Молекулярно-генетическое изучение наследственной предрасположенности к развитию хронического алкоголизма в популяциях якутов и эвенков республики саха (якутия)

На правах рукописи

КУЛИЧКИН СТЕПАН СТЕПАНОВИЧ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ НАСЛЕДСТВЕННОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К РАЗВИТИЮ ХРОНИЧЕСКОГО АЛКОГОЛИЗМА В ПОПУЛЯЦИЯХ ЯКУТОВ И ЭВЕНКОВ РЕСПУБЛИКИ САХА (ЯКУТИЯ) 03.00.15- генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа-2009 2

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики человека Учреждения Российской академии наук Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН и в лаборатории молекулярной генетики Отдела молекулярной генетики Учреждения Российской академии медицинских наук Якутский научный центр комплексных медицинских проблем СО РАМН.

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Хуснутдинова Эльза Камилевна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Викторова Татьяна Викторовна ГОУ ВПО Башкирский государственный медицинский университет доктор биологических наук, профессор Спицын Виктор Алексеевич ГУ Медико-генетический научный центр РАМН

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН

Защита диссертации состоится «_» декабря 2009 г. в «_» часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.133.01 при Учреждении Российской академии наук Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, просп. Октября, 71.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН, по адресу: 450054, Уфа, просп. Октября, 71 и на сайте Учреждения Российской академии наук Институт биохимии и генетики:

www.ibg.anrb.ru/dissov.html, e-mail: [email protected]

Автореферат разослан «» ноября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Бикбулатова С.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Согласно мировой статистике аддиктивные расстройства входят в первую десятку причин смертности и представляют важную социальную проблему в большинстве стран мира. Алкоголизм – это вызванное злоупотреблением спиртными напитками хроническое психическое заболевание, характеризующееся патологическим влечением к алкоголю и связанными с ним физическими и психическими последствиями алкогольной интоксикации [Альтшуллер, 1999].

Алкогольная ситуация в Республике Саха (Якутия), как и в целом по России, за последние годы стала чрезвычайной. Показатель распространенности хронического алкоголизма (ХА) в РС(Я) за 2008 год составил 1884,7 на 100 тысяч населения, что на 8,5% ниже показателя по Дальневосточному федеральному округу (2055,9 на 100 тысяч населения по итогам 2008 года), но выше на 20,3% показателя по Российской Федерации (1566,3 на 100 тысяч населения за аналогичный период времени) [Белолюбская, 2009]. Таким образом, по данным официальной статистики к 1 января 2009 года у врача-нарколога наблюдались 23565 человек, имеющих болезненное пристрастие к алкоголю, что составляет 2,5% всего населения республики.

В основе формирования данной патологии, наряду с социальными, важную роль играют и генетические факторы, которые отражают индивидуальные особенности деятельности нейромедиаторных систем и ферментов метаболизма алкоголя Особая роль [Tyndale, 2003;

Goldman, 2005;

Hiroi, 2005].

наследственности в формировании ХА состоит в возникновении компенсаторных механизмов, обеспечивающих нормальное функционирование нейромедиаторных систем при длительном влиянии алкоголя на организм.

Наиболее плодотворным подходом к исследованию наследственной предрасположенности к ХА является изучение ассоциаций между полиморфными локусами генов-кандидатов и заболеванием с учетом этнической принадлежности исследованных индивидов [Bishop et al., 2000]. Якуты и эвенки из РС(Я) представляют особый интерес в плане анализа ассоциаций в связи с низким уровнем генетических различий между их субпопуляциями, то есть большей гомогенностью по сравнению с остальными европейскими и азиатскими популяциями, как было показано в многочисленных исследованиях мтДНК, Y хромосомы и некоторых аутосомных микросателлитных локусов [Федорова, 2005;

2008].

В РC(Я) молекулярно-генетическое изучение алкоголизма ранее не проводилось и выявление полиморфных вариантов генов-кандидатов, наиболее значимых в развитии заболевания, представляет собой актуальную задачу, как для фундаментальной науки, так и практической медицины.

Цель исследования - анализ роли полиморфных вариантов генов-кандидатов в развитии хронического алкоголизма в популяциях якутов и эвенков из Республики Саха (Якутия).

Задачи исследования:

1. У больных ХА и в контрольных группах якутской и эвенкийской этнической принадлежности из Республики Саха (Якутия) провести анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов:

- рецептора D2 дофамина (32806СT и 939TC), - рецептора D3 дофамина (25GA), - рецептора D4 дофамина (VNTR и -616CG), - переносчика дофамина (VNTR и 2319GA), - рецептора 2А серотонина (-1438AG), - рецептора 1В серотонина (861GC), - переносчика серотонина (5HTT LPR и rs25531 AG), - моноаминоксидазы А (MAOA LPR и 1460CT), - моноаминоксидазы В (rs1799836 AG), - алкогольдегидрогеназы 1В (143AG).

2. Провести анализ ассоциаций 15 полиморфных маркеров генов-кандидатов с риском развития ХА в популяциях якутов и эвенков из Республики Саха (Якутия).

3. Провести анализ гаплотипов гена D2 рецептора дофамина, DRD2 (32806СT и 939TC);

D4 рецептора дофамина, DRD4 (VNTR и -616CG);

гена переносчика дофамина SLC6A3 (VNTR и 2319GA);

гена моноаминоксидазы А МАОА (MAOA LPR и 1460CT) и оценить их роль в формировании хронического алкоголизма у якутов и в объединенной выборке из Республики Саха (Якутия).

4. Провести анализ межгенных взаимодействий полиморфных вариантов генов нейромедиаторных систем и фермента метаболизма алкоголя в развитии хронического алкоголизма в популяциях якутов и эвенков из Республики Саха (Якутия).

Научная новизна исследования. Впервые в РС(Я) собрана коллекция ДНК больных хроническим алкоголизмом. В популяциях якутов и эвенков впервые охарактеризованы частоты генотипов и аллелей полиморфных вариантов генов DRD2, DRD3, DRD4, SLC6A3, HTR2A, HTR1B, 5HTT, MAOA, MAOB, ADH1B и проведен анализ ассоциаций с риском развития ХА. Показано, что полиморфные варианты генов DRD2, DRD4, HTR1B, MAOA, ADH1B и SLC6A3 участвуют в формировании генетической предрасположенности к ХА в исследованных коренных этносах РС(Я).

Научно-практическая значимость работы. Полученные данные представляют интерес для понимания молекулярно-генетических механизмов формирования ХА в двух наиболее многочисленных коренных этносах Якутии – якутов и эвенков. На основе полученных данных можно предложить новые направления в разработке методов лечения, диагностики и формирования групп риска данной патологии. Полученная информация может быть использована в области генетической эпидемиологии, в популяционной и эволюционной генетике для углубленного описания генофонда народонаселения Якутии. Результаты исследования могут быть использованы в преподавании спецкурсов по медицинской генетике на медицинских и биологических факультетах, на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Апробация работы. Основные результаты научно-исследовательской работы были представлены на второй Всероссийской конференции с международным участием «Актуальные проблемы биологической психиатрии и наркологии» (Томск, 2008), на республиканском семинаре «Актуальные проблемы женского алкоголизма. Вопросы профилактики и медико-социальная реабилитация» на научно-практической конференции с (Якутск, 2009), международным участием «Актуальные проблемы медицинской генетики на Крайнем Севере» (Якутск, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, из них статьи – в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и их обсуждение, заключение, выводы, список литературы. Работа иллюстрирована рисунками и 40 таблицами. Список литературы включает 396 источников, из них 326 – на иностранном.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования Материалы исследования. В исследование были включены 106 якутов и эвенков (мужчины и женщины, средний возраст: 43,4±13,4) с диагнозом ХА II стадии, находившиеся на стационарном лечении в ГУ «ЯРНД» с 2000 по годы. Диагноз был поставлен в соответствии с Международной классификацией болезней десятого пересмотра (МКБ-10, 1994).

Контрольную группу составили 109 якутов и 47 эвенков, сопоставимые по полу и возрасту группе больных, не состоявшие на учете у психиатра, нарколога и отрицавшие злоупотребление алкоголем. Этническую принадлежность определяли путем опроса, преимущественно до 3-го поколения.

Методы исследования. ДНК была выделена из лимфоцитов периферической венозной крови стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции [Mathew, 1984]. Анализ полиморфных ДНК-локусов в генах DRD2, DRD3, DRD4, SLC6A3, HTR2A, HTR1B, 5HTT, MAOA, MAOB и ADH1B осуществляли методом ПЦР синтеза ДНК и ПДРФ-анализа. Продукты амплификации анализировались электрофоретически в 7% полиакриламидном геле после окрашивания геля бромистым этидием с последующей визуализацией ДНК в ультрафиолетовом свете.

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета программ “Statistica for Windows 5.0” (StatSoft), программного обеспечения MS Excel XP (Microsoft) и компьютерных программ “GENEPOP” и “RxC” (Rows x Columns). При попарном сравнении частот аллелей и генотипов в группах больных и контроля использовался критерий c2 (р) для таблиц сопряженности 2x2 с поправкой Иэйтса на непрерывность. Силу ассоциаций оценивали в значениях показателя соотношения шансов Odds Ratio (OR) [Schlesselman et al., 1982]. Для оценки неравновесия по сцеплению между двумя полиморфными маркерами были использованы программы 2LD и [http://www.iop.kcl.ac.uk/IoP/Departments/PsychMed/GEpiBSt/software.shtml] EMLD [http://epi.mdanderson.org/~qhuang/Software/pub.htm]. Анализ межгенных взаимодействий проводился с помощью программы GMDR (Generalized Multifactor-Dimensionality Reduction) [Lou et al., 2007;

http://www.healthsystem.virginia.edu/internet/addiction-genomics/Software/].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ В результате анализа полиморфных вариантов генов DRD2, DRD3, DRD4, SLC6A3, HTR2A, HTR1B, 5HTT, MAOA, MAOB и ADH1B достоверные различия между популяциями якутов и эвенков обнаружены по распределению частот генотипов и аллелей полиморфных маркеров 25GA (BalI) гена DRD3 и 5HTTLPR гена 5HTT, что позволило провести сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов остальных полиморфных локусов между объединенными группами больных ХА и контроля из РС(Я).

Анализ ассоциаций полиморфных маркеров 32806СT и 939TC гена DRD c хроническим алкоголизмом в РС(Я) Результаты ряда исследований свидетельствуют о том, что алкоголь может стимулировать дофаминергические нейроны в вентральной области покрышки головного мозга человека [Brodie et al., 2002], приводя к уменьшению плотности дофаминовых рецепторов в лимбической системе у индивидов, употребляющих алкоголь на постоянной основе [McBride et al., 1993;

Stefanni et al., 1992;

Hietala et al. 1994]. Группа ученых обнаружила ассоциацию аллеля DRD2*C полиморфного локуса 32806СT (Taq1A) в гене DRD2 с уменьшенной дофаминергической активностью [Jonsson et al., 1999;

Ritchie and Noble, 2003]. Синонимичная замена 939СТ (NcoI) в гене DRD2, возможно, вовлечена в изменение экспрессии гена посредством вариации структуры кодируемого им белка [Akashi et al., 2001].

Проведенный сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного варианта 32806СT гена DRD2 у больных ХА и индивидов контрольных групп якутской и эвенкийской этнической принадлежности из РС(Я) не выявил ассоциации данного локуса с ХА.

В результате молекулярно-генетических исследований полиморфного маркера 939СТ гена DRD2 установлены статистически значимые различия в распределении частот аллелей между больными и контрольной группой – якутов по этнической принадлежности (2=3,90;

Р=0,048), связанные с увеличением частоты аллеля DRD2*С у больных (34,85%), тогда как аллель DRD2*T достоверно чаще встречался в контрольной группе (74,54% против 65,15% у больных). При оценке соотношения шансов развития алкоголизма нами было выявлено, что аллель DRD2*С является маркером повышенного риска развития данного заболевания в этнической группе якутов (OR=1,57;

95%CI 1,03–2,40), а аллель DRD2*T является протективным (OR=0,64;

95%CI 0,42-0,98) (Рис. 1.).

OR=0, Рис. 1. Распределение частот OR=1, аллелей и генотипов полиморфного маркера 939TC больные гена DRD2 в исследованных контроль выборках якутов *C/*C *C/*T *T/*T *C *T При анализе распределения частот генотипов данного локуса в объединенной выборке больных алкоголизмом и контроле выявлены статистически значимые различия (2=4,09;

P=0,043), связанные с увеличением частоты гомозиготного генотипа DRD2*Т/*T в контроле. При оценке соотношения шансов развития алкоголизма в объединенной выборке нами установлено, что генотип DRD2*Т/*T (OR=0,6;

95%CI=0,38-0,96) и аллель DRD2*T (OR=0,69;

95%CI=0,48-0,99) являются протективными факторами к развитию данного заболевания. В то же время, аллель DRD2*C (OR=1,45;

95%CI=1,01-2,07) является маркером повышенного риска развития ХА в РС(Я) (Рис. 2).

80 OR=0, OR=0, Рис. 2. Распределение частот 60 OR=1, аллелей и генотипов полиморфного маркера больные 939TC гена DRD2 у больных контроль ХА и индивидов контрольной группы в объединенных выборках *C/*C *C/*T *T/*T *C *T Полученные нами результаты согласуются с работой W.Chen с соавторами (1997), в которой обнаружено достоверное повышение частоты аллеля DRD2*С (51,0%) у больных алкоголизмом из Тайваня по сравнению с контрольной выборкой (34,0%). Недавнее исследование российских ученых также выявило наличие ассоциации аллеля DRD2*C с опийной наркоманией у русских и татар из Башкортостана [Гареева, 2004]. Той же группе авторов удалось показать, что гомозиготный генотип DRD2*Т/*T является «фактором устойчивости» к развитию опийной наркомании в Республике Башкортостан, что соответствует полученным нами данным [Гареева, 2002].

Исследованные полиморфные варианты гена DRD2 находятся в сильном неравновесии по сцеплению (D’~1), в связи с чем проведен их гаплотипический анализ, в результате было выявлено 4 гаплотипа, частоты которых в выборках больных и контроля статистически достоверно не различались.

Анализ ассоциаций полиморфного маркера 25GA гена DRD3 с ХА в РС(Я) В экзоне 1 гена DRD3 располагается несинонимичный полиморфный локус, первоначально идентифицированный как рестрикционный полиморфный вариант BalI/MsсI (25GA, Ser9Gly) [Crocq et al., 1992] и в настоящее время определяемый как rs6280. Транзиция аллеля Т на С нуклеотидной цепи соответствует замене аминокислоты серин на глицин в положении 9 в N-терминальном внеклеточном домене белка. Исследования К.Lundstrom и М.Turpin (1996) показали, что в результате данной транзиции изменяется способность рецептора D3 связываться с агонистом.

Всего в изученных группах якутов и эвенков было обнаружено два генотипа: DRD3*A/*A и DRD3*A/*G. Наиболее распространенным в контрольных выборках был гомозиготный генотип DRD3*A/*A, определенный в 80,23% случаев у якутов и в 95,35% у эвенков, и, соответственно, аллель DRD3*A, выявленный в 90,12% случаев у якутов и в 97,67% случаев у эвенков. Аллель DRD3*G встречался с частотой 9,88% в контрольной выборке якутов и 2,33% в контрольной группе эвенков.

При сравнительном анализе контрольных групп якутов и эвенков было выявлено статистически достоверное различие в распределении частот аллелей и генотипов полиморфного маркера 25GA гена DRD3 (P0,05).

Распределение частот аллелей и генотипов данного локуса были схожими в группах больных с ХА и в контроле (P0,05) как у якутов, так и у эвенков.

Таким образом, проведенное нами исследование полиморфного маркера 25GA гена DRD3 с ХА в РС(Я) не выявило вклад данного полиморфного варианта в развитие заболевания.

Анализ ассоциаций полиморфных маркеров -616CG и 120 п.о. VNTR гена DRD4 с ХА в РС(Я) Научный интерес к исследованию роли гена рецептора D4 дофамина (DRD4) при алкоголизме значительно возрос после сообщения Long и коллег о наличии сцепления с алкоголизмом маркера D11S1984, располагающегося на хромосоме 11, рядом с геном DRD4 [Long et al., 1998]. Исследования на животных обнаружили интересную роль рецептора D4 дофамина в формировании поведения:

наряду с гиперчувствительностью к алкоголю [Rubinstein et al., 1997] мыши нокауты по гену DRD4 демонстрировали пониженный «поиск новизны» по сравнению с мышами дикого типа [Dulawa et al., 1999].

У больных ХА из РС(Я) и в соответствующих контрольных группах нами проведен анализ полиморфных локусов -616CG и 120 п.о. VNTR в промоторном регионе гене DRD4. Расположенный вблизи регуляторных областей маркер 616CG в гене DRD4 участвует в регуляции экспрессии: аллель DRD4*C приводит к потере АР-2-сайта связывания и репрессирует транскрипцию [Barr et al., 2001]. В литературе отмечено уменьшение экспрессии гена в ряду:

DRD4 повтор2повтора4 повтора - в отношении полиморфного VNTR локуса в 5’-UTR регионе гена DRD4 [Kereszturi et al., 2007].

Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера -616CG гена DRD4 между группами больных ХА и контролем в зависимости от этнической принадлежности не выявил статистически достоверных различий ни у якутов, ни у эвенков (P0,05).

При сравнении частот аллелей и генотипов полиморфного VNTR маркера в 5’-UTR гена DRD4 между больными алкоголизмом и контрольными индивидами согласно их этнической принадлежности, статистически значимых отличий выявлено не было. Однако, при анализе распределения частот аллелей и генотипов исследованного полиморфного локуса гена DRD4 у больных и в контроле, в объединенных выборках, было обнаружено, что генотип DRD4*L/*L встречался с более высокой частотой в группе здоровых индивидов – в 41,3% случаев, по сравнению с больными ХА – 29,2% случаев (2=3,90, Р=0,048, OR=0,59;

95%CI 0,36-0,97) (Рис. 3).

OR=0. Рис. 3. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного варианта Больные п.о. VNTR гена DRD4 в 30 Контроль объединенных выборках больных ХА и контроля *S/*S *S/*L *L/*L *S *L Ранее сообщалось о связи полиморфного маркера VNTR гена DRD4 с метамфетаминовой зависимостью в китайской популяции [Li, 2004]. Полученный нами результат частично согласуется с данными ряда исследователей, обнаружившими ассоциацию аллеля DRD4*L с другой психической патологией – синдромом нарушения внимания с гиперактивностью (ADHD) [McCracken, 2000;

Kustanovich, 2004]. Исследования Rogers и коллег обнаружили ассоциацию короткого аллеля с чертами личности, такими как импульсивность, поиск новых ощущений и экстраверсия в европейских популяциях [Rogers, 2004]. Данные качества могут рассматриваться как промежуточные фенотипы предрасположенности к ADHD и зависимости от психоактивных веществ. Однако, проведенное нами исследование не подтвердило вклад короткого аллеля DRD4*S в формирование алкогольной зависимости у якутов и эвенков из РС(Я).

При оценке частот гаплотипов гена DRD4 было обнаружено наличие неравновесия по сцеплению (D’0,3) между маркерами -616CG и VNTR в 5’-UTR как в группе больных, так и в группе здоровых доноров. В результате последующего анализа гаплотипов гена DRD4, составленных на основе полиморфных маркеров VNTR и -616CG, различий в распределении частот гаплотипов между больными алкоголизмом и здоровыми донорами как среди якутов (2=4,42;

df=3;

P=0,219), так и в объединенной выборке (якуты и эвенки) (2=4,40;

df=3;

P=0,221) выявлено не было.

Анализ ассоциаций полиморфных маркеров 2319GA и VNTR в 3’-UTR гена SLC6A3 с ХА в РС(Я) Важную роль в дофаминергической нейротрансмиссии играет переносчик дофамина DAT1 (кодируемы геном SLC6A3), ограничивающий активность дофаминергической системы в синапсах путем обратного поглощения нейромедиатора в пресинаптические терминалы. Полиморфный VNTR локус в 3’ UTR регионе гена SLC6A3 имеет функциональную значимость: повышение экспрессии гена ассоциировано с аллелем SLC6A3*10R [VanNess et al., 2005].

Функциональная значимость маркера 2319GA (MspI) в 3’-UTR регионе гена SLC6A3 неизвестна, однако изменение нуклеотидной последовательности в 3’ регионе может привести к вариации сайтов узнавания специфическими микроРНК, регулирующими экспрессию гена посредством частичной или полной его инактивации [Presutti et al., 2006].

Проведенный анализ замены гена не выявил 2319GA SLC6A статистически значимых различий в распределении частот аллелей и генотипов данного локуса в группах как у больных ХА и контрольными выборками согласно их этнической принадлежности, так и в объединенных группах.

В результате исследования полиморфного маркера VNTR в 3’-UTR гена SLC6A3, выявлено, что в контрольных выборках якутов и эвенков генотипы SLC6A3*10R/*10R и SLC6A3*10R/*9R встречались практически с одинаковой частотой и соответственно). Генотип (82,91%, 86,05% 13,68%, 13,95% SLC6A3*9R/*9R обнаружен только в контрольной группе якутов с частотой 3,42%.

При сравнительном анализе распределения частот генотипов и аллелей полиморфного маркера VNTR гена SLC6A3 между группами здоровых якутов и эвенков, так и между группами больных ХА и контрольными группами в объединенной выборке и в соответствии с этнической принадлежностью достоверные различия не выявлены (P0,05).

Определено сильное неравновесие по сцеплению 2319GA и VNTR в 3’-UTR полиморфных локусов гена SLC6A3 (D’~1) и проведен их гаплотипический анализ, в результате которого выявлено 4 гаплотипа. В результате анализа гаплотипов гена SLC6A3, составленных из полиморфных маркеров VNTR и 2319GA, различий в распределении частот гаплотипов между больными алкоголизмом и здоровыми индивидами как среди якутов (2=0,64;

df=3;

P=0,887), так и в объединенной выборке (якуты и эвенки) (2=2,42;

df=3;

P=0,490) обнаружено не было.

Известно, что ген SLC6A3 вовлечен в формирование личностных черт, характеризующих социальную активность («поиск новизны» и «зависимость от вознаграждения») и целеустремленность В результате («настойчивость»).

исследования А. Казанцевой с соавт. (2009) был выявлен прямой эффект полиморфного маркера 2319GA в гене SLC6A3 на выраженность таких черт темперамента как «поиск новизны» и «зависимость от вознаграждения»: при наличии аллеля SLC6A3*А у женщин русской этнической принадлежности наблюдалось повышение значений этих личностных черт. По данным Ling D. c соавт. (2004) показана ассоциация аллеля SLC6A3*А с никотиновой зависимостью у мужчин китайской этнической принадлежности, характеризующейся повышенным «поиском новизны». Ряд исследователей выявил ассоциацию аллеля SLC6A3*9R с алкогольной зависимостью, развитием острого алкогольного психоза и тяжестью абстинентного синдрома при алкоголизме [Галеева, 2001;

Gorwood et.

al. 2003;

Van der Zwaluw et. al., 2009]. Однако, в результате проведенного нами исследования не было обнаружено ассоциаций полиморфных вариантов 2319GA и VNTR в 3’-UTR гена SLC6A3 с алкоголизмом в РС(Я).

Анализ ассоциаций полиморфного маркера -1438AG гена HTR2A и полиморфного маркера 861GC гена HTR1B c ХА в РС(Я) HTR2A – это один из основных серотониновых рецепторов, ответственных за постсинаптическую активацию переноса серотонина, который, таким образом, может участвовать в нервнопсихической дерегуляции, в первую очередь связанной с нарушением потребления алкоголя [Collier et al., 1997;

Sorbi et al., 1998, Serretti et al., 2007]. Предполагается, что диаллельный полиморфный локус 1438AG гена HTR2A в промоторном регионе или какие-либо другие локусы в этой области могут влиять на экспрессию гена и, следовательно, на плотность рецепторов в мозге [Turecki et al., 1999]. В частности, было отмечено увеличение промоторной активности гена HTR2A в клетках, экспрессирующих конструкцию с аллелем HTR2A*А (Parsons et al., 2004). При исследовании поведения у мышей нокаутов по гену HTR1B наблюдалась импульсивная агрессия, пониженная тревожность, повышенное исследовательское и сексуальное поведение, тяга к алкоголю и наркотическим веществам по сравнению с мышами «дикого типа» [Zhuang et al., 1999]. Полиморфный маркер 861GC влияет на экспрессию гена и, следовательно, на плотность рецептора [Huang et al., 1999].

По распределению частот аллелей и генотипов полиморфного локуса 1438AG гена HTR2A достоверных различий между популяциями якутов и эвенков, так и группами больных алкоголизмом и контролем с учетом этнической принадлежности, а также в объединенных выборках, не выявлено (Р0,05).

При сравнении распределения частот генотипов полиморфного локуса 861GC гена HTR1B в популяции эвенков было обнаружено достоверное различие между группами больных и контрольной выборкой (2=4,70;

Р=0,03), связанное с увеличением частоты генотипа HTR1B*С/*G в группе контроля (Рис. 4).

80 OR=0. Рис. 4. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного варианта 861GC больные гена HTR1B в исследованных контроль выборках эвенков *C/*C *C/*G *G/*G *C *G Гетерозиготный генотип HTR1B*С/*G является маркером пониженного риска развития ХА у эвенков из РС(Я) (OR=0,29;

95%CI: 0,1–0,81). Согласно литературным данным, молекулярно-генетические исследования полиморфного локуса гена проведенные в отношении алкоголизма, 861GC HTR1B, противоречивы: J. Lappalainen c соавторами (1998) установили, что у финнов и индейцев юго-восточной Америки, больных алкоголизмом, была повышена частота аллеля HTR1B*С по сравнению с контрольными выборками. Позднее, С.

Fehr с соавторами (2000) нашли повышенную частоту аллеля HTR1B*G среди лиц с алкогольной зависимостью – немцев по этнической принадлежности. Также, была показана ассоциация аллеля HTR1B*С с токсикоманией и большим депрессивным эпизодом Показанная нами роль [Huang et al., 2003].

гетерозиготного генотипа HTR1B*С/*G как протективного в отношении развития алкоголизма, ранее в литературе описана не была.

Анализ ассоциаций полиморфных маркеров 5-HTTLPR и rs25531 AG гена 5-НТТ c ХА в РС(Я) Рядом исследователей было отмечено, что ген переносчика серотонина (5 НТТ) является основным регулятором серотонинергической нейротрансмиссии в различных регионах мозга [Lesch et al., 1996]. Нами проведено изучение полиморфных локусов 5-HTTLPR и rs25531 AG в гене 5-НТТ. Однонуклеотидная замена AG, присутствующая исключительно в инсерционной форме локуса 5 HTTLPR (5-HTTLPR*L), находится в сайте связывания фактора транскрипции АР 2, вследствие чего, вероятно, влияет на уровень экспрессии белка [Ebstein et al., 2006]. Выявлено, что наличие гаплотипа 5-НТТLPR*LG приводит к снижению уровня экспрессии мРНК гена 5-НТТ в клеточной линии лимфобластов, что примерно соответствует уровню экспрессии гена при наличии делеционной формы (5-HTTLPR*S) [Nakamura et al., 2000]. Исходя из этих данных, исключительно важным является совместное исследование полиморфных маркеров 5-HTTLPR и rs25531 AG в гене 5-НТТ.

Различия в распределении частот генотипов полиморфного маркера 5 HTTLPR гена 5-НТТ в этнических группах здоровых эвенков и якутов были статистически значимыми (2=7,402;

P=0,023). Это связано с тем, что частота генотипа 5-HTTLPR*L/*S в контрольной группе якутов встречалась более, чем в два раза чаще (37,14%) по сравнению с таковой у эвенков (15,91%), в то время как частота генотипа 5-HTTLPR*L/*L, наоборот, была в два раза реже и составила 3,81% и 6,82%, у якутов и эвенков, соответственно.

Ранее было показано, что S – аллель полиморфного маркера 5-HTTLPR ассоциирован с алкогольной зависимостью. Наибольший эффект наблюдался среди людей с сопутствующими психическими отклонениями, их ранним началом или более серьезной формой алкоголизма [Feinn et al., 2005]. Но не все исследования обнаружили эту ассоциацию [Dick et al., 2007;

Bleich et al., 2007], поздние публикации представили сложную взаимосвязь между транспортной активностью, опосредованной данным полиморфным локусом, и историей злоупотребления алкоголя [Johnson et al., 2008]. В результате нашего исследования не были обнаружены статистически достоверные различия в распределении частот аллелей и генотипов маркеров 5-HTTLPR и rs25531 гена 5-HTT между больными ХА и контрольными группами из РС(Я).

Анализ ассоциаций полиморфных маркеров 1460CT и MAOALPR гена МАОА и полиморфного маркера rs1799836 AG гена МАОВ c ХА в РС(Я) Среди инактивирующих ферментов для серотонина наиболее активным является моноаминоксидаза (МАО), для дофамина – МАО и катехол-О метилтрансфераза (КОМТ). Предполагается, что алкоголь и продукты его метаболизма действуют, с одной стороны, как либераторы мозговых биогенных аминов, а с другой – как ингибиторы инактивирующих ферментов. Поскольку гены МАОА и МАОВ расположены на Х хромосоме и таким образом представлен разным числом аллелей у мужчин и женщин, в нашем исследовании мы проводили анализ распределения частот генотипов и аллелей с учетом половой принадлежности.

В результате молекулярно-генетических исследований полиморфного маркера 1460CT (EcoRV) гена MAOA в популяциях якутов и эвенков из РС(Я) обнаружено 2 гемизиготных генотипа у мужчин: МАОА*С и МАОА*Т, частоты которых составили соответственно в популяции якутов: 71,67% и 28,33%, в популяции эвенков: 63,64% и 36,36%. У женщин обнаружено 3 генотипа:

МАОА*С/*С, МАОА*С/*Т и МАОА*Т/*Т, частоты которых составили соответственно в популяции якутов: 35,71%, 35,71% и 28,58%, в популяции эвенков: 14,81%, 48,15% и 37,04%.

В объединенной выборке женщин установлено, что частота аллеля МАОА*Т в контрольной выборке была достоверно ниже по сравнению с таковой у женщин, страдающих алкоголизмом (c2=3,87;

P=0,049;

OR=2,35;

95%CI 1,07-5,15) (Рис. 5).

OR=2, Рис. 5. Распределение частот OR=0, аллелей и генотипов полиморфного варианта больные гена в 1460СT MAOA контроль объединенных выборках женщин, больных ХА и индивидов контрольной группы *С/*С *С/*Т *Т/*Т *С *Т Полученные результаты согласуются с данными Е. Горбуновой с соавторами (2002), показавшими, что МАОА*T является аллелем риска острого алкогольного психоза в популяции башкир.

В группе мужчин эвенкийской этнической принадлежности между больными ХА и контролем нами выявлены достоверные различия по распределению частот генотипов полиморфного локуса LPR гена МАОА (c2=6,33;

Р=0,025), обусловленные снижением частоты гемизиготного генотипа МАОА*L (OR=0,07;

95%CI 0,01–0,74) и достоверным повышением частоты генотипа МАОА*H (c2=4,27;

Р=0,038;

OR=14,1;

95%CI 58,27–113,52) у больных (Рис. 6).

Рис. 6. Распределение частот 100 OR=0.07 OR=1. гемизиготных генотипов полиморфного маркера LPR больные гена MAOА у мужчин, больных 40 контроль ХА и здоровых индивидов в популяции эвенков *L *H Ранее было показано, что аллель МАОА*L является протективным для развития алкоголизма у мужчин татарской этнической принадлежности из Волго Уральского региона [Горбунова, 2002]. Также была обнаружена ассоциация аллеля МАОА*H с риском развития антисоциального поведения, развитием алкоголизма и импульсивным поведением у финнов [Tikkanen, 2009], с тяжелым течением метамфетаминового психоза у японцев агрессивным [Nakamura 2009], антисоциальным поведением у женщин алкоголиков [Gokturk, 2008]. Полученные нами результаты указывают на вовлечение моноаминоксидазы А в патогенез алкоголизма и позволяют сделать выводы, что аллель МАОА*L является протективным, а аллель МАОА*Н является маркером риска в отношении развития хронического алкоголизма у мужчин эвенкийской этнической принадлежности.

Сравнительный анализ распределения частот гемизиготных генотипов полиморфного локуса rs1799836 в интроне 13 гена МАОВ между группами больных ХА и здоровых якутов не выявил достоверных различий (Р0,05).

В результате сравнения распределения частот гаплотипов гена MAOA, составленных из полиморфных маркеров 1460СT и MAOA-LPR, были выявлены достоверные различия между больными алкоголизмом и здоровыми донорами как среди якутов (2=39,26;

df=3;

P0,0001), так и в объединенной выборке (якуты и эвенки) (2=40,30;

df=3;

P0,0001). Дальнейший анализ множественных сравнений показал, что протективным маркером при развитии алкоголизма как среди якутов (2= 11,41;

P=0,0005;

OR=0,005;

95%CI 0,44-0,37), так и в объединенной выборке (якуты и эвенки) (2=13,96;

P=0,0008;

OR=0,005;

95%95%CI 0,46-0,30) является редкий в группе больных гаплотип MAOA*H*T (Рис. 7).

Рис. 7. Частоты гаплотипов гена OR=0. по полиморфным MAOA, /*T контр. в целом *H маркерам 1460CT и MAOA-LPR A ХА в целом O /*C A у больных ХА и в контрольной M якуты контр.

*L A группе индивидов якутской якуты ХА O /*C A M этнической принадлежности и в *H A O объединенных выборках из РС(Я) /*T A M *L 0 20 40 A O A M Анализ ассоциаций полиморфного маркера 143AG гена ADH1B c риском развития ХА в РС(Я) Ген фермента алкогольдегидрогеназы ADH1B содержит два активно изучаемых функциональных полиморфизма: Arg47His и Arg369Cys, которые являются результатом транзиций 143AG и 1108TC, соответственно. Фермент, кодируемый ADH1B*A обладает повышенной активностью, обеспечивает более быстрое накопление ацетальдегида, который оказывает токсическое действие на многие ткани организма [Oroszi et. al., 2004].

При сравнении распределения частот аллелей полиморфного маркера 143AG гена ADH1B в популяции якутов обнаружено достоверное увеличение частоты аллеля ADH1B*А в контрольной выборке (2=5,08,Р=0,024;

OR=0,47;

CI=0,25-0,87), в то время как выборке больных аллель ADH1B*G оказался достоверно чаще представленным (2=5,08,Р=0,024;

OR=2,12;

CI=1,14–3,95) (Рис.

8).

OR=2. Рис. 8. Распределение частот аллелей и генотипов OR=0. полиморфного варианта больные контроль гена в 143AG ADH1B исследованных выборках якутов *A/*A *A/*G *G/*G *A *G В объединенной выборке показано достоверное увеличение частоты генотипа ADH1B*G/*G у больных (2=4,18;

Р=0,040;

OR=1,99;

95% CI 1,09-3,65).

Также было выявлено, что в объединенной выборке аллель ADH1B*G является аллелем риска развития ХА (2=6,02;

Р=0,014;

OR=2,07;

95%CI 1,18-3,62), а аллель ADH1B*A является протективным (2=6,02;

Р=0,014;

OR=0,48;

95%CI 0,27-0,84) в отношении развития данного заболевания в РС(Я) (Рис. 9).

OR=2. 100 OR=1. Рис. Распределение 9.

частот аллелей и генотипов полиморфного варианта больные 143AG гена ADH1B в OR=0.48 контроль объединенной группе больных ХА и здоровых индивидов *A/*A *A/*G *G/*G *A *G Проведенные ранее исследования свидетельствуют, что аллель ADH1B*A и соответствующая ему атипичная алкогольдегидрогеназа реже встречаются у алкоголиков, чем среди здоровых индивидов;

среди страдающих алкоголизмом носители данного аллеля употребляют меньшие дозы этанола, чем индивиды, у которых он отсутствует [Oroszi et. al., 2004, Lee et. al., 2004]. Полученные нами данные согласуются с результатами исследований Oroszi и Lee и указывают на вовлеченность гена ADH1B в патогенез алкоголизма в РС(Я).

Анализ межгенных взаимодействий в формировании наследственной предрасположенности к развитию ХА в Республике Саха (Якутия).

Кластерный анализ моделей межгенных взаимодействий, проведенный в группе якутов (Рис. 10) и в объединенной выборке (Рис. 11), позволил идентифицировать специфичную картину взаимоотношений между всеми генами, составляющими отдельно взятую модель. При детальном анализе дендрограмм взаимодействия генов было обнаружено, что в пределах кластеров наблюдалась различная степень сопряженности между генами, детерминирующими тот или иной фенотип болезни.

Рис. Межгенные 10.

взаимодействия полиморфных локусов исследованных генов в формировании предрасположенности к хроническому алкоголизму у якутов При исследовании межгенных взаимодействий полиморфных локусов генов нейротрансмиттерных систем мозга и фермента катаболизма алкоголя у якутов с помощью алгоритма Forced search algorithm были определены модели межгенного взаимодействия ДНК-локусов, приводящие к развитию алкоголизма: 1) DRD 32806CT, ADH1B 143AG;

2) SLC6A3 2319GA, DRD2 32806CT, ADH1B 143AG;

3) DRD2 32806CT, ADH1B 143AG, HTR1B 816CG;

4) SLC6A 2319GA, DRD2 939CT, MAOA-LPR Согласно полученным моделям были выявлены сочетания повышенного риска развития хронического алкоголизма у якутов: комбинации генотипов DRD2*CADH1B*G/*G (OR=4,92;

95%CI 1,46–18,14), DRD2*CADH1B*G/*GSLC6A3*G/*G (OR=4,43;

95%CI 1,32–16,40), DRD2*CADH1B*Arg/*ArgHTR1B*G/*G (OR=4,43;

95%CI 1,32–16,40), SLC6A3*G/*GDRD2*CMAOA-LPR*L/*L (OR=5,20;

95%CI 1,07–34,42).

Рис. 11. Межгенные взаимодействия полиморфных локусов исследованных генов в формировании предрасположенности к ХА в объединенной выборке При оценке межгенных взаимодействий в объединенной выборке, были установлены статистически значимые модели взаимодействия полиморфных маркеров генов: 1) DRD4 -616CG, DRD2 939С;

2) DRD4 -616CG, DRD2 939CT, ADH1B 143AG. К сочетаниям повышенного риска развития заболевания в объединенной выборке были отнесены комбинации генотипов и DRD2*T/*TDRD4*G/*G (OR=0,31;

95%CI 0,11–0,86) DRD2*C ADH1B*G/*GDRD4*C/*G (OR=2,96;

95%CI 1,06–8,67), в то время как сочетание генотипов DRD2*T/*TADH1B*G/*GDRD4*G/*G (OR=0,25;

95%CI 0,08–0,79) являлось протективным в развитии хронического алкоголизма в объединенной выборке.

Таким образом, анализ межгенных взаимодействий показал, что проявление патологических эффектов полиморфных аллелей и генотипов генов нейромедиаторных систем мозга и генов ферментов метаболизма этанола существенно зависит от характера их взаимодействия. Так, совместная комплексная оценка влияния полиморфных вариантов изученных генов на риск развития алкогольной зависимости позволила не только подтвердить результаты, полученные в ходе анализов распределения изученных полиморфных локусов генов по отдельности, но и показать, что основу генетической предрасположенности к алкоголизму составляет взаимодействие генов DRD2, ADH1B и/или SLC6A3, HTR1B, MAOA у якутов и генов DRD2, DRD4, ADH1B в объединенной выборке жителей РС(Я).

*** Таким образом, проведенное молекулярно-генетическое исследование ХА в РС(Я) показало, что полиморфные варианты генов DRD2, DRD4, HTR1B, MAOA и вносят вклад в формирование генетической структуры ADH1B предрасположенности к хроническому алкоголизму в Республике Саха (Якутия).

Определены ключевые межгенные взаимодействия, детерминирующие риск развития ХА.

ВЫВОДЫ Обнаружены статистически значимые отличия по распределению частот 1.

генотипов и аллелей полиморфных локусов 25GA гена DRD3 и 5-HTTLPR гена 5-НТТ между контрольными группами якутов и эвенков.

Маркерами повышенного риска развития хронического алкоголизма у 2.

якутов являются аллели DRD2*939C и ADH1B*143G, маркерами пониженного риска – гаплотип МАОА*Н*Т.

У эвенков маркером пониженного риска развития хронического 3.

алкоголизма является гетерозиготный генотип HTR1B*861C/C.

Маркерами повышенного риска развития хронического алкоголизма в 4.

объединенной выборке из РС(Я) являются аллели DRD2*939C, ADH1B*143G и генотип маркерами пониженного риска генотипы ADH1B*143G/G, – DRD2*939T/T и DRD4*L/L и гаплотип МАОА*Н*Т.

Установлены модели межгенного взаимодействия полиморфных 5.

вариантов генов дофаминергической системы мозга и гена алкогольдегидрогеназы у якутов и комбинации генотипов полиморфных вариантов этих генов, предрасполагающие к развитию хронического алкоголизма (DRD2 32806СT, ADH1B 143AG, HTR1B 861CG;

SLC6A 2319GA, DRD2 939CT, MAOA LPR).

Установлены модели межгенного взаимодействия полиморфных вариантов 6.

генов дофаминергической системы мозга и гена алкогольдегидрогеназы в объединенной выборке из Республики Саха (Якутия) и комбинации генотипов этих локусов, являющиеся маркерами повышенного (DRD4 -616CG, DRD2 939CT) и пониженного (DRD4 -616CG, DRD2 939CT, ADH1B 143AG) риска развития хронического алкоголизма.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Фасхутдинова Г.Г., Гайсина Д.А., Куличкин С.С., Хуснутдинова Э.К.

Молекулярно-генетические аспекты зависимости от психоактивных веществ // Медицинская генетика. - 2007. - Т.6. - №7(61) – С.3- 2. Фасхутдинова Г.Г., Куличкин С.С., Матвеева Н.П. и др. Анализ полиморфизма генов дофаминергической системы у больных алкоголизмом, якутов и чукчей по этнической принадлежности // Медицинская генетика. – 2008. - №8 – С.3- 3. Казанцева А.В., Фасхутдинова Г.Г., Куличкин С.С., Хуснутдинова Э.К.

Роль полиморфного VNTR-локуса в гене DRD4 в развитии алкогольной и наркотической зависимости и формировании личностных черт у здоровых индивидов // Якутский медицинский журнал. – 2009. – 2(26). – С. 107- 4. Куличкин С.С., Фасхутдинова Г.Г., Казанцева А.В. и др. Анализ ассоциаций полиморфизмов генов D2-рецептора дофамина DRD2, переносчика дофамина DAT1 и моноаминоксидазы А MAOA с хроническим алкоголизмом у якутов и эвенков Республики Саха (Якутия) // Современные проблемы биологической психиатрии и наркологии: сборник тезисов докладов Второй Всероссийской конференции с международным участием (Томск, 4-6 марта 2008 г.). - 2008. – С. 136- 5. Faskhutdinova G., Juriev E., Kulichkin S., Gaysina D., Zainullina A., Noskova T., Khusnutdinova E. The serotonin transporter gene: analyses of haplotypes in substance misuse // Balkan Journal of Medical Genetics, V. 9, 2006, P. 89.

6. Закиров Д., Фасхутдинова Г., Куличкин С., Гареева А., Хуснутдинова Э.

Генетические аспекты предрасположенности к алкогольной зависимости // Материалы Всероссийской конференции «Вавиловские чтения», БГПУ – 2009. – С. 56-60.

7. Закиров Д., Фасхутдинова Г., Куличкин С., Гареева А., Хуснутдинова Э.

Изучение ассоциаций полиморфных локусов генов-кандидатов с алкоголизмом и опийной наркоманией // Материалы Международной научно-практической конференции «Роль классических университетов в формировании инновационной среды регионов», посвященной 100-летию БГУ. – 2009. – С. 42-44.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ Республика Саха (Якутия) РС(Я) Хронический алкоголизм ХА Государственное учреждение «Якутский республиканский ГУ ЯРНД наркологический диспансер» Полимеразная цепная реакция ПЦР Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ПДРФ Нетранслируемый регион UTR Ген D2 рецептора дофамина DRD2 Ген D3 рецептора дофамина DRD3 Ген D4 рецептора дофамина DRD4 Ген переносчика дофамина SLC6A3 Ген 2А рецептора серотонина HTR2A Ген 1В рецептора серотонина HTR1B Ген переносчика серотонина 5НТТ Ген фермента моноаминоксидазы А МАОА Ген фермента моноаминоксидазы В МАОВ Ген алкогольдегидрогеназы 1В ADH1B Соотношение шансов OR Доверительный интервал 95% CI