Молекулярно-генетическое изучение наследственной несиндромальной сенсоневральной глухоты в республике саха (якутия)
На правах рукописи
БАРАШКОВ НИКОЛАЙ АЛЕКСЕЕВИЧ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ НАСЛЕДСТВЕННОЙ НЕСИНДРОМАЛЬНОЙ СЕНСОНЕВРАЛЬНОЙ ГЛУХОТЫ В РЕСПУБЛИКЕ САХА (ЯКУТИЯ) 03.00.15 – генетика
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Уфа – 2007 2
Работа выполнена в Якутском научном центре Российской Академии медицинских наук и Правительства Республики Саха (Якутия) и в Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской Академии наук доктор биологических наук, профессор
Научный консультант:
Хуснутдинова Эльза Камилевна доктор биологических наук, профессор
Официальные оппоненты:
Мустафина Ольга Евгеньевна доктор биологических наук, профессор Спицын Виктор Алексеевич Институт Общей генетики
Ведущая организация:
им. Н.И. Вавилова РАН
Защита состоится 31 мая 2007 г. в 14 00 часов на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002.133.01 при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, просп. Октября, д.71.
С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН, по адресу: 450054, Уфа, просп. Октября, 71 и на сайте Института биохимии и генетики: http://www.anrb.ru/molgen/dissov.html Автореферат разослан 28 апреля 2007г.
Ученый секретарь Регионального диссертационного совета, кандидат биологических наук Бикбулатова С.М.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Распространенность врожденной тугоухости и глухоты составляет 1 на 650-1000 новорожденных детей [Mehl et. al., 2002;
Chalestori et. al., 2007]. По данным ВОЗ, число людей с различными формами тугоухости и глухоты только в России около 13-20 млн. [Гинтер и соавт., 2002;
Зинченко и соавт., 2007]. Распространенность наследственной сенсоневральной тугоухости в Республике Саха (Якутия) составляет 6,2:105 [Тарская и соавт., 2004]. По опубликованным данным, наследственная сенсоневральная тугоухость является одним из пяти наиболее распространенных наследственных заболеваний в Республике Саха (Якутия) наряду с такими частыми моногенными болезнями, как спиноцеребеллярная атаксия 1 типа и миотоническая дистрофия Россолимо-Куршмана–Штейнерта-Баттена [Платонов, 2003;
Тарская и соавт., 2004;
Сухомясова, 2005].
Примерно 50-60% всех случаев врожденной глухоты имеют наследственные причины [Morton, 1991;
Willems, 2000]. Наиболее частая форма наследственной глухоты – несиндромальная сенсоневральная глухота (НСТ), характеризующаяся клиническим полиморфизмом и генетической гетерогенностью [Cryns et. al., 2005]. Среди всех идентифицированных генов наследственной глухоты наиболее значимыми являются гены белков коннексинов 26 (GJB2) и 30 (GJB6), вклад которых в развитие несиндромальных и некоторых синдромальных форм составляет от 4 до 80% [Morton, 2006;
Petersen et. al., 2006].
Трансмембранные белки, кодируемые генами GJB2 и GJB6, участвуют в образовании межклеточных контактов - коннексонов - в тканях внутреннего уха, которые ответственны за перенос малых молекул, и обеспечивают, в основном, циркуляцию K+ в улитке. При дефектах синтеза этих белков происходит нарушение гомеостаза эндолимфы, что приводит к отмиранию волосковых рецепторных клеток и развитию потери слуха по сенсоневральному типу [Kikuchi et. al., 1995].
Кроме генов белков–коннексинов, непосредственно участвующих в процессе звуковосприятия, рядом исследователей [Prezant et. al., 1993;
Estivill et.
al., 1998] показано, что некоторые мутации генов митохондриальной ДНК могут обусловливать «гиперчувствительность» к ототоксическим лекарственным препаратам и вызывать потерю слуха. Рибосомальная РНК в волосковых клетках - наиболее вероятная мишень для таких препаратов аминогликозидного ряда как канамицин, гентамицин, стрептомицин, мономицин и т.д., наравне с «естественной мишенью» данных антибиотиков – бактериальной рРНК.
Показано, что замена A1555G в гене 12SrRNA мтДНК делает митохондриальную рРНК человека похожей по структуре на бактериальную рРНК, вследствие чего она становится мишенью для данных лекарственных препаратов [Prezant et. al., 1993]. Поскольку применение антибиотиков из группы аминогликозидов широко распространено, изучение частоты мутации A1555G в гене 12SrRNA, и мутаций А7445G и Т7511С в гене tRNASER является актуальным для оценки риска возникновения сенсоневральной глухоты в семьях с отягощенным наследственным анамнезом.
Целью настоящего исследования является анализ генов коннексина (GJB2), коннексина 30 (GJB6), генов мтДНК 12SrRNA и tRNASER у больных наследственной несиндромальной сенсоневральной глухотой и в популяциях Республики Саха (Якутия).
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Провести поиск мутаций и полиморфных вариантов в генах GJB2 и GJB6 у больных несиндромальной глухотой из Республики Саха (Якутия).
2. Изучить частоту идентифицированных мутаций гена GJB2 в популяциях якутов и русских из Республики Саха (Якутия).
3. Провести анализ патогенетически значимых мутаций мтДНК - A7445G и T7511C в гене tRNASER, мутации A1555G в гене 12SrRNA у больных несиндромальной глухотой из Республики Саха (Якутия).
4. Оценить частоту мутации A1555G в гене 12SrRNA мтДНК в популяции якутов.
5. Разработать на основе полученных данных алгоритм ДНК-диагностики наследственной несиндромальной сенсоневральной глухоты в семьях высокого риска в Республике Саха (Якутия).
Научная новизна.
В настоящей работе впервые проведено молекулярно-генетическое изучение наследственной несиндромальной глухоты в Республике Саха (Якутия). Впервые получены данные о спектре и частоте мутаций в генах GJB2, GJB6, 12SrRNA и tRNASER у больных наследственной несиндромальной сенсоневральной глухотой в Республике Саха (Якутия). Оценен вклад мутаций 35delG, V37I гена GJB2 и мутации A1555G гена 12SrRNA в развитие несиндромальных форм глухоты в Якутии. Показана этническая неоднородность по спектру и частоте найденных мутаций гена GJB2 в исследованной выборке больных. Установлена частота носительства идентифицированных мутаций гена GJB2 в популяциях якутов и русских из РС(Я).
Практическая значимость.
Разработан алгоритм выявления носителей мутаций генов GJB2 и 12SrRNA и проведения ДНК-диагностики наследственной несиндромальной глухоты в семьях высоко риска, что является необходимой предпосылкой повышения эффективности медико-генетического консультирования и профилактики наследственной патологии в РС(Я). Результаты настоящего исследования внедрены и применяются в работе медико-генетической службы региона.
Положения, выносимые на защиту:
1. Спектр и частоты мутаций 35delG, 333-334delAA, 312-326del14, V37I, R127H, R98L и полиморфных вариантов V27I, E114G и M34T гена GJB2 у больных несиндромальной глухотой из РС(Я).
2. Идентификация мутации A1555G гена 12SrRNA мтДНК у пациентов с несиндромальной глухотой, якутов по этнической принадлежности, и частота мутации A1555G гена 12SrRNA в популяции якутов.
3. Неоднородность популяций русских и якутов по частоте гетерозиготного носительства мутации 35delG в гене GJB2.
4. Частота носительства мутации V37I в гене GJB2 в популяции якутов.
5. Алгоритм молекулярно-генетической диагностики наследственной несиндромальной сенсоневральной глухоты в Республике Саха (Якутия).
Апробация работы.
Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на республиканской научно-практической конференции «Теория и практика комплексной реабилитации детей с ограниченными возможностями здоровья» (Нерюнгри, 2005), на международной научно-практической конференции «Генетические аспекты патологии человека. Проблемы сохранения генофонда коренных народов Севера» (Якутск, 2005), на международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2006» (Москва 2006), межлабораторном семинаре Отдела молекулярной генетики Якутского научного центра Российской Академии медицинских наук и Правительства РС(Я), на 13 международном конгрессе «Приполярная медицина» (Новосибирск, 2006).
Публикации По теме диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 3 статьи.
Структура и объем работы.
Диссертационная работа изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 192 источника (45 - отечественных и 147 - иностранных).
Диссертация иллюстрирована 42 рисунками, 16 таблицами и дополнена приложением (7 стр.).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В качестве материала для данной работы были использованы пробы ДНК пациентов из 65 неродственных семей с диагнозом двухсторонняя сенсоневральная тугоухость III-IV степени, предположительно, наследственной этиологии, а также образцы ДНК членов их семей (всего 86 человек). Материал для исследования предоставлен медико-генетической консультацией РБ№1 НЦМ г. Якутска, Сурдологопедическим центром РБ№1-НЦМ г. Якутска из числа амбулаторных больных, а также получен в ходе выездов в Республиканские специализированные (коррекционные) школы-интернаты для глухих и слабослышащих детей. Все пациенты были осмотрены врачами сурдологами-оториноларингологами и генетиками. Всем больным были проведены тональные аудиометрические исследования по костному и воздушному проведению, в некоторых случаях, по показаниям, была проведена импедансометрия и РКТ (рентгеновская компьютерная томография) височных костей. В ходе исследования уточнялись данные об этнической принадлежности больных путем опроса и выяснения национальной принадлежности родителей.
Возраст пробандов варьировал от 4 до 22 лет. В 47 семьях выявлен аутосомно рецессивный тип наследования, в 4-х семьях - аутосомно-доминантный, а в семьях, в виду отсутствия генеалогической информации, тип наследования не установлен. По этническому составу больные распределились следующим образом: 59 якутов из 48 семей, 10 русских из 9 семей, 1 украинец, 3 ингуша из семьи, 1 эвенк, 1 эвен, 3 метиса - русский/якут из 2 семей, 1 метис (украинец/якут). В качестве материала для популяционно-генетического исследования были использованы образцы ДНК здоровых доноров, без признаков снижения слуха (N=120), из 2 этногеографических групп якутов (центральные и вилюйские якуты), этническая принадлежность которых учитывалась до третьего поколения. Для расчета частоты гетерозиготного носительства мутации 35delG использовались вышеперечисленные образцы ДНК, а также рандемичная выборка якутов (N=127) (этническая принадлежность которых не учитывалась до третьего поколения, а была установлена путем опроса обследованных) и контрольная популяция русских (N=53) из Банка ДНК ЯНЦ РАМН и Правительства РС (Я).
Методы исследования.
ДНК выделяли из периферической крови методом фенольно хлороформной экстракции [Mathew et. al., 1984]. Анализ мутации 35delG в гене GJB2 проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью праймеров предложенных ранее [Anichkina et. al., 2001]. Детекцию мутаций 167delT и 235delC гена GJB2 проводили методом ПЦР/ПДРФ с использованием эндонуклеаз рестрикции ApaI (235delC) и PstI (167delT). Скрининг мутации D(GJB6-D13S1830) в гене коннексина 30 (GJB6) выполнен с использованием двух последовательных ПЦР, охватывающих район делеции, с помощью праймеров позволяющих выявить breakpoints-junction фрагменты в 390 п.н. и 335 п.н., соответственно [Pallarez-Ruez et. al., 2002]. Скрининг мутаций А7445G и Т7511С в гене tRNASER проводили с помощью ПДРФ-анализа (XbaI и MboII, соответственно) [Reid et. al., 1997]. Детекцию мутаций A1555G в гене 12SrRNA проводили также с помощью ПДРФ-анализа (HaeIII) [Estivill et. al., 1998].
Результаты амплификации оценивались путем проведения вертикального электрофореза в полиакриламидных гелях с последующим окрашиванием в растворе бромистого этидия.
Исследование образцов ДНК на наличие мутаций и полиморфных вариантов в гене GJB2 проводили методом SSCP-анализа (Single Strand Conformation Polymorphism) [Orita et. al., 1989] с последующим определением последовательности нуклеотидов на автоматическом секвенаторе ABI Prism (Applied Biosystems).
Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета программ “STATISTICA 5.0” (StatSoft), программного обеспечения MS Office Excel 2003 (Microsoft). При попарном сравнении частот аллелей в популяционной выборке использовался двусторонний критерий Фишера Р (F2), а также критерий 2(Р) с поправкой Йетса на непрерывность.
Статистически значимыми считали различия частот аллелей при значении Р0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ На первом этапе исследований был проведен анализ наиболее часто регистрируемых в мире мутаций 235delC, 167delT и 35delG в гене коннексина 26 (GJB2) у больных несиндромальной сенсоневральной глухотой из РС(Я).
Учитывая этническую специфичность мутации 235delC гена GJB2 для многих популяций Азии, нами был проведен скрининг мутации 235delC в гене GJB (рис. 1) у больных несиндромальной глухотой из Республики Саха (Якутия).
272 п.н.
176 п.н.
96 п.н.
1 2 3 4 5 6 Рис. 1. Электрофореграмма детекции мутации 235delC в гене GJB2 с помощью ПДРФ–анализа. При наличии мутации 235delC теряется сайт рестрикции для эндонуклеазы Apa1. Дорожки 1,4-7 – пробы с генотипом norm/norm (1 сайт рестрикции для эндонуклеазы Аpa1), 2 - гетерозигота 235delC/norm, 3 - гомозигота 235delC/235delC1 (отсутствует сайт рестрикции).
Мутация 235delC не была зарегистрирована ни у одного индивида из изученной выборки больных, и, по-видимому, не является причиной потери слуха у больных несиндромальной сенсоневральной глухотой из РС(Я).
Мутация 167delT в гене GJB2, встречающаяся, в основном, в популяции евреев ашкенази, также не была идентифицирована ни у одного пациента из Республики Саха (Якутия).
У 15 пациентов была обнаружена делеция гуанина в 35 положении гена GJB2 (табл. 1). Частота мутации 35delG составила 11,5% в исследованной Секвенированные контроли (235delC/235delC и 235delC/norm), любезно предоставлены к.б.н., с.н.с. лаб. рекомбинационного и сегрегационного анализа НИИ Цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск), О.Л. Посух выборке больных. Полученный результат согласуется с литературными данными о высокой распространенности данной мутации в европейских и ее низкой частоте в азиатских популяциях [Rabionet et. al., 2000;
Хидиятова и соавт., 2002;
Mukherjee et. al., 2003;
Xiao et. al., 2004].
Таблица 1.
Этническая принадлежность пациентов с мутаций 35delG в гене GJB Генотип 35delG/35delG Генотип 35delG/normal Национальность (количество человек) (количество человек) Русский 3 (2 неродственных) 2 (2 неродственных) Украинец 1 Якут - 2 (2 неродственных) Ингуш 3 (1 неродственный) Русский/Якут - 3 (2 неродственных) Украинец/Якут - Примечание: генотип 35delG/35delG – гомозиготы, генотип 35delG/normal – гетерозиготы.
У 7 пациентов, на обеих хромосомах которых была выявлена мутация 35delG, причину снижения слуха можно считать установленной. Данные пациенты полностью информативны для ДНК-диагностики. В этих семьях возможна как дифференциальная диагностика для установления наследственной этиологии заболевания, так и проспективное медико генетическое консультирование, включающее возможность проведения пренатальной (дородовой) ДНК-диагностики.
Мутация 35delG выявлена у 8 пациентов в гетерозиготном состоянии.
Обнаруженная мутация 35delG только в одной копии гена не раскрывает причины развития тугоухости у данных пациентов, т.к. мутантный аллель рецессивен по отношению к аллели дикого типа. Такое количество гетерозиготных носителей делеции 35delG и наличие у них потери слуха может указывать на сегрегацию различных по происхождению мутантных аллелей у исследованных нами больных, что, вероятно, является следствием ассортативности браков между индивидами с нарушением слуха.
Поиск мутаций в гене коннексина 26 (GJB2) у больных наследственной несиндромальной сенсоневральной глухотой из Республики Саха (Якутия) На втором этапе исследований с помощью SSCP-анализа с последующим секвенированием образцов с измененной подвижностью был проведен анализ всей кодирующей области гена GJB2 в выборке больных из РС(Я).
Молекулярно-генетический анализ позволил идентифицировать 5 мутаций V37I, R127H, R98L, 333-334delAA, 312-326del14 и 3 полиморфных варианта V27I, E114G, M34T в гене GJB2.
Мутация V37I в гене GJB2 была идентифицирована в гомозиготном состоянии у одного пациента, якута по этнической принадлежности (рис. 2).
При данной мутации в 109 положении гуанин заменяется на аденин, что приводит к замене аминокислоты валин на изолейцин в 37 положении.
А Б 1 2 3 В Г Рис. 2. A) Фрагмент родословной семьи с мутацией V37I (109GA) в гене GJB у пробанда (III-12) в гомозиготном состоянии и его матери (II-2) в гетерозиготном состоянии. Б) Электрофореграмма SSCP-анализа фрагмента гена GJB2. Дорожки 1 (V37I/V37I), 4 (V37I/normal) - образцы с измененной подвижностью;
дорожки 2, 3 - с нормальной подвижностью. B) Фрагмент сиквенса образца с генотипом V37I/V37I (А.III-12). Г) Фрагмент сиквенса образца с генотипом V37I/normal (А.II-2).
У пациента с генотипом V37I/V37I степень снижения слуха, по данным пороговой тональной аудиометрии, составила AD=78dB, AS=91dB, что соответствует IV степени смешанной тугоухости. При этом сенсоневральный компонент по оценке костной проводимости соответствует I-II степени тугоухости. Глубокая степень потери слуха объясняется кондуктивным компонентом, обусловленным сопутствующей патологией. В частности, у данного индивида отмечаются аномалии развития наружного и среднего уха.
Полученный результат согласуется с литературными данными о клиническом эффекте мутации V37I, которая описывается как причина тугоухости I–II степени [Cryns et. al., 2004].
Частота V37I в общей выборке больных составила 1,51%, среди пациентов якутов - 2%. Низкая частота мутации V37I среди больных несиндромальной глухотой из Якутии, вероятно, объясняется особенностями выборки. Группа пациентов была сформирована из лиц с врожденной тугоухостью тяжелой степени (III-IV), а как показали недавние исследования [Snoeckх et. al., 2005], мутация V37I описывается как причина тугоухости I–II степени.
В гене GJB2 были выявлены две делеции - 333-334delAA и 312-326del14 у двух пациентов. Больной с генотипом 333-334delAA/normal – русский по этнической принадлежности, а пациент с генотипом 312-326del14/normal – метис (русский/якут). Обе мутации являются причиной сдвига рамки считывания, вызывая образование преждевременного стоп-кодона, терминирующего трансляцию белка во внутриклеточном домене - IC1. Впервые мутации 333-334delAA и 312-326del14 были описаны в конце 90-х годов как рецессивные [Kelley et. al., 1998;
Denoyelle et. al., 1999]. Идентификация этих двух мутаций в гетерозиготном состоянии и наличие выраженной потери слуха у данных пациентов может свидетельствовать о наличии у них пока еще не идентифицированных мутаций в генах других коннексинов, экспрессирующихся в тканях улитки.
У одного пробанда, якута по этнической принадлежности, была идентифицирована замена гуанина на аденин в 380 положении гена GJB2, которая ведет к замене аминокислоты аргинин на гистидин в 127 положении белка коннексина 26 (рис. 3А). Мутация 293GT, обнаруженная нами впервые при секвенировании (рис. 3Б), вызывает замену аргинина на лейцин в положении белка коннексина 26 (R98L). Мутация R98L расположена в интрацеллюлярной части коннексина 26. Обе аминокислоты, аргинин и лейцин, имеют различную структуру: аргинин является аминокислотой с катионообразующей группой в боковой цепи, а лейцин относится к алифатическим аминокислотам. Замена аргинина на лейцин, возможно, влияет на конформационную структуру белка и изменяет функцию коннексина 26, а также приводит к образованию неполноценной субъединицы калиевого канала.
Наше предположение также подтверждает тот факт, что данная мутация находится у больного в компаунд-гетерозиготном состоянии с мутацией R127H. Наличие двух мутаций в компаунд-гетерозиготном состоянии в гене GJB2 подтверждает высказанное нами раннее предположение [Барашков и соавт., 2006] о сегрегации различных по происхождению мутантных аллелей у исследованных нами больных. Вероятно, это является следствием ассортативности браков между слабослышащими и глухими в Республике Саха (Якутия).
А Б Рис. 3. Фрагмент сиквенса гена GJB2, содержащего мутации в гетерозиготном состоянии: А) 380GA (R127H) Б) 293GT (R98L) На хромосомах больных несиндромальной глухотой из Республики Саха (Якутия) в гене GJB2 были выявлены 3 различные замены известные как полиморфные варианты - M34T (101ТС), V27I (79GA) и E114G (341AG). На сегодняшний день, патогенетическая значимость данных нуклеотидных замен рядом авторов трактуется неоднозначно и носит дискуссионный характер [Rabionet et. al., 2000;
Roux et. al., 2004;
Snoeckx et. al., 2005;
Bicego et. al., 2006].
Полиморфный вариант M34T (101ТС) в гене GJB2 впервые был описан как доминантная мутация [Kelley et. al., 1998]. Данное изменение приводит к замене полярной аминокислоты метионин на гетероциклическую - триптофан в трансмембранном домене (ТM-1) белка коннексина 26.
У одного индивида из выборки больных, якута по этнической принадлежности, была идентифицирована замена M34T в гетерозиготном состоянии (рис. 4), а у другого пациента, метиса (украинец/якут), в компаунд гетерозиготном состоянии с мутацией 35delG в гене GJB2.
Б А 1 2 Рис. 4. Электрофореграмма SSCP–анализа и фрагмент сиквенса гена GJB2, содержащего полиморфный вариант М34T в гетерозиготном состоянии. А) Дорожка 2 - образец с измененной подвижностью (M34T), 1, 3 - образцы без изменения подвижности;
Б) фрагмент сиквенса GJB2, содержащего замену 101ТС (M34T) в гетерозиготном состоянии.
Идентификация полиморфизма M34T в компаунд-гетерозиготном состоянии с мутацией 35delG в гене GJB2 в выборке больных свидетельствует о функциональной значимости M34T. Частота данного полиморфного варианта среди пациентов, якутов по этнической принадлежности, составила 1,04%. Из литературы известно, что полиморфный вариант M34T гена GJB2 встречается как среди больных наследственной глухотой, так и в популяциях Европы (например, частота данной замены во Франции - 2,3%) [Roux et. al, 2004].
На официальном сайте The Connexin–Deafness Homepage (http://davinci.crg.es/deafness/) полиморфные варианты V27I и E114G, образующие группу сцепления и находящиеся в цис-положении на одной хромосоме, описаны как рецессивная мутация. Среди больных сенсоневральной глухотой японцев, корейцев, алтайцев обнаруживается данная группа сцепления двух полиморфизмов, что может косвенно указывать на их патогенетическую значимость [Pandya et. al., 2001;
Posukh et. al., 2005]. На хромосомах больных несиндромальной глухотой, якутов по этнической принадлежности, полиморфизм V27I выявлен с частотой 6%. Однако, полиморфный вариант E114G (341AG) был идентифицирован лишь у пациента в сочетании с заменой V27I (79GA). Следовательно, наличие двух полиморфизмов может указывать на их сочетанное патологическое действие у данного больного. Учитывая достаточно высокую частоту полиморфного варианта V27I (6%) и низкую частоту E144G (1,04%) в выборке больных якутов, можно сделать вывод о том, что в изученной выборке больных вклад полиморфизмов V27I и E114G, образующих группу сцепления, незначителен.
Скрининг делеции D(GJB6-D13S1830) в гене коннексина 30 (GJB6) у больных с наследственной глухотой из Республики Саха (Якутия) Рядом авторов [Sosinsky et. al., 1995;
White et. al., 1998] показана широкая экспрессия коннексина 30 (GJB6) в органе Корти, а также его участие наравне с коннексином 26, в сборке гетерологичных коннексонов в тканях внутреннего уха. В связи с этим, нами был проведен скрининг на наличие делеции D(GJB6 D13S1830) в гене GJB6 среди больных из РС(Я). Результаты исследований показали, что делеция D(GJB6-D13S1830), захватывающая большую часть гена GJB6, выявленная ранее в некоторых популяциях в ассоциации (или без) с мутациями в гене GJB2, не была зарегистрирована ни у одного пациента из РС (Я). Отсутствие данной мутации в гене GJB6 у больных несиндромальной сенсоневральной глухотой якутов, не противоречит литературным данным о специфичности данной мутации для европейских популяций [Pallarez-Ruez et.
al., 2002;
del Castillo et. al., 2003;
Roux et. al., 2004].
Анализ мутаций А7445G и Т7511С в гене tRNASER и A1555G в гене 12SrRNA мтДНК у больных несиндромальной сенсоневральной глухотой из Республики Саха (Якутия) и в популяции якутов Мутации А7445G и Т7511С в гене tRNASER не были выявлены ни у одного индивида из выборки больных с наследственной глухотой из РС(Я). В гене 12SrRNA у двух пациентов из одной семьи, у матери и дочери метисного происхождения, идентифицирована мутация A1555G (рис. 5), которая впервые была описана в 1993 году [Prezant et. al., 1993].
А В Б 1 2 3 4 5 6 7 8 Рис. 5. Идентификация мутации A1555G в гене 12SrRNA в семье К.
А) Фрагмент родословной данной семьи К. Б) ПДРФ–анализ мутации A1555G в гене 12SrRNA (HaeIII). Дорожки 4 (А.III-7), 5 (А.II-4) - образцы с мутацией A1555G, 6 – маркер молекулярного веса, 1-3, 7-9 образцы без мутации. В) фрагмент сиквенса гена 12SrRNA содержащего мутацию A1555G Все потомки этой семьи, вероятно, получили данную мутацию от бабушки пробанда, якутки по этнической принадлежности. Судя по данным анамнеза, оба индивида - мать и дочь (рис. 5), у которых была обнаружена мутация A1555G – глухие, общаются с помощью языка жестов. У пробанда двухсторонняя сенсоневральная глухота считается врожденной. Тем не менее, в истории болезни имеются сведения о перенесенной пневмонии, что предполагает возможность терапии антибиотиками из группы аминогликозидов в раннем детском возрасте. Степень снижения слуха, по данным пороговой тональной аудиометрии, регистрировалась как IV (AS 104dB, AD 109dB). У матери пробанда резкое снижение слуха началось в 7 лет, после лечения антибиотиками (возможно, из группы аминогликозидов), родной сибс матери также глухой. Однако, у бабушки пробанда (рис. 5) слух нормальный. Данное обстоятельство, возможно, объясняется недостаточным количеством мутантных копий в клетках внутреннего уха для развития заболевания, т.е.
состоянием гетероплазмии. Частота данной мутации в общей выборке больных составила 1,5%, среди пациентов якутов – 2,08%, в популяции якутов - 0,8%.
Алгоритм молекулярно-генетической диагностики наследственной несиндромальной сенсоневральной глухоты в Республике Саха (Якутия) В результате проведенного молекулярно-генетического анализа идентифицировано 6 мутаций и 3 полиморфных варианта в гене GJB2 и мутация A1555G в гене 12SrRNA мтДНК. Спектр и частота данных мутаций имеют выраженную этническую неоднородность. Мутации 35delG, 333 334delAA и 312-326del14 в гене GJB2 выявлены преимущественно у больных европеоидного происхождения (рис. 8). Наиболее распространенной мутацией, идентифицированной на 42% хромосом пациентов русской, ингушской, украинской этнической принадлежности, оказалась мутация 35delG, что соответствует литературным данным о высокой частоте встречаемости данной делеции среди европеоидных популяций [Rabionet et. al., 2000;
Джемилева и соавт., 2006]. Высокая частота мутации 35delG у больных европеоидного происхождения в РС(Я) предполагает возможность проведения прямой ДНК– диагностики, а также проведения скрининга наследственных форм глухоты среди широких групп населения. Учитывая этнический состав населения РС(Я), где примерно 50% жителей являются европеоидами, можно отметить, что ДНК тестирование на данную мутацию является обоснованным и необходимым условием при проведении дифференциальной и пренатальной ДНК– диагностики наследственной несиндромальной глухоты в Якутии.
Среди больных, якутов по этнической принадлежности, были идентифицированы мутации V37I, R127H, 35delG и ранее не описанная - R98L в гене GJB2 (рис. 7). Небольшой вклад мутаций гена GJB2 в развитие несиндромальной глухоты у якутов, возможно, связан с наличием мутаций в других генах, участвующих в процессе звуковосприятия. Следует отметить, что низкий вклад мутаций гена GJB2 был отмечен при изучении больных несиндромальной глухотой алтайцев (не более 10%) [Posukh et. al., 2005].
Однако спектр мутаций гена GJB2 отличен - так, например, у якутов не обнаружено мутации 235delC, а у алтайцев - V37I. Кроме того, с небольшой частотой (2%) у якутов регистрируется мутация 35delG, не обнаруженная на хромосомах больных, алтайцев по этнической принадлежности, что, возможно, связано с более интенсивными процессами метисации среди глухих и слабослышащих в РС(Я). Общий спектр мутаций представлен на рисунке 6. На основании изученных спектра и частоты мутаций генов GJB2 и 12SrRNA разработан алгоритм молекулярной диагностики наследственной несиндромальной сенсоневральной глухоты в РС(Я) (рис. 9).
Рис. 6. Спектр и частота мутаций генов GJB2 и 12SrRNA в общей выборке больных наследственной несиндромальной сенсоневральной глухотой из РС(Я) (N=130 хромосом).
Рис. 7. Спектр и частота мутаций генов GJB2 и 12SrRNA Рис. 8. Спектр и частота мутаций гена GJB у больных наследственной несиндромальной у больных европеоидного происхождения глухотой якутов (N=96 хромосом). (русские, украинцы, ингуши) (N=24 хромосомы).
Проведение SSCP анализа и/или Анализ мутации 35delG гена GJB рестрикционного анализа кодирующего региона гена GJB2 на наличие других мутаций 100% Частичная и полная Информа- неинформативность Обнару Обнаружение 312- 235delC, тивность (при наличии -жение 326del14, 333- 167delT генотипа del35G/N и V37I, R98L 334delAA нарушениях процесса R127H звуковосприятия) 100% информа тивность Частичная и полная неинформативность (35delG, 167delT, 235delC, V37I, 312 326del14, 333-334delAA, R127H, R98L) – не обнаружены Анализ мутации A1555G в гене 12SrRNA мтДНК Рис. 9. Алгоритм ДНК-диагностики наследственной несиндромальной сенсоневральной глухоты в Республике Саха (Якутия).
Исследование частоты мутаций гена коннексина 26 (GJB2) в популяциях РС(Я) Молекулярно-генетический анализ мутации 35delG в гене GJB2 в популяции якутов показал наличие данной мутации с очень низкой частотой (0,2%), что, вероятно, свидетельствует, во-первых, о неспецифичности данной делеции для якутской популяции, а во-вторых, является следствием единичных случаев метисации. Частота мутации 35delG среди популяции русских РС(Я) составила 2,8%, что близко к таковым значениям в популяциях Европы. Таким образом, в РС(Я) риск развития несиндромальной аутосомно-рецессивной сенсоневральной глухоты, обусловленной мутацией 35delG, наиболее высок среди русских, у которых частота мутации составила 2,8%. Среди якутов частота 35delG оказалось очень низкой и риск «гомозиготации» этой патологической мутации на популяционном уровне можно считать невысоким, особенно, при отсутствии кровнородственных браков.
Мутации 167delT и 235delC в гене GJB2 не были обнаружены ни у одного индивида из популяции якутов и русских, проживающих на территории РС(Я).
Однако наибольший интерес вызывает тот факт, что, по полученным данным, мутация 235delC, встречающаяся, в основном, в популяциях Азии [Yan et. al., 2003], не была обнаружена у больных и в популяции якутов (рис. 10).
0, 167delT 235delC 35delG 0, 0,12 V37I M34T V27I 0, 0, 0, 0, 0, Якуты Русские Алтайцы Китайцы Французы РС(Я) Рис. 10. Частота мутаций гена GJB2 в некоторых популяциях.
Мутация V37I в гене GJB2 наиболее распространена в монголоидных популяциях и регистрируется с высокой частотой в Китае, Тайване, Японии, гораздо реже встречается в Европе, Турции и на Ближнем Востоке [Ohtsuka et.
al., 2003;
Roux et. al., 2004]. Мировой максимум частоты V37I отмечен в Китае 15% [Xiao et. al., 2004]. На сегодняшний день показана неоднородность встречаемости данной мутации в различных популяциях Азии. Так, мутация V37I не зарегистрирована у алтайцев, корейцев и индийцев [Park et. al., 2000;
Posukh et. al., 2005;
Ramchander et. al., 2005]. Частота мутации V37I в популяции якутов составила 2%. Частота полиморфных вариантов - V27I и M34T гена GJB2 в популяции якутов составила 5,4% и 0,4%, соответственно, что согласуется с литературными данными о специфичности V27I для многих азиатских популяций [Abe et. al., 2002;
Wang et. al., 2002;
Xiao et. al., 2004].
Низкая частота полиморфного варианта M34T у якутов объяснятся тем, что данный аллельный вариант встречается, в основном, в популяциях Европы.
ВЫВОДЫ 1. В гене коннексина 26 (GJB2) у больных наследственной несиндромальной сенсоневральной глухотой из Республики Саха (Якутия) обнаружены мутаций - 35delG (11,5%), V37I (1,5%), 333-334delAA (0,75%), 312-326del (0,75%), R127H (0,75%), R98L (0,75%) и 3 полиморфных варианта - V27I (4,6%), E114G (0,75%), M34T (1,5%). Мутация R98L обнаружена впервые.
2. Мутации V37I, R127H, R98L выявлены только у больных - якутов, мутации 35delG, 333-334delAA, 312-326del14 – преимущественно у больных европеоидного происхождения.
3. Скрининг делеции D(GJB6-D13S1830) в гене коннексина 30 (GJB6), мутаций A7445G и T7511C в гене tRNASER мтДНК у больных наследственной несиндромальной сенсоневральной глухотой не обнаружил данных изменений ни у одного пациента из Республики Саха (Якутия).
4. В гене 12SrRNA мтДНК у больных наследственной несиндромальной сенсоневральной глухотой из Республики Саха (Якутия) идентифицирована мутация A1555G с частотой 1,5% в общей выборке больных и с частотой 2% среди больных, якутов по этнической принадлежности, в популяции якутов частота A1555G составила 0,8%.
5. Частота мутации 35delG в гене коннексина 26 (GJB2) в популяции русских составила 2,8%, в популяции якутов – 0,2%.
6. Частота мутации V37I в гене коннексина 26 (GJB2) в популяции якутов составила 2%.
7. Разработан алгоритм молекулярно-генетической диагностики наследственной несиндромальной сенсоневральной глухоты в семьях высокого риска из Республики Саха (Якутия).
Работы, опубликованные по теме диссертации 1. Барашков Н.А., Кононова С.К., Федорова С.А., Максимова Н.Р., Сухомясова А.Л., Ноговицына А.Н., Джемилева Л.У., Валиев Р.Р., Хуснутдинова Э.К.
Апробация методов ДНК-диагностики при наследственной тугоухости в Республике Саха (Якутия) // Материалы международной научно - практической конференции «Генетические аспекты патологии человека. Проблемы сохранения генофонда коренных народов Севера».- Якутск - 2005. - С. 11-13.
2. Барашков Н.А., Федорова С.А., Кононова С.К., Сухомясова А.Л., Максимова Н.Р., Ноговицына А.Н., Джемилева Л.У., Хуснутдинова Э.К.
Внедрение идентификации мутации 35delG в гене GJB2 при наследственных формах тугоухости/глухоты в практику медико-генетического консультирования Республики Саха (Якутия) // Якутский медицинский журнал.
Приложение № 3. – 2005. - С. 90-93.
3. Барашков Н.А., Терютин Ф.М., Сухомясова А.Л., Максимова Н.Р., Джемилева Л.У., Гуринова Е.Е., Федотова Э.Е., Тапыев Е.В., Валиев Р.Р., Кононова С.К., Федорова С.А., Хуснутдинова Э.К., Ноговицына А.Н. Анализ локуса CХ26AU гена GJB2 у больных наследственной нейросенсорной тугоухостью и глухотой из Республики Саха (Якутия) // Якутский медицинский журнал. – 2006. Т.2. - №14. – С. 11-15.
4. Барашков Н.А., Кононова С.К., Федотова Э.Е., Максимова Н.Р., Сухомясова А.Л., Джемилева Л.У., Николаев В.М., Федорова С.А., Хуснутдинова Э.К., Ноговицына А.Н. Анализ распространенности мутации 35delG гена GJB2 у пациентов с нейросенсорной тугоухостью в Якутии // Материалы научно практической конференции с международным участием «Теория и практика комплексной реабилитации детей с ограниченными возможностями здоровья» Нерюнгри. - 2006.- С. 101-104.
5. Барашков Н.А., Кононова С.К., Максимова Н.Р., Терютин Ф.М., Сухомясова А.Л., Федотова Э.Е., Николаев В.М., Джемилева Л.У., Федорова С.А., Хуснутдинова Э.К., Ноговицына А.Н. Идентификация мутации 35delG в гене GJB2 у больных нейросенсорной тугоухостью в Республике Саха (Якутия) // Наука и образование – 2006. - Т.42. - №.2. С. 129-133.
6. Барашков Н.А., Терютин Ф.М., Сухомясова А.Л., Максимова Н.Р., Джемилева Л.У., Гуринова Е.Е., Тапыев Е.В., Кононова С.К., Федорова С.А., Хуснутдинова Э.К., Ноговицына А.Н. Распространенность мутации 35delG в гене GJB2 у больных нейросенсорной тугоухостью в Республике Саха (Якутия) // Бюллетень Сибирского отделения РАМН – 2006. Приложение. С.19.
7. Барашков Н.А., Максимова Н.Р., Сухомясова А.Л., Терютин Ф.М., Джемилева Л.У. Молекулярно-генетический анализ локуса CX26AU гена GJB у больных наследственной нейросенсорной тугоухостью и глухотой из Республики Саха (Якутия) // Материалы международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2006».- Москва: Секция «фундаментальная медицина». - 2006.- С.548-550.