Распространение и молекулярные механизмы резистентности к макролидным антибактериальным препаратам микроорганизмов рода streptococcus в российской федерации

На правах рукописи

Филимонова Ольга Юрьевна Распространение и молекулярные механизмы резистентности к макролидным антибактериальным препаратам микроорганизмов рода Streptococcus в Российской Федерации 03.02.03 – Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2010 год 1

Работа выполнена в государственном образовательном учреждении дополнительного профессионального образования «Российская Медицинская Академия Последипломного Образования»

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Сидоренко Сергей Владимирович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Белокрысенко Сергей Сергеевич доктор медицинских наук, профессор Мазурова Изабелла Константиновна

Ведущая организация: Военно-медицинская Академия им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится " " _ г.

в часов на заседании диссертационного совета Д 208.04.01 при Федеральном Государственном учреждении науки «Московский научно исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.

Г.Н.Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г.Москва, ул.Адмирала Макарова, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.

Г.Н.Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Автореферат разослан " " _ 2010г.

Ученый секретарь диссертационного совета Доктор медицинских наук О.Ю.Борисова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Респираторные инфекции занимают важное место среди инфекционных заболеваний человека.

Наиболее частыми возбудителями респираторных инфекций в амбулаторной практике являются Streptococcus pneumoniae и Streptococcus pyogenes (-гемолитический стрептококк группы А) (Белошицкий Г.В., 2005;

Белов Б.С., 2003;

Зубков М.Н., 2005;

Катосова Л.К., 2005;

Королева И.С., 2003;

Ноников В.Е., 2001;

Манеров Ф.К., 1990;

Сидоренко С.В., 2004;

Черняев А.Л., 2002).

Макролиды, а также сходные с ними по механизму действия линкозамиды и стрептограмины, давно и с успехом применяются в амбулаторной практике при различных бактериальных инфекциях респираторного тракта. Данные препараты объединены в MLS антимикробную группу (M-макролид, L-линкозамид, S-стрептограмин). При этом появление в 80-е – 90-е годы прошлого века новых препаратов этой группы существенно расширило возможности их практического применения (Дворецкий Л.И., 2005;

Заплатников А.Л., 2002;

Козлов Р.С., 2001;

Bergman M., 2006).

Однако, широкое, а в ряде случаев бесконтрольное и неоправданное использование макролидных антибиотиков при респираторных инфекциях, привело к появлению среди пневмотропных возбудителей устойчивых штаммов. Так, наиболее высокий удельный вес резистентных штаммов S.pneumoniae и S.pyogenes отмечен в тех странах, где макролидные антибиотики традиционно широко используются в клинической практике (Bergman M., 2004;

Critchley I.A., 2007;

Doern G.V., 2005;

Fujita K., 1994;

Gherardi G., 2007;

Gracia, M., 2009;

Guchev A., 2006;

Kresken M, 2004).

К наиболее распространенным механизмам устойчивости стрептококков к макролидным антибиотикам относятся модификация мишени действия этих препаратов (метилирование участка связывания антибиотиков, расположенного в V домене рРНК) и активное выведение лекарственного вещества из внутренней среды бактериальной клетки (эффлюкс). К редким механизмам устойчивости относятся мутации в генах рРНК и генах рибосомальных белков. Ферменты, осуществляющие метилирование рРНК, кодируются группой родственных генов (erm). У стрептококков чаще всего встречаются и гены, erm(A) erm(B) локализованные на хромосомах в составе транспозонов. Активное выведение макролидов осуществляется транспортными системами, представляющими собой крупные белки с 12-ю трансмембранными доменами. Указанные белки кодируются группой близкородственных генов (mef), которые локализуются на различных генетических элементах и опосредуют несколько различные уровни резистентности. В последние годы замечено возрастание количества вариантов mef генов (Betschel S.D., 1998;

Blackman Northwood J., 2009;

Cochetti I., 2005;

Corne H.W. Klaassen, 2005;

Del Grosso M., 2004;

Farrell DJ, 2005).

В связи с вышеизложенным, наблюдение за динамикой распространения устойчивости к макролидам среди стрептококков и расшифровка ее механизмов является необходимым условием обоснования рационального применения этих антибиотиков. Учитывая особенности быстрого распространения резистентности среди стрептококков посредством эффлюкса, представляется актуальным более углубленное исследование mef генов.

Цель исследования.

Оценить, c помощью современных фенотипических и молекулярно генетических методов, динамику распространения штаммов S.pneumoniae и S.pyogenes резистентных к макролидным антибиотикам, выделенных от больных с внебольничными респираторными инфекциями, и расшифровать молекулярные механизмы устойчивости.

Задачи исследования.

1. Оценить динамику распространения штаммов S. pneumoniae и S. pyogenes устойчивых к макролидным антибиотикам, выделенных от больных с внебольничными респираторными инфекциями в различных регионах Российской Федерации.

2. Расшифровать механизмы резистентности у штаммов, проявляющих фенотипическую устойчивость к макролидным антибиотикам, и выявить ведущие механизмы устойчивости.

3. Разработать высокопроизводительный метод дифференцировки mef-генов на подклассы, основанный на определении нуклеотидных полиморфизмов в реакции минисеквенирования с последующим масс спектрометрическим анализом.

4. Оценить клональное родство антибиотикоустойчивых штаммов S.pneumoniae.

Научная новизна работы.

В ходе настоящего исследования выявлены значительные различия в динамике распространения и уровне резистентности к макролидным антибиотикам среди S.pneumoniae и S.pyogenes в различных регионах Российской Федерации. Указанные различия обосновывают необходимость разработки региональных рекомендаций по применению макролидов для эмпирической терапии инфекций дыхательных путей.

Проведенный мониторинг чувствительности к антибактериальным препаратам у 2944 клинических штаммов S.pneumoniae и S.pyogenes, выделенных от больных с респираторными инфекциями показал, что характер динамики распространения изолятов, устойчивых к макролидным антибактериальным препаратам, а также абсолютные показатели уровня резистентности в отдельных регионах РФ существенно различаются.

С помощью ПЦР проведена детекция генов резистентности у штаммов стрептококков, проявляющих фенотипическую устойчивость к макролидным антибиотикам. Выявлено, что ведущими механизмами устойчивости у штаммов S.pneumoniae были: рибосомальное метилирование, кодируемое erm(B)-геном и сочетание метилирования (присутствие erm(B) гена) с активным выведением лекарственного вещества, связанное с наличием mef гена. В последние годы отмечено нарастание частоты выделения штаммов S.pneumoniae, несущих одновременно два гена, что увеличивает уровень резистентности микроорганизмов. Ведущим механизмом устойчивости к макролидам у штаммов S.рyogenes был эффлюкс, опосредованный mef-геном.

Разработан высокопроизводительный метод дифференцировки mef-гена на подклассы, основанный на MALDI-TOF масс-спектрометрии продуктов амплификации, полученных с помощью термоциклического достраивания праймеров с участием дезокси- и дидезоксинуклеотид-трифосфатов.

Впервые, с помощью разработанного метода, была проведена дифференцировка mef-генов на подклассы mef(A), mef(E) и mef(I) у штаммов S.pneumoniae и S.pyogenes.

Проведено мультилокусное сиквенс-типирование макролид резистентных штаммов обладающих ассоциированной S.pneumoniae, устойчивостью к бета-лактамным антибиотикам. Установлено, что они принадлежат к международно-распространенным клональным комплексам СС81, СС271 и СС315.

Практическая значимость работы.

Собрана уникальная коллекция клинических штаммов S.pneumoniae и S.pyogenes, выделенных от больных с внебольничными респираторными инфекциями в различных регионах РФ, позволяющая проводить многоплановые исследования с целью оценки динамики изменения антибиотикочувствительности и перспективности использования новых групп антибактериальных препаратов.

Полученные данные о динамике распространения штаммов S.pneumoniae и S.pyogenes резистентных к макролидным антибиотикам в различных регионах России могут быть использованы для оптимизации антибактериальной терапии респираторных инфекций.

Создан банк ДНК клинических изолятов S.pneumoniae и S.pyogenes, устойчивых к макролидным антибактериальным препаратам, который можно использовать в дальнейших работах по прогнозированию распространения резистентных штаммов и в исследованиях, направленных на изучение молекулярно-генетических механизмов их передачи.

Разработанный высокопроизводительный метод выявления нуклеотидных полиморфизмов для дифференцировки mef генов расширяет возможности лабораторий лечебно-профилактических учреждений по наблюдению за динамикой распространения детерминант устойчивости к макролидным антибиотикам и повышает эффективность методов идентификации, генотипирования и определения генетических маркеров лекарственной устойчивости микроорганизмов.

Нуклеотидные последовательности различных подклассов mef генов, обнаруженных у штаммов S.pneumoniae, внесены в международную базу GenBank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ (EU486997, EU486999, EU486995, EU487001).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Динамика распространения штаммов и S.pneumoniae S.pyogenes резистентных к макролидным антибиотикам в различных регионах Российской Федерации носит разнонаправленный характер, а ее уровень варьирует в широких пределах.

2. Ведущие механизмы устойчивости к макролидным антибиотикам у штаммов и различаются. У штаммов S.pneumoniae S.pyogenes S.pneumoniae устойчивость связана либо с генами erm(B), либо с наличием генов erm(B) и mef одновременно. У штаммов S.pyogenes устойчивость связана, в основном с mef генами.

3. Распространенные среди Streptococcus spp. mef гены отличаются значительным разнообразием. Среди S.pneumoniae превалируют гены mef(E) подкласса, среди S.pyogenes – mef(I) подкласса.

Апробация работы.

Диссертация апробирована на заседании кафедры микробиологии Российской медицинской академии последипломного образования, протокол №6 от 14 октября 2009 г.

Основные результаты исследований представлены и доложены на VII-й Российской научно-практической конференции «Современные проблемы антимикробной химиотерапии» (Москва, 2006), Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным болезням (Копенгаген, 2005), Международной конференции по антимикробным препаратам и химиотерапии (Сан-Франциско, 2006), конференции Европейского общества химиотерапии (Ахен, 2006), Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным болезням (Мюнхен, 2007), II-м Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2010).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 16 научных работ, в том числе статей, опубликованны в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 2 статьи в периодической печати, 9 – в материалах конференций.

Структура и объем диссертации.

Материалы диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, заключение по обзору литературы, 5 глав собственных исследований, заключение, выводы, приложение. Работа иллюстрирована 19 таблицами и рисунками. Список использованной литературы включает 156 источников, в том числе отечественных – 44 и зарубежных – 112 авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы.

Материалы.

В работу включены 2944 клинических изолята бактерий рода и полученных в ходе Streptococcus (S.pneumoniae S.pyogenes), многоцентрового исследования в период с 2002 по 2007 гг от больных с респираторными инфекциями различной локализации (острые синуситы, острые средние отиты, обострение хронических бронхитов, пневмонии, пневмонии с бактериемией, менингиты, конъюнктивиты) из десяти ЛПУ г.Москвы и из областных клинических больниц г.Санкт-Петербурга, г.Ярославля, г.Томска, г.Иркутска, г.Владивостока. Источниками выделения бактерий были: мокрота, бронхо-альвеолярный аспират, аспират из придаточных пазух носа, мазки из зева. Коллекция образцов клинических штаммов по годам и Федеральным округам представлена в таблице 1.

Таблица 1.

Коллекция образцов клинических штаммов Федеральные округа Микро- Общее Год Северо- Дальнево организм кол-во Центральный Сибирский Западный сточный S. pn 0 0 0 S. pyo 186 0 9 S. pn 237 0 0 S. pyo 173 0 45 S. pn 300 31 250 S. pyo 158 0 38 S. pn 242 101 242 S. pyo 117 0 54 S. pn 253 47 157 S. pyo 34 0 27 S. pn 82 6 18 S. pyo S. pn 2103 1114 185 667 Итого S. pyo 841 668 0 173 Методы.

Микробиологические исследования.

Идентификацию бактерий в бактериологических лабораториях ЛПУ проводили микроскопическим и культуральным методами, а также коммерческими тест-системами Crystal (BD, США). В качестве контроля использован референтный штамм АТСС 49619 S.pneumoniae.

Определение чувствительности к антимикробным препаратам проводилось методом микроразведений в бульоне Мюллера-Хинтон (BBL, США) согласно рекомендациям и критериям Методических указаний по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам 2004г, а также CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institution, 2007г.) в 96-лунковых планшетах для иммунологических исследований.

В панель тестируемых антибиотиков для штаммов S.pneumoniae были включены: эритромицин, кларитромицин, азитромицин, спирамицин, мидекамицин ацетат, джозамицин, телитромицин, клиндамицин;

для штаммов S.pyogenes – пенициллин, эритромицин, телитромицин, клиндами цин, тетрациклин, хлорамфеникол, офлоксацин, левофлоксацин (Sigma).

Молекулярные методы исследования.

Выделение ДНК. ДНК из суточной культуры S. pneumoniae или S.pyogenes, выращенной на твердом Колумбийском агаре (bioMerieux, Франция) c добавлением 5% дефибринированной бараньей крови, была выделена с помощью набора «ДНК-экспресс» (ООО НПФ «Литех», г.Москва), согласно инструкции.

Таблица 2.

Набор олигонуклеотидных праймеров, использованных для амплификации различных фрагментов генома Размер Локус Праймер 5’-3’ последовательность продукта, N п.н.

5’ ATG GAA AAA TAC AAC AAT TGG AAA 3’ 1 mef mef_F 5’ TTA TTT TAA ATC TAA TTT TCT AAC CTC 3’ mef_R 5’ ATG GAA AAA TAC AAC AAT TGG AAA 3’ 2 mef_1 mef_F_ 5’ CC AGC TGC TGC GAT AAT TAA ATC 3’ mef_R_ 5’ GCC TGA ATA TTT AGG ACG TGT 3’ 3 mef_mel mef_mel_F 5’ CTT CAC GGT CTA AAT GGC TCG 3’ mef_ mel_R 5’ GAA AAG GTA CTC AAC CAA ATA 3’ 4 ermB ermB_F 5’ AGT AAC GGT ACT TAA ATT GTT TAC 3’ ermB_R 5’ TCT AAA AAG CAT GTA AAA GAA 3’ 5 ermA ermA_F 5’ CTT CGA TAG TTT ATT AAT ATT AGT 3’ ermA_R Штаммы, нечувствительные к макролидным антибактериальным препаратам, исследованы методом полимеразной цепной реакции для детекции erm-генов и mef-генов. В исследовании использованы праймеры, представленные в таблице 2 (Okitsu N. et al. J Clin Microbiol. 2005;

Klaassen, CHW, Mouton JW, Antimicrob Agents Chemother. 2005, Филимонова О.Ю.

2007). Из-за того что, не всегда воспроизводился результат с праймерами для mef-гена, взятыми из других источников, нами разработаны праймеры mef_ и mef_mel и подобраны условия ПЦР, которые использовались параллельно.

Полимеразная цепная реакция проведена в амплификаторе PTC- DNA Engine Tetrad2 (MJ Research Bio-Rad, США) с последующим анализом продуктов амплификации в 2%-ном агарозном геле.

Определение нуклеотидной последовательности генов проводили модифицированным методом Сенгера с использованием прибора ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США;

Hitachi Япония).

Полноразмерную последовательность генов получали путем склеивания нуклеотидных фрагментов с использованием программного продукта «Vector NTI Suite v. 9» (Informax Inc, США). Для поиска гомологичных нуклеотидных или аминокислотных последовательностей в международных базах данных GenBank и EMBL была использована программа BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).

Статистическую обработку и анализ данных производили с помощью компьютерных программ Microsoft® Office Excel 2003, Whonet-5.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Динамика распространения штаммов S. pneumoniae и S.pyogenes резистентных к макролидам и оценка антибактериальной активности препаратов MLS-группы Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам является неотъемлемой частью в работе клинических лабораторий в ЛПУ при диагностике возбудителей респираторных инфекций.

Проведен анализ статистических параметров макролидов и линкозамидов за пять лет (характер распределения МПК, диапазон МПК, значения МПК50, МПК90, средняя геометрическая МПК) у 2103 штаммов S.pneumoniae и 841 штамма S.pyogenes.

Выявлено, что наибольший уровень антибактериальной активности к изученным штаммам S.pneumoniae и S.pyogenes наблюдался у телитромицина (полусинтетическое производное эритромицина, выделенное в подгруппу кетолидов).

Препараты эритромицин природный макролид), (14-членный кларитромицин (14-членный полусинтетический макролид) и клиндамицин (линкозамид) практически не различались по уровню активности и уступали телитромицину у обоих представителей рода Streptococcus. Уровень активности азитромицина (15-членный полусинтетический макролид) был несколько ниже, чем у трех выше приведенных антибиотиков.

Следует также отметить, что соотношение чувствительных, промежуточных и устойчивых штаммов для 14-ти и 15-ти членных макролидов было практически одинаковым.

Уровень чувствительности к телитромицину составил 99% у всех изученных штаммов. Только один штамм S.pneumoniae и пять штаммов S.pyogenes показали промежуточную устойчивость к этому препарату.

Учитывая приведенные данные, для анализа динамики распространения резистентных штаммов использовали эритромицин, как маркер устойчивости ко всем 14-ти и 15-ти членным макролидам, а также клиндамицин, как представитель линкозамидов.

На рисунке 1 представлен сводный график динамики распространения штаммов и S.pyogenes резистентных к эритромицину и S.pneumoniae клиндамицину (в %) по годам.

Выявлено, что уровень устойчивости S.pyogenes к эритромицину на территории Российской Федерации выше, чем у штаммов S. pneumoniae и варьирует в диапазоне 7-15.8%.

А уровень резистентности к клиндамицину, напротив, выше у штаммов S. pneumoniae, чем у пиогенных стрептококков, и практически полностью повторяет динамику устойчивости пневмококков к эритромицину, разница в частоте устойчивости к сравниваемым препаратам не превышает 1% - 2%.

15, 12, 11, 9, 9, 9,7 9, 7, 8 8,72 8, 5, 7, 6, 5, 4, 2002 2003 2004 2005 2006 Рисунок 1. Динамика распространения штаммов S.pneumoniae и S.pyogenes резистентных к эритромицину и клиндамицину (в %).

Примечание:

15, 12,7 11,48 9, 9,7 9,69 9, 7, 8,72 5,2 8, 7, 6, 5, 4, 2002 2003 2004 2005 2006 :

Эритромицин S.pneumoniae Клиндамицин S.pneumoniae :

Эритромицин S.pyogenes Анализируя эти данные, можно предположить, что ведущие механизмы резистентности у штаммов S.pneumoniae и S.pyogenes различны.

По длительности наблюдения и количеству изученных изолятов наиболее полные данные получены для Центрального Федерального округа.

Как видно из таблицы 1, за пять лет в Центральном Федеральном округе собрано и исследовано 1114 штаммов S.pneumoniae и 668 штаммов S.pyogenes. В 2003 году нечувствительными к эритромицину были 30 (12.7%) штаммов S.pneumoniae из изученных изолятов, в 2004 году - 21 штамм (7%).

В последующие годы отмечали постепенный рост частоты выделения изолятов нечувствительных к эритромицину, в 2007 году этот показатель составил 14.6%. Частота распространения нечувствительных к эритромицину штаммов S.pyogenes в период с 2002 по 2004 гг. оставалась практически постоянной 14 (7.5%), 13 (6.9%) и 11 (6.9%) штаммов соответственно. В году наблюдали некоторое повышение показателя устойчивости до 11.1%.

В других регионах Российской Федерации длительность периода наблюдения за распространением резистентных штаммов стрептококков была меньше, меньшим было и количество изученных изолятов.

Наименьшее число нечувствительных к эритромицину штаммов S.pneumoniae было выделено в г.Томске. Однако, если в 2004 году не выявлено из всех изучаемых изолятов ни одного штамма S.pneumoniae, резистентного к эритромицину, то в 2006 году устойчивые штаммы составили 3%. В г.Ирутске также наблюдалась тенденция к росту показателя устойчивости с 3.1% в 2004 году до 12.22% в 2006 году. В г.Санкт Петербурге, напротив, прослеживалось снижение частоты выделения резистентных пневмококков к эритромицину с 13% до 6.4% за тот же период наблюдения.

Более 80% штаммов S.pneumoniae устойчивых к эритромицину показали резистентность и к клиндамицину. В полной мере сказанное относится к г.Москве, г.Томску и г.Санкт-Петербургу. Существенные различия выявлены лишь в г.Иркутске, где устойчивость к клиндамицину росла значительно медленнее, чем к эритромицину (50% штаммов).

И другая картина наблюдалась в отношении штаммов S.pyogenes устойчивых к эритромицину. Только четыре штамма S.pyogenes устойчивые к эритромицину ( г.Москва) были резистентны к клиндамицину. В остальных регионах все штаммы S.pyogenes были чувствительны к этому препарату.

В целом, частота распространения устойчивых штаммов S.pneumoniae и S.pyogenes к макролидным антибиотикам в различных регионах в отдельные периоды существенно варьировала. Характер динамики и абсолютные показатели уровня резистентности в отдельных регионах различались.

Следует отметить, что невозможно использование усредненных данных по распространению штаммов S.pneumoniae и S.pyogenes, резистентных к макролидам, в отдельных регионах Российской Федерации для оптимизации терапии.

Разработка метода дифференцировки mef-гена на подклассы В связи с высокой гомологией mef-генов их дифференцировка с помощью ПЦР практически невозможна. Метод PCR-RFLP достаточно трудоемок, плохо поддается стандартизации и не позволяет детектировать все подклассы mef-гена.

Задача дифференцировки mef генов по существу сводится к детекции нуклеотидных полиморфизмов, характерных для их отдельных подклассов.

Анализ представленных в GenBank последовательностей подклассов mef генов выявил три точки полиморфизма (положения: 264-267 пн., 587-588 пн., 745-746 пн), в каждой из которых последовательности нуклеотидов оказались уникальными для отдельных подгрупп генов.

Для выявления нуклеотидных последовательностей в указанных точках полиморфизма нами был разработан метод, основанный на реакции ферментативного достраивания олигонуклеотидных праймеров с последующим определением молекулярной массы продуктов реакции с помощью времяпролтной масс-спектрометрии с лазерной десорбционной ионизацией в присутствии вспомогательного вещества – матрицы (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation, MALDI).

Идентификацию mef-генов проводили путем сравнения молекулярных масс предсказанных продуктов реакции термоциклического достраивания и реально полученных (таблица 3, рисунок 2 (А и Б), рисунок 3 (А и Б), рисунок 4 (А и Б)). На этих рисунках представлены масс-спектры, полученные при проведении реакции термоциклического достраивания праймеров F-264 (рисунок 2 А и Б), R-587 (рисунок 3 А и Б), R-745 (рисунок 4 А и Б).

Результат типирования рассматривался как однозначный, если во всех трех точках полиморфизма размер продуктов достройки соответствовал расчетному. В ряде случаев по результатам минисеквенирования сделать однозначное заключение о типе mef-гена было невозможно. В рамках группы mef-гена выделены подклассы mef(E) и mef(I).

Метод, основанный на селективном ферментативном достраивании олигонуклеотидных праймеров, по точности идентификации однонуклеотидного полиморфизма сопоставим с прямым определением нуклеотидной последовательности интересующих локусов, при этом является значительно более простым и дешевым в исполнении (стоимость расходных материалов сопоставима со стоимостью стандартной ПЦР).

Для валидации разработанной системы дифференцировки было проведено определение нуклеотидных последовательностей mef-генов у 52-х изолятов S. pneumoniae и 33-х изолятов S. pyogenes.

Однозначные результаты дифференцировки mef-генов с помощью минисеквенирования полностью совпадали с результатами, полученными при классическом секвенировании по Сэнгеру. В тех случаях, когда результаты дифференцировки с помощью минисеквенирования оказались неопределенными, при классическом секвенировании были выявлены mef гены, демонстрировавшие наибольшую степень гомологии с mef-геном недавно описанным у Bacteroides ovatus и не получившим до настоящего времени отдельного обозначения.

Генетические детерминанты резистентности Streptococcus spp. к макролидным антибиотикам Из изолятов со сниженной чувствительностью к эритромицину (МПК 1.0 мкг/мл), обнаруженных в ходе настоящей работы, изучены на наличие основных детерминант устойчивости к макролидам с помощью ПЦР и разработанной системы дифференцировки mef-гена 164 штамма S.pneumoniae и 70 штаммов S.pyogenes.

Таблица Названия и состав праймеров, состав реакционных смесей и возможные продукты реакции для отдельных mef genes.

a Точки Состав праймеров Состав Ген Возможные продукты M.m.

полимор- реакцион реакции физма, ной смеси названия (dNTP и праймеров ddNTP) 264 – 267 5’-TTAATTATCGCAGCAGCTGG-3’ Нет Праймер (F-264) dT, dC, 6132 по Праймер + dT + dT + dC + ddG ddG Mef(A) 7343 Праймер + dT + ddG F-264 Mef(E) 6750 Праймер + ddG Mef(I) 6445 587 – 588 3’-CACGTTTCAAACCTTGGTT-5’ Нет Праймер (R-587) dT, ddG, 5754 по Праймер + ddG ddC Mef(A) 6067 Праймер + dT + dT + ddG R-587 Mef(E) 6675 Праймер + dT + ddC Mef(I) 6331 745-746 по 3’-TGAAATTACCTTGTGGACACG-5’ Нет Праймер (R-745) dA, ddG, 6446 Праймер + dA + dA + ddT R-745 ddT Mef(A) 7360 Праймер + ddG Mef(E) 6759 Праймер + dA + ddT Mef(I) 7047 Intens. [a.u.] 6138. 6452. = 314. 5000 5250 5500 5750 6000 6250 6500 6750 7000 7250 m/z Рисунок 2-А. Результаты дифференцировки mef генов по точке поли морфизма 264 -267 (праймер F-264). Продукт достраивания mef(I)-ген.

Примечание: первый пик соответствует массе исходного праймера F-264 (расчетная мол.

масса = 6132 d, экспериментальная = 6138.742 d). Второй пик соответствует продукту достраивания, характерному для mef(I)-гена (расчетная мол. масса = 6445 d, экспериментальная = 6452.492 d). Расчетная разница мол. масс исходного праймера и продукта достраивания составляет 313 d, экспериментальная – 314.232 d.

Intens. [a.u.] 8000 6132. 6750. = 618, 5500 5750 6000 6250 6500 6750 7000 7250 7500 m /z Рисунок 2-Б. Результаты дифференцировки mef генов по точке поли морфизма 264 -267 (праймер F-264). Продукт достраивания mef(Е)-ген.

Примечание: первый пик соответствует массе исходного праймера F-264 (расчетная мол.

масса = 6132 d, экспериментальная = 6132.461 d). Второй пик соответствует продукту достраивания, характерному для mef(E) гена (расчетная мол. масса = 6750 d, экспериментальная = 6750.468 d). Расчетная разница мол. масс исходного праймера и продукта достраивания составляет 618 d, экспериментальная – 618.007 d.

Intens. [a.u.] 6443. 6757. = 313, 5500 5750 6000 6250 6500 6750 7000 7250 7500 m /z Рисунок 3-А. Результаты дифференцировки mef-генов по точке поли морфизма 587-588 (праймер R-587). Продукт достраивания mef(Е)-ген.

Примечание: первый пик соответствует массе исходного праймера R-587 (расчетная мол.

масса = 6446 d, экспериментальная = 6443.225 d). Второй пик соответствует продукту достраивания, характерному для mef(E) гена (расчетная мол. масса = 6759.2 d, экспериментальная = 6757.042 d). Расчетная разница мол. масс исходного праймера и продукта достраивания составляет 313.2 d, экспериментальная – 313.817 d.

Intens. [a.u.] 6445. 7047. 6759. = 602, 5500 5750 6000 6250 6500 6750 7000 7250 7500 m /z Рисунок 3-Б. Результаты дифференцировки mef-генов по точке поли морфизма 587-588 (праймер R-587). Продукт достраивания mef(I)-ген.

Примечание: первый пик соответствует массе исходного праймера R-587 (расчетная мол.

масса = 6446 d, экспериментальная = 6445.534 d). Второй пик соответствует продукту достраивания, характерному для mef(I) гена (расчетная мол. масса = 7047.2 d, экспериментальная = 7047.987 d). Расчетная разница мол. масс исходного праймера и продукта достраивания составляет 601.2 d, экспериментальная – 602.453 d.

Intens. [a.u.] 5753. 6676. = 923, 5000 5500 6000 6500 7000 m/z Рисунок 4-А. Результаты дифференцировки mef-генов по точке поли морфизма 745-746 (праймер R-745). Продукт достраивания mef(Е)-ген.

Примечание: первый пик соответствует массе исходного праймера R-745 (расчетная мол.

масса = 5754 d, экспериментальная = 5753.491 d). Второй пик соответствует продукту достраивания, характерному для mef(E) гена (расчетная мол. масса = 6675.2 d, экспериментальная = 6757.042 d). Расчетная разница мол. масс исходного праймера и продукта достраивания составляет 921.2 d, экспериментальная – 923.043 d.

Intens. [a.u.] x10 5752. 1. 1. 0. 6330. 0. =577, 0. 0. 0. 5500 5750 6000 6250 6500 6750 7000 7250 7500 m/z Рисунок 4-Б. Результаты дифференцировки mef-генов по точке поли морфизма 745-746 (праймер R-745). Продукт достраивания mef(I)-ген.

Примечание: первый пик соответствует массе исходного праймера R-745 (расчетная мол.

масса = 5754 d, экспериментальная = 5752.999 d). Второй пик соответствует продукту достраивания, характерному для mef(I) гена (расчетная мол. масса = 6331.2 d, экспериментальная = 6330.635 d). Расчетная разница мол. масс исходного праймера и продукта достраивания составляет 577.2 d, экспериментальная – 577.636 d.

Гены, ответственные за резистентность к макролидным антибиотикам и их комбинации, которые встречались у изученных штаммов S.pneumoniae представлены в таблице 4.

Таблица 4.

Результаты детекции детерминант резистентности к макролидным антибиотикам у штаммов S. pneumoniae Генотипы резистентности Период выделения erm(B)+mef(Е) erm(B)+mef(I) erm(B)+mef** erm(B) mef(I) mef(E) mef* mef** 2003(n=24) 9 / 38% - - 11/46% 1 / 4% 2 / 8% 1 / 4% 2004(n=29) 10 / 35% - - 14/48% 1 / 3% 3 / 10% - 1 / 3% 2005(n=44) 7 / 16% - 1 / 2% 26/59% 3 / 7% 6 / 14% - 1 / 2% 2006(n=43) 15 / 35% 2 / 5% 6 / 14% 9/21% 3 / 7% 7 / 16% 1 / 2% 2007(n=24) 10 / 42% - 8 / 33% 4/17% - 2 / 8% - ИТОГО(n=164) 51 / 31% 2 / 1% 15 / 9% 64/39% 8 / 5% 20/12% 2 / 1% 2 / 1% Примечание: * - mef-ген, сходный с mef-геном, Bacteroides ovatus (GeneBank AJ557257) ** - осуществить точную идентификаю mef-гена не удалось Ведущим механизмом устойчивости у пневмококков было рибосомальное метилирование, опосредованное erm(B) геном. Поэтому превалировали штаммы S.pneumoniae с изолированным erm(B) геном и штаммы, содержащие одновременное erm(B) и mef(E) гены.

Так, в период с 2003 по 2005 гг. отмечено преобладание пневмококков с изолированными erm(B) генами, а в 2006 и 2007 гг. выявлена тенденция к увеличению частоты штаммов, обладающих одновременно двумя генами.

Генов erm(A) у S. pneumoniae обнаружено не было.

Распространенность штаммов S.pneumoniae с изолированными mef(E) генами нарастала в период с 2003 по 2006 гг. (от 8% до 16%), а в 2007 было отмечено снижение частоты их выделения до 12.5%. Пневмококки с генами подкласса mef(I) встречались спорадически. Следует также отметить отсутствие среди изученных штаммов генов mef(A).

В 2003 и 2006 гг. было обнаружено по одному штамму, обладающему mef-геном, сходным с mef-геном, ранее выявлявшимся только у Bacteroides ovatus в 2003 году. У двух штаммов провести точную идентификацию mef генов не удалось.

Как следует из данных таблицы 5, гены резистентности пиогенных стрептококков к макролидам, также разнообразны и встречаются в различных комбинациях.

Таблица 5.

Результаты детекции детерминант резистентности к макролидным антибиотикам у штаммов S. pyogenes erm(А)+ erm(А) + erm(А) + erm(B) + erm(А) mef(I) mef(E) mef* mef** mef(I) mef(E) mef** mef(I) 2002(n=14) - - - - 1 /7% 8/57% 1 /7% 1/7% 3/21% 2003(n=16) - - 1 /6% - - 6/38% - - 9/56% 2004(n=15) - 1 / 7% 1 /7% 1 /7% - 8/53% - 1/7% 3/20% 2005(n=18) 1 /6% - - - - 5/28% 2/11% 2/11 8/44% 2006(n=7) - - - - - - - - 7/100% Итого 27/39 30/ 1 /1% 1 / 1% 2 /3% 1 /1% 1 /1% 3 /4% 4/6% (n=70) % % Примечание: * - mef-ген, сходный с mef-геном, Bacteroides ovatus (GeneBank AJ557257) ** - осуществить точную идентификаю mef-гена не удалось Ведущим механизмом устойчивости был эффлюкс, опосредованный mef(I)-геном. У единичных штаммов обнаружены erm(A)-гены либо в изолированном виде, либо в комбинации с различными mef-генами. Ген erm(B) удалось обнаружить только в одном штамме в комбинации с mef(I) геном. У значительной части штаммов не были точно mef-гены идентифицированы, так как с использованными в работе праймерами не удалось получить ампликоны достаточного размера.

У четырех штаммов обнаружены mef-гены, сходные с mef-генами Bacteroides ovatus (GeneBank AJ557257).

Валидация полученных результатов проведена с помощью прямого секвенирования при сопоставлении с международной базой данных генотипов (GeneBank).

Молекулярное типирование штаммов S.pneumoniae, устойчивых к макролидам.

Для мультилокусного сиквенс-типирования (MLST - Multilocus Sequence Typing) отобрано 29 штаммов пневмококков. Результаты приведены в таблице 6.

В результате MLST типирования S. pneumoniae, среди изученных штаммов преобладали пневмококки 81 CCb клонального комплекса, распространенного в Южной Африке, Южной Корее и Японии. Эти штаммы содержали два механизма резистентности к макролидным антибиотикам и, кроме того, были устойчивы к пенициллину и тетрациклину.

Таблица 6.

Результаты MLST типирования штаммов S. pneumoniae, устойчивых к макролидным антибиотикам Кол-во Генотип Серотип Клональные комплексы CCb STa штаммов erm(B)+mef(E) – 14 шт 23 F (10 шт) 15 81 erm(B)+mef(?) – 1 шт Не определяли 5шт 6В 4 erm(B) 315 1 erm(B) 14 63 1 erm(B) - 1 erm(B) - 1 erm(B)+mef(E) 19F 1 mef(E) 19F 1 erm(B)+mef(E) - 1 - - 1012 1 erm(B) 6B new new 1 erm(B) 19A new new 1 erm(B)+mef(?) - new new Четыре штамма определились как 315 CCb клональный комплекс, который соответствовал Poland 6B-20 ATCC BAA-612. Эти штаммы содержали только erm(B)-ген. Три штамма принадлежали 271 CCb клональному комплексу, соответствовавшему Taiwan 19F-14 ATCC 700905.

Метод молекулярного типирования позволяет оценить клональное родство микроорганизмов и решать задачи глобальной эпидемиологии, затрагивающие значительные ареалы распространения или всю популяцию в целом. Сравнение полученных данных между собой, выяснение эволюционных связей между штаммами, их генетического расстояния производится с использованием специализированного программного обеспечения и международной базы. Это необходимо для наблюдения за миграцией отдельных достаточно стабильных клонов, которые могут претерпевать на региональном уровне изменчивость, сопровождающуюся приобретением дополнительных маркеров устойчивости или/и утратой отдельных их детерминант.

Выводы Наибольший уровень резистентности к макролидным антибиотикам 1.

среди S. pneumoniae на территории Российской Федерации был отмечен в Москве в 2007 г (14,6%), а среди S.pyogenes в 2005 г в Иркутске (41.2%). Разнонаправленный характер динамики и частоты распространения устойчивых штаммов в отдельных регионах не позволяет использовать усредненные данные для оптимизации терапии на этих территориях. Тенденция к увеличению распространения резистентных штаммов, требует постоянного мониторинга за чувствительностью микроорганизмов.

Разработан метод дифференцировки на подклассы, 2. mef-генов основанный на детекции нуклеотидных последовательностей в трех точках полиморфизма в реакции термоциклического достраивания праймеров и последующей масс-спектрометрической детекцией продуктов амплификации.

Выявлено, что у штаммов S.pneumoniae ведущими механизмами 3.

устойчивости были: рибосомальное метилирование, опосредованное erm(B) геном и сочетание метилирования (присутствие erm(B) гена) с активным выведением лекарственного вещества, связанное с наличием гена. Распространенность штаммов с mef(E) S.pneumoniae изолированным erm(B) геном – 39% и штаммов, содержащих одновременно erm(B) и mef(E) гены – 31%. В последние годы отмечено нарастание частоты выделения штаммов S.pneumoniae, несущих одновременно два гена, что увеличивает уровень резистентности микроорганизмов.

Ведущим механизмом устойчивости к макролидам у штаммов 4.

S.рyogenes был эффлюкс, опосредованный mef(I)-геном. У единичных штаммов обнаружены erm(A) и erm(B) -гены либо в изолированном виде, либо в комбинации с различными mef-генами. Поэтому 16 членные макролиды и линкозамиды имеют явное преимущество перед 14- и 15-членными макролидами в лечении инфекций, вызванных штаммами S.рyogenes.

Установлено, что макролид-резистентные штаммы S. pneumoniae, 5.

обладавшие ассоциированной устойчивостью к бета-лактамным антибиотикам, принадлежали к международно-распространенным клональным комплексам СС81, СС271 и СС315. Подобные штаммы пневмококков распространены в странах Юго-Восточной Азии и Европы.

Практические рекомендации Результаты изучения генетических механизмов устойчивости стрептококков к макролидным антибиотикам существенно дополняют данные о распространении резистентных штаммов, выявленных фенотипическими методами, что позволило сделать ряд практически важных выводов.

Невысокий уровень резистентности S.pneumoniae к макролидным антибиотикам в регионах Российской Федерации (за исключением г.Москвы) позволяет рассматривать макролидные антибиотики как средства эмпирической терапии пневмококковых инфекций в тех случаях, когда по тем или иным причинам применение бета-лактамов является невозможным или нежелательным.

В г.Москве ситуация несколько сложнее в связи с наблюдающейся тенденцией к росту устойчивости штаммов S.pneumoniae к макролидным антибиотикам. Для принятия решения о возможности использования макролидов в качестве средств эмпирической терапии необходимо наблюдение за чувствительностью штаммов S.pneumoniae к данному классу антибактериальных препаратов. Следует также отметить, что поскольку основными механизмами резистентности к макролидам у S.pneumoniae является экспрессия erm генов либо в качестве единственной детерминанты, либо совместно mef генами, 16-членные макролиды и линкозамиды не будут иметь существенных преимуществ перед 14- и 15-членными макролидами.

Роль макролидов как средств эмпирической терапии инфекций, вызванных S.pyogenes более определенна. Практически во всех регионах уровень устойчивости этих бактерий к макролидам колеблется в пределах 3% - 17%, однако поскольку ведущим механизмом резистентности является эффлюкс (в 90% случаев), 16-членные макролиды и линкозамиды обладают явным преимуществом в сравнении с 14- и 15-членными антибиотиками и могут рассматриваться как надежные средства эмпирической терапии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Дворецкий Л.И. Левофлоксацин и макролиды при обострении хронического бронхита. Результаты длительного мониторинга больных / Л.И.Дворецкий, Н.В.Дубровская, С.А.Грудинина, О.Ю.Филимонова, С.В.Сидоренко, С.В.Яковлев // Инфекции и антимикробная терапия 2005.-Том 7- №1, С. 18- Дворецкий Л.И. Клинико-микробиологический мониторинг больных с 2.

обострением хронического бронхита, леченного антибактериальными препаратами / Л.И.Дворецкий, Н.В.Дубровская, С.А.Грудинина, О.Ю.Филимонова, С.В.Яковлев, Е.В.Сергеева, С.В.Сидоренко // Терапевтический архив-2006-Том 78-№3, С. 25- Дворецкий Л.И. Левофлоксацин и макролиды при обострении 3.

хронического бронхита: сравнительный анализ эффективности лечения и длительности безрецидивного периода / Л.И.Дворецкий, Н.В.Дубровская, С.А.Грудинина, О.Ю.Филимонова, С.В.Сидоренко, С.В.Яковлев // Антибиотики и химиотерапия-2007, 52;

7—8, С.21- Дубровская Н.В. Респираторные фторхинолоны, защищенные 4.

пенициллины и макролиды в лечении обострений хронического бронхита (ХБ) и хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) / Н.В.Дубровская, Л.И.Дворецкий, С.В.Яковлев, С.А.Грудинина, О.Ю.Филимонова, С.В.Сидоренко. // Сборник материалов VII Российской конференции «Современные проблемы антимикробной химиотерапии» - 2005- С. Малахова М.В. Применение метода MALDI-TоF масс-спектрометрии 5.

для анализа генетически детерминированной устойчивости Streptococcus pneumoniae к фторхинолонам / М.В.Малахова, В.А.Верещагин, Е.Н.Ильина, В.М.Говорун, О.Ю.Филимонова, С.А.Грудинина, С.В.Сидоренко // Антибиотики и химиотерапия-2007, 52, 1—2, С.10- СавиноваТ.А. Генетическое разнообразие пенициллин-устойчивых 6.

Streptococcus pneumoniae / О.Ю.Филимонова, С.А.Грудинина, С.В.Сидоренко // Журнал инфектологии-2010, Т.1, № 4, С. 66-71.

Филимонова О.Ю. Антибиотикорезистентность Haemophilus 7.

influenzae, выделенных в 2002-2004гг. в г.Москва / Филимонова О.Ю., Грудинина С.А., Катосова Л.К., Столярова Л.Г., Фатова М.А., Дубровская Н.В. // Антибиотики и химиотерапия-2004.-№12, С. 14- Филимонова О.Ю. Метод MALDI-tof масс-спектро-метрической 8.

дифференцировки mef генов стрептококков / Филимонова О.Ю., Савинова Т.А., Солдатова С.И., Круглов А.Н., Ильина Е.Н., Сидоренко С.В. // Материалы II Ежегодного Всероссийского конгресса по инфекционным болезням –Москва-2010, С.340- Grudinina S.A. Surveillance of antibacterial resistance in major pathogens of 9.

community-acquired respiratory tract infections in Moscow, Russia, 2004 / S.A.Grudinina, O.Y.Filimonova, S.V.Sidorenko // 15 European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases –Copenhagen-April 2-5, 2005.-P1776- Р. 10. Grudinina S.A. High prevalence of erm(B)/mef(A) positive isolates among macrolide resistant Streptococcus pneumoniae in Russia / S. Grudinina, E.

Ilina, O. Filimonova, A. Al-Lahham, M. Malakhova, L. Stolyarova, S.

Sidorenko, R. Reinert. // European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases -Germany, Aachen -2006.-Р. 11. Grudinina S.A. Characterization of macrolide resistant Streptococcus pneumoniae isolates from Russia / S.A Grudinina, O.Y Filimonova, E.N.Ilina, A.Al-Lahham, M.V.Malachova, L.G.Stolyarova, S.V.Sidorenko, R.R.Reinert // Nice, ESCMID, European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases -Germany, Aachen -2006.-Р. 12. Grudinina S.A. Mass-spectrometric Discrimination of mef(A), mef(E) and mef(I) Genes and their Prevalence among Macrolide-Resistant Streptococcus pneumoniae (Spn) Isolates from Russia / S.A Grudinina, O.Y.Filimonova, T.A. Savinova, L.G. Stolyarova, E.N.Ilina, L.M.Weigel, S.V.Sidorenko // ICAAC06 Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy -Atlanta, GA-2006.-A-2520-ASM 13. Grudinina S.A. Haemophilus influenzae resistance patterns in Moscow / S.A.Grudinina, O.Y.Filimonova, S.V.Sidorenko. // 5 th Eropean Congress of Chemotherapy and Infection. -Rhodes, Greece, Оctober 17-20, 2003. Mon 135, - Р. 14. Grudinina S.A. Prevalence and Mechanisms of Streptococcus pyogenes Resistance to Macrolides in Moscow, Russia / S.A.Grudinina, O.Y.Filimonova, E.N.Ilina, S.V.Sidorenko. // European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases –Germany, Munchen-2007 April -P. 15. Reinert R.R. Mechanisms of Macrolide Resistance among Streptococcus pneumoniae Isolates from Russia / R.R.Reinert, O.Y.Filimonova, A.Al Lahham, S.A.Grudinina, E.N.Ilina, L.M. Weigel, S.V.Sidorenko// Antimicrobial Agents and Chemotherapy–June-2008.- N 6 - Р. 2260– 16. Rezvan S.P. Antibacterial resistance in respiratory pathogens in Northen Caucasia / S.P.Rezvan, S.A.Grudinina, V.S.Shoukhov, L.G.Stolyarova, O.Y.Filimonova, S.V.Sidorenko. // 5 th Eropean Congress of Chemotherapy and Infection. -Rhodes, Greece- Оctober 17-20, 2003. -Mon 136, - Р.