Разработка технологии изготовления и контроля инактивированной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц

На правах рукописи

БОРИСОВА Ирина Александровна РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ИЗГОТОВЛЕНИЯ И КОНТРОЛЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ НЬЮКАСЛСКОЙ БОЛЕЗНИ И МЕТАПНЕВМОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ ПТИЦ 03.00.06. - «Вирусология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владимир – 2008

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных», г. Владимир.

- кандидат ветеринарных наук,

Научный консультант:

старший научный сотрудник СТАРОВ Сергей Константинович - доктор биологических наук,

Официальные оппоненты:

старший научный сотрудник ПОНОМАРЕВ Алексей Петрович ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», г. Владимир - доктор биологических наук, профессор СМОЛЕНСКИЙ Владимир Иванович ФГУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов», г. Москва Государственное научное учреждение

Ведущая организация:

«Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства» (ГНУ ВНИВИП, г. Ломоносов).

Защита диссертации состоится «25» июня 2008 года в 10 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220.015.01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец, ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

Автореферат разослан «22» мая 2008 г.

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Г.М. Семенова 1.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Для обеспечения стойкого эпизоотического благополучия по инфекционным болезням птиц в промышленном птицеводстве наряду с общими ветеринарно-санитарными мероприятиями широко применяются различные комплексные схемы специфической профилактики с использованием живых и инактивированных вакцинных препаратов [Смоленский В.И., 1999;

Борисов В.В., 2007].

В последнее десятилетие в Российской Федерации возросло количество случаев проявления новых инфекционных болезней (реовирусная инфекция, метапневмовирусная инфекция (МПВИ) птиц, инфекционный энцефаломиелит, инфекционная анемия), которые ранее в стране не регистрировались, и специфическая профилактика против них не проводилась [Ельников В.В. с соавт., 2004;

Ирза В.Н. с соавт., 2005].

Сложившаяся ситуация требует применения новых подходов к созданию противовирусных препаратов, в частности, перспективным направлением является разработка ассоциированных инактивированных вакцин [Дубовой А.С., 1998;

Ирза В.Н., 2000;

Ельников В.В. с соавт., 2004;

Борисов В.В., 2007].

Несмотря на широкое использование средств специфической профилактики и карантинных мероприятий по ньюкаслской болезни (НБ), проблема борьбы с этим особо опасным заболеванием птиц остается весьма актуальной во всем мире [Alexander D.J. et al., 1998;

Манин Т.Б., 2000;

Wakamatsu N. et al., 2006;

Miller et al., 2007;

Dilaveris D. et al., 2007]. В году, по данным МЭБ, в мире было зарегистрировано более неблагополучных пунктов по ньюкаслской болезни [бюллетень МЭБ, 2007]. В последнее время в Российской Федерации отмечена тенденция к увеличению числа неблагополучных пунктов, которые регистрируются в личных подворьях, где специфическая профилактика НБ не проводилась [Руденко Т.В. с соавт, 1998;

Смоленский В.И., 1999;

Манин Т.Б., 2000].

Серьезную угрозу для птицеводческой отрасли страны представляет метапневмовирусная инфекция птиц, наносящая значительный экономический ущерб, который складывается за счет гибели птиц, потерь мясной и яичной продуктивности, затрат на проведение ветеринарно-санитарных мероприятий [Виноходов В.О., 2003;

Ирза В.Н. с соавт., 2003;

Хлебовец З.Б. с соавт., 2005].

Случаи возникновения метапневмовирусной инфекции птиц отмечены на птицефабриках многих административно-географических регионов Российской Федерации [Ирза В.Н. с соавт., 2003, 2005], и можно говорить о повсеместном распространении данной болезни в мире [Naylor C.J. et al., 1997;

Cavanagh D., 1999;

Alkhalaf A.N., 2002;

Jones R.C., 2004].

Для специфической профилактики МПВИ птиц за рубежом разработаны и применяются живые и инактивированные вакцинные препараты [Jirjis F.E. et al., 2001;

Worthington K.J. et al., 2003;

Ganapathy K. et al., 2006, 2007].

Необходимость в создании инактивированной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц возникла в результате следующих причин:

- отсутствие отечественных вакцин против НБ и МПВИ птиц;

- широкое распространение в птицехозяйствах Российской Федерации метапневмовирусной инфекции птиц;

- потребность в вакцинном препарате, не содержащем в своем составе инфекционного вируса;

- сокращение количества прививок с целью уменьшения стрессов и нагрузки на иммунную систему ремонтного молодняка.

Таким образом, разработка технологии изготовления и контроля инактивированной вакцины против НБ и МПВИ птиц является актуальной и требует своего решения.

Цель и задачи исследований. Главной целью исследований являлась разработка технологии изготовления и контроля инактивированной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц и изучение её иммунобиологических характеристик.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

- подобрать производственные штаммы вируса НБ и метапневмовируса (МПВ);

- выбрать оптимальные системы культивирования производственных штаммов вируса НБ и МПВ;

- отработать методики инактивации инфекционных свойств вируса НБ и МПВ с использованием различных инактивантов;

- выбрать адъюванты, обеспечивающие повышение иммуногенных свойств вакцины против НБ и МПВИ птиц;

- определить оптимальный иммунобиологически сбалансированный компонентный состав инактивированной вакцины против НБ и МПВИ птиц;

- изучить физические и иммунобиологические свойства разработанной вакцины против НБ и МПВИ птиц в лабораторных и производственных условиях;

- разработать нормативную документацию на инактивированную эмульсионную вакцину против НБ и МПВИ птиц.

Научная новизна. Впервые разработана отечественная инактивированная эмульсионная вакцина против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц, отработаны технология её изготовления и методы биологического контроля.

Проведено выделение, изучение, паспортизация и депонирование во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (ФГУ «ВГНКИ», г. Москва), штамма «PV03-B №127 ДЕП» метапневмовируса птиц.

Разработана оптимальная схема получения вирусного сырья из штамма «PV03-B» метапневмовируса птиц с использованием перевиваемой культуры клеток почки зеленой мартышки Vero.

Обоснованы режимы инактивации вирусов НБ и МПВИ птиц бета пропиолактоном. Изучена динамика инактивации вируса НБ и МПВ.

Подобран и научно обоснован компонентный состав инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц.

В ходе исследований определены оптимальные соотношения антигенов, адъювантов, входящих в состав инактивированных вакцин против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц, дозы и схемы применения препаратов. Доказана безвредность, умеренная реактогенность и высокая иммуногенность инактивированных эмульсионной и сорбированной вакцин при их применении на птицефабриках.

Изучены в лабораторных и производственных условиях физические и иммунобиологические свойства инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц.

Практическая значимость работы. На основании собственных исследований, а также обобщения данных литературы, в соавторстве разработаны и утверждены в установленном порядке следующие методики:

- «Методика культивирования и титрования метапневмовируса птиц в перевиваемой культуре клеток Vero»;

- «Методика инактивации метапневмовируса птиц бета пропиолактоном», которая позволяет сократить время инактивации по сравнению с традиционными технологиями в 2 раза.

Полученные результаты послужили основанием для разработки технологии производства и подготовки нормативной документации на вакцину против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц инактивированную эмульгированную, которая одобрена на заседании ученого совета ФГУ «ВНИИЗЖ» (протокол №1 от 08.02.2008 г.):

- «Стандарт организации на вакцину против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц инактивированную эмульгированную (СТО 00495527-0094-2008)»;

- «Промышленный регламент на производство вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц инактивированной эмульгированной»;

- «Инструкция по применению вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц инактивированной эмульгированной».

На основании проведенных исследований в ветеринарную практику для специфической профилактики ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц предложена инактивированная эмульсионная вакцина, которая с 2006 г. проходит процедуру внедрения в птицеводческих хозяйствах РФ. В период с 2006 г. по 2008 г. выпущено и применено около 18 млн. доз вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц инактивированной эмульсионной.

Практическая ценность разработанного препарата подтверждается положительными результатами широких производственных испытаний.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

- производственный штамм «PV03-В» метапневмовируса птиц, полученный путем адаптации полевого изолята к системе культивирования в перевиваемой культуре клеток Vero;

- оптимальная схема получения вирусного сырья для изготовления инактивированной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц;

- инактивация вируса ньюкаслской болезни и метапневмовируса птиц бета-пропиолактоном;

- компонентный состав инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц;

- технология изготовления и методы контроля инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц;

- физические и иммунобиологические характеристики инактивированной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц в лабораторных и производственных условиях.

Апробация результатов работы. Основные материалы диссертации были доложены и обсуждены на международной научно-практической конференции молодых ученых «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику», посвященной 50-летию ФГУ «ВНИИЗЖ» (г. Владимир, 2008 г.), а также на заседаниях ученого совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2005-2008 гг.

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы выполнены совместно с Сарбасовым А.Б., Герасимовой Н.И., Волковой М.А., Хлебовец З.Б., Прониным А.С., за что автор выражает им сердечную благодарность.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 2 работы в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 167 листах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, выводов и практических предложений, содержит 14 таблиц и рисунков. Список использованной литературы включает 290 наименований, из них 38 отечественных и 252 зарубежных. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих достоверность результатов работы, её научную и практическую значимость.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы В работе использовали следующие материалы:

Производственные штаммы вирусов НБ и МПВИ птиц:

- производственный штамм «Ла-Сота» вируса ньюкаслской болезни;

- производственный штамм «PV03-В» метапневмовируса птиц.

Вакцины:

- лабораторные образцы инактивированной сорбированной и эмульсионной вакцины против НБ и МПВИ птиц (ФГУ «ВНИИЗЖ»);

- инактивированная вакцина против метапневмовируса птиц Nobilis TRT inac производства фирмы «Intervet» (Голландия).

Диагностикумы:

- набор для выявления антител к вирусу ньюкаслской болезни в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) (ФГУ «ВНИИЗЖ»);

- набор для обнаружения антител к возбудителю метапневмовирусной инфекции птиц Svanovirтм производства фирмы «Svanova» (Швеция);

- набор для определения антител к метапневмовирусу иммуноферментным методом (СИНКО) (ФГУ «ВНИИЗЖ»).

Куриные эмбрионы (КЭ) и инкубационные яйца:

- яйца СПФ-кур фирм «Lohmann Tierzucht» (Германия), «Hy-Vac» (США);

- эмбрионы кур кроссов «Хайсекс белый» и «Хай Лайн» (Россия).

Птицы:

- цыплята различных возрастов яичных кроссов «Хайсекс белый», «Хайсекс коричневый» и «Хай Лайн»;

- цыплята, полученные из СПФ-яиц фирм «Lohmann Tierzucht» (Германия) и «Hy-Vac» (США).

Культуры клеток:

- первично трипсинизированные культуры клеток куриных фибробластов (ФЭК) и почки теленка;

- перевиваемые культуры клеток почки африканской зеленой мартышки, почки теленка, гонад козленка, коронарных сосудов теленка (музей культур клеток ФГУ «ВНИИЗЖ»).

Питательные среды, реактивы, растворы и сыворотки:

- питательные среды ПСП и ПСС (ФГУ «ВНИИЗЖ»);

- гидролизат лактальбумина (ГЛА) фирмы «Sigma»;

- сыворотка крови крупного рогатого скота (КРС);

- трипсин фирмы «Merck»;

- водный раствор димера аминоэтилэтиленимина (ДЭИ) (ООО «Биохим ресурс»);

- бета-пропиолактон (БПЛ) (Organics);

- коллоидный 3%-й раствор гидрата окиси алюминия (ГОА) (ФГУ «ВНИИЗЖ»);

- масляный адъювант Montanide ISA 70 VG, «SEPPIC» (Франция).

2.2. Методы исследований Культивирование вируса ньюкаслской болезни Для культивирования вируса НБ использовали куриные эмбрионы 9-10 сут. возраста, которые инфицировали по общепринятой методике в аллантоисную полость и инкубировали в течение 80-99 ч.

После охлаждения КЭ вскрывали и отбирали экстраэмбриональную жидкость (ЭЭЖ), которую проверяли на стерильность, гемагглютинирующую активность в РГА и инфекционную активность.

Культивирование метапневмовируса птиц Этапы культивирования метапневмовируса птиц:

- заражение перевиваемой клеточной культуры Vero метапневмовирусом птиц;

- культивирование метапневмовируса птиц в течение 3-4 сут.;

- охлаждение роллерных сосудов с перевиваемой клеточной культурой Vero, зараженной метапневмовирусом птиц;

- сбор вируссодержащего материала.

Определение инфекционной активности вирусов НБ и МПВИ птиц Инфекционную активность вируса НБ определяли титрованием в эмбрионах СПФ-кур 10-сут. инкубации. Через 72 ч отбирали ЭЭЖ, которую исследовали в РГА.

Инфекционную активность метапневмовируса птиц определяли титрованием, которое проводили в двухсуточной клеточной культуре Vero в течение 7 сут.

Титр вирусов НБ и МПВИ птиц рассчитывали по методу В. Кербера в модификации И.П. Ашмарина (1962 г.).

Определение стерильности Определение стерильности проводили по ГОСТ 28085-89 и согласно «Руководству МЭБ по стандартам для диагностических тестов и вакцин» на бактериальное загрязнение, исключение контаминации грибами и микоплазмами.

Инактивация вирусов НБ и МПВИ птиц Инактивацию вирусов осуществляли путем добавления в вируссодержащие жидкости димера аминоэтилэтиленимина или бета пропиолактона в различных концентрациях и инкубированием при разных температурах по отработанным для каждого возбудителя временным режимам.

Полноту инактивации вируса НБ определяли методом двукратных последовательных пассажей материала в эмбрионах СПФ-кур. Инактивацию вируса ньюкаслской болезни считали полной, если ЭЭЖ после второго пассажа не агглютинировала эритроциты петуха.

Полноту инактивации МПВ определяли методом трехкратных «слепых» пассажей биоматериала в перевиваемой клеточной культуре клеток Vero. Отсутствие цитопатических изменений в культуре клеток в течение 7 сут.

подтверждает авирулентность инактивированного МПВ птиц.

Изготовление сорбированной формы вакцины против НБ и МПВИ птиц Лабораторные образцы вакцины против НБ и МПВИ птиц готовили с использованием 3%-го геля ГОА, который смешивали с инактивированными суспензиями вирусов в различных соотношениях.

Изготовление эмульсионной формы инактивированной вакцины против НБ и МПВИ птиц Масляный адъювант Монтанид ИЗА 70, образующий эмульсию обратного типа, и инактивированные антигены НБ и МПВИ птиц смешивали в соотношении, рекомендованном производителем адъюванта, на гомогенизаторе в течение 4-6 мин при скорости вращения винта 3000 об/мин и температуре 10С.

Определение физических свойств инактивированной эмульсионной вакцины против НБ и МПВИ птиц Определение типа вакцинной эмульсии осуществляли «капельным методом».

Стабильность эмульсии определяли следующими методами:

Центрифугирование образца вакцины Эмульсию считали стабильной, если после центрифугирования при об/мин (1000g) в течение 30 мин в пробирке в процессе визуального контроля не обнаружено никаких изменений содержимого, или если высота столба прозрачной фракции, сформировавшейся в верхней части пробирки, не превышает 10% от общей величины столба эмульсии.

Метод «быстрого старения» Эмульсию считали стабильной, если в течение 14 сут. в пробирке в процессе визуального контроля не обнаружено никаких изменений содержимого, или если высота столба прозрачной фракции, сформировавшейся в верхней части пробирки, не превышала 10% от общей высоты столба.

Экспресс-метод Пробирку с эмульсией помещали в низкотемпературную холодильную камеру на 1 ч, затем в термостат на 1 ч, после чего измеряли линейкой высоту столба прозрачной фракции в верхней части пробирки.

Эмульсию считали хорошего качества, если в пробирке в процессе визуального контроля величина столба нижней водной фракции не превышала 5% от общей высоты столба или отсутствовала;

удовлетворительного качества, если величина столба водной фракции составляла от 5% до 15%. Вакцина считалась нестабильной, если величина столба водной фракции составляла 15% от общей величины, и более.

Определение гранулометрического состава осуществляли следующими методами:

Лазерная дифракционная гранулометрия Для тестирования вакцины использовали лазерный анализатор частиц Microtrac 3500 (США). Эмульсию считали хорошего качества, если средний диаметр частиц дисперсионной фазы D50 не превышал 5,0 мкм, а индекс гомогенности Span был менее 2,4.

Световая микроскопия Эмульсию считали хорошего качества, если в поле микроскопа наблюдалась равномерная мелкозернистая структура.

Кинематическую вязкость определяли с помощью вискозиметра по ГФ XI, т.1, с.87.

Определение безвредности инактивированной эмульсионной вакцины против НБ и МПВИ птиц Визуальную оценку степени поражения тканей в месте введения эмульсионной вакцины проводили через 42 сут. после прививки по критериям, предложенным H.D. Stone (1997 г.):

- лёгкие поражения: побледнение тканей, окружающих место инъекции, размером до 1 см в диаметре, признаки воспаления отсутствовали;

- средние поражения: зона воспалительной реакции тканей, проявляющаяся отёчностью, побледнением или гиперемией имела размеры от до 2 см в диаметре, присутствовала диффузно расположенная вакцина;

- сильные поражения: очаг воспаления тканей с вовлечением глубоких и поверхностных мышц и образованием гранулём в диаметре от 3 до 4 см, вакцина вытекала на разрезе или присутствовала в тканях в виде белого творожистого вещества.

Проверка иммуногенности инактивированной вакцины против НБ и МПВИ птиц Сущность метода заключалась в определении способности вакцины вызывать у привитых птиц выработку специфических антител против МПВ, которые обнаруживали методом иммуноферментного анализа (ИФА) и в РТГА - против НБ.

Птиц в возрасте 50-80 сут. прививали инактивированной эмульсионной вакциной против НБ и МПВИ птиц однократно в грудную мышцу в прививном объеме 0,5 см3.

Вакцину считали иммуногенной, если титр антител в сыворотках крови у более чем 80% вакцинированных птиц через 21 сут. после иммунизации составлял к вирусу НБ не ниже 5 лог2 в РТГА, и процент блокирования антител к МПВ в ИФА был не ниже 40.

Статистическая обработка результатов исследований Использовали общепринятые способы определения дисперсии, стандартных отклонений и доверительных интервалов варьирующих переменных. Вычисляли количественные показатели связи зависимых переменных в виде коэффициентов корреляций, детерминации или коэффициентов регрессионных уравнений (Закс Л., 1976;

Мисюк Н.С., 1975;

Поллард Дж., 1982).

Оценка значимости проведенных статистических вычислений (или адекватности построенных моделей) представлена в виде значения ошибки прогноза (р0,05).

2.3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.3.1. Подбор штаммов вируса ньюкаслской болезни и метапневмовируса птиц для изготовления инактивированной вакцины Получение вирусного сырья занимает важное место в технологии изготовления инактивированной вакцины против НБ и МПВИ птиц.

В качестве производственного штамма вируса НБ наш выбор был остановлен на штамме «Ла-Сота», который многими исследователями [Ирза В.Н., 2000;

Манин Т.Б., 2000;

Ельников В.В., 2003;

Борисов В.В., 2007] признан по своим биологическим и антигенным свойствам наиболее пригодным.

Выбор производственного штамма метапневмовирусной инфекции птиц был осложнен тем, что в мире встречаются 4 подтипа метапневмовируса птиц (А, В, С, D).

Нами была проведена диагностическая работа по выявлению и типированию метапневмовирусов птиц в Российской Федерации, которая включала обнаружение генома вируса методом обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР), выделение вируса и регистрацию вирусспецифических антител в крови птиц.

За период 2005-2006 гг. на наличие метапневмовируса птиц методом ОТ ПЦР было исследовано 160 проб из 64 птицеводческих хозяйств различных регионов РФ. МПВ подтипа В был выявлен в пробах из 10 птицефабрик регионов РФ.

На основании полученных результатов был сделан вывод о преобладании на территории Российской Федерации метапневмовируса птиц подтипа В.

Таким образом, для изготовления инактивированной вакцины против НБ и МПВИ птиц с целью дальнейшего применения в Российской Федерации целесообразно использовать штаммы подтипа В метапневмовируса.

В 2003 г. в ФГУ «ВНИИЗЖ» из патологического материала, полученного от больных цыплят-бройлеров, был выделен полевой изолят метапневмовируса птиц, который адаптировали к размножению в первичных и перевиваемых культурах клеток.

После проведения молекулярно-биологических исследований и постановки реакции нейтрализации со специфической и эталонной сыворотками к МПВ птиц было сделано заключение о принадлежности изолята к семейству Paramyxoviridae, роду Metapneumovirus, подтипу «В».

Полученному штамму дано название «PV03-B» и в 2006 г. он был депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (ФГУ «ВГНКИ», г. Москва) под регистрационным номером – штамм «PV03-B №127 ДЕП» метапневмовируса птиц.

Во время работ по депонированию штамм «PV03-В» вируса МПВИ птиц был проверен на морфологическое и видовое соответствие, стерильность, контаминацию микоплазмами, вирусами и грибами, инфекционную активность и иммуногенную активность в составе инактивированной вакцины.

2.3.2. Разработка оптимальной схемы получения вирусного сырья для изготовления инактивированной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц Для изготовления инактивированных вакцин против НБ в РФ разработана система получения вирусного сырья с применением лентогенного штамма «Ла Сота», который накапливается в КЭ с высокой инфекционной активностью.

При разработке оптимальной системы культивирования вируса МПВ проводили исследования по получению вирусного сырья в развивающихся куриных эмбрионах, а также в первичных и перевиваемых культурах клеток.

Было установлено, что штамм «PV03-B» метапневмовируса птиц подтипа В, независимо от способа введения, в 3 и 4 пассажах накапливался в эмбрионах СПФ-кур в незначительных количествах (титры инфекционной активности вируса - от 3 до 4 lg ТЦД50/см3).

В дальнейшем, основное внимание было уделено поиску высокоэффективной клеточной системы для получения МПВ птиц подтипа В в количествах, необходимых для производства вакцины.

В результате проведенных исследований установлено, что штамм «PV03-B» лучше всего адаптировался и накапливался в перевиваемой культуре клеток Vero. В других культурах клеток показатели инфекционности были ниже.

Метапневмовирус птиц подтипа В размножался в культуре клеток ФЭК в незначительных количествах с титром инфекционности от 3,0 до 3,5 lg ТЦД50/см3. С целью повышения показателя накопления вируса были проведены эксперименты по культивированию в культуре клеток ФЭК с обработкой клеток 0,25% раствором трипсина.

После применения этого технологического приема удалось получить вирусное сырье с более высокой инфекционной активностью, достигающей 6,75-7,5 lg ТЦД50/см3.

Таким образом, для культивирования метапневмовируса птиц подтипа В нами была выбрана перевиваемая культура клеток Vero, которую можно использовать для наработки вирусного сырья в больших количествах.

В качестве альтернативного способа получения вирусного антигена можно рассматривать первично трипсинизированную культуру клеток ФЭК, которая менее технологична и требует наличия эмбрионов СПФ-кур.

Перевиваемую культуру клеток Vero культивировали в стационарных условиях в роллерных сосудах объемом 3,0 дм3, по разработанным в ФГУ «ВНИИЗЖ» регламентам. В качестве ростовой среды использовали питательные среды ПСС, ПСП с 10% сыворотки крови КРС.

Сосуды с зараженной культурой клеток помещали в роллерный аппарат стеллажного типа при скорости вращения барабанов 12 об/ч. Культуру клеток выращивали при температуре 37,0-37,5°С в течение 3-4 сут. до формирования плотного монослоя без признаков дегенерации клеток. Из сосудов сливали ростовую среду, монослой клеток дважды отмывали раствором Хенкса и вносили испытуемый вирус с множественностью заражения 0,1-0,5 ТЦД50/на клетку. Инфицированные культуры помещали в роллерный аппарат и для контакта вируса с клетками выдерживали 1 ч при температуре 37,5-38,0°С.

Затем вносили поддерживающую среду с 2% инактивированной сыворотки крови КРС и культивировали до поражения монослоя на 80-90%.

Установлено, что штамм «PV03-B» метапневмовируса птиц имел максимальное накопление в культуре клеток Vero с посевной концентрацией 120 тыс кл/см3. В этом случае титр инфекционности вируса был наибольшим и колебался от 7,50 до 7,75 lg ТЦД50/см3.

Оптимальным временем культивирования культуры клеток Vero, при котором получены высокие титры инфекционности МПВ птиц, является 72 ч.

Наивысший титр инфекционности метапневмовируса птиц отмечен при выращивании вируса в течение 72 часов.

2.3.3. Инактивация вируса ньюкаслской болезни и метапневмовируса птиц с использованием различных инактивантов После разработки оптимальных схем получения биомассы вирусов НБ и МПВ, перед нами стояла задача по выбору эффективного инактивирующего средства, его концентрации и оптимальных параметров инактивации, обеспечивающих полное подавление инфекционных свойств вирусов при максимальном сохранении антигенных структур вирионов.

В Российской Федерации для инактивации инфекционных свойств многих вирусов широко применяется димер аминоэтилэтиленимина.

Следует отметить, что ДЭИ выпускается в Российской Федерации одним предприятием партиями с различным содержанием действующего вещества.

Поэтому в промышленных условиях для полной гарантированной инактивации вируса ньюкаслской болезни используют более высокую концентрацию ДЭИ от 0,15 до 0,2%, при температуре процесса 27°С в течение 24 ч.

При поиске альтернативного эффективного инактиванта провели исследования по изучению условий инактивации вирусов НБ и МПВИ птиц с помощью бета-пропиолактона.

В экспериментах по инактивации вируса НБ использовали эмбриональную суспензию штамма «Ла-Сота» с инфекционным титром 10,5±0,1 lgЭИД50/см3 (lgT0). Изучали воздействие различных концентраций инактиванта в диапазоне от 0,005 до 0,04%. Инактивацию проводили при температуре 20±2°С в режиме перемешивания. Исследовали динамику инактивации вируса для каждой концентрации БПЛ. С этой целью, через заданные интервалы времени (j), из реактора, где происходил процесс инактивации, отбирали пробы, определяли их инфекционный титр (lgTj) и вычисляли показатели остаточной инфекционности вируса (lgV = lgTj - lgT0).

Полученные результаты представлены в виде графика на рис. 1.

lgV - -5 lgV{0,02} = -0,619h - 6, R2 = 0, - lgV{0,04} = -0,786h - 7, - R2 = 0, - - - - - 0 4 8 12 16 20 h, часы Рис. 1. Распределение оценок остаточной инфекционности вируса НБ (V, lg ЭИД50/см3) соответственно экспозиции (ч) и концентрации бета-пропиолактона (%) - 0,005;

– 0,01;

– 0,02;

• - 0,04.

Регрессии вида: “lgV{0,02}=(-0,619)h-6.86 и “lgV{0,04}=(-0,786)h-7,50, где: “V – прогнозируемое значение для заданной экспозиции воздействия инактиванта и соответственно его концентрации {значение в фигурных скобках};

R2 - коэффициент детерминации (характеристика линейности модели).

Установлено, что распределения оценок остаточной инфекционности вируса НБ имели вид убывающих значений, из которых следовало, что эффективность воздействия инактиванта определялась его концентрацией. При этом инактивирующий эффект БПЛ в концентрациях свыше 0,01% был более выраженным, и соответствующие графики имели приближение к линейному виду. На этом основании для концентраций инактиванта 0,02 и 0,04% были построены линейные регрессионные модели, которые оказались адекватными (p0,01) и позволяли прогнозировать оценки остаточной инфекционности вируса вне диапазона экспериментальных измерений.

Учитывая статистические характеристики приведенных прогнозируемых величин, считали, что для стабильного получения инактивированного вируса НБ целесообразно использовать концентрацию БПЛ, равную 0,04%.

Для исследования инактивации МПВ использовали культуральную суспензию штамма «PV03-B» с инфекционным титром 7,3±0,2 lgТЦД50/см (lgT0). По аналогии с экспериментами по инактивации вируса НБ изучали воздействие различных концентраций инактиванта в диапазоне от 0,005 до 0,04%, при температуре 20±2°С в режиме перемешивания. Через заданные интервалы времени (j) определяли инфекционный титр (lgTj) вируссодержащей суспензии и вычисляли показатели остаточной инфекционности вируса, (lgV = lgTj - lgT0).

Полученные данные, отраженные на рис. 2, показывают, что снижение остаточной инфекционности МПВ зависело от концентрации инактиванта и от времени его воздействия.

V, lg - - - - - - -8 lgV{0,02} = -1,036h - 3, R2 = 0, - lgV{0,04}= -1,50h - 4, - 0 4 8 12 16 20 24 h, часы Рис. 2. Распределение оценок остаточной инфекционности МПВ (V, lg ТЦД50/см3) соответственно экспозиции (ч) и концентрации бета-пропиолактона (%) - 0,005;

– 0,01;

– 0,02;

• - 0, Регрессии вида: “lgV{0,02}=(-1,036)h-3,05 и “lgV{0,04}=(-1,50)h-4,30, где: “V – прогнозируемое значение для заданной экспозиции воздействия инактиванта и соответственно его концентрации {значение в фигурных скобках};

R2 - коэффициент детерминации (характеристика линейности модели).

Построенные регрессионные модели позволили определить, что при концентрации БПЛ 0,02%, после 8 ч экспозиции, ожидаемая величина остаточной инфекционности МПВ составила оценку “lgV{0,02}=(-1,036)8-3,05=( 11,338) lgТЦД50/см3, т.е около 10-9,3% от исходного инфекционного титра. В свою очередь, значение имело величину “lgV{0,04}=(-1,50)8-4,30=(-16,30) lg ТЦД50/см3, т.е около 10-14,3%. Очевидно, что такие значения экспериментально установить практически невозможно.

Учитывая статистические характеристики прогнозируемых величин для гарантированного получения инактивированного МПВ, считали целесообразным использовать бета-пропиолактон в концентрации 0,04%.

Для определения влияния различных инактивантов на иммунобиологические свойства вируса НБ и МПВ из инактивированных вирусных суспензий были изготовлены лабораторные образцы инактивированной эмульсионной вакцины против НБ и МПВИ птиц, которые вводили серонегативным цыплятам внутримышечно в прививном объеме 0,5 см.

Перед эмульгированием антигенные компоненты НБ и МПВ смешивали в следующих соотношениях: 30:70;

40:60 и 50:50 отдельно по каждому инактиванту.

Установлено, что иммуногенная активность образцов вакцины, изготовленных на основе вирусного сырья, инактивированного бета пропиолактоном, несколько выше в сравнении с образцами, где вирусные антигены инактивировали ДЭИ.

В целом можно заключить, что для инактивации вируса НБ и МПВ при изготовлении вакцины можно использовать как ДЭИ, так и бета-пропиолактон, которые позволяют получить препарат с высокой иммуногенной активностью.

Следует отметить, что применение бета-пропиолактона для инактивации вирусов НБ и МПВИ птиц предпочтительнее из-за более короткого, в сравнении с ДЭИ, периода инактивации. Кроме этого, процесс инактивации вирусов БПЛ преимущественен, т.к. не требуется нейтрализация оставшегося свободного инактиванта в вакцине.

2.3.4. Выбор оптимальной формы инактивированной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц В ветеринарной практике птицеводческой отрасли применяют две формы инактивированных вакцин: сорбированную и эмульсионную. Многими исследователями [Ирза В.Н., 2000;

Ельников В.В., 2004;

Борисов В.В., 2007] при испытаниях широкого спектра масляных адъювантов и эмульсий различных типов показано, что вакцины против вирусных болезней птиц на основе масляного адъюванта Монтанид ИЗА 70, образующего эмульсию обратного типа, имели наиболее оптимальные физические показатели и высокие иммунобиологические качества. В связи с этим при конструировании эмульсионной формы инактивированной вакцины против НБ и МПВИ птиц наш выбор был остановлен на масляном адъюванте Монтанид ИЗА производства фирмы «SEPPIC» (Франция).

При подборе адъюванта для изготовления сорбированной формы инактивированной вакцины использовали наиболее широко применяемые в производстве ветеринарных вакцин: гель гидроокиси алюминия и водный раствор сапонина. Количество этих адъювантов в составе вакцины против НБ и МПВИ птиц было следующим: ГОА – 1% и сапонин – 1,0-1,5 мг/доза. Для изготовления обеих форм вакцины против НБ и МПВИ птиц брали инактивированные бета-пропиолактоном вирусные антигены, которые смешивали в равных соотношениях (50:50).

Cравнительные испытания иммуногенной активности биопрепаратов провели на серонегативных цыплятах (по 20 цыплят в группе). Образцы вакцины вводили внутримышечно в область груди в прививном объеме 0,5 см3.

Через 28 сут. после прививки выполняли взятие проб крови для получения сывороток, которые исследовали на наличие специфических антител к вирусу НБ и МПВ.

Результаты сравнительных испытаний двух форм инактивированной вакцины против НБ и МПВИ птиц представлены в табл. 1, из которой видно, что оба варианта препарата индуцируют выработку высокого уровня антител.

Однако следует отметить, что эмульсионная вакцина вызвала образование более напряженного иммунного ответа к обоим вирусным антигенам. Так, при серологических исследованиях сывороток крови в РТГА концентрация антигемагглютининов к вирусу НБ у цыплят, привитых эмульсионной формой вакцины, была выше. Средний титр антител составил 10,7±0,3 лог2, в то время как этот показатель по группе цыплят, привитых сорбированной вакциной, был равен 8,3±0,5 лог2. Аналогичную тенденцию зафиксировали при исследовании сывороток крови на наличие антител к МПВ. Средний процент блокирования антител в ИФА в группе цыплят, привитых эмульсионной формой вакцины, составил 87,2 (59,6-89,8), а в группе птиц, вакцинированных сорбированным препаратом, был равен 51,2 (42,0-64,3).

Таблица Титры антител после введения эмульсионной и сорбированной форм инактивированной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц Результаты серологических Форма Название инфекции и исследований через 28 сут.

вакцины серологической реакции после прививки НБ, РТГА, лог2 10,7±0, Эмульсионная МПВИ, ИФА, % 87,2 (59,6-89,8) НБ, РТГА, лог2 8,3±0, Сорбированная МПВИ, ИФА, % 51,2 (42,0-64,3) НБ, РТГА, лог2 н/о Контроль МПВИ, ИФА, % н/о Примечание: н/о – не обнаружено.

Таким образом, на основании проведенных сравнительных испытаний иммуногенной активности двух форм инактивированной вакцины против НБ и МПВИ птиц наиболее перспективной признана эмульсионная форма препарата с использованием масляного адъюванта Монтанид ИЗА 70.

2.3.5. Определение оптимального компонентного состава вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц При конструировании инактивированной эмульсионной вакцины против НБ и МПВИ птиц была поставлена задача по определению оптимального соотношения вирусных антигенов в препарате.

При изучении инактивации вирусов НБ и МПВИ птиц в эксперименте на восприимчивых цыплятах была установлена более высокая иммуногенная активность образцов вакцины с соотношением антигенов НБ и МПВ в водной фазе- 30:70, которое в дальнейшем считали оптимальным.

Однако, учитывая то, что при культивировании вирусов возможно получение вирусного сырья с различной инфекционной активностью, было принято решение о постановке опытов по изучению иммуногенной активности образцов вакцины, содержащих в прививном объеме антигены с различной инфекционной активностью до инактивации.

Сначала были изготовлены 3 образца инактивированной вакцины против МПВИ птиц. Инфекционная активность МПВ птиц до инактивации была равна 7,0±0,3 lg ТЦД50/см3.

Вирусный антиген до инактивации был разведен физиологическим раствором с таким расчетом, что инфекционная активность образцов антигенов была равна 6,5 и 6,0 lg ТЦД50/см3. После инактивации бета-пропиолактоном все вирусные антигены с различной активностью (7,0;

6,5 и 6,0 lg ТЦД50/см3) развели физиологическим раствором (ФР) в соотношении 70:30, объединили с масляным адъювантом Монтанид ИЗА 70 и эмульгировали в гомогенизаторе.

Разведения вирусного антигена были сделаны с таким расчетом, что в прививном объеме первого образца содержалось около 6,0, второго – 5,5 и третьего – 5,0 lg ТЦД50 в пересчете на нативный вирус. Аналогичные действия были проведены с вирусом НБ, который до инактивации имел титр инфекционной активности, равный 10,0±0,4 lg ЭИД50/см3. Разведения физиологическим раствором были проведены так, что инфекционная активность полученных образцов была равна 9,0 и 8,0 lg ЭИД50/см3. После процедуры инактивации вирусные антигены с различной активностью (10;

9 и lg ЭИД50/см3) развели ФР в соотношении вируса к ФР 30:70, объединили с масляным адъювантом Монтанид ИЗА 70 и эмульгировали в гомогенизаторе.

Таким образом, изготовили 3 образца инактивированной моновакцины против НБ. В прививном объеме первого образца содержалось 8,6, второго – 7,6 и третьего – 6,6 lg ТЦД50/см3, соответственно.

Представленные в табл. 2 данные свидетельствуют о том, что уровень напряженности иммунитета после прививки образцами инактивированных моновакцин против НБ и МПВИ птиц напрямую зависит от инфекционной активности используемого вирусного сырья.

При моделировании процентного соотношения вирусных антигенов НБ и МПВ в водной фазе как 30:70 установлено, что для изготовления эмульсионной вакцины против НБ и МПВИ птиц необходимо использовать вирусный антиген НБ с инфекционной активностью до инактивации не ниже 9,0 lg ЭИД50/см3, а вирусный антиген МПВ – не ниже 6,5 lg ТЦД50/см3.

Использование для изготовления моновакцины вирусного сырья МПВИ птиц с инфекционной активностью до инактивации 6,0 lg ТЦД50/см3, обеспечило выработку иммунитета только у 60% привитых птиц с самым низким показателем среднего процента блокирования антител, который по истечении 8 недель после прививки был равен 44,9 с диапазоном положительных результатов от 40,6 до 62,2.

Таблица Титры антител после введения инактивированных эмульсионных моновакцин против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц Титры антител в Инфекцион- Соотно- Расчетное РТГА (лог2) и ИФА Название ная шение кол-во (средний процент блокирования антител) инфек- активность антигена вируса в в разные сроки после ции вируса в и водной прививном прививки, сут.

образце фазы объеме 28 НБ 30:70 11,1±0,4 11,9±0, 10,0 lg ЭИД50/см3 8,6 lg ЭИД50/см НБ 30:70 8,2±0,3 9,4±0, 9,0 lg ЭИД50/см3 7,6 lg ЭИД50/см НБ 30:70 6,8±0,4 7,2±0, 8,0 lg ЭИД50/см3 6,6 lg ЭИД50/см 20/20* 20/20* МПВИ 70: 7,0 lg ТЦД50/см3 6,0 lg ТЦД50/см3 73,7 77, (55,8-80,3) (69,4-82,3) 20/20* 20/20* МПВИ 70: 6,5 lg ТЦД50/см3 5,5 lg ТЦД50/см3 65,6 67, (57,1-77,1) (52,3-74,5) 12/20* 11/20* МПВИ 70: 6,0 lg ТЦД50/см3 5,0 lg ТЦД50/см 48,3 44, (41,4-61,2) (40,6-62,2) - - н/о н/о Контроль не прививалась Примечание: н/о – не обнаружено;

* - количество положительных результатов/общее количество проб.

Одновременно с исследованиями по определению иммуногенной активности монопрепаратов из того же вирусного сырья были изготовлены лабораторных образца инактивированной эмульсионной вакцины против НБ и МПВИ птиц с процентным соотношением антигенов 30:70 в водной фазе.

Результаты экспериментов по определению иммуногенной активности и возможного взаимного влияния антигенов при введении цыплятам в составе инактивированной эмульсионной вакцины против НБ и МПВИ птиц показали, что титры гуморальных антител к вирусу НБ находились на том же уровне, как и после применения моновакцин против НБ с таким же содержанием антигена в прививном объеме (табл. 3).

По результатам исследований в ИФА по обнаружению специфических антител к МПВ установлено, что смешивание вирусных антигенов НБ и МПВ в водной фазе вакцины в пропорции 30:70 приводит к их усиленному взаимному влиянию.

Таблица Титры антител после введения инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц Кол-во Название Лабора- Титры антител к вирусам цыплят в инфекции и торный после прививки, сут.

группе, серологической образец гол. реакции 28 НБ, РТГА, лог2 10,9±0,3 11,3±0, 1 20 91,5 95, МПВИ, ИФА, % (67,3-94,5) (78,9-97,2) НБ, РТГА, лог2 11,4±0,5 11,7±0, 2 20 94,2 96, МПВИ, ИФА, % (73,2-96,1) (81,0-98,4) НБ, РТГА, лог2 10,7±0,3 10,8±0, 3 20 92,4 92, МПВИ, ИФА, % (59,8-94,4) (75,8-95,2) НБ, РТГА, лог2 н/о н/о Контроль МПВИ, ИФА, % н/о н/о Примечание: н/о – не обнаружено.

Средний процент блокирования антител в сыворотках крови птиц, привитых вакциной против НБ и МПВИ птиц, колебался от 92,9 до 96,3, а у цыплят, иммунизированных моновакциной против МПВИ птиц, составил 77,8 (69,4-82,3) %.

Таким образом, установлено, что для изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против НБ и МПВИ птиц процентное соотношение вирусных антигенов НБ к МПВИ птиц в водной фазе должно быть 30 к 70.

Инфекционная активность вируса НБ до инактивации должна быть не ниже 9,0 lg ЭИД50/см3, а метапневмовируса – не ниже 6,5 lgТЦД50/см3.

2.3.6. Определение физических свойств инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц в зависимости от продолжительности её хранения Нами были изучены физические свойства вакцины против НБ и МПВИ птиц инактивированной эмульсионной после длительного хранения (12 мес.) при температуре 2-8С: тип вакцинной эмульсии, стабильность вакцинной эмульсии, гранулометрический состав и вязкость.

Установлено, что кинематическая вязкость свежеприготовленной вакцины составляла 48,8 мм2/с, а через 12 мес. хранения при температуре 2-8С незначительно выросла - до 55,2 мм2/с. Таким образом, кинематическая вязкость в процессе хранения вакцины почти не изменилась и была в пределах допустимых норм.

Изучение стабильности вакцинной эмульсии с помощью центрифугирования, экспресс-методики и «быстрого старения» показало, что свежеприготовленная партия эмульсионной вакцины была стабильна во всех трёх тестах: величина верхней фракции составляла 2%, отслоения водной фазы не отмечалось. Через 12 мес. хранения эти показатели практически не изменились: во всех трёх тестах величина верхней фракции составляла 2%, отслоения водной фазы также не отмечалось. Это свидетельствует о том, что вакцинная эмульсия обладает высокой стабильностью как сразу после изготовления, так и в течение длительного срока хранения.

Результаты изучения гранулометрического состава эмульсии до и после хранения с помощью лазерной гранулометрии и световой микроскопии показали, что средний линейный диаметр частиц дисперсной фазы свежеприготовленной вакцины составляет 0,810 мкм, индекс гомогенности эмульсии Span составляет 0,94.

В процессе хранения эмульсионной вакцины произошло незначительное укрупнение линейного диаметра частиц дисперсной фазы эмульсии, в среднем эта величина составила 1,621 мкм. Вакцина оставалась высокогомогенной – индекс Span составил 0,53.

«Капельный метод» показал, что вакцинная эмульсия как до, так и после длительного хранения представляла собой «обратный» тип, т.е. «вода-масло».

Таким образом, установлено, что в процессе хранения у вакцины против НБ и МПВИ птиц инактивированной эмульсионной физические свойства практически не изменились и остались в рамках нормативных требований. Об этом свидетельствуют высокая стабильность вакцинной эмульсии, низкая вязкость, высокая гомогенность и оптимальный средний диаметр частиц дисперсной фазы вакцинной эмульсии как до, так и после 12-мес. срока хранения. Анализируя результаты исследований физических свойств биопрепарата, можно сделать заключение о высоком качестве вакцины против НБ и МПВИ птиц инактивированной эмульсионной, что косвенно может свидетельствовать о её эффективности.

Параллельно исследованиям физических показателей качества биопрепарата проводили оценку его иммуногенных свойств на цыплятах, которым внутримышечно в грудную мышцу в дозе 0,5 мл вводили свежеприготовленную и хранившуюся в течение 12 мес. при температуре 2-8С инактивированную эмульсионную вакцину против НБ и МПВИ птиц.

Установлено, что хранение инактивированной эмульсионной вакцины против НБ и МПВИ птиц в течение 12 мес. при температуре от 2 до 8С не привело в существенному снижению иммуногенной активности препарата.

2.3.7. Изучение динамики формирования антител к вирусу ньюкаслской болезни и метапневмовирусу после иммунизации инактивированной эмульсионной вакциной В опыте использовали 30 цыплят яичного кросса «Хайсекс коричневый» в возрасте 50 сут., серонегативных к возбудителям НБ и МПВИ птиц.

Исследованиями установлено, что инактивированная эмульсионная вакцина против НБ и МПВИ птиц индуцировала у однократно привитых птиц формирование высокого уровня гуморального иммунитета к вирусу НБ (9,55±0,44 лог2) уже через 14 сут. после вакцинации. При дальнейшем исследовании в более поздние сроки концентрация антигемагглютининов в крови повысилась до 10,25±1,70 лог2 через 42 сут. после прививки и до 10,40±0,78 лог2 через 56 сут. (срок наблюдения).

Повторное введение препарата через 28 сут. после первой иммунизации не привело к приросту титров антител к вирусу НБ.

Так, значение титра антител к вирусу НБ через 21 сутки после двукратной иммунизации составило 10,00±0,56 лог2.

Серологические исследования методом ИФА показали, что антитела к МПВ начали регистрироваться в защитных титрах так же, как и при ньюкаслской болезни, т.е. через 14 сут. после прививки (средний процент блокирования антител – 46,6%). В дальнейшие сроки наблюдения этот показатель возрос до значений 69,5-72,8%. После двукратной иммунизации сероконверсии к МПВ также не обнаружено.

Таким образом, установлено, что инактивированная эмульсионная вакцина против НБ и МПВИ птиц индуцирует у привитых птиц образование высоких титров специфических антител к вирусу НБ и МПВ птиц.

2.3.8. Сравнение иммунобиологических свойств инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц с зарубежным аналогом В эксперименте для сравнения иммунобиологических свойств были взяты два биопрепарата:

- инактивированная эмульсионная вакцина против НБ и МПВИ птиц (экспериментальная серия № 5, ФГУ «ВНИИЗЖ»);

- инактивированная эмульсионная вакцина против МПВИ птиц Nobilis TRT inac, № серии 05920221, «Интервет», Голландия (образец получен из ФГУ «ВГНКИ»).

Следует отметить, что для сравнения была взята зарубежная моновакцина против МПВИ птиц в связи с тем, что бивалентные вакцины против НБ и МПВИ птиц в Российскую Федерацию не импортируются.

Серонегативные к вирусам НБ и МПВИ птиц птицы яичного кросса «Хайсекс коричневый» в количестве 40 голов возрасте 10 недель были привиты внутримышечно в грудную мышцу в дозе 0,5 см3 инактивированными вакцинами отечественного и зарубежного производства. Через 6 недель после иммунизации у птиц выполняли взятие проб крови, получали сыворотки, которые исследовали в ИФА на наличие антител к вирусу МПВИ птиц. В эти же сроки птиц подвергали эвтаназии для проведения послеубойной оценки состояния тканей в месте инъекции.

Установлено, что отечественная инактивированная вакцина против НБ и МПВИ птиц не уступает зарубежному монопрепарату против МПВИ птиц по иммуногенной активности.

Средний процент блокирования антител к МПВ в ИФА в сыворотках крови птиц, привитых отечественной вакциной, составил значение 80,1 (74,1 85,8), а у птиц, иммунизированных зарубежной вакциной, он был равен значению 79,0 (69,1-83,5).

Послеубойная оценка тканевых реакций в месте инъекции вакцин показала, что степень поражения тканей по критериям, предложенным Stone H.D., можно отнести к легким.

По результатам проведенного эксперимента можно сделать заключение о том, что инактивированная эмульсионная вакцина против НБ и МПВИ птиц производства ФГУ «ВНИИЗЖ» обладает высокими иммунобиологическими свойствами и не уступает зарубежной инактивированной моновакцине против МПВИ птиц.

2.3.9. Изучение иммунобиологических свойств инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц в производственных условиях На одном из птицепредприятий яичного направления в 2005 г. была зарегистрирована вспышка МПВИ птиц, которая сопровождалась увеличением падежа кур на 3-5%, снижением яичной продуктивности на 7-12% и увеличением затрат на проведение лечебных обработок и дезинфекций.

Диагноз на МПВИ птиц был поставлен комплексно, на основании клинических признаков, патологоанатомических изменений, серологических данных и результатов молекулярно-биологических исследований (в ПЦР выявлен геном МПВ подтипа В).

В производственном эксперименте использовали 770 тыс. голов кур яичных кроссов «Хай-лайн» и «Хайсекс коричневый».

По данным серологического мониторинга птицепоголовья и эпизоотологических данных нами был определен срок эффективного применения инактивированной вакцины: в возрасте 60 сут., в момент снижения титров антител к НБ до уровня, когда необходимо проводить ревакцинацию против данного заболевания, т.е. когда в сыворотках крови отсутствовали антитела к МПВ и не фиксировались признаки данной инфекции.

Птиц прививали инактивированной эмульсионной вакциной против НБ и МПВИ птиц однократно в грудную мышцу в прививном объеме 0,5 см3.

Для получения сывороток выполняли взятие крови у кур из подкрыльцовой вены в разные сроки после иммунизации до 18-мес. возраста.

Напряженность и продолжительность поствакцинального иммунитета у кур-несушек после однократной иммунизации инактивированной эмульсионной вакциной против НБ и МПВИ птиц представлены на рис. 3 и 4.

Дальнейшие серологические исследования показали, что в возрасте 3 мес.

у птиц концентрация антител к вирусу НБ в крови после иммунизации повысилась до максимального в экспериментах значения и составила 10,9±0, лог2. При серологических исследованиях сывороток крови от птиц в более поздние сроки после иммунизации установлено, что титры антигемагглютининов в крови у кур находились примерно на одном уровне (10,2-10,5 лог2) до 9-мес. возраста.

Титр в РТГА, лог Прот ективный 6 уровень антит ел 4 Вакцинация 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Сроки после иммунизации, мес.

• – время отбора проб крови Рис. 3. Показатели напряженности и продолжительности иммунитета к ньюкаслской болезни после прививки инактивированной эмульсионной вакциной против НБ и МПВИ птиц В дальнейшем отмечено, что концентрация антигемагглютининов в крови кур с возрастом незначительно снизилась.

Так, при исследовании сывороток крови от кур 12-мес. возраста средний титр антигемагглютининов составил 9,4±0,5 лог2, а в возрасте 18 мес. у кур в крови концентрация антител снизилась до значения 8,1±0,6 лог2.

По результатам исследования в РТГА следует заключить, что инактивированная эмульсионная вакцина против НБ и МПВИ птиц индуцирует у привитых птиц формирование высокого уровня гуморального иммунитета к вирусу НБ, обеспечивающего надежную защиту кур от заражения в течение всего периода эксплуатации кур.

Аналогичную тенденцию после прививки наблюдали по напряженности и продолжительности иммунитета к МПВИ птиц (рис. 4).

До вакцинации антитела к МПВ в крови привитых кур отсутствовали, а через 1 мес. после прививки уровень защитных антител был максимальным (средний процент блокирования антител 92,1%). В возрасте кур-несушек от до 13 мес. этот показатель был на высоком уровне и колебался от 85,3 до 91,8%.

Минимальный процент блокирования антител в крови, равный 68,2%, был зафиксирован у птиц перед убоем в возрасте 18 мес.

Следует отметить, что антитела к обоим вирусам в защитных титрах были обнаружены во всех исследованных пробах крови. В течение всего периода наблюдения на вакцинированном поголовье признаков заболевания ньюкаслской болезнью и метапневмовирусной инфекцией птиц не обнаружено.

Средний процент блокирования антител в ИФА Протективный 50 уровень антител 30 Вакцинация 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Сроки после вакцинации, мес.

• – время отбора проб крови Рис. 4. Показатели напряженности и продолжительности иммунитета к метапневмовирусной инфекции птиц после прививки инактивированной эмульсионной вакциной против НБ и МПВИ птиц Таким образом, в производственных условиях на поголовье кур в 770 тыс.

голов установлено, что инактивированная эмульсионная вакцина против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц безвредна для кур и индуцирует у них формирование напряженного продолжительного иммунитета к обеим инфекциям в течение всего технологического периода содержания птиц (18 мес.).

3. ВЫВОДЫ 1. Разработана технология изготовления и контроля инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц. Вакцина безвредна, высокоиммуногенна при парентеральном введении и сохраняет свои иммунобиологические свойства при длительном хранении (12 мес.) при температуре от 2 до 8С.

2. Получен и изучен производственный штамм «PV03-B» метапневмовируса птиц, обладающий выраженными антигенными и иммуногенными свойствами, который при масштабном культивировании в перевиваемой культуре клеток Vero позволяет получать вирусный материал с высокой инфекционной активностью - до 7,75 lg ТЦД50/см3, пригодный для изготовления инактивированной вакцины.

3. Установлено, что для полной инактивации вируса ньюкаслской болезни и метапневмовируса птиц при температуре 20С и времени инактивации 8 ч необходима конечная концентрация бета-пропиолактона, равная 0,04 %.

4. В сравнительных испытаниях по выбору оптимальной формы инактивированной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц установлено, что сорбированная и эмульсионная формы препарата обладают выраженной иммуногенностью, но эмульсионная вакцина с использованием масляного адъюванта Монтанид ИЗА 70 признана перспективной по оптимальным физическим и более высоким иммунобиологическим показателям.

5. Подобрано оптимальное иммунобиологически сбалансированное соотношение антигенных компонентов ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц (30:70) в водной фазе вакцины с масляным адъювантом Монтанид ИЗА 70 с инфекционной активностью вируса ньюкаслской болезни до инактивации не ниже 9,0 lg ЭИД50/см3, а метапневмовируса – не ниже 6,5 lg ТЦД50/см3.

6. В сравнительных экспериментах показано, что инактивированная эмульсионная вакцина против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц не уступает по иммуногенной активности зарубежному аналогу фирмы «Интервет» (Голландия).

7. В лабораторных и производственных условиях установлено, что инактивированная эмульсионная вакцина против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц безвредна и индуцирует у однократно привитых кур образование напряженного продолжительного иммунитета к обеим инфекциям в течение всего периода содержания птиц (18 мес.).

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 1. Для практического использования предлагается производственный вакцинный штамм «PV03-B №127 ДЕП» метапневмовируса птиц, который после изучения свойств был депонирован во Всероссийской государственной коллекции культур микроорганизмов ФГУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (справка о депонировании ФГУ «ВГНКИ» от 22.11.2006 г.).

2. Предложены, комиссионно проверены, одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ «ВНИИЗЖ» следующие методики:

- «Методика культивирования и титрования метапневмовируса птиц в перевиваемой культуре клеток Vero» (2006 г.);

- «Методика инактивации метапневмовируса птиц бета пропиолактоном» (2007 г.).

3. Результаты научных исследований по разработке технологии изготовления и контроля инактивированной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц и результаты лабораторных и производственных испытаний вошли в нормативную документацию на новый вакцинный препарат:

- «Стандарт организации на вакцину против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц (СТО 00495527-0094-2008)».

- «Промышленный регламент на производство вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц инактивированной эмульгированной» одобрен ученым советом и утвержден директором ФГУ «ВНИИЗЖ» (2008 г.).

- «Инструкция по применению вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц инактивированной эмульсионной» (2008 г).

5. СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Пневмовирусная инфекция птиц / И.А. Борисова, С.К. Старов // Тр.

Федерального центра охраны здоровья ж-ных. - Владимир, 2006. - Т.4. С. 281-296.

2. Обоснование выбора подтипа пневмовируса птиц в качестве антигена инактивированной вакцины / А.С. Пронин, Н.И. Герасимова, М.А. Волкова, З.Б.

Хлебовец, И.А. Борисова //Тр. Федерального центра охраны здоровья ж-ных. Владимир, 2006. - Т.4. – С. 323-328.

3. Антигенная активность экспериментальной инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни и пневмовирусной инфекции птиц/ И.А. Борисова // Вет. патология. - 2006. - №4 (19). С. 135-138.

4. Метапневмовирусная инфекция птиц: обзор литературы / О.А.

Борисова, И.А. Борисова // Владимир, 2007. - 80 с.

5. Выявление и типирование метапневмовирусов птиц в Российской Федерации / З.Б. Хлебовец, И.А. Борисова, А.С. Пронин, С.К. Старов, В.В.

Дрыгин // Тр. Федерального центра охраны здоровья ж-ных. - Владимир, 2007. Т.5. – С. 317-325.

6. Изучение иммунобиологических свойств эмульсионной инактивированной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц в производственных условиях / И.А.

Борисова, С.К. Старов, А.Б. Сарбасов // Вет. патология. - 2007. - №4 (23). - С.

137-141.

Отпечатано на полиграфической базе ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ «ВНИИЗЖ»). Тираж 90 экземпляров, май 2008 г.