Структурная и функциональная характеристика антигенного с-комплекса туляремийного микроба разных подвидов
На правах рукописи
КУЗНЕЦОВА Екатерина Михайловна Структурная и функциональная характеристика антигенного С-комплекса туляремийного микроба разных подвидов 03.02.03 – микробиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Саратов - 2010 2
Работа выполнена в ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Научный консультант:
кандидат биологических наук Волох Оксана Александровна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Щербаков Анатолий Анисимович доктор медицинских наук, профессор Швиденко Инна Григорьевна
Ведущая организация:
ФГУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт»
Защита состоится «_»_2010 г. в _часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» (410005, г. Саратов, Университетская, 46).
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб».
Автореферат разослан «_» _2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, старший научный сотрудник Слудский А.А.
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Francisella tularensis – грамотрицательная факультативно внутриклеточная неподвижная мелкая плеоморфная бактерия, вызы вающая заболевание у людей и животных, ареал распространения которой охваты вает в основном зону умеренного климатического пояса Северного полушария. Раз личают 4 подвида F. tularensis: subsp. nearctica (встречается только в Северной Аме рике), subsp. holarctica (Северное полушарие), subsp. mediasiatica (только в Средней Азии) и subsp. novicida (Северная Америка и тропическая Австралия) [Олсуфьев Н.Г., 1975;
Oyston P.C.F. et al., 2003;
Whipp M. J., 2003;
Splettstoesser W.D. et al., 2005], для которых характерна относительная генетическая однородность (до 90%) [Домарадский И.В., 2005]. Несмотря на достигнутые успехи в исследовании особен ностей строения и биологии туляремийного микроба, факторы патогенности этого возбудителя, состав капсулы и протективные антигены окончательно не установле ны [Havlasova J. et al., 2002;
Sjstedt A., 2003;
Eyles J.E., 2007;
Oyston P.C.F., 2008;
Santic M., 2010]. Эндемичные очаги туляремии характеризуются стабильностью проявления и широко распространены, в том числе на территории России и сосед них стран [Trnvik A. et al., 2004;
Топорков В.П. и др., 2007, Безсмертный В.Е. и др., 2008]. Кроме того, возбудитель туляремии включен в высшую категорию А как по тенциальный агент биотерроризма [Dennis D. et al., 2001;
Gallagher-Smith M. et al., 2004].
Лабораторная диагностика туляремии в настоящее время основывается на им мунологических (сероаллергологическая диагностика) и бактериологических мето дах [Лаб. диагност. ООИ, 2009]. В области разработки новых способов детекции ту ляремийного микроба ведутся активные исследования [Splettstoеsser W. D. et al., 2005;
Hotta A. et al., 2007]. Тест-системы на основе молекулярно-генетических мето дов интенсивно разрабатываются и в настоящее время включены в схему лабора торной диагностики туляремии [Лаб. диагност. ООИ, 2009]. У возбудителя туляре мии липополисахарид (ЛПС) и белки внешней мембраны (ВМ) влияют на специ фичность иммунного ответа макроорганизма, обладают уникальной полиэпитопной антигенной структурой и рассматриваются как перспективные антигены для созда ния профилактических и диагностических препаратов [Родионова И.В., Захаренко В.И., 1990;
Хлебников В.С. и др., 1992, 1993;
Ellis J. et al., 2002;
Conlan J.W. 2004;
Oyston P.C.F., 2008]. Оценка эффективности тест-систем для иммуноферментного анализа (ИФА) показала, что диагностикумы на основе препаратов ЛПС F. tularensis или отдельных белков ВМ (43 и 17 кДа) обладают более низкой чувствительностью (96,5-99,0%) и специфичностью (96-97%), чем на основе комплекса белков ВМ 100% специфичность и чувствительность [Bevanger L. et al., 1988, 1989;
Schmitt P. et al., 2005;
Splettstoеsser W. D. et al., 2005].
К антигенным структурам сложной химической природы относится поверхно стный С-комплекс, обладающий выраженными иммуномодулирующими свойствами [Родионова И.В., 1989;
Юров С.В. и др., 1991;
Хлебников В.С. и др., 1994;
Жемчугов В.Е., 2004]. В составе данного антигена, полученного из клеток вакцинного штамма F. tularensis 15 линии НИИЭГ (С-15), были определены белки, липиды и углеводы, установлена его протективная активность для белых мышей при экспериментальной туляремии, а также отсутствие токсичности и повреждающего действия на иммуно компетентные клетки [Шепелв И.А., 2005;
Волох О.А. и др., 2007]. В то же время недостаточно изучены особенности строения и состава С-комплекса туляремийного микроба разных подвидов и его антигенные, биохимические и иммунобиологиче ские свойства. Полученные данные позволят оценить возможность применения С-комплекса для разработки новых экспериментальных иммунодиагностических препаратов.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ - определение особенностей структуры и свойств антигенного С-комплекса туляремийного микроба разных подвидов, оценка воз можности использования в иммунодиагностике туляремии.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:
1. Получить препараты антигенного С-комплекса туляремийного микроба разных подвидов, провести их сравнительный анализ.
2. Разработать методические подходы для выделения и очистки компонентов С-комплекса туляремийного микроба.
3. Определить оптимальную схему иммунизации животных-продуцентов для получения туляремийных поликлональных антител.
4. Разработать методические подходы для выявления и количественного оп ределения С-комплекса туляремийного микроба и его компонентов с применением различных вариантов иммуноанализа.
5. Разработать на основе антигенного С-комплекса туляремийного микроба экспериментальные иммунодиагностические препараты для детекции возбудителя туляремии и противотуляремийных антител.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. На основе сравнительного анализа структуры и свойств полученных препаратов С-комплекса из штаммов туляремийного микроба подвидов holarctica, nearctica, mediasiatica установлено, что их молекулярная масса в нативных условиях составляет около 280 кДа, все препараты сходны по химиче скому (содержат белки 62±5%, липиды 27±6% и углеводы 15±3%) и субъединично му составам (содержат иммунохимически активные субъединицы: 81-85, 57-60, 43, 23-27 и 14-17 кДа). В составе препарата С-15 с помощью протеомного анализа под тверждено наличие указанных выше субъединиц, среди которых впервые иденти фицированы биологически активные молекулы – белки-шапероны (GroES и GroEL), три фермента, три белка ВМ и регуляторный белок (фактор элонгации EF-Tu).
Препараты С-комплекса основных подвидов обладают протективными свой ствами для лабораторных животных при экспериментальной инфекции, вызванной вирулентными штаммами голарктического, неарктического и среднеазиатского под видов и индуцируют в организме лабораторных животных образование антител в ранние сроки. С-комплекс из F. tularensis subsp. novicida отличается от аналогичных антигенов других подвидов большим содержанием углеводной части (26,5±1,2%), наличием субъединиц с молекулярной массой более 110 кДа и отсутствием иммуно реактивных белков в области 57-85 кДа. Установлено снижение иммунохимической (в 5 раз) и протективной активностей этого препарата.
Усовершенствованы отдельные этапы получения компонентов С-комплекса туляремийного микроба, разработаны иммунохимические методы (ИФА, иммунодот – ДИА, иммуноблоттинг) их выявления и количественного определения. Установ лено, что компоненты С-комплекса с молекулярными массами более 23 кДа имеют белковую природу, а субъединицы 14-17 кДа - липопротеидную. Впервые было по казано, что С-комплекс регистрируется у туляремийного микроба независимо от формы ЛПС и наличия капсулы.
Чувствительность экспериментальных препаратов на основе антител к С-комплексу туляремийного микроба для детекции возбудителя туляремии разных подвидов иммунодиагностическими методами (ИФА, ДИА) составляет 104- м.к./мл. Иммуносуспензионный метод на основе реакции латекс агглютинации по зволяет выявлять как Cap+, так и Cap- штаммы туляремийного микроба, в отличие от коммерческого диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА).
Использование С-15 в качестве маркерного антигена в иммуноблоттинге и ИФА (ДИА) позволяет определять туляремийные антитела у лабораторных животных (вакцинированных и экспериментально зараженных).
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Разработаны методы выделения компо нентов С-комплекса туляремийного микроба с помощью ферментативного и хими ческого гидролиза с последующей хроматографической очисткой, позволяющие с наименьшими затратами получать эти препараты в лабораторных условиях. Полу ченные препараты С-комплекса разных подвидов используются при выполнении научно-экспериментальных работ в лабораториях вакцинологии и иммунопрофи лактики, иммунодиагностики и молекулярной диагностики РосНИПЧИ «Микроб».
Полученные в результате работы научные данные об особенностях антигенного строения туляремийного микроба используются на курсах первичной специализа ции врачей и биологов по особо опасным инфекциям и курсах усовершенствования по специальности «бактериология» в институте «Микроб» при чтении лекций цикла «Микробиология и лабораторная диагностика туляремии».
По результатам проведенных научных исследований разработаны методиче ские рекомендации «Применение антител к С-комплексу туляремийного микроба для детекции возбудителя туляремии методами иммуноанализа», одобренные Уче ным советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 2 от 17.04.2008 г.) и утвержденные директором института.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
1. С-комплекс является общим антигеном для туляремийного микроба основ ных подвидов (subsp. holarctica, nearctica, mediasiatica), обладает сходной структу рой и свойствами.
2. Особенности биохимического и иммунохимического строения С-комплекса из F. tularensis subsp. novicida обусловливают снижение его иммуно генности и протективности для белых мышей в отношении экспериментальной ту ляремийной инфекции по сравнению с аналогичными антигенами, выделенными из штаммов других подвидов.
3. Препарат С-комплекса, выделенный как из вакцинных, так и вирулентных штаммов, обладает иммуномодулирующими свойствами и защищает белых мышей при заражении вирулентными штаммами возбудителя туляремии голарктического, среднеазиатского и неарктического подвидов.
4. Разработанный комплекс методов выделения компонентов антигенного С-комплекса, основанный на комбинировании способов химического и фермента тивного гидролиза препаратов с последующей хроматографической очисткой, по зволяет получать иммунохимически активные компоненты.
5. Разработанная схема иммунизации животных продуцентов позволяет полу чать гипериммунные туляремийные сыворотки, отличающиеся высокой активно стью и стабильностью.
6. Экспериментальные антительные препараты позволяют выявлять С-комплекс туляремийного микроба и его компоненты в различных вариантах им муноанализа (ДИА, ИФА, иммуноблоттинг) в концентрации до 0,5-1,0 нг/мл, клетки туляремийного микроба разных подвидов в количестве до 104-105 м.к./мл. Экспери ментальные препараты на основе антигенного С-комплекса выявляют специфиче ские противотуляремийные антитела у животных (вакцинированных, инфицирован ных и переболевших) в ранние сроки и до 6 мес.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были представлены и об суждались на VI Межгосударственной научно-практической конференции «Сани тарная охрана территорий государств-участников СНГ: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях», Волго град;
Российской научно-практической конференции «Инфекционные болезни: про блемы здравоохранения и военной медицины», Санкт-Петербург, 2006;
VII Межго сударственной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации меж дународного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий госу дарств-участников СНГ», Оболенск;
Съезде Всероссийского научно IХ практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва;
научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на Юге России», Став рополь, 2007;
IX Межгосударственной научно-практической конференции «Совре менные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников СНГ», Волгоград;
научно практической конференции молодых ученых и специалистов научно исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире», Оболенск, 2009;
Всероссийской научно-практической конфе ренции «Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения», Нижний Новгород, 2009;
ежегодных итоговых научно-практических конференциях Рос НИПЧИ «Микроб», Саратов, 2005-2010 гг.
ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, из них 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК России.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, об зора литературы, материалов и методов, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных источников. Объем диссертации страница машинописного текста. Список литературы содержит 129 отечественных и 137 иностранных источников. Работа иллюстрирована 25 рисунками и 18 таблицами.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Материалы и методы.
Работа выполнена с использованием вакцинных (F. tularensis 15 НИИЭГ и LVS cap-) и 65 вирулентных штаммов F. tularensis разных подвидов и биоваров (ho larctica: eryR, eryS, japonica;
nearctica, mediasiatica, novicida), а также 30 гетероло гичных микроорганизмов, все штаммы получены из ГКПБ «Микроб». Культивиро вание туляремийного микроба проводили при 37 оС на плотных и жидких питатель ных средах FT, T и LB.
Препараты С-комплекса разных подвидов получали из инактивированной фе нолом биомассы поэтапным осаждением в изоэлектрической точке с предваритель ным гидродинамическим смывом [Шепелв И.А., 2005].
Концентрацию белка определяли общепринятыми методами. Углеводы реги стрировали по реакции с тимоловым реактивом [Сборник инструкций по общим ме тодам контроля…, 1983], количество липидов - бихроматным методом [Amenta J., 1964], нуклеиновых кислот - по Спирину [ФС 42-3874-99, 2000].
Для получения сывороток к С-комплексу туляремийного микроба использова ли взрослых (2 кг) кроликов породы «Шиншилла». Иммуноглобулиновые фракции (Ig«С») выделяли по L. Rane, L. Newhauser [1954]. Для постановки метода флуорес цирующих антител (МФА) использовали препарат Ig «С» и его F(ab,)2-фрагменты, меченые флуоресцеинизотиоционатом по методу J. Marshall et al. [1958]. Иммунопе роксидазный конъюгат получали с помощью периодатного метода [Фримель Г., 1987]. Для прямого ДИА использовали антитела, конъюгированные с коллоидными металлами (серебром - проведено Шараповой Н.А. в РосНИПЧИ “Микроб”, золотом – в ИБФРМ д.б.н. Дыкманом Л.А.).
Для очистки препаратов антигенов и иммуноглобулинов, разделения их ком понентов использовали колоночную хроматографию с использованием различных носителей на хроматографе низкого давления Biologic LP фирмы «Bio-RAD» (США). Электрофорез в полиамилакридном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) проводили по U. Laemmli [1970] в 4% концентрирующем и 10% разделяющем гелях. Для обнаружения белков использовали окрашивание Кумасси ярко синим R-250, для детекции ЛПС-содержащих компонентов гели окрашивали азотнокислым серебром.
Для определения иммунохимической идентичности разных серий антигенных и антительных препаратов применяли следующие методы: реакцию диффузионной преципитации по Оухтерлони (РДП) и иммуноблоттинг по методу H. Towbin [1979].
В работе использовали РНГА с иммуноглобулиновым и антигенным диагностику мами (г. Киров), ИФА и ДИА в различных модификациях.
Для изучения иммуногенности полученных препаратов использовали беспо родных белых мышей (18 г) и морских свинок (250 г). Протективную активность препаратов определяли при экспериментальном заражении лабораторных животных вирулентными штаммами F.tularensis, рассчитывая ED50 и LD50 по методу Кербера.
Работу с животными проводили по стандартным методикам [СП 1.3.1285-03;
МУ 3.3.1.2161-07].
При обработке полученных результатов применяли общепринятые статисти ческие методы, вычисляя среднеарифметические величины, степень достоверности различий по t-критерию Стьюдента, исходя из уровня значимости (Р) 0,05 (95%) [Ашмарин И. П., Воробьев А. А., 1962;
Рокицкий П.Ф., 1973].
2. Результаты исследований и их обсуждение На первом этапе работы для оценки возможности получения С-комплекса из штаммов-продуцентов разных подвидов туляремийного микроба был проведен электрофоретический анализ суммарных клеточных белков 65 штаммов F. tularensis и препарата С-15. Было доказано наличие белковых фракций поверхностного анти генного С-комплекса туляремийного микроба в составе протеинограмм всех иссле дуемых штаммов и выявлена высокая однородность внутри и между подвидами F. tularensis. Получены препараты С-комплекса из следующих вирулентных штам мов-продуцентов: F. tularensis subsp. holarctica eryR 503/840 (С-503), holarctica eryS В- 300 (С-В 300), holarctica japonica Miura (С-Miura), nearctica В399 A`Сole (С-A`Сole), mediasiatica А 179 (С-А 179), mediasiatica А-61 (117) КМ 4 (С-А 61), no vicida Utah 112 (С-Utah 112);
и из вакцинных штаммов F. tularensis 15 НИИЭГ и LVS cap-. Все штаммы по проведенным биохимическим тестам внутривидового ти пирования соответствовали своему подвиду. В результате сравнительного анализа физико-химических, антигенных и биохимических особенностей препаратов С-комплекса F. tularensis разных подвидов было установлено, что все препараты, полученные из вирулентных штаммов, кроме С-Utah 112, сходны по содержанию углеводов, белков и липидов с препаратом С-15 (таблица 1). Активность С-комплекcа F. tularensis разных подвидов в ДИА с поликлональными антительны ми препаратами к С-15 составляла около 17 нг/мл, в РДП – 31-15,6 мкг/мл, а в ИФА – 0,7 нг/мл.
Таблица 1. Состав и иммунохимические свойства препаратов С-комплекса F. tularensis разных подвидов (М±mt).
№ Препарат Химический состав, % Активность, нг/мл п/п С-комплекса Белки Углеводы Липиды ДИА ИФА С- 1 63,1±3,9 10,9±1,6 23,0±2,4 20,0±6,9 0,6±0, С-503 0,7±0, 2 52,4±3,7 17,5±3,3 32,4±3,4 19,2±6, С-В 300 68,7±2, 3 11,7±2,0 18,7±1,9 15,4±6,0 0,1±0, С-Miura 1,2±1, 4 62,5±3,4 19,0±1,3 21,3±1,6 20,0±5, С-A`Cole 24,3±6, 5 67,2±1,6 14,4±0,8 19,5±1,8 1,6±0, С-A 179 15,6±7,0 0,3±0, 6 51,6±1,9 19,3±1,3 30,9±2, С-А 7 67,0±2,5 12,0±1,2 19,4±3,4 10,5±3,3 0,8±0, С-Utah 112 99,3±8, 8 45,5±4,1 26,5±1,2 24,5±3,1 2,0±0, Электрофоретический белковый профиль С-комплекса из клеток вирулентных штаммов (503, В 300, Miura, A`Cole, А 179, А 61) не отличался от препарата, полу ченного из клеток вакцинного штамма. Окрашивание электрофореграммы азотно кислым серебром показало наличие во всех препаратах С-комплекса, независимо от подвида штамма-продуцента, компонентов липополисахаридной природы, которые представлены липидом А с коровым олигосахаридом и боковыми цепями. Кроме то го, иммуноблоттинг с антителами к С-комплексу туляремийного микроба позволил установить иммунодоминантные полипептиды с молекулярной массой 81-85, 57-60, 43, 23-27 и 14-17 кДа, входящие в состав всех исследованных препаратов (рисунок 1).
А Б 250 95 — 95- 72 — 72 55 55 — 36 36 — 28- 28 — 17 — 17 М1 234 567 8 М12 3 4 56 М - маркеры молекулярной массы 11-250 кДа («Fermentas», США).
А - белковый профиль (окраска Кумасси синим): 1 - С-15;
2 - С-В 300;
3 - С-503;
4 - С-Мiura;
5 - С- А 179;
6 - С-A`Cole;
7 - C-Utah 112;
8 – клеточный лизат F. tularensis 15 НИИЭГ.
Б – иммуноблоттинг с Ig «С» : 1 - С-15;
2 - С-503;
3 - С-В 300;
4 - С-Мiura;
5 - С-A`Cole;
6 - С-А 179;
7 - C-Utah 112.
Рисунок 1. электрофорез и иммуноблоттинг препаратов SDS-PAG С-комплекса туляремийного микроба разных подвидов.
С помощью гель-хроматографии были определены профили препаратов С-15, С-503, С-В 300, С-А 179, С-А 61 и С-A`Сole, которые были представлены одним мажорным пиком с молекулярной массой около 280 кДа. Профиль С-Utah 112 имел два пика с молекулярными массами около 280 и 160 кДа. Состав пиков отличался: в первом были белки более 43 кДа, а во втором – менее 23 кДа. В результате опреде ления идентичности между антигенным комплексом, выделенным из novicida Utah 112, и препаратами остальных подвидов в РДП были отмечены частично перекре щивающиеся линии преципитации («шпора»), что свидетельствует о наличии раз личных антигенных детерминант. Электрофоретический профиль препарата С-Utah 112 также отличался наличием дополнительных белков с молекулярной массой бо лее 110 кДа и отсутствием иммунореактивных белков в диапазоне 57-85 кДа (рису нок 1).
Субъединичный состав С-комплекса F. tularensis был подтвержден протеом ным анализом на модели препарата С-15. Протеомный анализ проводили в ФГУ НИИ физико-химической медицины ФМБА России (г. Москва). При компьютерном анализе протеома с помощью программы Mascot в базе данных NCBI (National Cen ter for Biotechnology Information) в составе С-комплекса были идентифицированы биологически активных молекул, специфических для F. tularensis, и один белок го мологичный фракции А D-аланил-D-аланин карбоксипептидазы Yersinia pseudotu berculosis (рисунок 2).
Идентифицированные белки: 105 – 50S рибосомальный белок L7/L12 (RplL);
106 – белок-шаперон GroES;
107-108 – гипотетический белок FTL_0617;
111 – АС белок;
113 – белок ВМ;
114 - фракция А D-аланил-D-аланин карбоксипептидазы;
115-116 – глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа;
117-118 – фактор элонгации Tu (EF-Tu);
119 – белок-шаперон GroEL;
120 – пероксидаза/каталаза (KatG).
Рисунок 2. Двумерный PAG-электрофорез препарата С-15.
Присутствие в составе С-комплекса стрессовых белков-шаперонов, рецептор ных белков EF-Tu и RplL, бактериальных ферментов обусловливают высокую им мунобиологическую активность данного антигена. Показано, что все препараты С-комплекса, независимо от подвидовой принадлежности штамма-продуцента, за щищают лабораторных животных от гибели при экспериментальной туляремии, вы званной вирулентными штаммами голарктического, неарктического и среднеазиат ского подвидов, а также большими дозами вакцинного штамма F. tularensis НИИЭГ (таблица 2). Показатели индекса иммунитета для белых мышей, иммунизи рованных препаратом С-15, против голарктического подвида составили 1468, а про тив неарктического подвида – 10, индекс защиты (ИЗ) в обоих случаях был более 50%. Для препарата С-Utah 112 ИЗ для белых мышей был значительно ниже (37,5%) по сравнению с другими исследованными образцами, что может быть связано с осо бенностями строения С-комплекса из подвида novicida, в частности с большим со держанием углеводного компонента, а также отсутствием ряда иммунореактивных белков.
Таблица 2. Иммуногенность препаратов С-комплекса для белых мышей при экспериментальной туляремийной инфекции.
Заражающий штамм Препарат ИЗ/ED50 F. tularensis F. tularensis F. tularensis F. tularensis ssp. holarctica ssp. nearctica ssp. mediasiatica ssp.holarctica В399 A`Cole A-179 15 НИИЭГ 503/ ИЗ, % 95,6 42 100 С-15 ED50, 3,1 95,5 2,24 1, мкг 2,411,3 55,9169 1,88,3 0,62, ИЗ, % 50 56,5 100 С-503 ED50, 112,2 66,1 2,24 5, мкг 48,9257 25,1204 1,88,3 4,512, ИЗ, % 45,8 21,7 100 С-A`Cole ED50, 131,8 562,3 2,24 4, мкг 50,1407,4 251,2818 1,88,3 2,510, ИЗ, % 58,3 69,5 100 С-А 179 ED50, 33,11 16,21 2,24 2, мкг 27,2108 9,225,1 1,88,3 1,98, Контроль ИЗ, % 0 0 0 n /N 0/6 0/6 0/6 0/ Примечание: n /N – отношение числа выживших белых мышей к общему числу животных в группе;
ED50: средняя иммунизирующая доза, диапазон minmax.
При сравнительном анализе влияния иммунизации С-комплексом F. tularensis разных подвидов на показатели клеточного звена иммунитета было показано отсут ствие выраженного повреждающего действия всех препаратов на тимоциты и спле ноциты белых мышей, а также положительная реакция лейкоцитолиза на 14-21 су тки иммуногенеза. Введение препаратов С-комплекса лабораторным животным вы зывало формирование выраженного антительного ответа, независимо от подвида штамма-продуцента, вида животного (мыши, свинки, кролики) и способа иммуниза ции. Максимальной иммуномодулирующей активностью обладал С-комплекс, по лученный из вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ. В частности, при изучении динамики антителообразования у белых мышей в процессе развития гуморального иммунитета к С-15 отмечено формирование антительного ответа в ранние сроки (на 3-7 сутки). При использовании в качестве биомодели морских свинок антительный ответ, несмотря на регистрацию в ранние сроки, стабилизировался на высоком уровне только к 42 суткам и сохранялся до 4,5 мес., через 6 мес. уровень антител приблизился к исходному.
Поскольку бактерии F. tularensis при попадании в неблагоприятные условия экспрессируют ряд стрессовых белков, два из которых GroES и GroEL были иден тифицированы в составе С-комплекса, мы определяли влияние температуры выра щивания (28 оС, 37 оС, 42 оС) на изменение белкового состава F. tularensis 15 НИИ ЭГ. Было установлено, что состав суммарных клеточных белков не менялся, но с повышением температуры до 42 оС увеличивалось количество белков, секретируе мых в культуральную жидкость. Субъединичный состав С-комплекса не зависел от температуры культивирования.
Учитывая поверхностное расположение С-комплекса, был проведен экспери мент по определению участия данного антигена в формировании капсулоподобного вещества F. tularensis. Для этих целей нами с помощью обработки клеток акридино вым оранжевым из культуры F. tularensis 15 НИИЭГ были получены Сap- штамм и субкультура в R-форме. Сap--мутант F. tularensis 15 НИИЭГ обладал чувствительно стью к действию НКС и не вступал в специфическое взаимодействие с антительным диагностикумом в РНГА [Sandstrom G., 1988;
Павлович Н.В. и др., 1993]. Колонии в R-форме обладали сниженной активностью в РНГА 108 м.к./мл (по сравнению с ис ходным штаммом – 5105 м.к./мл) и плохо суспендировались в 0,85% растворе NaCl рН 7,2, но обладали устойчивостью к бактерицидному действию нормальной сыво ротки. Полученные штаммы взаимодействовали с Ig «С» в ИФА, ДИА (2,5- м.к./мл) и иммуноблоттинге. При анализе состава С-комплекса из клеток капсуло дефицитного штамма F. tularensis LVS cap- было установлено, что по основным фи зико-химическим и иммунохимическим свойствам он сходен с аналогичными пре паратами, выделенными из вакцинного и вирулентных штаммов F. tularensis. Полу ченные результаты позволяют сделать вывод, что присутствие С-комплекса на по верхности клетки не зависит от формы ЛПС и в его состав не входят антигенные компоненты капсулоподобного вещества туляремийного микроба.
Выделение компонентов С-комплекса туляремийного микроба осуществляли при помощи химического (действие кислот, щелочей, растворов детергентов, фено ла) и ферментативного гидролиза (проназы Е, пепсина, протеиназы К). При этом было установлено, что С-15 термостабилен, устойчив к действию кислот и щелочей в диапазоне рН от 1,0 до 13,0. Применение детергентов привело к изменению элек трофоретического белкового профиля антигена и позволило установить белковую природу компонентов С-комплекса с молекулярными массами от 23 до 57 кДа, тогда как остальные белковые фракции обладали устойчивостью к их действию. Феноль ная экстракция позволила разделить препарат С-15 на три фракции: фенольную, на 70% состоящую из углеводных и липидных компонентов, водно-фенольную и вод ную, содержащие в своем составе мажорные белки С-15 (78-80% белка). Присутст вие во всех полученных фракциях двух иммунореактивных компонентов с молеку лярными массами в диапазоне 14-17 кДа свидетельствовало о липопротеидной при роде этих субъединиц.
Установлена высокая чувствительность С-комплекса к действию пепсина, вы зывающего полный его гидролиз, и протеиназы К, приводящей к гидролизу его бел ковой части и позволяющей получить компонент ЛПС природы, который имеет структуру, типичную для S-формы грамотрицательных бактерий. Разработанный нами метод ферментативного гидролиза С-15 проназой Е позволил получить моди фицированный препарат С-15 (С-15 М) с молекулярной массой 56 кДа по данным гель-хроматографии и содержащий в своем составе мембранный белок 41-43 кДа (рисунок 3), обладающий высокой антигенной и протективной активностью.
А Б 95 — 72 — 55 — 36 — 17 — М1 2 3 4 56 7 8 9 10 11 12 13 А - Иммуноблоттинг препарата С-15 на этапах ферментативного гидролиза:
М – маркеры молекулярной массы;
1 – С-15 до гидролиза;
время инкубации:
2 – 0 часов;
3-4 – один час;
5-6 – два часа;
7-8 – три часа;
9-10 – 4 часа;
11-12 – 5 ча сов;
13-14 – 6 часов.
Б - Гель-хроматография препарата С-15 М на Sephacryl S-300: по оси абсцисс – время элюции, мин. По левой оси ординат – оптическая плотность элюента при 280 нм (A.u.), по правой оси ординат – электропроводность элюента mS/cm.
Рисунок 3. Результаты иммуноблоттинга и гель-хроматографии модифициро ванного препарата С-комплекса.
Полученные к С-15 М мышиные поликлональные антитела взаимодействова ли в ДИА с франциселлами всех подвидов в концентрации 106 м.к./мл (рабочее раз ведение 1/10), причем в иммуноблоттинге выявлялись только специфические для туляремийного микроба белки (43 и 17 кДа). Более низкая активность мышиных сы вороток может быть связана с природой антигена (отсутствие ЛПС-компонента и ряда белков исходного С-комплекса).
Были получены специфичные поликлональные сыворотки к С-комплексу ту ляремийного микроба, содержащие антитела против основных мажорных белков всех антигенов независимо от штамма-продуцента. Использование на первых этапах иммунизации кроликов инактивированных цельноклеточных экстрактов штаммов трех основных подвидов туляремийного микроба с последующим внутривенным введением очищенного препарата С-комплекса, позволило увеличить специфич ность сывороток без снижения чувствительности. Сыворотки к С-15 выявляли в ИФА, ДИА и иммуноблоттинге вирулентные штаммы F. tularensis разных подвидов, обладающие более богатым антигенным спектром. Была проведена адсорбция полу ченных сывороток для освобождения от неспецифического взаимодействия с клет ками чумного и псевдотуберкулезного микробов. Анализ чувствительности и спе цифичности «С»-сыворотки в ДИА показал, что она превосходит КТС. Чувстви тельность КТС при разведении 1/100 для штаммов F. tularensis составляет м.к./мл, тогда как кроличья сыворотка к С-комплексу, при тех же разведениях, вы являла 106 м.к./мл возбудителя. «С»-сыворотка обладала 100 % специфичностью для концентрации гетерологичных штаммов 108 м.к./мл, тогда как при использовании КТС были отмечены перекрестные реакции с клетками Y. pestis, Y. pseudotuberculo sis, E. coli и S. paratyphi в концентрации до 107 м.к./мл. Активность полученных Ig «С» была проверена на расширенной панели F. tularensis разных подвидов ( штаммов) и в среднем (М±mt) составила в ИФА 7,2(±0,39)105 м.к./мл, в ДИА – 8(±0,47)105 м.к./мл. При определении влияния способа обработки (инактивации) бактериальных клеток на чувствительность ИФА и ДИА было установлено, что экс периментальные тест-системы чувствительнее при исследовании культур F. tularen sis, инактивированных фенолом и глутаральдегидом без нагревания.
На основе антител к С-комплексу туляремийного микроба был получен экспе риментальный латексный диагностикум, позволяющий выявлять Сap+ и Сap- штам мы F. tularensis в РСА на стекле и РЛА микрометодом. Чувствительность РЛА для Сap+ штаммов составляла 5106 м.к./мл, для Сap- - 107 м.к./мл.
Разработан способ ферментативного гидролиза Ig «С» пепсином с последую щей хроматографической очисткой для получения F(ab’)2-фрагментов молекулы иммуноглобулина, которые обладали большей специфичностью по сравнению с ис ходным препаратом. Отработана экспериментальная технология изготовления на основе Ig «С» и его F(ab’)2-фрагментов видоспецифических конъюгатов: иммунопе роксидазных и с коллоидными металлами, позволившими повысить чувствитель ность ИФА и ДИА для клеток F. tularensis до 104 м.к./мл и упростить методику по становки анализа, используя прямой вариант. При постановке МФА с использова нием экспериментальных ФИТЦ-конъюгатов Ig «С» и F(ab’)2-фрагментов и коммер ческого диагностикума (ИДТЛ) было отмечено специфическое свечение возбудите ля в мазках-отпечатках органов зараженных вакцинным и вирулентными штаммами F. tularensis разных подвидов белых мышей на 3 креста. При бактериологическом анализе этих же отпечатков органов был отмечен рост туляремийного микроба, па тологоанатомическая картина у павших животных была характерной для туляре мийной инфекции. При бактериоскопическом исследовании мазков-отпечатков, ок рашенных по Романовскому-Гимзе, возбудитель туляремии обнаруживали только в некоторых пробах, что согласуется с литературными данными [Олсуфьев Н.Г., 1975;
Сомова Н.М. и др., 1964].
Были проведены лабораторные исследования возможности применения разра ботанных методов ИФА и ДИА на основе Ig «С» для обнаружения возбудителя ту ляремии в материале от лабораторных животных и для анализа природного мате риала. Исследование материала от 41 лабораторно зараженной белой мыши показа ло, что антигены возбудителя туляремии обнаружены ИФА в 34 пробах (83%), ДИА в 29 пробах (71%), бактериологическим методом в 15 пробах (36,6%) (таблица 3).
Была отмечена 100% корреляция между результатами бактериологического анализа и экспериментальных иммунодиагностических тест-систем в период от 1-10 суток после заражения.
Таблица 3. Результаты обнаружения антигенов туляремийного микроба в сус пензии печени и селезенки экспериментально зараженных белых мышей.
Количество Количество положительных результатов Срок № Заражающий исследо жизни Бактериоло п/п штамм ванных животного гический ИФА ДИА проб метод 7 сут. 3 3 3 F. tularensis 8 сут.
1. 1 1 1 B399 A`Cole 21 сут 6 0 6 7 сут. 3 3 3 F. tularensis 8 сут.
2. 2 2 2 503/ 21 сут. 6 0 4 5 сут. 4 4 4 7 сут. 2 2 2 F. tularensis 14 сут. 2 0 2 3.
15 НИИЭГ 21 сут. 6 0 2 1 месяц 3 0 2 2 месяца 3 0 3 При эпизоотологическом обследовании зеленой зоны Саратова на обнаруже ние антигенов туляремийного микроба было проанализировано 106 проб от фоно вых животных данного региона. Положительные результаты получены ИФА и ДИА в 17 (16%) и 15 (14%) случаях соответственно. При этом было отмечено, что поло жительные пробы встречались в трех из 15 исследованных природных эпитопов.
Разработанные иммунодиагностические тест-системы на основе С-комплекса из клеток вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ позволяют выявлять противо туляремийные антитела как в экспериментальных и коммерческих противотуляре мийных сыворотках, так и у экспериментально зараженных и иммунизированных лабораторных животных. Сэндвич вариант ДИА был использован для детекции уровня противотуляремийных антител, как одного из показателей напряженности противотуляремийного иммунитета у вакцинированных людей. Показана возмож ность использования С-15 в иммуноблоттинге для регистрации туляремийной ин фекции у лабораторных животных.
Полученные в работе данные представляют научный и практический интерес, поскольку впервые было показано, что С-комплекс является общим антигеном для туляремийного микроба, независимо от подвида возбудителя. Впервые получены препараты С-комплекса из штаммов туляремийного микроба разных подвидов ho larctica, nearctica, mediasiatica и novicida, проведен сравнительный анализ их струк туры, антигенных, биохимических и иммунологических свойств. Разработанные способы выявления и получения С-комплекса, его компонентов и специфических антител могут служить основой для создания новых средств диагностики и профи лактики туляремии.
ВЫВОДЫ 1. Получены препараты С-комплекса из вирулентных штаммов F. tularensis четырех подвидов и основных биоваров: holarctica eryR, holarctica eryS, holarctica japonica, nearctica, mediasiatica, novicida;
и вакцинных штаммов. Выявлена высокая иммунохимическая активность и антигенная идентичность образцов С-комплекса, выделенных из всех подвидов, кроме subsp. novicida.
2. Препараты С-комплекса F. tularensis разных подвидов, кроме subsp. novici da, имеют молекулярную массу 280 кДа и содержат следующие иммунодоминант ные полипептиды: 81-85, 57-60, 43, 23-27 и 14-17 кДа. С-комплекс регистрируется у туляремийного микроба независимо от формы ЛПС и наличия капсулы.
3. Антигенный С-комплекс разных подвидов туляремийного микроба инду цирует в организме лабораторных животных образование антител в ранние сроки и влияет на формирование клеточного иммунитета, обладает протективной активно стью - защищает лабораторных животных от гибели при экспериментальной инфек ции, вызванной вирулентными штаммами голарктического, неарктического и сред неазиатского подвидов.
4. Особенности препарата С-Utah 112 (преобладание углеводной и липидной частей над белковой, присутствие двух компонентов с молекулярными массами около 280 и 160 кДа (при гель-хроматографии на Sephacryl S-300), наличие допол нительных иммунохимически инертных высокомолекулярных субъединиц более 110 кДа, и отсутствие иммунодоминантных полипептидов 57-85 кДа) приводят к снижению его иммуногенности и протективности по сравнению с аналогичными ан тигенами из штаммов других подвидов.
5. Оптимизированы схемы гипериммунизации животных-продуцентов С-комплексом туляремийного микроба, позволяющие получать высокоактивные по ликлональные сыворотки (чувствительность - 106 м.к./мл при 100% специфичности для концентрации гетерологичных штаммов 108 м.к./мл). Для детекции F. tularensis в различных вариантах иммуноанализа, включая непрямой и прямой ИФА, сэндвич ИФА, непрямой ДИА, реакция слайд-агглютинации на стекле, реакция латекс агллютинации микрометодом, МФА, прямым ДИА с золотой меткой, предлагается использовать антитела к С-комплексу и F(ab’)2-фрагменты Ig«С». Минимально вы является до 0,5-1,0 нг/мл антигена, чувствительность для клеток туляремийного микроба разных подвидов - 105-104м.к./мл.
6. Проведена оценка эффективности применения ИФА и ДИА на основе ан тител к С-комплексу туляремийного микроба для детекции F. tularensis в органах экспериментально зараженных животных и у ряда фоновых для Саратовской облас ти видов животных при эпизоотологическом обследовании данного региона. Была отмечена 100% корреляция полученных результатов с данными бактериологическо го анализа и ИФА в период от 1 до 10 суток после заражения.
7. Применение С-комплекса туляремийного микроба в качестве маркерного антигена в ИФА (ДИА) и иммуноблоттинге позволяет определять специфические противотуляремийные антитела в экспериментальных и коммерческих туляремий ных сыворотках, при изучении динамики образования антител у иммунизирован ных, вакцинированных и экспериментально зараженных лабораторных животных в процессе развития гуморального иммунитета против F. tularensis.
Список работ, опубликованных по материалам диссертации 1. Волох О.А., Шепелв И.А., Храмкова Е.М., Ермин С.А., Дятлов И.А. Раз работка иммуноферментного анализа на основе «С»-комплекса туляремийного мик роба // Санит. охрана террит. государств участников СНГ: пробл. биол. безоп. и про тиводействия биотерроризму в совр. условиях: Матер. VI Межгосуд. науч.-практ.
конф. – Волгоград, 2005. – С. 217-219.
2. Волох О.А., Ермин С.А., Шепелв И.А., Храмкова Е.М., Авдеева Н.Г., Дятлов И.А. Разработка комплексного профилактического препарата против чумы и туляремии // Инф. болезни: пробл. здравоохр. и военной медицины: Матер. Рос. на уч.-практ. конф. – СПб, 2006. – С. 70.
3. Храмкова Е.М., Волох О.А., Шепелв И.А., Ермин С.А. Использование препарата С-комплекса Francisella tularensis для определения противотуляремийных антител // Чрезвыч. ситуации междунар. значения в общественном здравоохр. и са нит. охрана террит. государств-участников СНГ: Матер. VII Межгосуд. науч.-практ.
конф. – Оболенск, 2006. – С. 254-255.
4. Храмкова Е.М., Волох О.А., Шепелв И.А., Ермин С.А., Дятлов И.А. Ис пользование С-комплекса туляремийного микроба для создания диагностических тест-систем // Биотехнология. - 2007. - №2. – С. 72-77.
5. Храмкова Е.М., Волох О.А., Шепелв И.А., Ермин С.А., Авдеева Н.Г. Ис пользование антител к С-комплексу Francisella tularensis для выявления возбудите ля туляремии // Матер. IX съезда Всерос. науч.-практ. об-ва эпидемиологов, микро биологов и паразитологов. – Москва, 2007. – С. 91.
6. Храмкова Е.М., Шепелв И.А., Волох О.А., Кузнецов О.С., Алшина Ю.А., Ермин С.А. Изучение ответных реакций макроорганизма на введение С-комплекса туляремийного микроба // Совр. аспекты эпид. надзора за особо опасными инф. за болеваниями на Юге России: Матер. науч.-практ. конф. – Ставрополь, 2007. – С.
152-154.
7. Волох О.А., Шепелв И.А., Фирстова В.В., Храмкова Е.М., Авдеева Н.Г., Самохвалова Ю.И., Ермин С.А., Дятлов И.А. Оценка иммунобиологической актив ности препаратов С-комплекса возбудителя туляремии как перспективного компо нента химических вакцин // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. – 2007. № 3. - С. 16-21.
8. Храмкова Е.М., Уткин Д.В., Шепелв И.А., Авдеева Н.Г., Волох О.А.
Оценка чувствительности и специфичности антительных препаратов к «С»-комплексу туляремийного микроба // Совр. технологии в реализации глобаль ной стратегии борьбы с инф. бол. на террит. государств-участников СНГ: Матер. IX Межгосуд. науч.-практ. конф. – Волгоград, 2008. – С. 143-144.
9. Храмкова Е.М., Волох О. А., Шепелв И.А., Авдеева Н.Г., Еремин С.А., Подборонова Н.А. Применение антител к С-комплексу туляремийного микроба для детекции возбудителя туляремии методами иммуноанализа // Метод. докум. и отче ты по сан.-эпид. охране террит. Российской Федерации: Реферат. сб. – Саратов, 2009. – С.17-18.
10. Кузнецова Е.М., Волох О.А., Шепелв И.А., Авдеева Н.Г. Разработка пре парата для иммунодиагностики возбудителя туляремии // Биол. безоп. в совр. мире:
Матер. науч.-практ. конф. молодых ученых и специалистов науч.-исслед. учрежд.
Роспотребнадзора. – Оболенск, 2009. – С. 129-131.
11. Кузнецова Е.М., Волох О.А., Шепелв И.А. Актуальные вопросы диффе ренциации подвидов Francisella tularensis // Научное обеспечение противоэпид. за щиты населения: Мат. юбил. Всерос. науч.-практ. конф., посв. 90-летию ННИИЭМ им. акад. И.Н. Блохиной Роспотребнадзора и 20-летию Приволжского окружного центра по профилакт. и борьбе со СПИД. – Н. Новгород, 2009. – С. 143-146.
12. Волох О.А., Кузнецова Е.М., Ермин С.А., Гусева Н.П., Шепелв И.А., Ав деева Н.Г. Перспективы создания химической туляремийной вакцины // Научное обеспечение противоэпид. защиты населения: Мат. юбил. Всерос. науч.-практ.
конф., посв. 90-летию ННИИЭМ им. акад. И.Н. Блохиной Роспотребнадзора и 20 летию Приволжского окружного центра по профилакт. и борьбе со СПИД. – Н. Нов город, 2009. – С. 329-331.
13. Кузнецова Е.М., Шепелв И.А., Волох О.А. Структурно-функциональная характеристика основных антигенов Francisella tularensis // Проблемы особо опас ных инфекций – 2009. – Вып. 2 (100). - С. 44-49.
Подписано к печати 10.09.2010 г.
Формат 6084/16. Бумага офсетная.
Печать офсетная. Гарнитура «Таймс».
Усл.-печ. л. 1. Тираж 100.
_ Отпечатано на полиграфическом оборудовании ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» 410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46.