Глутатионилирования na,k-атpазы под действием окисленного глутатиона
На правах рукописи
Мэн Сяньюй ИЗУЧЕНИЕ ГЛУТАТИОНИЛИРОВАНИЯ Na,K-АТPазы ПОД ДЕЙСТВИЕМ ОКИСЛЕННОГО ГЛУТАТИОНА 03.01.04 – Биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2013 1
Работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» и в лаборатории конформационной стабильности белков и физических методов анализа Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук.
доктор биологических наук, профессор Научные руководители:
Лопина Ольга Дмитриевна кандидат физико-математических наук Петрушанко Ирина Юрьевна
Официальные оппоненты: Капрельянц Арсений Сумбатович доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук, заведующий лабораторией Хапчаев Аскер Юсуфович кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, Институт экспериментальной кардиологии, старший научный сотрудник Федеральное государственное бюджетное
Ведущая организация:
учреждение науки Институт молекулярной генетики Российской академии наук
Защита диссертации состоится « 28 » ноября 2013 года в 13-00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата и доктора наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук по адресу:
119071, Москва, Ленинский проспект, дом 33, строение 2.
С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы Российской академии наук по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, дом 33, строение 1.
Автореферат разослан « 23 » октября 2013 года
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Na,K-ATPаза – это фермент плазматической мембраны клеток животных, который гидролизует АТP и использует освобождающуюся энергию для переноса ионов Na и K через мембрану против электрохимического градиента. В состав Na,K-ATPазы входит минимум 2 субъединицы: каталитическая - и регуляторная гликозилированная -субъединица. Каждая из субъединиц представлена несколькими изоформами (1 - 4 и 1 - 3), кодируемыми различными генами. Изоформы могут сочетаться друг с другом в любых комбинациях. 1-Субъединица встречается почти во всех тканях, но является основной в эпителии почек и солевых желез, 2 характерна для нервной ткани, сердца, адипоцитов, является основной в скелетных мышцах.
В результате функционирования Na,K-АТРазы на плазматической мембране возникает потенциал покоя, а в возбудимых тканях может происходить генерация потенциала действия (Glitsch, H.G., 2001). Na,K-АТРаза принимает участие в регуляции клеточного объема, транспорте некоторых ионов, глюкозы и аминокислот, сопряженных с переносом натрия. Кроме того, Nа,K-АТРаза является рецептором для сердечных гликозидов, которые, связываясь с ферментом, «включают» различные сигнальные каскады (Xie, Z., et al., 1999;
Xie, Z., Askari, A., 2002).
Внутриклеточный трипептид глутатион (-Glu-Cys-Gly) - это самый распространенный низкомолекулярный тиол в клетке. Глутатион существует в двух формах: восстановленной (GSH) и окисленной (GSSG). Длительное время считалось, что функция глутатиона сводится к защите клетки от токсичных ксенобиотиков, поддержанию внутриклеточного редокс-статуса (Schafer, F., Buettner, G., 2001) и антиоксидантному действию. В настоящее время появляется все больше данных о том, что связывание глутатиона с SH-группами цистеиновых остатков с образованием S-S-связи (S-глутатионилирование) может являться таким же важным механизмом регуляции функции белков, как и фосфорилирование (Mieyal, J., et al., 2008). Поскольку соотношение GSH/GSSG, определяющее редокс-статус клетки, изменяется при различных внутриклеточных процессах и существенно падает при развитии окислительного стресса, глутатионилирование является редокс-чувствительной модификацией, которая может играть не только защитную, но и регуляторную роль (Schafer, F.Q., Buettner, G.R., 2001).
Установлено, например, что глутатионилированию подвергается Са-АТPаза саркоплазматического ретикулума, родственная Na,K-АТPазе. В результате глутатионилирования Са-АТPаза активируется (Adachi, T., et al., 2004). Показано также, что под действием GSH и ONOO- глутатионилированию подвергается -субъединица Na,K-АТPазы, что снижает активность фермента на 20% (Figtree, G., et al., 2009), однако глутатионилирование -субъединицы этого фермента до настоящего времени не обнаружено.
Каталитическая 1-субъединица Na,K-ATPазы содержит 23 остатка цистеина, 15 из которых располагаются в цитозоле клетки и могут быть доступны для окисленного глутатиона. Поочередная замена остатков цистеина на аланин сохраняет фермент в функционирующем состоянии, хотя в некоторых случаях наблюдается снижение числа оборотов фермента (Shi, H. G., et al., 2000). В связи с этим возникает вопрос о роли SH-групп -субъединицы Na,K-ATРазы и состоянии этих групп при изменении соотношения GSH/GSSG, особенно при повышении концентрации окисленного глутатиона.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Цель работы: исследовать глутатионилирование Na,K-АТРазы под действием окисленного глутатиона.
Задачи:
1. Выяснить, происходит ли глутатионилирование каталитической -субъединицы Na,K-АТPазы в клетке («базовое» глутатионилирование).
2. Установить, происходит ли глутатионилирование Na,K-АТPазы под действием окисленного глутатиона in vitro, и определить, влияет ли глутатионилирование на активность фермента.
3. Определить, какие изоформы -субъединицы Na,K-АТPазы подвергаются глутатионилированию.
4. Выяснить, какие SH-группы -субъединицы подвергаются базовому глутатионилированию, а какие глутатионилируются под действием GSSG in vitro.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые показано, что 1-субъединица Na,K-АТPазы, выделенная из трех видов ткани (солевые железы птиц, почки кролика и сердце крысы) содержит связанный глутатион («базовое» глутатионилирование). Впервые установлено, что в препарате Na,K-ATРазы, полученном из сердца крысы, глутатион связан и с 2-субъединицей. Показано, что глутатионилирование 1-, но не 2-субъединицы, устраняется при выделении фермента в присутствии дитиотреитола.
Добавление окисленного глутатиона in vitro приводит к дополнительному глутатионилированию 1-субъединицы, что сопровождается инактивацией фермента.
Впервые проведен кинетический анализ инактивации Na,K-АТPазы окисленным глутатионом и показано, что процесс ингибирования фермента двухфазный, определены константы скоростей для быстрой и медленной фазы ингибирования.
Впервые показано, что адениновые нуклеотиды (АТР, АDР и АМP) защищают Na,K-АТРазу от инактивации окисленным глутатионом. Впервые установлено также, что глутатионилирование фермента под действием GSSG, приводящее к инактивации фермента, полностью предотвращает связывание АDP с Na,K-АТPазой.
Впервые с использованием метода масс-спектрометрии проанализированы протеолитические фрагменты 1-субъединицы Na,K-АТPазы и идентифицированы остатки цистеина, которые подвергаются базовому и дополнительному глутатионилированию. Установлено, что после обработки фермента смесью восстановленного/окисленного глутатиона в концентрациях, которые характерны для клетки в состоянии гипоксии (1,7 мМ/170 мкМ), увеличивается связывание глутатиона с остатками цистеина (454, 458 и 459) 1-субъединицы Na,K-АТPазы, расположенными в большой цитозольной петле, а также с остатком цистеина 244, расположенным в малой цитозольной петле. Из 15 цитозольных остатков цистеина 1-субъединицы Na,K-АТPазы идентифицировано 13. Все они, за исключением остатка цистеина 423, способны взаимодействовать с глутатионом.
На основе опубликованных данных по трехмерной структуре -1субъединицы Na,K-АТРазы из почек свиньи совместно с сотрудниками Института молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН создана модель, позволяющая оценить площадь контактов аминокислот, участвующих в связывании АТР, и глутатиона, связанного с цитозольными остатками цистеина. В результате анализа наших экспериментальных данных и данных, полученных на основе модели, впервые сделан вывод, что глутатионилирование остатков цистеина 454, 458 и 459 предотвращает доступ АТР к активному центру фермента, и наоборот, связывание АТР предотвращает глутатионилирование этих остатков.
Полученные результаты показывают, что при концентрациях окисленного глутатиона, которые существует in vivo при окислительном стрессе и гипоксии, происходит глутатионилирование SH-групп -субъединицы Na,K-АТРазы, что предотвращает окисление этих SH-групп. При этом важные для ферментативной активности SH-группы Na,K-АТРазы защищены от глутатионилирования за счет связывания с активным центром адениновых нуклеотидов, в первую очередь, АТР.
Глутатионилирование частично устраняется под действием дитиотреитола, и полностью под действием соответствующих ферментных систем (например, глутаредоксина в присутствии NADPH). Таким образом, глутатионилирование в состоянии гипоксии защищает существенные для активности SH-группы каталитической субъединицы Na,K-ATPазы от необратимого окисления, одновременно снижая активность фермента, потребляющего в норме значительное количество АТР. Полученные результаты могут оказаться полезными при разработке новых подходов к лечению ишемии, гипоксии, а также устранению последствий окислительного стресса.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Международном симпозиуме «Биологическая подвижность» (Пущино, 2010), Международной конференции по Na,K-АТРазе и родственным АТРазам (Асимолар, США, 2011), на 10-м Международном конгрессе “Регуляция клеточного объема” (Москва, 2013), а также на заседании кафедры биохимии биологического факультета МГУ имени М.В.
Ломоносова (2010, 2011, 2013).
По теме диссертации опубликована 1 статья в издании, Публикации.
рекомендованном ВАК РФ, и 3 тезиса докладов на конференциях.
Структура и объем работы. Диссертационная работа содержит следующие разделы:
«Введение», «Обзор литературы», «Цель и задачи исследования» «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на страницах 108 машинописного текста, иллюстрирована 35 рисунками и таблицами. Список цитированной литературы включает 224 печатных и Web-источников.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Очищенные препараты Na,K-АТРазы получали из солевых желз утки (Smith, T., 1988) и почек кролика (Jorgensen, P., 1988) методом дифференциального центрифугирования.
Частично очищенную микросомальную фракцию, обогащенную активностью получали из сердца крысы методом дифференциального Na,K-АТРазы, центрифугирования (Schwartz, A., et al., 1969;
Harigaya, S., Schwartz, A., 1969).
Концентрацию белка в препаратах Na,K-АТРазы определяли по методу Лоури и соавторов (Lowry, O.H., et al., 1951), в качестве стандарта использовали раствор бычьего сывороточного альбумина.
Активность Na,K-ATРазы определяли путм измерения продукта реакции Рi методом Ратбуна и Бетлах (Rathbun, W.B., Betlach, M.V., 1969). В реакционную среду, содержащую 130 мМ NaCl, 20 мМ KCl, 3 мМ MgCl2, 3 мМ ATP и имидазол 30 мМ (pH = 7,4), вносили 0,5-2 мкг препарата Na,K-ATРазы из почек кролика или солевых желез уток или 20-30 мкг препарата Na,K-ATРазы из сердца крысы. Смесь инкубировали 5-10 мин при 37оС. Предварительно было показано, что накопление Рi в этот промежуток времени происходит линейно. Накопление Рi линейно зависело и от концентрации белка во всем диапазоне концентраций, использованных для оценки активности.
Активность Na,K-ATРазы в препарате из сердца крысы определяли как разность скорости гидролиза АТР в отсутствие и в присутствии 5 мМ уабаина. Анализ кривой ингибирования Na,K-ATРазной активности уабаином, необходимый для определения гидролиза АТР 1- и 2-изоформами фермента, проводили с использованием программы Origin 7.0, используя модель одного или двух типов участков связывания.
Кинетический анализ ингибирования Na,K-АТРазы проводили, преинкубируя фермент в течение различного времени (1-30 минут) в среде с окисленным глутатионом (25-150 мкМ). Затем аликвоты смеси переносили в среду инкубации, разводя при этом среду преинкубации в 50-100 раз. Определение активности проводили, как описано выше.
Полученные кривые анализировали, аппроксимируя зависимость активности от концентрации окисленного глутатиона в среде преинкубации суммой двух экспонент с использованием программы Origin 7.0.
Защитный эффект адениновых нуклеотидов исследовали, добавляя в среду преинкубации, содержащую 1 мМ глутатион, АТР, ADP или AMP в различных концентрациях. Через 20 минут аликвоты смеси переносили в среду инкубации и измеряли активность, как описано выше.
Электрофорез в полиакриламидном геле проводили по модифицированному методу Лэммли (Laemmli, U.K., 1970), используя 5% концентрирующий гель и 7,5% разделяющий гель (или 8%-20% градиентный разделяющий гель).
проводили после переноса белков с геля на Вестерн-блот анализ нитроцеллюлозную мембрану (Towbin, Н. et al., 1979), иммунохимическое окрашивание белков осуществляли с использованием первичных антител, специфичных к глутатиону, связанному с белком (MAB5310, «Millipore», США), 1-субъединице (05-369, «Sigma-Aldrich», США) и 2-субъединице Na,K-АТРазы (AB9094, «Sigma-Aldrich», США).
Для визуализации белковых полос пользовались вторичными антителами, специфичными к иммуноглобулинам мышей (A0168, «Sigma-Aldrich», США) и иммуноглобулинам кроликов (A0545, «Sigma-Aldrich», США), конъюгированными с пероксидазой.
Изотермическая калориметрия титрования (ITC) была использована для оценки термодинамических параметров связывания АDР с Na,K-ATРазой. Эксперименты проводили на приборе MicroCal ITC 200 (MicroCal, Northapton, MA). Полученные кривые анализировали с помощью программы MicroCal Origin 7.0, используя модель одного участка связывания. Из экспериментальных кривых определяли константу связывания (Ka) и изменение энтальпии (H), изменение энергии Гиббса и изменение энтропии (S) вычисляли по формуле: G= –RTlnKа=H–TS.
Цистеиновые остатки -субъединицы Na,K-АТРазы, Масс-спектрометрия.
подвергающиеся глутатионилированию, были определены с помощью метода времяпролетной масс-спектрометрии с лазерной десорбцией/ионизацией при помощи матрицы - MALDI-TOF MS (Shevchenko, A., 2006). Фермент инкубировали с 1,7 мМ GSH/170 мкМ GSSG в течение 30 минут при комнатной температуре, затем часть пробы отбирали на измерение ферментативной активности, а остальную часть пробы инкубировали с додецилсульфатом натрия (SDS) в течение 5 минут при 37 °C для проведения последующего электрофореза с целью разделения - и -субъединиц Na,K-АТРазы. После окончания времени инкубации с SDS проводили электрофорез по Лэммли в 7,5% полиакриламидном геле. Чтобы не допустить восстановления тиоловых групп и деглутатионилирования белка электрофорез проводили в отсутствие -меркаптоэтанола. Полосу геля с 1-субъединицей вырезали и проводили ее расщепление с помощью трипсина или химотрипсина. MALDI-TOF MS анализ полученных пептидных фрагментов проводили на масс-спектрометре Ultraflex II TOF/ (Bruker Daltonics, Германия).
Относительная интенсивность пиков фрагментов была рассчитана как интенсивность пиков фрагментов, нормированная на интенсивность максимального пика, что выражалось в процентах. Возможность оценки изменения количества глутатионилированных фрагментов по относительной интенсивности пиков обеспечивалась следующими факторами: матрицей, позволяющей получить однородное распределение образца, и большим количеством импульсов, суммированных для каждого спектра (4000 лазерных импульсов по 200 импульсов для различных 20 точек одного участка). Полученные масс-спектрометрические данные были проанализированы с помощью программы Bruker Daltonics Flex Analysis 2.4 (Bruker Daltonics, Германия), точность определения масс пептидов была не менее 100 ppm. Детектирование пиков осуществляли с помощью алгоритма SNAP программы Flex Analysis. Соответствие данных масс-спектра аминокислотной последовательности белка было установлено с помощью программы Brucker Daltonics BioTools 3.0. Эксперименты были повторены три раза.
Моделирование взаимодействия связанного глутатиона с аминокислотами, участвующими в формировании участка связывания АТР проводили в поле MMFF94x с использованием программы MOE версии 2009.10. Трехмерные модели каталитической субъединицы S-глутатионилированной Na,K-АТPазы были созданы на основе ранее опубликованной структуры (с разрешением 3,5, PDB code 3b8e) 1-субъединицы из почек свиньи (Morth, et al., 2007). Эта работа проводилась совместно с сотрудниками ИМБ РАН А.А. Анашкиной и И.Ю. Петрушанко.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Характеристика препаратов Na,K-АТРазы из почек кролика, солевых желез утки и сердца крысы. Работа выполнена с использованием трех видов препаратов Na,K-АТРазы:
1. Высокоочищенные (по методу Йоргенсена) препараты Na,K-АТРазы из почек кролика, содержащие 1-изоформу.
2. Высокоочищенные препараты Na,K-АТРазы из солевых желез утки, содержащие 1-изоформу.
3. Выделенные по методу Джонса и соавторов частично очищенные препараты из сердца крысы, содержащие 1- и 2-изоформы каталитической субъединицы.
На рис.1 представлен типичный результат, полученный после проведения электрофореза исследованных препаратов. Видно, что наиболее чистыми являются препараты из солевых желез утки и почек кролика, где присутствуют в основном - и -субъединицы (полоса, соответствующая -субъединице очень размыта, поскольку она сильно гликозилирована). В препарате из сердца крысы видно несколько примесных белков. В области, где должна располагаться -субъединица, видны две полосы (по-видимому, 1 и 2-субъединицы).
В препаратах Na,K-АТРазы из почек кролика и солевых желез утки не было другой АТРазной активности (образование Рi в присутствии ионов Na и K полностью подавлялось в среде с 1 мМ уабаина). Активность Na,K-АТРазы составила 600-1200 и 2000 мкмоль/мг белка в ч соответственно (или 10-20 и 33,3 мкмоль/мг белка в мин).Активность Na,K-АТРазы в препарате из сердца крысы составила около мкмоль/мг белка в ч (~ 0.33 мкмоль/мг белка в мин), активность Mg-AТРазы в этом препарате была около 15% от общей АТРазной активности.
1 2 130кДа 130кДа 100кДа 1 100кДа 70кДа 70кДа 55кДа 55кДа 1. почка Рис. 1. Белковый состав препаратов Na,K-АТРазы, определенный методом электрофореза в 2. солевая железа ПААГ. Слева направо: белки-маркеры, препараты Na,K-АТРазы из почек кролика (1), солевых желез утки (2) и 3. сердце сердца крысы (3).
Для установления природы -субъединицы препараты анализировали с помощью Вестерн-блоттинга, проводя окрашивание специфическими антителами. Иммуноблоттинг препаратов с использованием антител против 1- и 2-субъединиц показал, что в препаратах Na,K-АТРазы из почек кролика и солевых желез утки присутствует только 1-субъединица, а в препарате из сердца крысы – 1- и 2-субъединицы (рис. 2).
Рис. 2. Результаты Вестерн-блоттинга против 1 против препаратов Na,K-АТРазы: слева направо препараты фермента из почки 1 2 3 1 2 кролика (1), солевых желз утки (2) и 117 кДа 1 сердца крысы (3). Окрашено 85 кДа антителами против 1-субъединицы (слева), и антителами против 48 кДа 2-субъединицы (справа).
34 кДа Ингибирование Na,K-АТРазы уабаином в препаратах, выделенных из солевых 1 : почка кролика 2 : солевая железа утки желез утки и крысы крысы. Уабаин – специфический ингибитор Na,K-АТРазы, 3 : сердце сердца относящийся к кардиостероидам, чувствительность Na,K-АТРазы к этому ингибитору характеризуется тканевой и видовой изменчивостью. Фермент, содержащий различные изоформы -субъединицы Na,K-АТРазы, имеет различную чувствительность к уабаину, а у представителей разных видов в одной и той же изоформе присутствуют мутации, влияющие на эту чувствительность.
Изучение зависимости ингибирования Na,K-АТРазы уабаином показало, что в препаратах из солевых желез утки есть один участок связывания уабаина, связывание уабаина с которым вызывает ингибирование с величиной I50 (концентрация, при которой достигается 50% ингибирование) около 210-7 М (рис. 3). В тоже время зависимость ингибирования уабаином Na,K-АТРазы из сердца крысы свидетельствует о наличии двух типов центров связывания со значениями I50 10-5 М и около 10-8 М (рис. 4). Согласно литературным данным в сердце присутствует два типа изоформ -субъединицы (1 и 2) (Mercer, R.W., 1993), методом иммуноблоттинга мы также показали, что в препаратах из сердца крысы, использованных в наших экспериментах, присутствуют две изоформы: 1 и 2 (рис.2). Анализ кривой, представленной на рис. 4, показал, что активность более чувствительной к уабаину изоформы (2-), составляет около 20% от общей активности Na,K-АТРазы, а активность менее чувствительной (1) – около 80%.
I501 210-7 М Активность, % 1E-8 1E-7 1E-6 1E-5 1E-4 1E- [уабаин], М Рис. 3. Зависимость активности Na,K-АТРазы из солевых желез утки от концентрации уабаина, I501 = (1,8±0,1)10-7 М (n = 3).
Активность, % 1E-9 1E-8 1E-7 1E-6 1E-5 1E-4 1E- [уабаин], М Рис. 4. Зависимость активности Na,K-АТРазы из сердца крысы от концентрации уабаина.
I501 = (1,0±0,1)10-5 М, I502 = (6,7±2,2)10-9М (n = 3).
Глутатионилирование Na,K-АТРазы в препаратах, выделенных из солевых желез утки, почек кролика и сердца крысы. С пользованием антител на глутатион в составе белков (-SSG) мы установили, что 1-субъединица Na,K-АТРазы, выделенной из солевых желез утки, уже содержит связанный глутатион (рис. 5, слева вверху), однако инкубация фермента с GSSG приводит к дополнительному включению глутатиона в 1-субъединицу (рис. 5 вверху справа). Количественный анализ денситограмм, полученных с использованием трех препаратов фермента, приведен ниже.
Рис. 5. Глутатионилированное состояние 1-субъединицы Na,K-АТРазы, выделенной из солевых желез утки (вверху слева), и увеличение уровня глутатионилирования после инкубации с мМ GSSG (вверху справа). Нормирование проведено путем окрашивания 1-субъединицы специфическими антителами (две нижние полосы слева и справа). Внизу – результаты количественной денситографии (n = 3).
С использованием тех же антител мы установили, что 1-субъединица Na,K-АТРазы из солевых желез утки также глутатионилирована (на рис. 6 слева вверху), однако при обработке фермента 1 мМ GSSG в течение 30 минут уровень глутатионилирования практически не увеличивается. Количественный анализ денситограмм, полученных с использованием трех препаратов фермента, приведен ниже.
Рис. 6 Глутатионилированное состояние 1-субъединицы Na,K-АТРазы, выделенной из солевых желез утки (вверху слева), и отсутствие дополнительного глутатионилирования -субъединицы после инкубации с 1 мМ GSSG.
Внизу – результаты количественной денситографии (n = 3).
В препарате Na,K-АТPазы из почек кролика 1-субъединица также содержит связанный глутатион. Мы обнаружили, что при выделении препарата фермента в присутствии 100 мкМ дитиотреитола (ДТТ) глутатионилирование 1-субъединицы Na,K-АТPазы почти полностью устраняется. Однако глутатионилирование, полученное с использованием GSSG (1 мМ), устраняется под действием ДТТ в меньшей степени (рис.
7).
Рис. 7. Влияние дитиотреитола (100 мкМ) на базовое глутатионилирование 1-субъединицы Na,K-АТРазы, выделенной из почек кролика, и на дополнительное глутатионилирование, происходящее в присутствии GSSG in Вверху: результаты vitro.
иммуноблоттинга 1-субъединицы, полученные при окрашивании антителами против –SSG;
внизу:
результаты иммуноблоттинга при окрашивании антителами против 1-субъединицы. 1 – базовое глутатионилирование 1-субъединицы, 2 – глутатионилирование 1-субъединицы препарата, выделенного в присутствии дитиотреитола, 3 –дополнительное глутатионилирование под действием GSSG, 4 – дополнительное глутатионилирование под действием GSSG препарата, который был выделен в среде с дитиотреитолом.
При исследовании препаратов Na,K-ATРазы, выделенных из сердца крысы, мы обнаружили, что базовому глутатионилированию подвергается не только 1-, но и 2-субъединица Na,K-ATРазы (рис. 8). Глутатионилирование 1-субъединицы почти полностью устранялось, если препарат фермента получали в присутствии 100 мкМ дитиотреитола, тогда как 2-субъединица Na,K-ATРазы, выделенная в присутствии ДТТ, оставалась существенно глутатионилированной (рис. 8).
Рис. 8. Иммуноблоттинг препаратов Na,K-АТРазы из сердца крысы, которые содержат 1 и 2 субъединицы. Окрашивание проведено антителами против 1-субъединицы (1,2), против 2-субъединицы (3, 4) и антителами против –SSG (5, 6).
Na,K-ATРаза была выделенa в присутствии (1, 3, 5) и в отсутствие 100 мкМ дитиотреитола (2, 4, 6).
Окисленный глутатион (GSSG) инактивирует Na,K-АТРазу в препаратах, выделенных из почек кролика и сердца крысы.
Мы преинкубировали фермент из почек кролика с GSSG, после чего добавляли небольшие аликвоты в среду инкубации и определяли его активность. Мы обнаружили, что в некоторых случаях активность Na,K-АТРазы уменьшалась. Однако если фермент выделяли в среде с дитиотреитолом, то инактивация наблюдалась всегда. Это связано, по-видимому, с тем, что в случае окисления тиоловых групп (в отсутствие ДТТ), они не способны подвергаться глутатионилированию под действием GSSG. Cкорость инактивации зависела от времени преинкубации c GSSG и от его концентрации. Через минут преинкубации при концентрации GSSG 150 мкМ активность фермента почти полностью подавлялась (рис. 9). Полученная в присутствии значительного избытка GSSG по сравнению с SH-группами фермента (около 500 раз) зависимость активности от времени преинкубации хорошо апроксимировалась суммой двух экспонент. Таким образом, инактивация была двухфазной: сначала происходило быстрое падение активности, после чего процесс инактивации замедлялся. Кинетика инактивации Na,K-АТФазы окисленным глутатионом описывается уравнением Аt = А01 exp{-k1[GSSG]} + А02 exp{-k2[GSSG]t}, где Аt – измеряемая активность фермента, k1 и k2 – константы скорости инактивации, [GSSG] – концентрация окисленного глутатиона.
Расчет констант скорости инактивации (константы скорости второго порядка получены в результате деления констант скорости псевдопервого порядка на концентрацию GSSG) при концентрации GSSG 150 мкМ дал значения констант инактивации 3650 ± 340 М-1 мин-1 для быстрой фазы и 270 ± 20 М-1мин-1 для медленной фазы (рис. 10).
0 мкМ GSSG 25 мкМ GSSG 50 мкМ GSSG 100 мкМ GSSG 150 мкМ GSSG Активность,% 0 5 10 15 20 25 Время преинкубации, мин Рис.9. Зависимость активности Na,K-АТФазы из почек кролика от времени преинкубации с различными концентрациями GSSG (0;
25;
50;
100;
150 мкМ, n = 4).
Рис.10. Зависимость активности Na,K-АТРазы из почек кролика от времени преинкубации с GSSG (150 мкМ) в полулогарифмических координатах, определение констант скоростей инактивации (k1 = 3650 ± 340 М-1мин-1 и k = 270 ± 20 М-1мин-1).
Поскольку в сердце есть 2 изоформы каталитической субъединицы Na,K-АТРазы ( и 2), мы измеряли активность фермента в присутствии 10-7 М уабаина, который полностью ингибирует высокочувствительную к уабаину Na,K-АТPазу, содержащую 2-изоформу (около 20% активности, см. рис. 4). Процесс инактивации Na,K-АТРазы сердца крысы, содержащей 1-изоформу, тоже является двухфазным. Константы скорости инактивации составили k1 = 3750 ± 360 М-1мин-1 и k2 = 246 ± 18 М-1мин-1 (рис. 12), что близко к величинам, полученным для препарата Na,K-АТРазы из почек кролика (с 1-изоформой.
0 мкМ GSSG 90 25 мкМ GSSG 50 мкМ GSSG 100 мкМ GSSG 150 мкМ GSSG Активность, % 0 5 10 15 20 25 Время преинкубации, мин Рис.11. Зависимость активности Na,K-АТФазы из сердца крысы, содержащей 1-изоформу, от времени преинкубации с различными концентрациями GSSG (0;
25;
50;
100;
150 мкМ, n = 4).
Рис. 12. Зависимость активности Na,K-АТФазы из сердца крысы, содержащей 1-субъединицу, в полулогарифмических координатах от времени преинкубации со 150 мкМ GSSG и расчет констант скорости инактивации k1 = 3745± 360 М-1мин-1 и k2 = 246 ± М-1мин-1.
Адениновые нуклеотиды (АТР, АDР и АМР) защищают Na,K-АТРазу от инактивации GSSG. Мы установили, что предварительное выдерживание Na,K-АТРазы, полученной из сердца крысы, в среде инкубации, содержащей АТР, защищает ее от инактивации под действием окисленного глутатиона.
Затем мы преинкубировали Na,K-ATРазу в течение 20 мин с 1 мМ GSSG и различными концентрациями АТР (0-3мМ) при комнатной температуре, после чего определяли активность фермента. Результаты представлены на рис. 13. Видно, что при концентрации АТР выше 0,8 мМ наблюдается почти полная защита активности, полумаксимальный эффект АТР оказывает при концентрации 0,54 мМ.
Активность, % 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3. Концентрация нуклеотида, мМ Рис. 13. Зависимость активности Na,K-АТPазы, преинкубированной в течение 20 мин в присутствии 1 мМ GSSG при комнатной температуре, от концентраций АТP (), АDP (), АМP () в среде преинкубации. На оси ординат активность в % по отношению к контролю. Контроль – преинкубация фермента в среде без GSSG с различными концентрациями АТP, АDP, АМP.
Подобные эксперименты были проведены также с АDP и АМP. Результаты представлены на рис. 13. АDP и АМP обеспечивают полную защиту активности от инактивации 1 мМ GSSG при концентрациях 3 и около 4 мМ соответственно, полумаксимальная защита наблюдается при концентрациях АDP и АМР 0,7 и 1,75 мМ.
Таким образом, сродство адениновых нуклеотидов к центру, заполнение которого предотвращает инактивацию Na,K-АТРазы, уменьшается в ряду: АТР, АDP, АМP.
Глутатионилирование предотвращает связывание АDP с Na,K-АТPазой. Для оценки термодинамических параметров связывания нуклеотидов с глутатионилированной и неглутатитонилированной формой Na,K-ATPазы из почек кролика была использована изотермическая калориметрия титрования (ITC). Эксперименты по ITC были проведены в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН. Выделение тепла, связанное с взаимодействием АDP и фермента из почек кролика, было измерено в присутствии дитиотреитола (100 мкМ) или окисленного глутатиона (1 мМ). Аликвоты лиганда (2,6-3,8 мкл, 20-35 мкМ) добавляли в ячейку, содержащую 2-18 мкМ Na,K-АТРазы, до достижения полной изотермы связывания. Чтобы оценить эффективную теплоту связывания, из теплоты реакции вычитали теплоту разбавления. Типичная экспериментальная кривая ITC для связывания ADP c Na,K-ATPазой из почек кролика приведена на рис. 14. На верхней панели рисунка приведена кривая титрования Na,K-ATРазы из почек кролика АDP при pH=7,5 и 25 °C, на нижней панели – изотерма связывания, полученная интегрированием ITC-кривой и аппроксимированная с помощью модели одного участка связывания. Связывание АDP с Na,K-ATPазой является энтальпийно выгодным процессом (H= – 8,2 ± 0,3 ккал моль-1, TS=1,1 ккал моль-1) с константой связывания Ka = (6,8 ± 1,4) 106 M-1 (константа диссоциации Kd=0,15 мкM).
Стехиометрия связывания АDP с Na,K-ATPазой составляла около 0,8. Из представленных данных видно, что S-глутатионилирование фермента окисленным глутатионом полностью предотвращает связывание АDP с Na,K-ATPазой.
Рис. 14. Анализ взаимодействия Na,K-АТPазы с АDP методом изотермической калориметрии титрования, ингибирующий эффект S-глутатионилирования на связывание АDP с Na,K-ATPазой. Кривая титрования (выделение тепла в ответ на добавление АDP (верхняя панель) и изотерма связывания (нижняя панель) АDP с Na,K-АТРазой в отсутствие (черная кривая) или присутствии (красная кривая) окисленного глутатиона ( мM) при 25 °C.
Идентификация глутатионилированных цистеиновых остатков 1-субъединицы Na,K-ATРазы. Идентификацию цистеиновых остатков Na,K-ATРазы из солевых желез утки, которые имеют базовое глутатионилирование и подвергаются дополнительному глутатионилированию в присутствии окисленного и восстановленного глутатиона, проводили с использованием метода масс-спектрометрии. Очищенную Na,K-АТРазу инкубировали в присутствии 1,7 мМ GSH и 170 мкМ GSSG. Это те концентрации, которые характерны для сердца в состоянии гипоксии. Параллельно оценивали активность Na,K-ATРазы в контроле и после обработки 1,7 мМ GSH и 170 мкМ GSSG, чтобы убедиться в наличии инактивации. Затем брали по два образца из контроля и опытных проб и подвергали обработке трипсином или химотрипсином.
Масс-спектрометрический анализ проводили в лаборатории Института биоорганической химии им. академиков M.M. Шемякина и Ю.А. Овчинникова. В результате проведения анализа протеолитических фрагментов 1-субъединицы Na,K-ATРазы методом MALDI-TOF MS было получено покрытие сиквенса 70-80% в случае химотрипсина и 50-60% для триптических фрагментов. Данные по модификации цитозольных остатков цистеина привены в таблице 1.
Таблица 1. MALDI-TOF-MS анализ S-глутатионилированных пептидов -субъединицы Na,K-АТРазы из солевых желез утки (т-трипсиновый, хт-химотрипсиновый фрагмент).
Номер Фраг- Экспериментальное Рассчитанное Модифик Относите остатка мент значение m/z значение m/z ация льная Cys интенсив Немодиф. Модифиц.
Контроль GSH/GSSG ность Контроль GSH/GSSG 194-207 т 206 1798,82 1798,89 1493,82 1798,89 SG 0,72 0, 236-250 т 244 1934,95 1934,86 1629,75 1934,84 SG 0,08 0, 338, 351 336-353 xт 2326,19 2326,19 2021,14 2326, 21 SG, SН 0,14 0, 350-272 т 351-369 3035,49 3035,48 2425,19 3035,33 SG, SG 0,03 0, 454-468 т 454,458,459 2671,20 2671,19 1755,79 2671,01 SG, SG, SG 0,05 0, 456-462 хт 458,459 1015,34 1015,34 710,28 1015,35 SG, SН 0,28 0, 502-516 хт 513 1981,0 1981,01 16,74,86 1980,93 SG 2,98 2, 549-554 хт 551 2097,96 2097,95 1792,79 2097,87 SG 1,88 2, 640-660 хт 658 2526,24 2526,36 2221,22 2526,29 SG 0,19 0, 694-702 т 700 1335,65 1335,65 1030,56 1335,64 SG 0,58 0, В таблице показаны триптические и химотриптические фрагменты, содержащие глутатионилированные остатки цистеина, для каждого фрагмента приведены экспериментальные и расчетные значения m/z (отношение массы фрагмента к его заряду, z=1), а также относительная интенсивность пиков с данными значениями m/z. Расчетные значения m/z приведены для фрагментов, в которых все цистеины находятся в немодифицированной (восстановленной-SH) форме, а также для модифицированных (глутатионилированных-SG) форм фрагментов.
Модификации цистеинов были оценены путем сравнения экспериментальных значений m/z с расчетными, так как связывание глутатиона (-SG) увеличивает массу фрагмента на 305 Да.
Детектирование пиков осуществляли с помощью алгоритма SNAP программы Flex Analysis (Bruker Daltonics, Германия). Эксперименты были повторены три раза.
Из 15 цитозольных цистеиновых остатков 1-субъединицы успешно были идентифицированы 13, почти все они подвергаются базовому глутатионилированию.
Обработка фермента смесью GSH/GSSG приводит к достоверному увеличению глутатионилированных форм остатков цистеина 454, 458 459, расположенных в большой цитозольной петле, и остатка цистеина 244, находящегося в малой цитозольной петле (рис.
15). Цистеин 423 никогда не был обнаружен в глутатионилированном виде.
Цитоплазма Рис. 15. Локализация глутатионилированных цистеинов 1- субъединицы Na,K-ATРазы по отношению к центру связывания АТР. Мембранные домены показаны как цилиндры и обозначены M1-M10. Цитозольные и внеклеточные домены показаны линиями, на которых участок связывания уабаина обозначен синим цветом, а участок связывания АТР – красным цветом. Синим цветом указаны остатки цистеина, красным – те из них, глутатионилирование которых возрастает при инкубации со смесью GSH/GSSG, зеленым, остаток цистеина, которого нет в 1-субъединице, но который присутствует в 2-субъединице.
Моделирование взаимодействия связанного глутатиона с аминокислотами АТР-связывающего центра. Для оценки возможного взаимодействия глутатиона, связанного с остатками цистеина 1-субъединицы, с аминокислотными остатками АТР-связывающего центра, была создана трехмерная модель глутатионилированной 1-субъединицы Na,K-АТРазы на основе ранее опубликованных данных о структуре 1-субъединицы Na,K-ATРазы из почек свиньи (PDB код 3b8e). Сравнение аминокислотной последовательности -субъединицы из свиньи (P05024, UniProtKB database), утки (Q7ZYV1), кролика (Q9N0Z6) и крысы (P06685) показало, что локализация остатков цистеина консервативна во всех перечисленных видах. Моделирование и расчеты были проведены в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.
Полученные данные свидетельствуют, что связывание глутатиона с остатками цистеина 452, 456 и 457 1 -субъединицы почек свиньи, которые соответствуют остаткам цистеина 454, 458 459 в 1-субъединице утки, кролика и крысы, может влиять на связывание адениновых нуклеотидов с участком связывания АТР.
В соответствии с моделью расстояние между терминальным отрицательно заряженным остатком АТР и карбоксильной группой глутатиона, связанного с цистеином 452 1-субъединицы Na,K-АТРазы из почек свиньи, несущей отрицательный заряд, составляет менее 8. Силы электростатического отталкивания между двумя этими отрицательными зарядами будет препятствовать связыванию АТР с активным центром.
Электростатическое отталкивание будет усиливаться при глутатионилировании остатков цистеина 456 и 457. Результаты этого наблюдения находятся в соответствии с нашими данными, согласно которым связывание адениновых нуклеотидов с активным центром и глутатионилирование взаимно исключают друг друга. Моделирование показывает, что глутатионилирование остатка цистеина 242 (244 для 1-субъединицы утки, кролика и крысы) не будет влиять на доступность активного центра для молекулы АТР.
Рис. 16. Наложение трехмерной структуры нуклеотид-связывающего домена 1-субъединицы Na,K-АТРазы из почек свиньи (от Arg-378 до Arg-589) с АТР (А) или глутатионом (В), связанным с оcтатками Cys-452, -456 и -457. Модель создана на основе 3,5 структуры Na,K-АТРазы из почек свиньи (PDB код 3b8e). Структурное выравнивание проведено с помощью программы MOE.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Полученные данные свидетельствуют, что S-глутатионилирование -субъединицы Na,K-АТРазы может приводить к ее инактивации за счет предотвращения доступа АТР к активному центру. Такое глутатионилирование и связанное с ним падение активности осуществляется при снижении концентрации ATP до определенной величины (50% падения активности под действием глутатионилирования, так же как и 50% защита от инактивации GSSG под действием АТР, наблюдаются при концентрации нуклеотида около 0,5 мМ). Известно, что в некоторых органах, таких как мозг, диафрагма, сердечная мышца, почки, Na,K-АТРаза может потреблять существенное количество от общего запаса АТР в клетке (см., например, Soltoff, S., and Mandel, L., 1984). В сердце при гипоксии вслед за снижением запасов О2 наблюдается быстрое исчерпание запасов АТР (Kominski, M. et al., 2011). Таким образом, глутатионилирование -субъединицы Na,K-АТРазы может предотвратить падение концентрации АТР в условиях гипоксии, когда митохондрии теряют способность производить ее. Характерно, что при такой концентрации АТР (0,5 мМ) Na,K-АТРаза ингибируется не полностью (теряется лишь около 50% активности) (Lopina, O.D., 2000), таким образом, необходимые для жизнедеятельности клетки функции фермента сохраняются. Более того, S-глутатионилирование каталитической субъединицы устраняется под действием глутаредоксина и NАDPH, таким образом, при переходе ткани в состояние с нормальной концентрацией кислорода функция фермента может полностью восстановиться.
Na,K-АТРаза может быть S-глутатионилирована в результате реакции тиол-дисульфидного обмена, при этом ее частичная инактивация наблюдается уже при концентрации GSSG 25 мкМ, становясь почти максимальным при его концентрации мкМ, которая достигается в сердце при гипоксии. Глутатионилирование под действием таких концентраций GSSG происходит и при относительно высокой концентрации GSH (1,7 мМ).
Двухфазная кинетика инактивации Na,K-АТРазы GSSG может означать существование двух классов SH-групп, модификация которых приводит к падению активности фермента, как было обнаружено для фермента, устраняющего разветвления в молекуле гликогена (Cappel, R., et al., 1986). С другой стороны, это может отражать наличие двух конформаций Na,K-АТРазы (E1 и Е2), в которых SH-группы имеют разную доступность для GSSG.
Мы обнаружили также, что 1-субъединица Na,K-АТРазы, выделенная из трех видов ткани (солевые железы, почки и сердце) уже содержит связанный глутатион. Более того, 2-субъединица Na,K-АТРазы, как и 1-субъединица также выделяется в глутатионилированном виде. Роль такого базового глутатионилирования пока не выяснена, однако оно описано и для других белков, например, для Са-АТРазы (SERCA 2A) (Lancel, S., et al., 2009) и рианодинового рецептора (Aracena-Parks, P., et al., 2006).
2-субъединица Na,K-АТРазы из сердца глутатионилируется в большей степени. Это интересный факт, поскольку 2-изоформа Na,K-АТРазы выполняет несколько иные функции, чем 1-изоформа: в плазматической мембране кардиомиоцитов этот изофермент находится в области триад, где он ассоциирован с Na/Са-обменником (Despa, S., Bers, D., 2007). Таким образом, 2-изофермент, более чувствительный к глутатионилированию, будет защищен от необратимого окисления при высоком уровне О2. Известно, что сильный окислительный стресс приводит к необратимому окислению SH-групп белков до -SO2 и -SO3, после чего эти группы уже не могут подвергаться S-глутатионилированию.
Это означает, что глутатионилирование защищает фермент от необратимой инактивации.
Мы показали, что глутатионилированию могут подвергаться почти все цитозольные SH-группы -субъединицы фермента, за исключением цистеина 423. Однако in vitro в присутствии характерных для гипоксии концентраций окисленного и восстановленного глутатиона увеличивается его связывание с остатками цистеина 244 малой цитозольной петли, а также с остатками цистеина 454, 458 и 459 большой цитозольной петли 1-субъединицы фермента. Построение трехмерной модели участка связывания АТР показало, что глутатионилирование трех последних остатков может закрывать доступ АТР в активный центр, вызывая инактивацию Na,K-АТРазы.
Можно полагать, что S-глутатионилирование Na,K-АТРазы имеет физиологическое значение, снижая активность фермента, потребляющего значительное количество АТР. В то же время глутатионилирование предотвращает необратимое окисление фермента, что позволяет восстановить его активность с использованием, например, глутаредоксина и NАDРН после перехода ткани в состояние с нормальной концентрацией кислорода.
ВЫВОДЫ 1. Установлено, что 1-субъединица Na,K-ATРазы, выделенной из почек кролика, солевых желез утки и сердца крысы, содержит связанный глутатион. В препарате Na,K-ATРазы, полученном из сердца крысы, глутатион связан и с 2-субъединицей.
Глутатионилирование 1- (но не 2-) субъединицы в значительной степени устраняется в присутствии дитиотреитола.
2. Окисленный глутатион вызывает протекающую во времени инактивацию Na,K-ATРазы почек кролика и сердца крысы in vitro;
одновременно возрастает и уровень глутатионилирования 1-субъединицы. Кинетика инактивации Na,K-ATРазы под действием окисленного глутатиона является двухфазной, константы скорости инактивации для быстрой и медленной фаз различаются более чем в 10 раз.
3. Адениновые нуклеотиды защищают Na,K-ATРазу от инактивации окисленным глутатионом;
защитное действие нуклеотидов снижается в ряду: АТР ADP AMP.
Методом изотермической калориметрии титрования показано, что глутатионилирование фермента предотвращает связывание с ним АDP.
4. Методом масс-спектрометрии (с перекрыванием 70-80% последовательности 1-субъединицы при обработке химотрипсином и 50-60% при обработке трипсином) установлено, что из 15 остатков цистеина 1-субъединицы Na,K-ATРазы, локализованных в цитозольном домене, глутатион может модифицировать 12. Остаток цистеина 423 никогда не глутатионилируется.
5. Инкубация Na,K-ATPазы из солевых желез утки со смесью восстановленный/окисленный глутатион (1,7 мМ/170 мкМ) приводит к полной инактивации фермента. При этом увеличивается связывание глутатиона с остатками цистеина 244, 454, 458, 459.
6. Сравнение набора остатков цистеина, подвергающихся глутатионилированию, и результаты моделирования связывания глутатиона и АТP с Na,K-АТРазой, позволяют заключить, что для инактивации фермента необходимо глутатионилирование остатков цистеина 454, 458, 459 1-субъединицы из почек кролика, солевых желез утки и сердца крысы. Модификация этих остатков препятствует связыванию АТР, а связывание нуклеотида предотвращает модификацию указанных остатков цистеина.
7. Полученные результаты позволяют предположить, что физиологическое значение глутатионилирования 1-субъединицы заключается, во-первых, в том, что связанный глутатион защищает SH-группы от необратимого окисления, а во-вторых, позволяет за счет инактивации Na,K-АТРазы предотвратить снижение концентрации АТР в клетке.
ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. I.Yu. Petrushanko, S. Yakushev, V.A. Mitkevich, Y. V. Kamanina, R.H. Ziganshin, Xianyu Meng, A.A. Anashkina, A. Makhro, O. D. Lopina, M. Gassmann, A. A. Makarov, A. Bogdanova.
S-glutationilation of the Na,K-ATPase catalytic -subunit is a determinant of the enzyme redox sensitivity. J. Biol. Chem. (2012), 287 (38), 32195-32205.
2. O.D. Lopina, Xianyu Meng, A.V. Graf, N.A. Sokolova Effect of hypoxia on the activity of Na,K-ATPase isoforms in rat heart. Biological motility. From fundamental achievments to nanotechnologies. Pushchino, 2010, стр. 153.
3. I.Yu. Petrushanko, V.A. Mitkevich, Y.V. Kamanina, X. Meng, R.H. Ziganshin, A.A. Anashkina, O.D. Lopina, A.A. Makarov. S-glutathionylation of the Na,K-ATPase catalytic alpha-subunit as a new regulator of the enzyme redox-sensitivity. Theses of The 13th International ATPase Conference «Na,K-ATPase and Related P-type Transport ATPases: Structure, Biology, and Medicine», Asilomar Conference Grounds Pacific Grove, California, USA, September 27– October 2, 2011, p.121.
4. Meng, X., Petrushanko, I.Yu, Klimanova, Е.А., Dergousova, Е.А., Lopina, O.D.
Glutationylation of -subunit of Na,K-ATPase from rat heart results in the enzyme inhibition.
Thesis of 10th International Conference “Cell volume regulation”. Moscow, August 26-29, 2013, p.109.