценить влияние АБК, инициирующей морозостойкость, на 3.
активность гликозидаз клеточной стенки проростков озимой пшеницы.
4. Охарактеризовать некоторые особенности формирования морозостойкости клеток при действии АБК в модельной системе - суспензионной культуре озимой пше ницы Triticum timopheevii Zhuk.
Научная новизна работы. Показано, что повышение активности гликозидаз явля ется частью процесса адаптации озимых злаков. Впервые обнаружено влияние олиго сахарина НТ, индуцирующего морозостойкость, на активность гликозидаз. Установле но, что реакция ферментов на действие температуры и олигосахарина НТ характерна только для озимых растений и не является сорто- и видоспецифичной. Впервые выяв лена активация гликозидаз под действием АБК;
показано, что этот процесс сопровож дается изменением пропорции нецеллюлозных полисахаридов клеточной стенки. Ис пользование частично синхронизированной суспензионной культуры клеток озимой пшеницы позволило показать, что процесс инициации закаливания определяется долей воспринимающих (компетентных) сигнал АБК клеток.
Научно-практическая значимость работы. В работе получили развитие пред ставления о регуляторных механизмах низкотемпературной адаптации и, в частности, процессов, происходящих на уровне клеточной стенки. Показано, что активация глико зидаз, как часть термоиндуцированных катаболических реакций включена в генетиче скую программу адаптации клеток. Она может быть физиологическим показателем за каливающихся растений. Расшифровка механизмов перестройки клеточной стенки в ходе низкотемпературной адаптации поможет изменять свойства растительных орга низмов на молекулярном уровне, что позволит создавать новые устойчивые сорта рас тений.
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в ис следования. Исследования автора являлись частью работ, проводимых по грантам РФФИ 00-04-48220, Фонда НИОКР РТ 03-3.9-234/2004. Научные положения и выводы диссертации базируются на результатах собственных исследований автора.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на 8 международной конференции по клеточной стенке (Норвич, Великобритания, 1998);
на XII конгрессе FEPPS (Будапешт, Венгрия, 2000);
на международной конференции «Актуальные во просы экологической физиологии растений в XXI веке», (Сыктывкар, 2001);
на 9 меж дународной конференции по клеточной стенке (Тулуза, Франция, 2001);
на 6 Пущин ской конференции молодых ученых «Биология – наука ХХI века» (2002);
на III съезде биохимического общества (СПб, 2002);
на 7 Пущинской конференции молодых ученых «Биология – наука ХХI века» (2003);
на международной научной конференции «Новая геометрия природы» (Казань, 2003);
на V съезде общества физиологов растений России и международной конференции «Физиология растений - основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003);
на всероссийской конференции «Стрессовые белки растений» (Иркутск, 2004);
на 10 международной конференции по клеточной стенке (Сорренто, Италия, 2004);
на молодежных конференциях КИББ КазНЦ РАН (2003, 2004), на итоговых конференциях КазНЦ РАН (Казань, 2004- 2007);
II международном симпозиуме «Сигнальные системы клеток растений: роль в адаптации и иммунитете» (Казань, 2006).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 работ (из них статьи в отечественной и зарубежной печати).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 135 страницах машино писного текста, включает 23 рисунка и 4 таблицы, состоит из введения, обзора литера туры, описания методов исследования, изложения результатов исследования и их об суждения, заключения, выводов и списка литературы (241 наименование, из них 56 на русском языке).
1. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования. Объектами исследования служили проростки пшеницы (Triticum aestivum L.) озимых сортов Казанская-84, Мироновская 808 и яровых сортов Артёмовка, Керба, проростки озимой ржи (Secale cereale L.) полученных из ВИРа (Всероссийского Института Растениеводства им. Вавилова) сортов Бурятская, Ситниковская, Мининская, Вятка–2, Саратовская-7, Dominant, Кунгс-2, Петкус местный, Таловская и суспензионная культура клеток озимой пшеницы Triticum timopheevii Zhuk. (РККК ВР, № 34), полученная в отделе биотехнологии ИФР РАН из каллуса незрелых зародышей пшеницы (Зоринянц и др., 1993). Клетки выращивали на среде Шенка-Хильдебрандта (Shenk, Hildebrandt, 1971). Период субкультивирования составлял 21 день, при плотности высева 10х5 клеток/мл.
Характеристика олигосахарина НТ. Используемая в работе высокоочищенная (индивидуальный пик при анализе методом ВЭАОХ (Dionex, США)) олигосахаридная фракция эндогенного происхождения выделена из корней закаливающихся проростков озимой пшеницы (через 6 часов действия температуры) согласно методике, описанной в работах Заботиной и др. (1998, 2003). Она на 90% состоит из глюкозы и ксилозы в соотношении 1:1, содержит в минорных количествах арабинозу и галактозу, имеет степень полимеризации 12, представляет собой, наиболее вероятно, фрагмент ксилоглюкана и обозначена в работе как олигосахарин НТ.
Приготовление белковых экстрактов. За основу выделения клеточных стенок и экстракции связанных с ней белков взята методика Ranwala et al. (1992), с модификациями. Кончики (2 см) корней проростков растирали в ступке, погруженной в лед, в буфере (20 мМ HEPES ("Sigma", США), 5 мМ Na2S2O5, pH 7,5) в отношении 1: г/мл. Полученный гомогенат представлял растворимую фракцию. Клеточные стенки суспендировали в среде гомогенизации с добавлением 2М NaCl. Солевую экстракцию проводили в течение 24 часов при 4 0С. Навеску клеток помещали в тот же буфер мМ НEPES ("Sigma", США) в соотношении 1:10. Для разрушения клеточных стенок клетки озвучивали на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-1 (Россия), при частоте кГЦ, 0,5 А, два раза по 2 минуты. Гомогенат фильтровали, получая, растворимую белковую фракцию.
Определение гликозидазной активности. Ферментативную активность гликозидаз измеряли по модифицированной методике Masuda et al. (1988), с использованием в качестве субстратов 4-метилумбеллиферил меченые сахара (4-MU-гликозиды), ("Sigma", США). Концентрация каждого субстрата в реакционной смеси была: для 4 MU--D-галактозида – 75 мкМ, 4-MU--D-глюкозида – 500 мкМ, 4-MU--L арабинозида - 75 мкМ, 4-MU--D-маннозида - 75 мкМ, 4-MU--D-фукозида – 25 мкМ.
О величине ферментативной активности судили по количеству отщепившегося 4 метилумбеллиферона, содержание которого измеряли на спектрофлюориметре MPF 44B (Perkin Elmer, США) при длине волны 448 нм (длина волны возбуждения 325 нм).
Активность фермента выражали в нМ 4-метилумбеллиферона, умножая на коэффициент рассчитанный из калибровочной кривой для (2,3), 4 метилумбеллиферона (натриевая соль) и относили к единице сырого веса (мг) за единицу времени (мин), или в процентах к исходному значению контрольных образцов.
Выделение фракций полисахаридов. Корешки проростков (2 см), фиксировали в термостате при 1000С в течение 30 мин, затем сушили при 600C до постоянного веса.
Для выделения клеточной стенки 100 мг сухого растительного материала растирали в фарфоровой ступке. К растертой до гомогенного состояния массе добавляли 5 мл фос фатного буфера (рН 7.0) и центрифугировали при 10000 об/мин 15 мин. Осадок промы вали три раза 80 % ацетоном, и центрифугировали при том же режиме. Высушенные при комнатной температуре клеточные стенки гомогенизировали с 5 мл NH4 оксалат ного буфера (рН 5.2) с добавлением 0,05 М ЭДТА. Полученный гомогенат выдержива ли 1 ч на водяной бане при температуре 800С и затем центрифугировали при об/мин 15 мин. Осадок ещё раз ресуспендировали в том же буфере и повторяли ту же операцию. Полученная надосадочная жидкость представляла собой пектиновую фрак цию клеточной стенки. Затем к осадку добавляли 5 мл 0,05М KOH с 0.01% боргидри дом натрия и оставляли на 24 часа при комнатной температуре, затем центрифугирова ли 15 мин при 10000 об/мин, после чего собирали надосадочную жидкость. Таким об разом, была получена 0,05М KOH фракция гемицеллюлоз. Последующие фракции ге мицеллюлоз были получены таким же образом, путём последовательной экстракции 1М KOH и 4М KOH.
Определение каллозы проводили по методике (Kauss et al., 1983).
Определение содержания сахаров проводили антронным методом (Северин, Со ловьев, 1989).
Измерение морозостойкости. Об изменении морозостойкости судили по выходу электролитов после промораживания образцов согласно модифицированной методике (Uemura, Steponkus, 1989). В опытах с проростками, листья каждого варианта (1 г) по мещали в микрохолодильник типа ТЛМ и выдерживали в течение часа при температу рах от -20C до -160C с интервалом в 20C, отбирая через каждый час промороженные пробы. Клетки (0,1 г) суспензионной культуры отмывали 3% раствором сахарозы, по мещали в микрохолодильник и выдерживали 1 ч при температурах от -30С до -100С, с интервалом 1 C, отбирая через каждый час промороженные пробы. Затем к образцам листьев и клеток добавляли 10 мл дистиллированной воды и инкубировали на качалке 1 ч. Выход электролитов определяли по электропроводности жидкой фазы на кондук тометре ОК-102-1 с диаметром ячейки 22 мм и высотой 1,97 мм. Полумаксимальные значения электропроводности определяли как ЛТ50 – значение температуры, соответст вующее 50% гибели клеток. За нулевой уровень принимали значение электропровод ности образцов, не подвергавшихся промораживанию, за 100% - значения после авто клавирования образцов при 0,8 атм. 30 мин.
Определение митотического индекса клеток суспензионной культуры озимой пшеницы. Клетки помещали в фиксатор Кларка на 24 часа. Для мацерации использо вался фермент: смесь гликозилаз из Trichoderma viridae (Maxazime C. Gist Brocades, Нидерланды). Мацерацию проводили при 400С, 3 часа. Клетки окрашивали 1,5% ор сеином. Готовили препараты типа “раздавленной капли” (Турков и др., 1988). На каж дом препарате просмотрено не менее 2500 клеток.
Опыты проводили в 3 биологических и 3 аналитических повторностях. Данные обработаны статистически (Лакин, 1980). Анализ корреляционных связей определялся с использованием пакета программ "Анализ данных Exсel XP". На графиках и в табли цах представлены средние арифметические величины со среднеквадратичной ошибкой.
2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 2.1. Влияние низкой положительной температуры на активность гликозидаз и ус тойчивость проростков разных сортов пшеницы и ржи Реакция внеклеточного матрикса проростков озимой пшеницы в ходе низкотем пературной адаптации характеризуется изменением моносахаридного состава основ ных фракций полисахаридов (Заботин и др., Активность, нМ 4-МУ/мг сыр. веса/мин 1995). Одной из причин этого может быть активация катаболизма полисахаридов.
Действительно, ранее была обнаружена ак 900 тивация ряда гликозидаз клеточной стенки проростков озимой пшеницы в первые часы действия низкой положительной темпера 700 туры (+2 0С);
при этом пик активности гли козидаз предшествовал уменьшению со держания полисахаридных фракций (Забо тин и др., 1998). Эти работы послужили Казанская Керба Артемовка предпосылкой для выяснения вопроса, свя зано ли формирование морозостойкости +25° С +2° С Рис. 1. Влияние краткосрочного воздейст- растений с реакцией активации гликозидаз.
вия низкой температуры (+20 С, 4 часа) на Для ответа на этот вопрос, была про активность глюкозидазы растворимой анализирована активность гликозидаз на фракции проростков разных сортов пшени- начальном этапе закаливания у разных сор цы.
тов пшеницы и ржи. Базовая устойчивость этих сортов и уровень их морозостойкости были протестированы путём определения их ЛТ50 при комнатной температуре (+250С) и после воздействия низкой положительной температуры (+2 0С) в течение 7 суток (табл.1).
Были использованы три сорта пшениц - яровые Артемовка и Керба, и озимая Ка занская-84, на которой ранее был установлен факт активации гидролаз. Поскольку на температурное воздействие все исследованные гликозидазы (-арабинозидаза, глюкозидаза, Табл. 1. Характеристика базовой морозостойкости и способ- галактозидаза, ности к закаливанию (по ЛТ50) проростков разных сортов маннозидаза, -фукозидаза) пшеницы и ржи у незакалённых (+250 С, 7 суток) и закалён- реагировали сходным об ных (+20 С, 7 суток) растений. -Высокоустойчивые, - разом, в работе представ среднеустойчивые, - слабоустойчивые сорта ржи. Разница лены данные по двум фер между значениями достоверна (Р0,05). ментам – глюкозидазе и га лактозидазе. Как следует из экспериментов, 4-х часовая Морозостойкость, 0С Сорт обработка проростков +250С +20С пшеницы низкой положи Пшеница яровая тельной температурой Керба -4,7 ± 0,2 -5,3 ± 0, приводит к увеличению ак Артемовка -5,0 ± 0,2 -5,4 ± 0, тивности -глюкозидазы Пшеница озимая (рис. 1) и -галактозидазы Казанская 84 -5,6 ± 0,2 -9,2 ± 0, (данные в реферате не при Мироновская водятся) растворимой -5,9±0,1 -9,6±0, фракции морозостойкого Рожь озимая сорта и ингибированию Бурятская -8,3 ± 0,1 -14,5 ± 0,4 этих гликозидаз у яровых Ситниковская -8,1 ± 0,2 -13,8 ± 0,4 сортов. То есть, в яровых Мининская -8,0 ± 0,0 -13,9 ± 0,0 культурах отсутствует ак Вятка 2 -7,8 ± 0,1 -13,0 ± 0,5 тивация гликозидаз кле Dominant -7,6 ± 0,2 -13,0 ± 0,0 точной стенки, характерная Кунгс 2 -7,3 ± 0,0 -12,4±0,2 для озимых культур.
Саратовская 7 -7,1 ± 0,1 -12,1 ± 0,4 Далее было выявлено Петкус местный -7,0 ± 0,4 -12,0 ± 0,2 наличие активации глико Таловская -7,0 ± 0,0 -11,8 ± 0,3 зидаз у сортов озимой ржи.
Следует отметить, что представленные озимые сорта ржи, полученные из коллекции ВИРа, охватывают все климатические зоны культивирования Российской Федерации.
На основании наших исследований (табл.1), исходя из базовой ЛT50, они могут быть условно подразделены на сильно-, средне- и слабоморозостойкие.
Была исследована активность ферментов в различных по устойчивости сортах ржи: высокоустойчивых (Бурятская и Мининская), среднеустойчивых (Вятка-2 и Dominant), и менее устойчивом сорте (Петкус). Было показано, что стабильно наблю даемая в озимой пшенице активация глю козидазы и галактозидазы (данные в рефе Активность,нМ 4-МУ/мг сыр рате не приводятся) через 4 часа действия низкой положительной температуры об наруживается и во всех исследованных веса/мин сортах озимой ржи, независимо от степе ни их устойчивости (рис.2).
Более детальное исследование влия ния низкой положительной температуры Бу Ми Вя Do Пе ря т н и т к mi тку ска нск а-2 nan с на активность ферментов подтвердило t я ая наши выводы о сходстве реакции глико зидаз в озимых сортах пшеницы и ржи.
+ 25° C +2° C Так исследования на примере сортов Бу Рис. 2. Влияние краткосрочного воздействия рятская и Ситниковская (данные в рефера низкой температуры (+20 С, 4 часа) на актив ность глюкозидазы растворимой фракции те не приводятся) показали наличие тер моиндуцированного повышения активно проростков разных сортов озимой ржи.
сти -глюкозидазы, -галактозидазы, маннозидазы, -фукозидазы, которое наблюдается и в проростках озимой пшеницы (Заботин и др., 1998). Положительной корреляции между степенью активации гликози даз и уровнем морозоустойчивости не обнаружено.
Таким образом, суммируя данные по реакции гликозидаз клеточной стенки на дей ствие низкой положительной температуры, и сопоставляя их с данными по измерению морозоустойчивости, можно заключить, что, изменение активности гликозидаз и спо собность к закаливанию совпадают, что, по-видимому, яыляется частью программы адаптивной реакции клеток озимых расте ний.
Активность, нМ 4-МУ/мг 2.2. Влияние высокоочищенной сыр веса/мин олигосахаридной фракции, индуци рующей морозостойкость, на актив 600 ность гликозидаз яровой пшеницы и озимой ржи Рядом исследователей показано уси ление гидролитической активности фер Артемовка Керба ментов при различных приспособитель +2° C+олигосахарин НТ +25° C +2° C ных реакциях, в том числе и на холодовую Рис. 3. Влияние олигосахарина НТ на актив- обработку (Вовчук и др., 1994), что позво ность глюкозидазы растворимой фракции лило сделать заключение о вовлеченности проростков яровых пшениц. Олигосахарин катаболических реакций в реорганизацию НТ (0,05 мкг/мл) вносили в среду выращива- и обновление структуры и состава клетки ния за 16 часов до гипотермии (+20С, 4 часа). (Браун и др., 1987, Тарчевский, 2001).
Предполагается, что активация катабо Активность, нМ 4-МУ/мг лизма может быть связана с образованием регуляторных молекул (Тарчевский, 2001).
сыр.веса/мин Действительно, из проростков озимой пше ницы была выделена олигосахаридная фракция, обозначенная олигосахарин НТ, которая образуется в первые часы адаптации под действием низкой положительной тем пературы (Заботина и др., 1998, 2003). Судя по моносахаридному составу, она происхо- Ми Вят Пет ни н ка-2 кус ска я дит из фракции гемицеллюлоз. Было пока зано, что обработка проростков озимой + 2° C+олигосахарин НТ + 25° C +2° C пшеницы олигосахарином НТ, выделенным из этого же объекта, до начала закалки по Рис. 4. Влияние олигосахарина НТ на актив вышала эффективность термоадаптации ность глюкозидазы растворимой фракции растений (Заботина и др., 1998, 2003). проростков разных сортов озимой ржи.
Обработка олигосахарином НТ проро- Олигосахарин НТ (0,05 мкг/мл) вносили в стков озимой пшеницы за 16 часов до помещения их на закаливание приводила к уси лению активации гликозидаз в начальный период адаптации (Трофимова и др., 2004).
При этом у яровых пшениц сортов Артемовка и Керба такая предобработка усилила падение активности глюкозидазы (рис.3) и галактозидазы (данные в реферате не при водятся). Влияние олигосахарина НТ на мо розостойкость проявлялось только у озимых Активность, нМ 4-МУ/мг сортов (табл. 2). При использовании той же схемы воз сыр.веса/мин действия олигосахарином и температурой, была выяснена реакция гликозидаз у озимой ржи на внесение олигосахарина НТ, выде ленного из пшеницы. Это, вместе с измере- ниями морозостойкости, позволило выяс нить видовую специфичность эффектора.
Олигосахарин НТ увеличивал морозостой- кость во всех тестируемых сортах ржи (табл. 0 3 6 9 12 14 2). Предобработка “пшеничным” олигосаха Время воздействия,часы рином так же повышала активность глюко глюкозидаза галактозидаза зидазы озимой ржи трех сортов (по одному из каждой группы устойчивости: Минин- Рис. 5. Влияние олигосахарина НТ (0, ская, Вятка-2, Петкус) (рис. 4). По- мкг/мл) на активность глюкозидазы и галак видимому, в процессе закаливания ржи об- тозидазы растворимой фракции корней про разуются подобные биологически активные ростков озимой пшеницы Казанская (250С).
молекулы и, возможно, того же состава, по Табл. 2. Влияние закаливания и обработки олигосахари- скольку рожь и пшеница имеют сходный тип строения ном НТ на морозоустойчивость проростков разных сор клеточной стенки (Carpita, тов пшеницы и ржи. Олигосахарин НТ (0,05 мкг/мл) вно сили за 15 часов до гипотермии (+20С, 7 суток). - 2000).
Высокоустойчивые, - среднеустойчивые, - слабоус- Олигосахарин НТ спосо бен индуцировать морозо тойчивые сорта озимой ржи. Разница между значениями стойкость озимой пшеницы и достоверна (Р0,05).
при комнатной температуре (Трофимова, Торощина, 2003).
Морозостойкость, С К тому же он активирует и Сорт Олигосахарин 20С 0 гликозидазы (рис. 5). Уже в НТ + 2 С первые 3-6 часов действия Пшеница яровая олигосахарина НТ при ком Керба -5,3 ± 0,0 -5,3 ± 0, натной температуре наблюда Артемовка -5,4 ± 0,2 -5,4 ± 0, ется сначала небольшое сни Пшеница озимая жение, а потом кратковремен Казанская 84 -9,2 ± 0,1 -10,8 ± 0, ное повышение (к 9 часам) ак Мироновская -9,6 ± 0,1 -11,1 ± 0,3 тивности гликозидаз.
Таким образом, основ Рожь озимая ные события в запуске про Бурятская -14,5 ± 0,4 -15,8 ± 0, цесса низкотемпературной пе Ситниковская -13,8 ± 0,4 -15,0 ± 0, рестройки под действием оли Мининская -13,9 ± 0,0 -15,2 ± 0, госахарина НТ происходят Вятка 2 -13,0 ± 0,5 -14,3 ± 0, именно в первые часы воздей Dominant -13,0 ± 0,0 -14,2 ± 0, ствия, что обуславливает по Кунгс 2 -12,4 ± 0,2 -13,6 ± 0, вышение устойчивости пре Саратовская 7 -12,1 ± 0,4 -13,0 ± 0, добработанных проростков.
Петкус местный -12,0 ± 0,2 -13,3 ± 0, Направленность реакции гли Таловская -11,8 ± 0,3 -12,8 ± 0, козидаз (активация или инги бирование) при воздействии низких температур сохраняется и при обработке олигосахарином НТ, но эффект при его применении усиливается, что, в свою очередь, согласуется с его влиянием на моро зостойкость разных сортов и видов злаковых (табл.2).
Изменение активности гликозидаз и содержания нецеллюлозных 2.3.
фракций полисахаридов клеточной стенки при действии АБК Известно, что образование морозостойкого состояния растений, находящихся в условии комнатной температуры может быть индуцировано экзогенным добавлением фитогормона - абсцизовой кислоты (АБК) (Veisz et al., 1996). Вызываемые ею измене ния метаболизма клетки касаются и механических свойств клеточной стенки, анало гично наблюдаемым при закаливании низкими положительными температурами (Ra 14 jashekar, Lafta, 1996). Существующая точ Активность гликозидаз, % к ка зрения, о том, что низкая температура и исходному уровню АБК могут иметь независимые пути транс дукции сигнала (Thomashow, 1999;
Gusta et al., 2005), при одновременном сходстве от- ветной реакции на них, позволила сравнить влияние АБК и температуры на активности гликозидаз на начальных этапах формирова ния низкотемпературной адаптации.
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 Исследования показали, что как в рас- А) Время воздействия АБК, часы творимой (рис. 6, А), так и в ионно-связанной фракциях (рис. 6,Б), активация всех исследо Активность гликозидаз, % к исходному ванных нами гликозидаз:
-арабинозидазы, - галактозидазы, -глюкозидазы, -фукозидазы и -маннозидазы наблюдалась, в основном, через 6-9 часов после действия гормона. Характерно, что как и в случае действия уровню низкой положительной температуры, она продолжалась в течение суток. Исходя из полученных данных реакции гликозидаз, мы предположили, что при дей- ствии АБК фракции матриксных полисахари дов клеточной стенки могут подвергаться мо- 0 6 12 1824 30 36 42 48 5460 66 дификации таким же образом, как и при дей Время воздействия АБК, часы ствии температуры (Заботин и др., 1995). Б) арабинозидаза галактозидаза глюкозидаза маннозидаза Действительно, в ходе исследований фукозидаза было обнаружено, что обработка растений Рис. 6. Динамика активности гликозидаз АБК приводила к изменениям в содержании растворимой А), ионно-связаной Б) фрак полисахаридных фракций, что ции из корней проростков озимой пшени характеризовалось временным снижением цы при действии АБК (10 мкМ, 250 С). За фракций 100% принята активность гликозидаз без количества пектинов и гемицеллюлоз, экстрагируемых щелочью воздействия.
0,05М, 1М и 4М в первые часы действия АБК (рис.7). Наиболее интересным представляется увеличение фракции гемицеллюлоз, экстрагируемых 4М щелочью через 24 часа действия гормона. Возможно, что модификация этой фракции может свидетельствовать об усилении прочности клеточной стенки.
При действии температуры активация гликозидаз как в растворимой, так и ион но-связанной фракциях предшествовала уменьшению количества полисахаридных фракций (Заботин и др., 1998).
При сравнении содержания матриксных полисахаридов и их синтеза с изменени ем гликозидазной активности, был сделан вывод, что уменьшение количества полиса харидов является результатом как сниже ния их образования, так и увеличения их Время воздействия АБК, часы деградации (Zabotin et al., 1998).
Выявленные нами сходные изменения в содержании фракций и активации гликозидаз могут свидетельствовать об изменениях моносахаридного состава как при действии температуры, так и АБК.
Анализ моносахаридного состава и типов связей показал, что при гипотермии на блюдается, главным образом, обмен геми 0 целлюлозной фракции (Zabotin et al., 1998). Предполагается, что активация ка таболизма гемицеллюлоз в процессе их 0 50 обновления приводит к появлению олиго Содержание полисахаридов, мг/г сух.массы сахаридов – фрагментов полисахаридов, 4М гемицеллюлозы вовлеченых в процесс низкотемператур 1М гемицеллюлозы ной адаптации (Заботина и др., 2003). Они 0,05М гемицеллюлозы пектины могут образовываться в результате актив Рис. Изменение содержания ной работы ферментов, локализованных в 7.
нецеллюлозных фракций полисахаридов корней проростков озимой пшеницы при клеточной стенке и участвующих в гидро лизе гликозильных связей матриксных по воздействии АБК (10 мкМ, 250 С).
лисахаридов.
Таким образом, индуцируемые АБК изменения клеточного метаболизма, вызы вающие повышение морозоустойчивости, приводят к перестройке метаболизма кле точной стенки так же, как это происходит при действии низкой температуры.
Действие циклогексимида на индуцированное АБК изменение актив 2.4.
ности гликозидаз корней проростков озимой пшеницы Использование ингибиторов трансляции и транскрипции позволило сформировать современные представления о роли белоксинтезирующей системы в формировании морозостойкого состояния растений. Известно, что циклогексимид (ЦГ) препятствует образованию морозостойкого состояния (Зверева, Трунова, 1985;
Новицкая и др., 1995). Повышение устойчивости к низким температурам с помощью обработки АБК как при нормальной, так и при температуре закаливания, реализуется посредством дифференциальной экспрессии генов, что приводит к изменениям в синтезе белка (Mo hapatra et al., 1988;
Xin, Li, 1992). Между тем, имеются данные, что морозостойкость, индуцируемая гормоном при физиологически нормальной температуре не подавляется ингибиторами белкового синтеза (Таланова и др., 1988). Результаты проведенных нами ранее экспериментов показали, что ЦГ, добавленный одновременно с АБК в среду Активность гликозидаз, % к исходному культивирования суспензионных клеток озимой пшеницы, препятствовал образо ванию морозостойкого состояния (Тро фимова, Заботин, 2001). Поскольку обна 125 ружено, что АБК способна активировать уровню гликозидазы, возник вопрос о вовлеченно сти белоксинтезирующего аппарата клет 75 ки в регуляцию этого процесса.
Исследуя влияние ЦГ на индуцируе мую АБК активацию гликозидаз, было обнаружено, что обработка ЦГ за 15 часов до внесения АБК полностью снимает эф 0 3 6 9 12 15 18 21 фект гормона как в растворимой (рис. 8), Время воздействия АБК, часы так и в ионно-связанной (данные в рефе ЦГ(15 ч)+АБК АБК рате не приводятся) фракциях, на примере Рис. 8. Влияние предобработки ЦГ (3·10-5 М, 15 часов) на динамику активности глюкози- глюкозидазы. Это свидетельствует о том, дазы растворимой фракции корней пророст- что регуляция активности этих ферментов ков озимой пшеницы при воздействии АБК сопряжена с функционированием бело (10 мкМ, 250 С). За 100% принята активность ксинтезирующей системы, и привело нас к гликозидаз без воздействия.
выводу о сходстве механизмов регуляции метаболизма клеточной стенки под действием гормона и под действием температурно го фактора.
На корнях проростков озимой пшеницы было показано, что ЦГ полностью подав ляет фазу активации гликозидаз клеточной стенки в первые часы закаливания низкой температурой (Барышева и др., 1999). Авторы предполагают, что подавление цикло гексимидом термоиндуцированного адаптивного “всплеска” активности гликозидаз происходит через блокирование экспрессии генов, ответственных за образование регу ляторных молекул, которые в норме ответственны за активацию гликозидаз клеточной стенки. В этой же работе был обнаружен интересный факт повышения активности гли козидаз за время предобработки этим ингибитором при комнатной температуре, что также наблюдается в наших экспериментах в обеих фракциях в момент внесения АБК.
Исходя из полученных данных, пока сложно установить точный механизм, с по мощью которого ингибитор активирует гликозидазы. Следует отметить, что как в слу чае индукции активности АБК (рис. 8), так и температурой (Барышева и др., 1999), ЦГ подавлял именно фазу активации ферментов.
Характеристика действия АБК на ростовые параметры и формирова 2.5.
ние морозостойкого состояния суспензионной культуры озимой пшеницы Культуры растительных клеток широко используются в качестве модельных сис тем для проведения физиологических исследований. Их использование позволяет стро го контролировать и изменять условия роста и развития, а синхронизация роста клеток позволяет вести исследования с достаточно однородной популяцией. Ранее бы ло обнаружено, что в первые часы закаливания частично синхронизированной суспен зионной культуры озимой пшеницы Triticum timopheevii Zhuk. низкими положитель ными температурами активируются те же гликозидазы, что и у проростков озимой пшеницы (Барышева, Заботин, 2001). Поэтому, исследование АБК-индуцированного формирования морозоустойчивости клеток проводилось на суспензионной культуре озимой пшеницы.
На рисунке 9 представлен рост культуры клеток озимой пшеницы Triticum timo pheevii Zhuk. (РККК ВР, № 34), оцениваемой по накоплению сырой массы. На графике можно выделить основные стадии ее развития: экспоненциальная фаза со 2 по 10 6 день, когда идёт интенсивное деление митотический индекс, % клеток без значительного увеличения массы клеток, фазу быстрого (логариф сырой вес, г 6 мического) роста (от 7 до 12 дней), когда 5 3 клетки переходят к росту растяжением и 4 стационарную фазу (от 12 до 21 дня), в 3 течение которой не происходит каких 2 либо изменений в величине митотиче 1 ского индекса или в увеличении массы 0 0 клеток.
0 2 4 6 8 101214161820 Было показано, что в ходе разви тия суспензионной культуры озимой Время культивирования, дни пшеницы максимальный митотический митотический индекс масса индекс предшествовал накоплению эн Рис. 9. Изменение массы и митотического догенной каллозы (Заботин и др., 2002).
индекса в течение культивирования суспен- Это позволило связать увеличение коли зионной культуры клеток озимой пшеницы чества полисахарида с формированием Triticum timopheevii Zhuk.
клеточной пластинки в процессе деления клеток. Было показано, что деградация каллозы в клетках, закончивших цитокинез, происходит на фоне клеток, переходящих к росту растяжением (Заботин и др., 2002). Таким образом, «время жизни» каллозы ог раничено соответствующей стадией цитокинеза. Эти данные дают позволяют заклю чить, что эндогенный уровень каллозы может использоваться как своего рода маркер пролиферативной активности клеток и прохождения ими стадии деления.
Было обнаружено, что кривая роста культуры меняется в зависимости от того, на какой фазе роста была внесена АБК. На рисунке 10,А представлены данные о том, что при внесении гормона в среду культивирования в начале пассажа (0 день) рост клеток полностью подавлялся, а при внесении гормона на стадии экспоненциального роста (на 3-й день) - на 35%. Подсчет митотического индекса показал (рис. 10, Б), что практиче ски полное подавление роста при внесении АБК в самом начале пассажа сопровожда ется падением митотического индекса и появлением его пика на сутки позже, чем 6 А) в контроле.
Если АБК вносилась в момент мак сырой вес, г симального деления культуры, то мито тический индекс снижался в меньшей степени. Исходя из данных по распреде 2 лению делящихся клеток в ходе пассажа, видно, что степень подавления роста за висит от количества клеток, находящих 0 ся на той стадии клеточного цикла, когда 0 4 6 8 12 17 19 они чувствительны к действию АБК.
Молекулярные механизмы запуска кле Время культивирования, дни точного деления и регуляция клеточного цикла при изменениях окружающей сре Б) ды недостаточно изучены. Также немно 9 го известно о роли и механизмах дейст Митотический индекс,% 8 вия АБК в клеточном цикле. Данные ли тературы предполагают, что механизм влияния АБК на клеточный цикл состоит в экспрессии ингибитора cdc-2 киназы ICK1 (Wang et al., 1998), а также в запуске экспрессии CKI1A гена, роль которого, возможно, связана с удлине нием клеточного цикла растений под действием неблагоприятных факторов (Stals et al., 2000). Есть данные, свиде Время культивирования, дни Рис. 10. Влияние АБК (50 мкМ, 250 С) на тельствующие о том, что у АБК в кле рост А) и митотический индекс Б) суспензи- точном цикле одна «точка приложения» онной культуры озимой пшеницы Triticum - это момент перехода клеток из стадии timopheevii Zhuk. в зависимости от време- G в стадию S (den Boer, Murray, 2000;
ни ее внесения. - ростовая кривая без об - АБК внесена в начале пассажа, Stals, Inzй, 2001), когда индуцируемый работки, АБК ингибитор ICK1 способен “пере - АБК внесена на 3 день пассажа программировать” путь развития кле точного цикла, и, пройдя которую, клетки, по-видимому, не воспринимают АБК.
Поскольку нами было установлено, что параметры клеточной культуры: масса, митотический индекс меняются в ответ на АБК (рис. 12) в зависимости от времени её внесения, нас интересовало, как эти изменения согласуются с возникновением морозо стойкости в культуре. Были проведены эксперименты по определению морозостойкого состояния клеток озимой пшеницы, индуцированного действием АБК при комнатной температуре. Так, если клетки подвергались действию гормона в самом начале пасса жа, индукция морозостойкости наблюдалась к третьим суткам. Внесение АБК в среду роста клеток в момент их ин Табл. 3. Образование морозостойкого состояния кле тенсивного деления значитель ток (по ЛТ50) суспензионной культуры озимой пше но сокращало время возникно ницы Triticum timopheevii Zhuk. под действием АБК вения морозостойкости – она (50 мкМ, 250С) в зависимости от возраста. * Время обнаруживалась уже через часов (табл. 3).
обработки 12 часов Устойчивость и способ ность клеток к закаливанию за Время висят от зоны роста органа в куль- АБК вне- случае целых растений кукуру тиви- сена в на- АБК внесена КонтрольБ) зы (Родченко и др., 1988), или рова- чале пас- на 3 день от возраста, в случае суспензи ния, сажа онной культуры (Сопина и др., дни 1994). Есть мнение, что клетки, ЛТ 50 в 0С находящиеся на стадии актив - 5,3 ± 0,3 - 5,3 ± 0, 1 - ного деления, до перехода к - 5,5 ± 0,3 - 5,5 ± 0, 2 - растяжению и обладающие вы - 6,5 ± 0,2 - 7,4 ± 0,2 - 7,4 ± 0,2* 3 сокой метаболической активно - 7,5 ± 0,2 - 8,2 ± 0,2 - 8,6 ± 0, 4 стью, проявляют наибольшую - 8,1 ± 0,2 - 9,0 ± 0,2 - 9,5 ± 0, 5 способность к адаптации (Со пина и др., 1994). Известно, что повышение уровня АБК, кото рое наблюдается при действии любых неблагоприятных факторов, приводит к тормо жению деления и роста клеток. То есть, не активный метаболизм клетки сам по себе является условием устойчивости. Возникновение морозостойкости, наблюдавшееся к третьим суткам, связано, как уже упоминалось выше, с появлением достаточного коли чества клеток, в той фазе клеточного цикла (G1/S) (den Boer, Murray, 2000;
Stals, Inzй, 2001), когда сигнал гормона эффективно воспринимался. Более быстрое формирование устойчивости связано с количеством проходящих по циклу клеток. В варианте с внесе нием АБК в самом начале пассажа отсутствие формирования морозостойкости в пер вые 2 суток может быть связано с изначально малым количеством клеток, вступающих в клеточный цикл.
Следует отметить, что измерение морозостойкости суспензионной культуры про водилось нами с использованием метода измерения электропроводности водной вы тяжки промороженных клеток. Это позволило нам, используя более высокую разре шающую способность по температурной шкале, обнаружить очень узкий температур ный интервал выживаемости клеток, выражающийся в скачкообразном переходе к максимальному выходу электролитов (свидетельство гибели клеток), тогда как для це лых растений этот процесс имеет значительно более “плавный” и постепенный харак тер. Данная особенность при измерении электропроводности клеток суспензии свиде тельствует о значительной однородности клеточной популяции, что дает нам основа ние рассуждать о чувствительности клеток, проходящих определенную стадию своего развития.
По-видимому, эффективно закаливаться (приобретать устойчивость к какому либо фактору) способны не все клетки растительной ткани, даже обладающие актив ным метаболизмом. Синхронизованная в достаточной степени культура клеток прохо дит во времени стадии своего развития, аналогичные определенным зонам роста целых растений, за исключением дифференциации. Представленные нами экспериментальные и литературные данные позволяют предположить, что закалку инициируют клетки, проходящие определенную стадию клеточного цикла. Но доля этих клеток невелика в относительно синхронных суспензионных культурах, а в целом растении еще меньше.
Тем не менее, у растений наблюдается более высокая степень морозостойкости, чем в культурах. Можно предположить, что в воспринявших внешний сигнал клетках обра зуются интегрирующие факторы, которые могут распространяться от клетки к клетке и вовлекать в процесс образования морозостойкого состояния ткани в целом. Действи тельно, в литературе имеются сведения, указывающие на существование неких интег рирующих факторов (Satoh et al., 1986;
Ojima et al., 1997). Можно предположить, что определенную роль в передаче сигнала от клетки к клетке при образовании морозо стойкого состояния могут играть олигосахарины НТ. Эти молекулы обладают опреде ленными особенностями, которые позволяют им выполнять подобные функции: во первых, их накопление обнаруживается уже через 3 часа воздействия низкой темпера туры в кончике корня, где доля меристематических клеток больше, тогда как в осталь ной части корня – через 6 часов или позже, и, во-вторых – они обнаруживаются в пер вые часы и при обработке растений АБК (Торощина, 2004) в-третьих, они имеют не большую молекулярную массу (степень полимеризации 12). Кроме того, нами получе ны данные, предполагающие, что одной из функций олигосахарина НТ может быть усиление “сигнала” АБК. Так, предобработка этим веществом проростков озимой пше ницы в полумаксимальной концентрации приводила к значительному возрастанию эф фекта АБК на их закаливание (табл. 4).
Как показали эксперименты, обработка проростков озимой пшеницы либо толь ко олигосахарином НТ, либо АБК, приводила к повышению морозостойкости пример но на 25%. Растения, обработанные сначала АБК, а через 15 часов олигосахарином НТ, показали «суммирование» эффектов, равное теоретической сумме, то есть наблюдается аддитивное влияние того и другого вещества на их морозостойкость. Иное взаимодей ствие было выявлено при предобработке проростков озимой пшеницы олигосахарином в течение 15 часов до внесения фитогормона. При этом морозостойкость значительно превышала просто суммирование влияния того и другого вещества (табл. 4).
Так, уже через 3 часа предобработки олигосахарином НТ эффективность закалки озимой пшеницы под действием АБК превысила простое сложение двух эффекторов, то есть, наблюдался синергический характер взаимодействия, который к 9 часам дейст вия олигосахарина НТ достиг максимального уровня (табл. 4). Из этих данных следует, что эффект олигосахарина НТ на закаливание зависит, во-первых, от порядка внесения эффекторов, во-вторых, от продолжительности его воздействия. Таким образом, можно Таблица 4. Влияние олигосахарина на морозостойкость (ЛТ50, %, 7 суток) проростков озимой пшеницы, индуцированную АБК (1 мкМ, 250С, 7 суток). Олигосахарин НТ (0,025 мкг/мл, 250С) добавляли на указанное время до или после начала действия фак тора. За 100 % принято значение ЛT50 для незакаленных проростков озимой пшеницы (-5,6 С).
Время предоб- АБК Олигосахарин Олигосахарин АБК + олиго работки, ч НТ НТ + АБК сахарин НТ ЛT50, % 125 ±0,2 123 ±0,2 122 ±0, 0 150 ±0, 1 - - 175 ±0, 3 - - 177 ±0, 6 - - 200 ±0, 9 - - 200 ±0, 12 - - 200 ±0,2 150 ±0, 15 - заключить, что олигосахарин НТ не только сам может индуцировать процесс образова ния морозостойкого состояния, но также способен повышать эффективность действия АБК. Учитывая, что и тот, и другой эффектор эндогенного происхождения, можно предположить, что одной из физиологических задач олигосахарина НТ является увели чение чувствительности клеток растения к действию АБК. Таким образом, данный биологически активный сахар играет роль сенсибилизатора клеток к фитогормону, то есть, действительно является эндогенной регуляторной молекулой.
Как уже упоминалось выше, к действию абсцизовой кислоты клетки растения чувствительны ограниченный промежуток времени, и к тому же не все клетки тканей, а лишь определенное их количество. Поэтому, одной из возможных причин повышения уровня морозостойкости предобработанных олигосахарином НТ проростков является то, что олигосахарин НТ может изменять восприимчивость клеток к гормону. И наибо лее вероятный механизм явления синергизма, по нашему мнению, связан с эффектив ностью рецепции сигнала АБК, детали которого еще предстоит выяснить.
Заключение Начальные этапы низкотемпературного закаливания растений характеризуются усилением катаболических реакций, одним из следствий которого является, по видимому, появление олигосахаридов – фрагментов полисахаридов клеточной стенки, которые вовлечены в процесс низкотемпературной адаптации. Основываясь на данных, представленных в этой работе, можно заключить, что активация гликозидаз, как пока затель усиления катаболических процессов, не только вовлечена в процессы модифи кации полисахаридных компонентов клеточной стенки, но и является составляющей адаптационной программы именно закаливающихся растений. Это рас ширяет наши представления о роли гликозидаз клеточной стенки в растительном орга низме, поскольку ранее она обычно сводилась к процессам, связанным с ростом или созреванием плодов.
Интересными, на наш взгляд, являются данные, показывающие изменение актив ности гликозидаз в ответ на применение олигосахарина НТ, который появляется в пер вые часы действия низкой положительной температуры. Характерная особенность его влияния на активность гликозидаз - усиление их активации в способных к закаливанию сортах пшеницы и ржи, не только свидетельствует о роли олигосахарина НТ в адапта ции, но и предполагает, что его происхождение и цепь вызываемых им процессов мо гут быть универсальными для озимых культур. Способность этого биологически ак тивного сахара самостоятельно повышать морозостойкость растений ставят его в ряд таких эффекторов, как низкая температура и АБК. Поскольку, олигосахарин НТ явля ется эндогенным, он может быть назван системным фактором, участвующим в форми ровании морозостойкости растений.
Учитывая, что олигосахарин НТ является продуктом усиления гидролитических процессов, инициируемых низкой температурой, можно заключить, что активация гли козидаз является не просто частью катаболических реакций, но и выявляет регулятор ную роль этих процессов при закаливании растений. Таким образом, процессы, проис ходящие в клеточной стенке, являются неотъемлемой частью всего комплекса реакций, запускаемых при низкотемпературной адаптации растений.
Использование суспензионной культуры озимой пшеницы позволило выяснить особенности формирования морозостойкого состояния растений, в частности, под дей ствием АБК, где выявлена первичная связь этого процесса не столько с активным ме таболизмом клеток, сколько с чувствительностью клеток на определённой стадии про хождения ими клеточного цикла. Эти данные позволили предположить, что олигосаха рин НТ является специфическим межклеточным эффектором, запускающим адаптив ную программу клеток, не способных воспринять сигнал гормона непосредственно, то есть, способствовать закаливанию всего растительного организма.
Суммируя результаты представленной работы, можно составить следующую це почку событий, происходящих в клеточной стенке в ходе закаливания растений (рис.
11): понижение температуры приводит к повышению уровня АБК, сигнал которой, воспринимаемый клетками, находящимися в определенной фазе клеточного цикла, за пускает каскад внутриклеточных реакций, приводящих, в том числе, к активации гли козидаз клеточных стенок, которые принимают участие в модификации полисахаридов этого компартмента (главным образом гемицеллюлоз), следствием чего может быть появление олигосахаринов. Олигосахарины НТ, в свою очередь, могут быть следую щим звеном в межклеточных и тканевых контактах, запуская интегрированный ответ клеток, в том числе путем их сенсибилизации к АБК, что приводит к формированию морозостойкого состояния растительного организма в целом. Подобный механизм формирования адаптационных процессов, по-видимому, является характерным именно для озимых растений, т.е. его развитие кон тролируется геномом клетки, что может предоставить широкие возможности для генной инженерии, и способствовать созда нию новых, устойчивых сортов.
ОС АБК Р ПМ ОС 2+ Ca Полисахариды Клеточный Дифференциальная Активация цикл экспрессия генов гликозидаз S G КС Физиологический ответ Рис. 11. Схема участия компонентов клеточной стенки в процессах, происходящих в ходе низкотемпературной адаптации растений. Р - рецептор, ПМ - плазматическая мембрана, КС – клеточная стенка, ОС – олигосахарин НТ.
Выводы 1. Показано, что повышение активности гликозидаз проростков пшеницы и ржи в первые часы воздействия низкой положительной температурой связано с форми рованием морозостойкости, то есть, включено в адаптивную программу озимых злаков.
2. Впервые обнаружено, что эндогенная высокоочищенная олигосахаридная фрак ция (олигосахарин НТ), образующаяся в процессе закаливания проростков ози мой пшеницы низкой положительной температурой и инициирующая образова ние морозостойкого состояния, активирует гликозидазы озимой пшеницы и при комнатной температуре.
3. Впервые установлено, что активация гликозидаз эндогенной высокоочищенной олигосахаридной фракцией, выделенной из проростков озимой пшеницы, прояв ляется только у озимых злаков и характеризуется отсутствием видовой и сорто вой специфичности.
4. Впервые обнаружено, что индукция морозостойкого состояния под действием АБК приводит к активации гликозидаз и изменению пропорции нецеллюлозных полисахаридов клеточной стенки проростков озимой пшеницы.
5. Направленность и динамика действия низкой положительной температуры, АБК и олигосахарина НТ на активацию гликозидаз разных сортов злаковых являются маркерами адаптивных процессов при формировании морозостойкого состояния у растений.
6. Показано, что ответная реакция на внесение АБК на разных стадиях развития частично синхронизованной суспензионной культуры озимой пшеницы Triticum timopheevii Zhuk. отличается по степени подавления роста, деления и по времени, необходимому для формирования морозостойкости.
7. Сформировано представление, что, закаливание растений обусловлено субпопу ляцией чувствительных клеток, реакция которых сопровождается образованием в процессе катаболизма полисахаридов клеточной стенки, в частности с помощью гликозидаз, интегрирующего клетки фактора (олигосахарина НТ), вовлечённого в формирование морозостойкого состояния растительного организма в целом.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Abscisic acid is involved into the cell wall modification during the process of cold hardi ness formation in winter plants / A. Zabotin, T. Barisheva, I. Larskaya, V. Lozovaya, O.
Trofimova, O. Zabotina // 8th International Cell Wall Meeting: Ann. abstr.- Norwich, 1998.
2. Trofimova, O.I. Effect of ABA on the growth and cell-wall glycosidase activities of win ter wheat cell culture / O.I. Trofimova, T.S. Barisheva, A.I. Zabotin // XII Congress of FEPPS: Ann. Abstr.- Budapest, 2000.- P.22.
Трофимова, О.И.. Некоторые особенности инициирования абсцизовой 3.
кислотой морозостойкого состояния клеток озимой пшеницы / О.И. Трофимова, А.И.
Заботин // Вестник Башкирского университета.- 2001.- №2(II).- С.126-128.
4. Трофимова, О.И. Некоторые ответные реакции суспензионной культуры озимой пшеницы на АБК / О.И. Трофимова, А.И. Заботин // Международная конференция «Актуальные вопросы экологической физиологии растений в ХХI веке»: Сб. тезисов. Сыктывкар, 2001.-С.351-352.
5. Peculiarities of cell wall formation obtained during development of synchronized cell sus pension culture of Triticum timopheevii Zhuk. / A. Zabotin, T. Barisheva, I. Larskaya, O.
Trofimova // 9th International Cell Wall Meeting: Toulouse, 2001.- P.250.
6. Исследование регуляции метаболизма каллозы в клетках высших растений in vitro / А.И. Заботин, Т.С. Барышева, О.И. Трофимова и др. // Физиология растений.- 2002. Т. 49, № 6.-С. 1-8.
7. Трофимова, О.И. Индуцированные АБК ответные реакции суспензионной культуры озимой пшеницы / О.И. Трофимова // 6-ая Пущинская школа молодых ученых: Сб. те зисов.- Пущино, 2002.- С. 239.
8. Клеточная стенка и гипотермический синдром озимых растений / А.И. Заботин, Д.А.
Аюпова, Т.С. Барышева, О.А. Заботина, И.А. Ларская, О.И. Трофимова, Т.Е. Торощи на // III съезд Биохимического общества: Сб. тезисов.- СПб, 2002.- С. 439.
9. Трофимова, О.И. Взаимодействие олигосахарида и АБК в процессе низкотемпера турной адаптации озимой пшеницы / О.И. Трофимова, Т.Е. Торощина // 7-ая Пущин ская школа молодых ученых: Сб. тезисов.- Пущино, 2003.- С.228.
10. The new system factor of cold resistance of winter plants / A. Zabotin, O. Zabotina T.
Barisheva, I. Larskaya, T. Toroshina, O. Trofimova // Proceedings of the international scien tific conference "New Geometry of Nature": Kazan, 2003.-V.II.- P. 402-406.
11. Новый системный фактор морозоустойчивости озимых растений / О.А. Заботина, Т.С. Барышева, И.А. Ларская, Т.Е. Торощина, О.И. Трофимова, А.И. Заботин // V сьезд общества физиологов растений России и международная конференция "Физиоло гия растений - основа фитобиотехнологии": Сб. тезисов.- Пенза, 2003.- С.275.
12. Oligosaccharins – a new systemic factor in the acquisition of freeze tolerance in winter plants / A.I. Zabotin., T.S. Barisheva, I.A. Larskaya, T.E. Toroshina, O.I. Trofimova, M.G.
Hahn, O.A. Zabotina // X Cell Wall Meeting: Sorrento, 2004.- №19.- P.61.
13. Участие гликозидаз клеточной стенки в формировании низкотемпературной устой чивости озимой пшеницы / О.И. Трофимова, Т.С. Барышева, О.А. Заботина, Т.Е. То рощина, И.А. Ларская, А.И. Заботин // Материалы Всероссийской научной конферен ции «Стрессовые белки растений».- Иркутск, 2004.- С. 121-124.
14. Oligosaccharins – a new systemic factor in the acquisition of freeze tolerance in winter plants / A.I. Zabotin, T.S. Barisheva, I.A. Larskaya, T.E. Toroshina, O.I. Trofimova, M.G.
Hahn, O.A. Zabotina // Plant Biosystems.-2005.- №1.-Р.139-145.
15. Идентификация и характеристика посредника, вовлеченного в приобретение моро зостойкости озимых растений / А.И. Заботин, О.А. Заботина, Т.С. Барышева, И.А. Лар ская, Т.Е. Торощина, О.И. Трофимова // Второй международный симпозиум "Сиг нальные системы клеток растений: роль в адаптации и иммунитете": Тез. докл. Казань, 2006.- С.40.
16. Олигосахарины являются естественными посредниками защитных реакций в расте ниях / О.А. Заботина, А.И. Заботин, М.Г. Хан, Т.Е. Торощина, Т.С. Барышева, И.А.
Ларская, О.И. Трофимова // Второй международный симпозиум: "Сигнальные систе мы клеток растений: роль в адаптации и иммунитете": Тез. докл.- Казань, 2006.- С.42.
17. Торощина, Т.Е. Взаимодействие олигосахарина и АБК в реакции низкотемператур ной адаптации проростков озимой пшеницы / Т.Е. Торощина, О.И. Трофимова, А.И.
Заботин // Второй международный симпозиум: "Сигнальные системы клеток растений:
роль в адаптации и иммунитете": Тез. докл.- Казань, 2006.-С.219.