Пути метаболизма сульфобацилл при различных типах питания
На правах рукописи
Журавлева Анна Евгеньевна ПУТИ МЕТАБОЛИЗМА СУЛЬФОБАЦИЛЛ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ТИПАХ ПИТАНИЯ Специальность 03.00.07. – Микробиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2008
Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН и на кафедре микробиологии биологического факультета Московского государственного университета им.
М.В. Ломоносова.
Чл.-корр. РАН Г.И. Каравайко
Научный консультант:
к.б.н. И.А. Цаплина д.б.н., проф. Г.И. Эль-Регистан
Официальные оппоненты:
д.б.н., проф. Т.С. Калебина Российский химико
Ведущая организация:
технологический университет им. Д.И. Менделеева
Защита диссертации состоится “ 22 ” декабря 2008 года в 12 00 часов на заседании диссертационного совета Д.002.224.01 в Институте микробиологии им. С.Н.
Виноградского РАН по адресу:
117312, Москва, Проспект 60-летия Октября, д. 7, корп. 2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им.С.Н. Виноградского РАН.
Автореферат разослан “ ” ноября 2008 года
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Т.В. Хижняк
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Сульфобациллы – уникальная группа аэробных грамположительных спорообразующих экстремально ацидофильных бактерий семейства Alicyclobacillaceae, окисляющих Fe2+, S0/S2- и сульфидные минералы.
Большинство представителей рода Sulfobacillus – умеренные термофилы;
оптимальный тип питания – миксотрофный, когда одновременно используются метаболические пути окисления неорганических и органических соединений (глюкоза, дрожжевой экстракт и др.);
также возможен рост в течение ряда пересевов (Захарчук, 2006) при хемоорганогетеротрофном и хемолитоавтотрофном типах питания. Местами обитания сульфобацилл являются отвалы сульфидных руд, кислые гидротермы, шахтные воды, месторождения сульфидных минералов, где температура варьирует в пределах 10–600С.
Сульфобациллы являются постоянными членами сообществ микроорганизмов в области температур до 500С, играя важную роль в биогидрометаллургических процессах. К настоящему времени подробно исследованы экофизиология и выщелачивающая активность этих бактерий (Каравайко и др., 2006). Значительные успехи также достигнуты в изучении центрального конструктивного метаболизма умеренно термофильных представителей рода Sulfobacillus в области оптимальных температур (Wood, Kelly, 1990;
Захарчук и др., 1994), тогда как при температурах, близких к предельным для роста, характерных для мест обитания умеренно термофильных сульфобацилл, в природных и техногенных эконишах, сведений нет.
Данные об энергетическом обмене фрагментарны. В литературных источниках не представлено информации о процессах энергообеспечения клеток сульфобацилл в форме АТФ;
остается неясной роль органических субстратов при миксотрофном типе питания этих бактерий. Электронтранспортная система (ЭТС) сульфобацилл практически не изучена: предполагается функционирование отдельных переносчиков электронов у бактерий, позднее отнесенных к видам рода Sulfobacillus (Barr et al., 1990;
Blake et al., 1993).
Исследование особенностей метаболизма штаммов сульфобацилл имеет большое значение как для решения теоретических задач, так и практического применения. Изучение путей метаболизма сульфобацилл при изменении условий культивирования – при переключении с оптимального миксотрофного на лито- и органотрофный типы питания, изменении содержания кислорода, температуры, в условиях нестабильного снабжения органическими веществами, является актуальной проблемой.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение конструктивного обмена новой термотолерантной бактерии S. thermotolerans Kr1Т, выделенной при 300С, и особенностей энергетического метаболизма представителей рода Sulfobacillus при различных типах питания и температурах роста.
Задачи исследования включали:
1. Подробную характеристику фенотипических свойств термотолерантной культуры S. thermotolerans Kr1Т – роста и центральных путей углеродного метаболизма, при различных типах питания и предельных температурах.
2. Изучение энергетического обмена S. thermotolerans Kr1 и умеренного термофила S. sibiricus N1Т: установление взаимосвязи внутриклеточного уровня АТФ с типом питания, определение субстратов – доноров электронов и акцепторов электронов, исследование ЭТС при окислении Fe(II).
3. Исследование возможности использования термофильных сульфобацилл для биоокисления упорных золотомышьяковых концентратов сульфидных руд Олимпиадинского месторождения при 500С. Выделение преобладающих культур из термофильной ассоциации.
Научная новизна. В результате исследования активности ферментов катаболизма углеводов обнаружено, что у термотолерантной бактерии S. thermotolerans Kr1Т, в отличие от умеренно термофильных сульфобацилл, функционируют три главные пути метаболизма сахаров – путь Эмбдена– Мейергофа–Парнаса, окислительный пентозофосфатный и путь Энтнера–Дудорова при различных типах питания (миксо-, органогетеро- и литоавтотрофном). В условиях предельных температур роста (12 и 550С) сохранение жизнеспособности и окислительной активности клеток сульфобацилл обеспечено ферментными системами путей Эмбдена–Мейергофа–Парнаса и Энтнера–Дудорова, что объясняет присутствие бактерий и их функционирование в местах обитания при низких и высоких температурах. Впервые исследована динамика пула АТФ и потребление субстратов в процессе миксо-, органо- и литотрофного роста сульфобацилл, установлена взаимосвязь этих процессов. Обнаружены различия в динамике пула АТФ, окисления субстратов и роста культур сульфобацилл при различных типах питания. Предложено использовать величину пула АТФ в качестве показателя эффективности роста и энергетического метаболизма сульфобацилл.
Выявлено сопряжение синтеза АТФ с функционированием электронтранспортной системы (ЭТС) при окислении неорганического и/или органических субстратов. Таким образом, органические вещества являются как источником углерода, так и донором электронов для ЭТС в условиях миксотрофии.
Установлено использование бактериями S. sibiricus N1T и S. thermotolerans Kr альтернативного кислороду акцептора электронов – Fe(III), в условиях гипоксии и пониженного содержания кислорода в газовой фазе.
Обнаружено, что ЭТС S. sibiricus N1 разветвлена и обеспечивает эффективное окисление железа при различном содержании O2. Система переноса электронов S. sibiricus N1 при окислении Fe(II) в начале роста включает кислотоустойчивый растворимый цитохром с и цитохромоксидазу aa3–типа, в конце роста – цитохром с, мембрансвязанный высокопотенциальный цитохром b573 и цитохромоксидазу bo3– типа. Впервые выявлен состав гемов цитохромов у штаммов S. sibiricus N1 (гемы А, В, С и О) и S. thermotolerans Kr1 (А и В, не исключено наличие гема С).
Практическая значимость. Лабильность конструктивного и энергетического метаболизма умеренно термофильных сульфобацилл впервые позволила реализовать биовыщелачивание упорных золотомышьяковых концентратов при 500C в режиме двустадийного полунепрерывного процесса в лабораторных реакторах. Выделены новые штаммы сульфобацилл и отнесены к виду Sulfobacillus sibiricus.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на II-ой (международной) и IV-ой (с международным участием) молодежной школе конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, ИНМИ РАН им. С.Н. Виноградского, 2006, 2008 гг.), 4-м московском Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007 г.), 17-м Международном симпозиуме по биогидрометаллургии (Германия, 2007 г.), международной научной конференции «Микроорганизмы и биосфера» (Москва, ИНМИ РАН им. С.Н. Виноградского, 2007 г.).
Публикации. По материалам диссертации, включая тезисы, опубликовано работ;
1 статья сдана в печать.
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на страницах машинописного текста, включают 20 таблиц и 37 рисунков Диссертация состоит из введения, четырех глав («Обзор литературы», «Объекты и методы исследований», «Результаты» и «Обсуждение»), заключения, выводов и списка цитируемой литературы, который включает _ отечественных и _ иностранных работ.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Основными объектами исследования были 2 вида сульфобацилл – термотолерантный штамм S. thermotolerans Kr1T (ВКМ В-2339T=DSM 17362T), выделенный из пульпы концентрата пирротиновой золото-пиритно-мышьяковой руды Восточной Сибири (Bogdanova et al., 2006), и умеренно термофильный штамм S. sibiricus N1T (ВКМ В-2380Т=DSM 17363Т), выделенный из опытно-промышленной установки из пульпы концентрата пиритно-арсенопиритной золотосодержащей руды Нежданинского месторождения Якутии (Меламуд и др., 2003). Для изучения взаимосвязи внутриклеточного пула АТФ с типом питания, кроме упомянутых штаммов, были также взяты другие ацидофильные бактерии: умеренно термофильная S. thermosulfidooxidans 1269Т (ВКМ В-1269Т=DSM 9293Т) (Головачева и др., 1978), миксотрофная бактерия Alicyclobacillus (Alb.) tolerans К1Т (ВКМ В 2304Т=DSM 16297Т) (Коваленко, Малахова, 1983, Karavaiko et al., 2005), автотроф Acidithiobacillus (At.) ferrooxidans TFBk (Агеева и др., 2001) и облигатные гетеротрофы Alb. аcidocaldarius (ATCC 27009T = DSM 446Т) и Alb. cycloheptanicus (DSM 4006Т = ATTC 49029Т).
Среды и условия культивирования. Культивирование штаммов сульфобацилл и ацидитиобациллы проводили на среде 9K (Silverman, Lundgren, 1959) с Fe(II) (2. и 9.0 г/л соответственно), pH 1.7–1.8, и/или глюкозой (1.1 мМ) и дрожжевым экстрактом (0.02%) (в случае сульфобацилл). Сахара (0.02%), аминокислоты (0.02% по углероду) и глицерин (1–3 мМ) добавляли к среде 9К для создания гетеротрофных условий. Миксотрофную алициклобациллу выращивали на модифицированной среде Маннинга (Manning, 1975), pH 2.5, при 370C c 1.0–1.5 г/л Fe(II) и 3–5 мМ Na2S2O3 и/или с добавлением глюкозы (1.1 мМ) и дрожжевого экстракта (0.02%). Гетеротрофные алициклобациллы культивировали на среде ВАM при 45–550С, pH 4.0 (Darland, Brock, 1971) с глюкозой (0.5%) и дрожжевым экстрактом (0.2% – в случае Alb. acidocaldarius;
0.5% – для Alb. сycloheptanicus).
Штаммы N1, 1269, TFBk выращивали соответственно при температурах 55, 50 и 280С, штамм Kr1 – при 400С и предельных температурах роста – 12 и 550С.
Периодическое культивирование штаммов проводили в колбах Эрленмейера (на мл со 100 мл среды) при 180 об/мин, в конических колбах на 2.5 л при интенсивной аэрации (Цаплина и др., 2006, 2008), в 5-л бутылях с 4 л среды при парциальном давлении воздуха, а также в пробирках Хангейта объемом 18 мл (объем среды – мл) с 17% кислорода в газовой фазе. Объем посевного материала составлял 10 об%.
В условиях гипоксии (0.07% О2) 40-мл флаконы содержали 18 мл среды (с 20 об% посевного материала). Полунепрерывное культивирование проводили в 2х ферментерах объемом 3 л с 1 л среды, со скоростью подачи воздуха 4 л/мин, перемешиванием при 470 об/мин и D=0.0042 ч-1. Для выделения преобладающих серо-, железо- и концентрат–окисляющих культур использовали среду 9К с 0.02% дрожжевого экстракта и 0.5% S0, 2.5 г/л Fe(II) или 5% концентрата соответственно.
Для создания условий гипоксии среду кипятили, остужали, разливали в 40-мл флаконы в токе азота, барботировали СО2 и асептически вносили посевной материал и Fe(III).
Посевной материал штаммов получали в оптимальных для них условиях (Цаплина и др., 2006). Чистоту культур проверяли посевом на агаризованные среды – МПА, BAМ или агарозную среду (Johnson, 1995) и микроскопированием.
Методы исследования. Рост культур оценивали прямым счетом количества клеток под микроскопом с фазово-контрастным устройством и методом Лоури для определения содержания белка (Lowry et al., 1951). Концентрацию ионов Fe(III) и Fe(II) и содержание глюкозы определяли комплексонометрическим и антроновым методами соответственно (Резников и др., 1970;
Ashwell, 1957). Подготовку биомассы для измерения активности ферментов углеродного обмена проводили, как описано (Захарчук и др., 1994). Активности карбоксилирующих ферментов бесклеточных экстрактов и фиксацию 14CO2 клеточными суспензиями определяли радиоизотопным методом (Романова, 1980;
Ивановский, 1980), остальных ферментов углеродного обмена – спектрофотометрически/колориметрически (Захарчук и др., 1994). Подготовку биомассы для измерения пула АТФ проводили согласно (Цаплина и др., 2007), определение АТФ – биолюминесцентным методом (Угарова и др., 1993). Для ингибиторного анализа АТФ-азы использовали 200 мкМ дициклогексилкарбодиимид (ДЦКД). Измерение скорости дыхания клеток проводили на полярографе с платиновым электродом Кларка. Для исследования ЭТС подготовку биомассы, фракционирование клеток, получение пиридиновых производных гемохромов и анализ спектров проводили, как описано (Strom et al., 2001;
Цаплина и др., 2008). ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) в обращенной фазе проводили по методу (Sone, Fujiwara, 1991), ДС-Na (додецилсульфат Na)–электрофорез – по методике (Laemmli, 1970). Концентрации ингибиторов железооксидазной активности составляли 1–20 мМ (KCN) и 1–30 мМ (NaN3). Содержание кислорода в газовой фазе регистрировали на газовом хроматографе с пламенно-ионизационным детектором. Для идентификации штаммов выделяли и очищали хромосомную ДНК по методике (Marmur, 1961), использовали методы рестриктного анализа ДНК с помощью высоковольтного пульс-электрофореза (Кондратьева, Каравайко, 1992), ДНК/ДНК-гибридизации (De Ley et al., 1970) и определения содержания нуклеотидных пар Г+Ц в ДНК (Owen et al., 1969). Данные обрабатывали статистическими методами (Зайцев, 1973;
Лакин, 1990), достоверность показателей оценивали с помощью t-критерия Стьюдента, принимая достаточным уровень значимости P 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Фенотипические характеристики S. thermotolerans Kr1. Недавно выделенная бактерия S. thermotolerans Kr1 была кратко охарактеризована (2006 г.), в данной работе изучены фенотипические свойства более подробно. У термотолерантного штамма Kr1 минимальное время генерации при лимитирующих рост температурах – 12–14 и 550С – увеличивалось, соответственно, до 7.6 и 38 ч, т.
е. в 2 и 10 раз по сравнению с оптимальной температурой. В отличие от умеренно термофильного штамма S. sibiricus N1, термотолерантная бактерия S. thermotolerans обладала более широким набором органических веществ (малат, глюкоза, фруктоза, сахароза, восстановленный глутатион, дрожжевой экстракт, глицерин).
Фиксация 14CO2 клетками S. thermotolerans Kr1 и активность карбоксилирующих ферментов. В варианте с внесением закисного железа в среду инкубации уровень ассимиляции 14СО2 штаммом Kr1 был максимальным – 558. нмоль СО2/мг белка (рис. 1). Штамм имеет широкий спектр карбоксилирующих ферментов, проявляющих активность при всех типах метаболизма. Активность рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (РБФК/О) у S. thermotolerans Kr максимальна при литоавтотрофном типе питания – 7.2 нмоль/(мин·мг белка), хотя сохраняется и при органогетеро- и миксотрофном типах питания (1.1 и 4. нмоль/(мин·мг белка)). Активность анаплеротических карбоксилаз – пируваткарбоксилазы, ФЕП (фосфоенолпируват)-карбоксилазы и ФЕП карбокситрансфосфорилазы – мало зависит от типа питания. Таким образом, карбоксилазы S. thermotolerans Kr1 подтверждают пластичность метаболизма, позволяя переключаться с миксотрофного на другие типы питания, и обеспечивают дополнительное использование углерода из минерального источника.
СО2, нмоль/мг белка 0 5 10 15 Время, ч Рис. 1. Фиксация 14СО2 клеточной суспензией S. thermotolerans Kr1 при добавлении в инкубационную среду: 1 – Fe(II);
2 – Fe(II), глюкозы и дрожжевого экстракта;
3 – глюкозы и дрожжевого экстракта. 4 – контроль. Количество клеточного белка в инкубационной среде – 1 мг.
Катаболизм углеводов S. thermotolerans Kr1. Отличия конструктивного обмена термотолерантной сульфобациллы от умеренно термофильных штаммов связаны с наличием при всех типах обмена активности ферментов трех главных путей центрального катаболизма углеводов (табл. 1). Судя по величинам ключевых ферментов, приоритетная роль при миксотрофном и литотрофном росте штамма принадлежит фруктозобисфосфатному пути. При смене миксотрофного типа питания на литоавтотрофный активность ферментов пути Энтнера–Дудорова (ключевые ферменты – 6-фосфоглюконатдегидратаза и 2-кето-3-дезокси-6 фосфоглюконатальдолаза) и окислительного пентозофосфатного пути (один из ключевых ферментов – 6-фосфоглюконатдегидрогеназа) снижается. При пересеве в гетеротрофные условия, кроме гликолитического, приоритетным становится также и путь Энтнера–Дудорова. При температурах роста, близких к предельным, время генерации увеличивается в 2 раза при 550С и в 10 раз при 12–140С, снижается активность ферментов, особенно при высокой температуре (в 2–30 раз), утрачивается пентозофосфатный путь окисления глюкозы. Тем не менее, клетки сохраняют свои окислительные свойства и жизнеспособность.
Ферменты ЦТК и глиоксилатного шунта S. thermotolerans Kr1. Активность 2-оксоглутаратдегидрогеназы в бесклеточных экстрактах термотолерантного штамма Kr1, как и у всех изученных сульфобацилл, не обнаружена, ЦТК не замкнут и выполняет биосинтетическую функцию. При смене источника энергии ферменты ЦТК сохраняют активность, за исключением фумаратгидратазы, активность которой не выявлена при органотрофном росте штамма. Глиоксилатный шунт не функционирует из-за отсутствия активности ферментов этого цикла. При температурах 55 и 12–140С обнаружена активность всех ферментов, за исключением 2-оксоглутаратдегидрогеназы и аконитатгидратазы.
Таким образом, можно отметить способность S. thermotolerans Kr1 выживать при изменениях типа питания и температуры. Это обеспечивается функционированием различных путей катаболизма гексоз, цикла Кальвина, реакциями анаплеротического карбоксилирования ФЕП и пирувата. Эти механизмы позволяют в результате регуляторных перестроек S. thermotolerans Kr1 переходить с оптимального миксотрофного на литоавто- или органогетеротрофный типы питания и сохранять жизнеспособность в изменяющихся условиях техногенных экониш и промышленных реакторов.
Пул АТФ в динамике роста штаммов сульфобацилл и окисления субстратов. Одной из важных характеристик микроорганизма является его энергетический показатель. Сравнение данных по накоплению и расходованию АТФ в процессе органотрофного роста миксотрофных бактерий на среде с глюкозой и дрожжевым экстрактом (рис. 2, табл. 2) показало, что штамм Alb. tolerans К1, несмотря на более интенсивный синтез АТФ, рос менее эффективно (по выходу белка), чем S. thermotolerans Kr1. У штамма К1, имеющего полный ЦТК и более высокую активность ферментов путей катаболизма углеводов и большую степень утилизации глюкозы (Каравайко и др., 2001;
2002), пул АТФ составил 3.1, у штаммов Кr1, N1 и 1269 – 2.2, 0.7 и 0.5 нмоль/мг белка соответственно (табл. 2).
Пониженные активности ферментов углеводного обмена, незамкнутость ЦТК у сульфобацилл – штаммов N1, 1269 и Kr1 – обуславливают более низкий уровень их органотрофного роста, по сравнению с ацидофильными гетеротрофными бактериями Alb. cycloheptanicus, шт. 4006, и Alb. acidocaldarius, шт. 27009, что Таблица 1. Активность ферментов углеводного метаболизма (нмоль/(мин • мг белка)) штамма S. thermotolerans Кr1, выращенного при различном типе питания Тип питания Фермент Миксотрофный Литоавто- Органогетеро 12–140С 400С 550С трофный трофный Гексокиназа (КФ 2.7.1.1) 22.3 24.0 3.1 7.1 10. Глюкозо-6-фосфат 27.8 70.1 4.5 28.1 31. дегидрогеназа (КФ 1.1.1.49) 6-Фосфоглюконат н.о. 9.6 н.о. 0.6 0. дегидрогеназа (КФ 1.1.1.43) 6-Фосфоглюконатдегидратаза (КФ 4.2.1.12) + 2-кето-3-дезокси-6 6.7 9.3 1.8 1.2 24. фосфоглюконат альдолаза (КФ 4.1.2.14) 6-Фосфофруктокиназа 16.0 28.1 10.9 26.2 10. (КФ 2.7.1.11) Фруктозо-1,6-бисфосфат 147.0 132.8 37.5 100.2 157. альдолаза (КФ 4.1.2.13) Дегидрогеназа 3-фосфо глицеринового альдегида (КФ 30.6 72.4 10.2 52.3 32. 1.2.1.12) Примечание. Литоавтотрофный тип питания – Fe(II), миксотрофный – Fe(II), глюкоза (1.1 мМ), дрожжевой экстракт (0.02%), органогетеротрофный - глюкоза (1.1 мМ) и дрожжевой экстракт (0.02%).
иллюстрирует в 7–25 раз более низкий пул АТФ в клетках сульфобацилл, чем в клетках штаммов 4006 и 27009 (табл. 2). Причем, в начале роста и конце экспоненциальной фазы в клетках штаммов 4006 и 27009 уровень АТФ был в несколько раз выше, чем в клетках сульфобацилл, при их росте на среде с органическими субстратами. Часть популяции клеток сульфобацилл изменяла морфологию при смене оптимальных условий роста на гетеротрофные и была представлена раздутыми клетками.
В течение литотрофного роста окисление Fe(II) штаммами Kr1, 1269 и N (рис. 3) и Alb. tolerans К1 с низкой скоростью наблюдали сразу после перенесения бактерий из оптимальных миксотрофных условий. Автотрофные условия для этих микроорганизмов являются стрессовыми, о чем свидетельствует падение пула АТФ, предшествующее росту. Максимальный уровень пула АТФ, в сравнении с миксотрофными условиями, отличался у культур сульфобацилл и штамма К1 в 1.5– 5.0 и более раз (табл. 2). В клетках облигатного хемолитоавтотрофа At. ferrooxidans TFBk содержание АТФ достигало 17.0 нмоль/мг белка, что на 1–2 порядка Рис. 2. Органотрофный рост S. sibiricus N1 на среде с глюкозой и дрожжевым экстрактом. 1 –белок, мкг/мл (рост), 2 – утилизация глюкозы, %, 3 – концентрация АТФ, нмоль/мг белка.
Таблица 2. Параметры роста и содержание АТФ в клетках исследованных культур Тип питания Максимальная Окисленное Утилизация Максимальное Максимальный скорость роста, Fe(II), глюкозы, количество уровень АТФ, - ч мМ мМ белка, мг/л нмоль/мг белка S. thermotolerans Kr Миксотрофный 0.26 40 0.69 32.1 3. Органогетеротрофный 0.17 - 0.47 21.0 2. Литоавтотрофный 0.12 40 - 6.2 0. S. sibiricus N Миксотрофный 0.50 40 0.50 20.0 2. Органогетеротрофный 0.27 - 0.44 13.5 0. Литоавтотрофный 0.13 40 - 3.6 0. S. thermosulfidooxidans Миксотрофный 0.29 40 0.39 22.5 4. Органогетеротрофный 0.10 - 0.22 12.6 0. Литоавтотрофный 0.07 40 - 6.3 0. Alb. tolerans K Миксотрофный 0.17 20 1.10 38.7 0. Органогетеротрофный 0.13 - 0.96 14.0 3. Литоавтотрофный 0.09 10 - 7.5 0. At. ferrooxidans TFBk Литовтотрофный 0.20 144 - 16.2 17. Alb. cycloheptanicus Органогетеротрофный 0.20 - 55.00 220.0 12. Alb. acidocaldarius Органогетеротрофный 0.20 - 66.00 92.0 12. Рис. 3. Литотрофный рост S. thermosulfidooxidans на среде с Fe(II). 1 – белок, мкг/мл (рост), 2 – окисление железа Fe(II), г/л, 3 – концентрация АТФ, нмоль/мг белка.
превышало величину пула АТФ у сульфобацилл. Значительно более высокий уровень АТФ отмечен и у других автотрофов (Eigener, 1975;
Apel et al., 1980). При литотрофном типе питания сульфобациллы, штаммы Kr1, N1 и 1269, в отличие от штамма К1, окисляли все внесенное в среду закисное железо. Смена условий выращивания с миксотрофных на автотрофные отрицательно сказалась на накоплении клеточной массы культур и морфологии клеток (часть популяции была представлена клетками меньших размеров). АТФ, полученный в результате окисления железа, тратится в ряде энергоемких процессов – цикл Кальвина, трансмембранный транспорт, механические перемещения, и, вероятно, обратный перенос электронов. Результаты экспериментов позволяют заключить, что энергия, полученная в автотрофных условиях в результате окисления неорганических соединений, является недостаточной для обеспечения роста бактерий, сравнимого с миксотрофным.
В оптимальных миксотрофных условиях (рис. 4) бактерии S. thermotolerans Kr1, S. sibiricus N1, S. thermosulfidooxidans 1269 и Alb. tolerans росли с наиболее высокими скоростями и накапливали наибольшую биомассу (табл. 2). В потреблении глюкозы и закисного железа наблюдали конкуренцию. У S. sibiricus N Fe(II) частично ингибировало использование глюкозы на начальных этапах развития культуры;
у S. thermotolerans Kr1, S. thermosulfidooxidans 1269 и Alb. tolerans К1, наоборот, глюкоза ингибировала потребление железа. Сравнение максимального пула АТФ в клетках культур, выращенных при миксотрофном типе питания, показало, что у S. thermosulfidooxidans 1269, S. thermotolerans Kr1 и S. sibiricus N1, пул АТФ в 4–7 раз выше, чем у Alb. tolerans К1 (табл. 2). Это свидетельствует о большей степени хемолитотрофии штаммов сульфобацилл, тогда как способность штамма К1 к утилизации практически всей глюкозы, вносимой в среду, свидетельствует о его большей гетеротрофии. Таким образом, у штаммов 1269, Kr и K1 сопряженность процессов получения и использования энергии в оптимальных ростовых условиях выявляется довольно наглядно: прослеживается корреляционная зависимость между началом интенсивного роста культур и падением уровня АТФ в клетках этих бактерий. Сравнение данных по содержанию пула АТФ в клетках сульфобацилл, растущих при различных типах питания, позволяет сделать вывод, что миксотрофные условия являются оптимальными, поддерживающими неограниченное число пересевов этих бактерий.
Рис. 4. Миксотрофный рост S. thermotolerans Кr1 на среде с Fe(II), глюкозой и дрожжевым экстрактом.
1 – белок, мкг/мл (рост), 2 – окисление Fe(II), г/л, 3 – потребление глюкозы, %, 4 – изменение пула АТФ в динамике роста, нмоль/мг белка.
Пул АТФ, скорости дыхания и ингибирование синтеза АТФ в суспензиях клеток сульфобацилл. Поскольку АТФ, как было показано, образуется сульфобациллами при катаболизме глюкозы на уровне субстрата, одной из задач исследований было определение интенсивности синтеза АТФ при функционировании ЭТС при окислении неорганического и органических субстратов, а также проведение ингибиторного анализа и измерение скорости дыхания этих штаммов. Результаты изучения энергетического обмена на отмытых суспензиях клеток показали, что штаммы Kr1 и N1 синтезируют АТФ при внесении в среду инкубации Fe(II) и/или органических соединений (табл. 3). Наблюдали подавление синтеза АТФ на 50–90% (табл. 3) в зависимости от субстрата окисления, дициклогексилкарбодиимидом (ДЦКД) – специфическим ингибитором синтеза АТФ. Измерение скорости поглощения O2 суспензиями клеток показало, что клетки обеих культур имеют достаточно высокие скорости дыхания, когда донором электронов являются как Fe(II), так и органические соединения. Быстрое восстановление скорости дыхания, показанное для штамма N1, выращенного при парциальном давлении воздуха, в отсутствие интенсивной аэрации, свидетельствует о пластичности энергетического обмена, обеспечивающего сохранение жизнеспособности культуры (табл. 3).
Таблица 3. Синтез АТФ суспензиями клеток и его ингибирование 200 мкМ ДЦКД.
Скорость дыхания суспензий клеток при окислении неорганического и/или органических субстратов Субстраты Fe(II) глю* др. э.* Глю + Fe(II) + Fe(II) + Fe(II) + глю + др. э. глю др.э. др.э.
S. thermotolerans Kr АТФ, нмоль/мг белка 15.2 10.3 7.2 19.2 25 20.4 28. Ингибирование синтеза АТФ 78.5 93.0 74.4 91.8 79.6 87.2 90. ДЦКД, % Скорость дыхания, нмоль 571.6 310.0 270.0 580.0 685.1 657.4 733. О2/(мин·мг белка) (клетки выращены с интенсивной аэрацией) S. sibiricus N АТФ, нмоль/мг белка 12.3 11.5 7.7 17.0 22.0 21.0 26. Ингибирование синтеза АТФ 50.3 81.9 82.3 69.7 53.0 70.6 63. ДЦКД, % Скорость Клетки 520.0 220.0 295.5 400.5 620.7 643.1 690. дыхания, выращены с нмоль интенсивной О2/(мин· мг аэрацией белка) Клетки 457.0 353.6 254. выращены в отсутствие интенсивной аэрации Примечание. Количество клеточного белка в инкубационной среде – 1.1–1.5 мг.
*Дрожжевой экстракт или глюкоза.
ЭТС у сульфобацилл. Данные об ЭТС сульфобацилл в литературе почти не представлены. Так, упоминается растворимый кислотоустойчивый желтый хромофор в клетках S. thermosulfidooxidans BC1, способный окислять Fe(II) (Blake et al., 1993). Предполагается наличие цитохромоксидазы аа3 и присутствие цитохромов b-типа у штаммов S. thermosulfidooxidans TH1 и S. acidophilus ALV (Barr et al., 1990). Наиболее изучена ЭТС у At. ferrooxidans (Bruscella et al., 2007).
На первом этапе исследований ЭТС показано, что скорость окисления сульфата железа мембранной фракцией клеток S. sibiricus N1 максимальна при рН 3.0. Спектральная характеристика мембран, выделенных из клеток S. sibiricus N разного возраста, приведена на рис. 5. В начале экспоненциальной фазы роста (рис.
5а) на разностных спектрах поглощения виден широкий максимум при 604 нм с плечом при 595 нм в –полосе и максимум при 446 нм с плечом при 453 нм в – полосе, соответствующие цитохрому аа3-типа. Разностный спектр поглощения мембран из клеток поздней экспоненциальной фазы роста (рис. 5б), помимо спектральных характеристик оксидазы аа3-типа, выявил -, - и -максимумы при 564, 536 и 436 нм соответственно, относящиеся к цитохромам b/о типа. На СО разностном спектре поглощения видны цитохромы, способные связывать СО, а, следовательно, и кислород. Восстановленный+СО минус восстановленный разностный спектр мембран из клеток поздней экспоненциальной фазы роста выявил СО-связывающие цитохромы а- и о- типа. Присутствие цитохрома а показано максимумом поглощения при 545 нм и минимумом поглощения при нм. Минимумы при 590 и 433 нм свидетельствуют о присутствии цитохром о-СО комплекса.
Рис. 5. Разностные спектры поглощения мембран из клеток S. sibiricus N1 начала (а) и конца (б, в) экспоненциальной фазы роста.
Дитионит–восстановленные минус персульфат–окисленные разностные спектры мембран (а, б). СО–разностный (восстановление дитионитом натрия + СО минус восстановление дитионитом натрия) спектр поглощения солюбилизированных мембран (в). Концентрации белка (мг/мл):
а – 5.4, б – 4.8, в – 5.0.
Разностные спектры поглощения пиридиновых гемохромов (рис. 6) кислого ацетонового экстракта мембран из клеток конца экспоненциальной фазы роста выявили - максимум при 590 нм гема А, - и -максимумы при 559 и 527 нм гемов B и О (рис. 6а). Учитывая коэффициенты экстинкции для этих гемов, согласно полученному спектру, соотношение гемов А и В было 3.4 к 1. Разностный спектр белковых частиц после экстракции 5% НСl–ацетоном не выявил мембрансвязанного цитохрома с (рис. 6б). При более мягком режиме экстракции гемов из мембран смесью 2% HCl и ацетона на спектре видны -максимум при 573 нм и -максимум при 537 нм, которые относятся к цитохрому b573 (рис. 6в), обнаруженному ранее у архей (Barr et al., 1990). ВЭЖХ нековалентно связанных гемов показало наличие гемов A, B и О в мембранах шт. N1 (рис. 7). Методом электрофореза с ДС-Na выявлен растворимый полипептид с массой 13 кДа, обладающий пероксидазной активностью и, следовательно, являющийся цитохромом с (рис. 8). Так как в клетках S. sibiricus N1 практически отсутствует периплазматическое пространство, цитохром с, видимо, прикреплен к внешней стороне плазматической мембраны, и, скорее всего, переходит в растворимую фракцию после длительного разрушения ультразвуком.
Рис. 6. Разностные спектры поглощения мембран S. sibiricus N1 конца экспоненциальной фазы роста. Дитионит–восстановленные минус феррицианид–окисленные разностные спектры экстракта 5% НСl–ацетона в 20% пиридине (а), дитионит–восстановленные минус персульфат– окисленные разностные спектры экстракта 5% HCl–ацетоном в 50 мМ -аланин-H2SO буфере рН 3.0 (б), дитионит–восстановленные минус феррицианид–окисленные разностные спектры экстракта 2% HCl–ацетоном в 20% пиридине (в). Концентрации белка (мг/мл):
а – 2.0, б – 1.3, в – 2.2.
Согласно полученным данным по ингибированию NaN3 и KCN, одна из оксидаз более чувствительна к азиду и цианиду (рис. 9). Монофазная кинетика ингибирования дыхания мембран клеток ранней экспоненциальной фазы роста свидетельствует о преимущественном участии оксидазы аа3-типа, клеток поздней экспоненциальной фазы – выявляет преимущественное функционирование цитохрома bo3-типа. Обе оксидазы чувствительны к цианиду и азиду со значениями Ki 4.1 µМ и 2.5 µМ для цитохрома aa3 и 9.4 µМ и 7.0 µМ для цитохрома bo3.
Обобщив полученные результаты, можно предложить, что электронный транспорт от Fe(II) к акцептору O2 идет через растворимый цитохром с и оксидазу аа3-типа в клетках ранней экспоненциальной фазы роста и через цитохром с, высокопотенциальный цитохром b573 и оксидазу bo3-типа в клетках поздней экспоненциальной фазы роста. Исходя из полученных результатов, предполагается, что цитохромоксидаза bo3-типа обладает большим сродством к кислороду и дерепрессируется при снижении кислорода в среде культивирования с увеличением плотности популяции S. sibiricus N1. Таким образом, окисление Fe(II) направлено на поддержание роста и обеспечение высоких скоростей окисления данного субстрата а, следовательно, и запасание энергии при различных концентрациях кислорода в среде.
В качестве первого шага в установлении состава цитохромов термотолерантной сульфобациллы S. thermotolerans Kr1 была выбрана идентификация гемов. Анализ спектров пиридиновых производных гемохромов показал, что клетки штамма Kr1 содержат гемы А, В и, вероятно, С (рис. 10).
Согласно ВЭЖХ в клетках штамма Kr1 присутствуют гемы А и В (рис. 11). Гем А служит указанием на наличие саа3 или аа3 цитохромоксидазы, гем B – цитохромов b-типа.
Рис. 7. Профили элюции нековалентно связанных гемов, экстрагированных из мембран S. sibiricus N1 (а) и контрольных культур E. coli (б) и В. subtilis (в), полученные методом ВЭЖХ в обращенной фазе.
Линия тренда (б) характеризует градиент элюции ацетонитрила (30–100%) в Н2О, содержащей 0.05% трифторуксусной кислоты.
Время удерживания (мин) гемов-стандартов:
гем D – 13.1, гем B – 15.1, гем А – 21.6, гем О – 26.4.
Рис. 8. Электрофорез с ДС-Na в ПААГ (12.6%) растворимой фракции клеток S. sibiricus N1 конца экспоненциальной фазы роста. 1 – цитохром с сердца лошади, 2 – растворимая фракция.
Содержание белка в 1 и 2 – 5 мкг. Гель окрашивали на пероксидазную активность гема с помощью 3,3’,5,5’ – тетраметилбензидина и H2O2.
Рис. 9. Кинетики ингибирования цианидом калия (а) и азидом натрия (б) железооксидазной активности мембран S. sibiricus N1 начала () и конца () экспоненциальной фазы роста.
V/Vi – 100/активность, %. [KCN] – концентрация цианида калия, мкМ, [NaN3] – концентрация азида натрия, мкМ.
И Рис. 10. Дитионит–восстановленный минус феррицианид–окисленный дифференциальный спектр поглощения пиридиновых гемохромов, экстрагированных 5% НСl–ацетоном в 20% пиридине из мембран S. thermotolerans Kr конца экспоненциальной фазы роста.
Концентрация белка – 2.3 мг/мл.
Рис. 11. Профиль элюции нековалентно связанных гемов, экстрагированных из мембран S. thermotolerans Kr1, полученный методом ВЭЖХ в обращенной фазе. Линия тренда характеризует градиент элюции ацетонитрила (30–100%) в Н2О, содержащей 0.5% трифторуксусной кислоты. Время удерживания (мин) гемов-стандартов В. subtilis FTU:
гем B – 13.3, гем А – 17.5.
Использование Fe(III) в качестве альтернативного акцептора электронов.
Ранее было показано восстановление Fe(III) у двух видов умеренно термофильных сульфобацилл (Bridge, Johnson, 1998);
в нашем исследовании установлено, что S.
thermotolerans Kr1 и S. sibiricus N1 способны использовать альтернативный кислороду акцептор электронов – Fe(III) – при изменении условий аэрации. Так, в условиях гипоксии (0.07% O2 в газовой фазе) окисление дрожжевого экстракта и глицерина сопряжено с восстановлением Fe(III) до Fe(II) (табл. 4). При снижении содержания кислорода в газовой фазе в среде культивирования до 17% акцепоторами электронов являлись и O2, и Fe(III) (табл. 4). При этом конечная концентрация О2 в газовой фазе была равной 10.3%;
из 7.50 мМ Fe(III) образовывалось 5.75 мМ Fe(II). В условиях гипоксии Fe(III) полностью восстанавливалось клетками S. thermotolerans Kr1 и S. sibiricus N1. При этом максимальная биомасса бактерий в условиях гипоксии через 8 суток культивирования несколько уступала величине биомассы культур на среде с глюкозой и дрожжевым экстрактом в условиях интенсивной аэрации.
Использование термофильных сульфобацилл для биоокисления упорного пирротинового золотосодержащего пиритно–арсенопиритного концентрата при 500С. Поскольку изученные сульфобациллы, согласно полученным результатам, обладают большими метаболическими возможностями, представляло интерес проследить реализацию гибкости обмена этого вида в оптимальных температурных условиях (500С) при биовыщелачивании золотосодержащего флотоконцентрата Олимпиадинской руды в режиме двустадийного - полунепрерывного культивирования при D=0.0042 ч, плотности пульпы Т:Ж = 1:7.5. Для биоокисления использовали ассоциацию штаммов, выделенную из Олимпиадинской руды. Элементный состав флотоконцентрата, %: Sbобщ – 12.8, SbS – 10.7, Feобщ – 14.98, FeS – 10.8, Sобщ – 15.96, SS – 14.3, S0 – 1.59, Asобщ – 4.85, AsS – 2.02, Ca – 5.2, Cорг – 3.2. Au – 124 г/т. Крупность концентрата 80% –0.044 мм. Параметры бактериального окисления приведены в табл. 5. В конце процесса установлена высокая степень окисления FeS, AsS и SbS. В биокеке (остаток концентрата после окисления сульфидных минералов) содержание элементов было низким (табл. 6), что привело к увеличению степени извлечения золота и сократило расход цианида натрия. Таким образом, использование термофильных сульфобацилл при 500C целесообразно. Высокие температуры позволят сократить затраты воды и электроэнергии на охлаждение реакторов, а также снизить расход серной кислоты на поддержание pH.
Выделение преобладающих культур из термофильной ассоциации. После окончания процесса БО была выделена накопительная культура, а затем преобладающие штаммы на субстратах окисления – Fe(II), S0 и флотоконцентрате.
По своим молекулярно-генетическим признакам (составу оснований ДНК, уровню ДНК/ДНК гибридизации, данных рестрикционного анализа хромосомной ДНК) и Таблица 4. Использование Fe (III) штаммами S. sibiricus N1 и S. thermotolerans Kr1 в качестве альтернативного акцептора электронов при снижении содержании О2 в газовой фазе и условиях гипоксии Субстраты и условия культивирования Число клеток, Fe (III), Fe(II), 1• 107 кл/мл мМ мМ S. sibiricus N Дрожжевой экстракт 17% О2 в газой фазе 15.2 1.25 5. (0.02%) Гипоксия, близкая к аноксии (0.07% О2) 9.1 0 10. S. thermotolerans Kr Дрожжевой экстракт Гипоксия, близкая к аноксии (0.07% О2) 8.7 0 10. (0.02%) Глицерин (10 мМ) Гипоксия, близкая к аноксии (0.07% О2) 8.3 0 10. Примечание. Засев – 1.0 • 107 кл/мл. Концентрация Fe(II) – за вычетом контроля.
Таблица 5. Параметры бактериального окисления сульфидных минералов золотосодержащего концентрата Олимпиадинской руды ассоциацией штаммов сульфобацилл в ходе двустадийного полунепрерывного процесса при D=0.0042 ч-1 в отливно–доливном режиме в реакторах при 500С №=п/п Технологические параметры Единицы Значения параметров в ходе процесса измерения процесса БО I реактор II реактор 1 Промежуток времени между ч 24 отливом–доливом пульпы 5.70•107– 6.30•107–8.40• 2 Общее количество клеток кл/мл 2.09• микробной ассоциации 3 Концентрация железа, г/л 11.96 12. суммарная 4 Активная кислотность жидкой ед pH 1.40–1.70 1.25–1. фазы пульпы 5 Окислительно- мВ 704–798 798– восстановительный потенциал 6 Концентрация мышьяка, г/л 2.46 2. суммарная 7 Продолжительность процесса сут 10 свойствам окисления субстратов все они принадлежали виду S. sibiricus. Один из штаммов – S. sibiricus HTFe2 обладал одинаковой способностью к окислению как Fe (II), так и серы. Другой штамм HTК активно окислял концентрат, по данным рестрикционного анализа хромосомной ДНК он был близок к штамму HT1.
Последний штамм обладал наиболее низким оптимумом pH роста. Штамм HTS отличается от других выделенных штаммов широкой областью рН-оптимума роста и окисления S0 (2.05–2.40), толерантностью к органическим соединениям и высокой степенью специализации в отношении субстрата окисления.
Таблица 6. Содержание элементов в биокеке флотоконцентрата Олимпиадинской руды и степень извлечения золота ассоциацией штаммов S. sibiricus в результате двустадийного полунепрерывного процесса при D=0.0042 ч-1 и температуре 500С № Содержание элементов в биокеке, % Степень реактора извлечения S Sобщ. SS SbS AsS FeS золота, % 1 11.90 4.26 1.57 0.7 0.130 3.23 90. 2 9.66 1.18 0.83 0.2 0.012 0.63 91. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В данной работе исследованы как пути метаболизма сульфобацилл, так и параметры роста, потребление субстратов, морфология клеток при различных типах питания. Изучение особенностей роста и конструктивного метаболизма бактерии S.
thermotolerans Kr1, недавно выделенной из золотосодержащего концентрата Олимпиадинского месторождения, позволяет заключить, что данный вид характеризуется адаптивным типом метаболизма. Об этом свидетельствуют наличие активности ключевых ферментов всех трех главных путей диссимиляции сахаров, карбоксилаз автотрофной и гетеротрофной фиксации при миксо-, органогетеро- и литоавтотрофном типах питания и изменение активности ферментов при смене энергетического источника. Сохранение жизнеспособности и окислительных свойств термотолерантных сульфобацилл при температурах роста, близких к предельным (12 и 550С), свидетельствует о приспособлении этих бактерий как к повышенным, так и пониженным температурам в местах обитания и объясняет их присутствие и функционирование в природных и техногенных эконишах.
Различие в величине пула АТФ в клетках сульфобацилл в динамике их миксо-, органо- и литотрофного роста подтверждает, что оптимальный тип питания этих бактерий – миксотрофный, при этом пул АТФ максимален, тогда как в гетеротрофных и автотрофных условиях пул АТФ снижен. Установленную взаимосвязь между внутриклеточной концентрацией АТФ, использованием субстратов и ростовыми параметрами культур следует учитывать при оптимизации условий деятельности сообщества микроорганизмов при выщелачивании/окислении сульфидных минералов руд и концентратов. Полученные данные о синтезе АТФ, его ингибировании ДЦКД и высокой скорости дыхания клеток S. sibiricus и S. thermotolerans свидетельствуют о том, что при окислительном фосфорилировании источником энергии могут служить не только неорганические, но и органические вещества. В условиях сниженной концентрации кислорода и гипоксии показано окисление органических соединений штаммами Kr1 и N1, сопряженное с восстановлением Fe(III) до Fe(II). Полученные результаты об электронтранспортной системе (ЭТС) S. sibiricus N1 позволили предложить вероятную схему окисления закисного железа у данного микроорганизма. Штамм обладает разветвленной ЭТС, в состав которой в начале экспоненциальной фазы роста входят растворимый цитохром с, цитохромоксидаза аа3-типа и в конце экспоненциальной фазы – цитохром с, высокопотенциальный цитохром b573 и цитохромоксидаза bo3-типа.
Установлено, что простетическими группами цитохромов являются гемы А, B, C и О в случае умеренно термофильного штамма N1 и гемы А, B и, вероятно, С – у термотолерантного штамма Kr1.
Полученные данные свидетельствуют о том, что экстремальные условия обитания привели к выработке приспособительных механизмов и отдельных реакций, обеспечивающих выживание сульфобацилл. Одним из них является чрезвычайная пластичность их конструктивного и энергетического обмена, а именно, способность переключаться с одного типа метаболизма на другой.
Возможность использования термофильных сульфобацилл при температуре 500С для биовыщелачивания золотосодержащих концентратов сульфидных руд позволит интенсифицировать данный процесс и значительно снизить затраты. Из микробных ассоциаций, окисляющих сульфидный концентрат в лабораторных реакторах, выделены новые штаммы сульфобацилл и отнесенны к виду S. sibiricus на основании совокупности характеристик.
Таким образом, полученные в ходе выполнения работы сведения значительно расширили данные о центральном углеродном и энергетическом обмене сульфобацилл и ацидофильных микроорганизмов, в целом.
ВЫВОДЫ 1. Новая бактерия S. thermotolerans Kr1Т ассимилирует углерод из СО2 и органических субстратов, набор которых шире, чем у умеренного термофила S.
sibiricus N1Т.
2. У S. thermotolerans Kr1Т впервые обнаружена активность ферментов трех главных путей катаболизма углеводов (фруктозобисфосфатного, окислительного пентозофосфатного и Энтнера–Дудорова), а также карбоксилаз автотрофной и гетеротрофной фиксации СО2 при хемолитоавтотрофном, хемоорганогетеротрофном и миксотрофном типах питания. Установлено, что ЦТК не замкнут, глиоксилатный шунт отсутствует. При температурах роста, близких к предельным (12 и 550С) пентозофосфатный путь окисления глюкозы и активность аконитатгидратазы утрачиваются.
3. Миксотрофный тип питания у термотолерантной и умеренно термофильных сульфобацилл обеспечивает максимальный уровень пула АТФ в клетках и выживание бактерий при многократных пересевах. Низкий уровень пула АТФ при литоавто- и органогетеротрофном типах питания коррелирует с прекращением роста бактерий после нескольких пассажей.
4. Доказано, что в аэробных условиях Fe(II) и/или органические соединения являются донорами электронов для электронтранспортной системы (ЭТС). В условиях гипоксии (0.07% О2 в газовой фазе) окисление органических веществ сопряжено с восстановлением Fe(III) в качестве альтернативного кислороду акцептора электронов.
5. ЭТС S. sibiricus N1 при окислении Fe(II) в клетках начала экспоненциальной фазы роста включает кислотоустойчивый растворимый цитохром с и цитохромоксидазу aa3-типа, в клетках конца экспоненциальной фазы – цитохром с, мембрансвязанный высокопотенциальный цитохром b573 и цитохромоксидазу bo3-типа;
выявлены гемы А, B, С и О. Клетки S. thermotolerans Kr1 содержат гемы А, В, не исключено наличие цитохрома С.
6. Лабильность путей энергетического и углеродного метаболизма сульфобацилл обеспечивает их доминирование в природных ассоциациях ацидофильных термофильных микроорганизмов, что может быть использовано в биогидрометаллургических технологиях извлечения золота из сульфидных минералов концентратов пиритно–арсенопиритных руд при температурах 40–50 0С в условиях непостоянства состава энергетического субстрата и содержания органических веществ в пульпе.
Список работ, опубликованных по материалам диссертации Экспериментальные статьи:
1. Цаплина И.А., Журавлева А.Е., Исмаилов А.Д., Захарчук Л.М., Красильникова Е.Н., Богданова Т.И., Каравайко Г.И. Взаимосвязь внутриклеточного содержания АТФ с типом питания ацидофильных бактерий рода Sulfobacillus thermotolerans и Alicyclobacillus tolerans. Микробиология. 2007. Т. 76. № 6. С.
742-751.
2. Zhuravleva A.E., Tsaplina I.A., Ismailov A.D., Zakharchuk L.M., and Karavaiko G.I. Metabolism peculiarities of bacteria of the genus Sulfobacillus. Advanced Materials Research. 2007. V. 20–21. P. 469–472.
3. Журавлева А.Е., Исмаилов А.Д., Захарчук Л.М., Красильникова Е.Н., Цаплина И.А. Особенности процессов энергообеспечения у умеренно термофильных бактерий рода Sulfobacillus. Микробиология. 2008. Т. 77. № 5. С. 708–712.
4. Цаплина И.А., Красильникова Е.Н., Журавлева А.Е., Егорова М.А., Захарчук Л.М., Сузина Н.Е., Дуда В.И., Богданова Т.И., Стадничук И.Н., Кондратьева Т.Ф. Сравнительные аспекты фенотипических свойств Sulfobacillus thermotolerans. Микробиология. 2008. Т. 77. № 6. С. 742–751.
5. Dinarieva T.Y., Zhuravleva A.E., Pavlenko O.A., Tsaplina I.A., Netrusov A.I.
Ferrous iron oxidation in a moderate thermoacidophile Sulfobacillus sibiricus N1Т. FEBS Lett. (в печати).
Тезисы конференций:
1. Журавлева А.Е., Каравайко Г.И. “Особенности метаболизма бактерий семейства Alicyclobacillaceae”. II молодежная международная школа-конференция “Актуальные аспекты современной микробиологии”. Москва. Россия. 1–3 ноября 2006. С. 57–58.
2. Журавлева А.Е., Цаплина И.А., Исмаилов А.Д., Богданова Т.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М., Красильникова Е.Н., Каравайко Г.И. “Особенности метаболизма бактерий семейства Alicyclobacillaceae”. Четвертый московский международный конгресс “Биотехнология: состояние и перспективы развития”. Москва. Россия. 12-16 марта г. С. 350.
3. Цаплина И.А., Богданова Т.И., Савари Е.Е., Сергеева Т.В., Кондратьева Т.Ф., Журавлева А.Е., Седельникова Г.В., Каравайко Г.И. “Исследование сообщества умеренно термофильных сульфобацилл в процессе окисления пиритно– арсенопиритного концентрата”. Четвертый московский международный конгресс “Биотехнология: состояние и перспективы развития”. Москва. Россия. 12-16 марта г. С. 325.
4. Zhuravleva A.E., Tsaplina I.A., Ismailov A.D., Zakharchuk L.M., and Karavaiko G.I.
Metabolism peculiarities of bacteria of the genus Sulfobacillus. International Biohydrometallurgy Symposium “Biohydrometallurgy: From the Single Cell to the Environment”. 2007. V. 20–21. P. 469–472.
5. Цаплина И.А., Журавлева А.Е., Богданова Т.И., Кондратьева Т.Ф. “Биотехнологический потенциал хемолитотрофных умеренно термофильных бактерий Sulfobacillus sibiricus”.
Международная научная конференция «Микроорганизмы и биосфера». Москва. Россия.
19–20 ноября 2007. С. 140–141.
6. Журавлева А.Е., Цаплина И.А. “К вопросу об энергетическом метаболизме сульфобацилл”. IV молодежная школа-конференция с международным участием “Актуальные аспекты современной микробиологии”. Москва. Россия. 20–22 октября 2008. С. 16–18.