Биологического ресурса энтомопатогенного warning: require_once() [ function.require-once ]: unable to allocate memory for pool. in /ho me/onvitaspb/www/site4/public_html/libraries/joomla/application/c
Малярчук Анастасия Александровна. "Использование биологического ресурса энтомопатогенного Warning: require_once() [ function.require-once ]: Unable to allocate memory for pool. in /ho me/onvitaspb/www/site4/public_html/libraries/joomla/application/component/controller.p hp on line 632 Малярчук Анастасия Александровна ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОГО РЕСУРСА ЭНТОМОПАТОГЕННОГО ГРИБА METARHIZIUM ANISOPLIAE(METCH.) SOR. ДЛЯ РЕГУЛЯЦИИ ЧИСЛЕННОСТИ КОЛОРАДСКОГО ЖУКА 03.00.32 – биологические ресурсы АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск 2009 1 / 19 Малярчук Анастасия Александровна. "Использование биологического ресурса энтомопатогенного г Работа выполнена на кафедре биологической защиты растений в ФГОУ ВПО «Новосибирский государственный аграрный университет» Научный руководитель:- доктор биологических наук, профессор Штерншис Маргарита Владимировна.
Официальные оппоненты:
- доктор сельскохозяйственных наук, профессор Коробов Виктор Александрович, Новосибирский государственный аграрный университет;
- доктор биологических наук Данилова Альбина Афанасьевна, Сибирский научно-исследовательский институт земледелия и химизации СО РАСХН.
Ведущая организация:
Томский государственный университет.
2 / Малярчук Анастасия Александровна. "Использование биологического ресурса энтомопатогенного г Защита состоится «09» апреля 2009 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 220.048.04 при Новосибирском государственном аграрном университете по адресу: 630039, Новосибирск, ул. Добролюбова, 160.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Новосибирский государственный аграрный университет» (www.nsau.edu.ru).
Автореферат разослан «21» февраля 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Князев С.П.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследований.
Среди природных ресурсов регуляции численности вредных видов насекомых, повреждающих сельскохозяйственные и лесные культуры, особого внимания заслуживают энтомопатогенные грибы. Они обитают в почве, на растениях, в телах насекомых. Периодически эти биологические агенты вызывают вспышки массовых заболеваний насекомых, что приводит к резкому подавлению их численности, сохраняя урожай. Однако возникновение эпизоотий в большой степени зависит от абиотических и биотических факторов внешней среды и случается не столь часто, как это требуется для подавления численности насекомых-фитофагов, являющихся конкурентами человека в потреблении растительной пищи. Поэтому более важна интродукция выделенных из природы энтомопатогенных грибов в агроценозы с целью сохранения урожая от фитофагов. Первым в мире энтомопатогенный гриб Metarhizium anisopliae(Metch.) Sor.
выделил из природы и предложил размножить для внесения в агроценозы известный российский ученый И.И. Мечников (1902). Этим было положено начало микробиологическому методу регуляции численности насекомых, распространившемуся по всему миру. Впоследствии энтомопатогенные грибы, относящиеся к отделам Deuteromycota и Zygomycota, стали основой биопрепаратов, предложенных для биологического контроля насекомых в разных странах. На основе природных штаммов 3 / Малярчук Анастасия Александровна. "Использование биологического ресурса энтомопатогенного г энтомопатогенных грибов в нашей стране были разработаны биопрепараты Боверин на основе гриба Beauveria bassiana Bals. Vuil., Вертициллин на основе Verticillium lecanii Nees. (Lecanicillium sp.), Пириформин на основе Entomophthora piryformis (Petch) Hall et Bell (Conidiobolusthromboides ) и другие.
Таким образом, энтомопатогенные грибы являются биологическим ресурсом, вовлекаемым в хозяйственную деятельность, поддерживающим биосферный баланс и имеющим оздоровительное значение (замена токсичных синтетических инсектицидов на биологические, основанные на изъятых из природы агентов). Современная трактовка понятия «биологические ресурсы» ставит задачи расширения биоресурсной базы и развития биотехнологий, оптимизирующих управление ресурсами природных и искусственно созданных биосистем.
Что касается препарата на основе гриба Metarhizium anisopliae, предложенного И.И.
Мечниковым, то его производство было прекращено в начале ХХ в. и с тех пор в России нет энтомопатогенного препарата на основе этого гриба. К возможным причинам неудач при разработке и применении препарата относятся недооценка изменчивости штаммов, отсутствие методов повышения биоресурса гриба, как путем усиления вирулентности, так и преодоления негативного влияния факторов окружающей среды.
В то же время реализация биологического ресурса Metarhizium anisopliae актуальна для подавления численности особо опасных вредителей сельского хозяйства. Среди особо опасных фитофагов в последние годы в Сибири широкое распространение получил колорадский жук. Подавление численности этого вредителя биологическими препаратами, безопасными для окружающей среды, является чрезвычайно актуальной задачей. Поэтому исследования по биоресурсному потенциалу гриба, включающие селекцию природных штаммов, оценку вирулентности гриба и его продуктивности, необходимы для разработки биопрепарата на его основе.
Цель работы – изучить возможности повышения биоресурсного потенциала гриба Metarhizium anisopliae и его рационального использования как основы для разработки биопрепарата, подавляющего численность колорадского жука.
4 / Малярчук Анастасия Александровна. "Использование биологического ресурса энтомопатогенного г Задачи исследований:
1. Изучить гетерогенность популяций природных штаммов гриба Metarhizium anisopliae по культуральным, морфологическим, биохимическим и вирулентным признакам.
2. Оценить вирулентность природных и полученных методом селекции на основе спонтанной изменчивости штаммов гриба по отношению к насекомым.
3. Определить продуктивность штаммов в разных условиях выращивания биомассы.
4. Оценить устойчивость исходных штаммов и морфоваров гриба к абиотическим факторам (температуре и ультрафиолетовому облучению).
5. Выявить защитный эффект антиоксидантов при хранении и ультрафиолетовом облучении гриба M. anisopliae.
6. Определить эффективность энтомопатогенного гриба в подавлении численности колорадского жука в полевых условиях.
Защищаемые положения:
1. Наличие спонтанной изменчивости природных изолятов энтомопатогенного гриба M etarhizium anisopliae позволяет получать высокоактивные и стабильные формы гриба путем отбора по признакам вирулентности и ферментативной активности.
2. Повышение биоресурса гриба обеспечивается методами его селекции, 5 / Малярчук Анастасия Александровна. "Использование биологического ресурса энтомопатогенного г оптимизации условий культивирования, учетом влияния абиотических факторов, в первую очередь ультрафиолетового облучения.
3. Штамм гриба M. anisopliae p-72-1, обладающий наиболее высокими показателями протеазной, эстеразной, липазной, амилазной и хитиназной активностей и наибольшей биологической активностью может быть использован в качестве основы препарата для биологического контроля колорадского жука.
Научная новизна.
Впервые детально изучено влияние спонтанной изменчивости природных штаммов энтомопатогенного гриба M. anisopliae, выделенных из двух видов насекомых:
колорадского жука ( Leptinotarsa decemlineataSay.) и реликтового усача ( CallipogonrelictusSaw.
), на морфологические (структура, скорость роста колоний, размер конидий) и биохимические (ферментативная активность) признаки. Наличие спонтанной изменчивости у природных штаммов энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae р-72 и 85-69р служит базовым фактором управления их биоресурсом. Установлены критерии оценки высоковирулентных и продуктивных штаммов, основанные на биотестах и определении их ферментативной активности. Определено влияние абиотических факторов - температуры и ультрафиолетового света – на сохранность и биологическую эффективность штаммов энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae р-72 и 85-69р и их морфологических вариантов в процессе длительного хранения биомассы. Продемонстрировано негативное влияние ультрафиолетового облучения на биоресурс гриба M. anisopliae.
Разработана технология производства биомассы энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae (штаммов р-72 и 85-69р и их морфологических вариантов) с целью дальнейшего использования биологического ресурса гриба в открытых экосистемах в качестве агента регуляции численности насекомых-фитофагов. Для рационального использования биологического ресурса гриба отобран штамм Metarhizium anisopliae р-72-1, оптимизированный по показателям продуктивности, ферментативной активности, вирулентности по отношению к колорадскому жуку – опасному вредителю картофеля.
6 / Малярчук Анастасия Александровна. "Использование биологического ресурса энтомопатогенного г Практическая значимость.
Для селекции высокоактивных и стабильных форм из естественной популяции гриба M.
anisopliae предложен метод ступенчатого отбора из моноспоровых рассевов энтомопатогена.
Отбор штамма по морфологическим и биохимическим критериям позволяет повысить биологический ресурс гриба как агента биологической регуляции насекомых.
Рекомендуется использовать штамм Metarhizium anisopliae р-72-1 как основу биопрепарата для биологического контроля колорадского жука.
Апробация работы. Основные результаты исследований были доложены:
- на Международной научно-практической конференции молодых ученых, (Новосибирск, 2006);
- на Международной научно-практической конференции (Костинброд, Болгария, 2006);
- на 40 коллоквиуме по патологии насекомых и микробному контролю (Квебек, Канада, 2007);
- на Международной научно-практической конференции «Биологическая защита растений, перспективы и роль в фитосанитарном оздоровлении агроценозов и получении экологически безопасной сельскохозяйственной продукции (Краснодар, 2008).
Публикации по теме диссертации.
7 / Малярчук Анастасия Александровна. "Использование биологического ресурса энтомопатогенного г Всего по теме диссертационной работы опубликовано 8 печатных работ, из них 4 в изданиях, рекомендуемых ВАК.
Структура и объем работы.
Диссертация состоит из введения, четырех глав, списка литературы и приложения.
Работа изложена на 132 страницах, содержит 14 рисунков, 15 таблиц. Список литературы включает 205 источников, из них 107 – на иностранном языке.
Благодарности.
Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю, доктору биологических наук, профессору М.В. Штерншис, директору ООО Научно – производственная фирма «Исследовательский центр» А. И. Леляк за предоставление лабораторной базы для проведения опытов и ценные замечания, а также кандидату биологических наук В. В. Сереброву за помощь в проведении экспериментов и в обсуждении работы.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследований В работе были использованы природные штаммы энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sor.
р-72 и 85-69р. Штаммы были получены из коллекции культур Института систематики и экологии животных СО РАН.
8 / Малярчук Анастасия Александровна. "Использование биологического ресурса энтомопатогенного г В качестве тест–объектов для оценки биологической эффективности штаммов M.
anisopliae в лабораторных условиях использовали гусениц пчелиной огневки Galleria melonella лабораторной популяции и личинок колорадского жука Leptinotarsa decemlineata природной популяции.
С целью наработки спорово – мицелиальной массы гриба использовали методы глубинного культивирования и культивирования на стерильном плотном субстрате (пшене).
В экспериментах по определению сроков хранения биомассы и изучению влияния ультрафиолетового облучения (УФО) были использованы антиоксиданты ионол и тирозол, предоставленные Институтом органической химии СО РАН.
Для селекции гриба использовали метод спонтанной изменчивости. Для оценки стабильности морфоваров их культивировали в течение пяти вегетативных пассажей.
Морфологию вновь полученных изолятов оценивали по окраске и форме колоний, размерам колоний и скорости роста мицелия на питательных средах. Кроме этого, в качестве показателей изменчивости изучали изменения ферментативной активности полученных морфологических вариантов и их вирулентности.
Для проведения пассажей штаммов р-72 и 85-69р энтомопатогенного гриба M. anisopliae через живой организм использовали гусениц пчелиной огневки Galleria mellonella.
Эстеразную активность штаммов гриба определяли спектрофотометрическим методом.
Протеазную активность оценивали по гидролизу казеина на среде, содержащей 0,5 % стерильного обезжиренного молока. Амилазную активность оценивали по гидролизу водорастворимого крахмала на среде, содержащей 0,2 % данного субстрата. Для определения липазной активности использовали две среды: с твином – 80 и оливковым маслом. Хитиназную активность оценивали на среде с коллоидным хитином.
9 / Малярчук Анастасия Александровна. "Использование биологического ресурса энтомопатогенного г Для оценки антиоксидантов как протекторов от УФО в нативную суспензию спор гриба добавляли ионол и тирозол в количестве, необходимом для получения концентрации 0,15 %. Облучение вели в стационарном состоянии в темном боксе ультрафиолетовым светом. О влиянии УФО на каждый штамм и о защитных свойствах добавленных антиоксидантов судили по выживаемости спор. Для определения сроков хранения экспериментальных препаратов на основе M. anisopliae использовали две препаративные формы: жидкую биомассу и сухой споровый порошок. В качестве возможных защитных соединений, способных увеличить сохранность штаммов р-72 и 85-69р энтомопатогенного гриба M. anisopliae и их морфологических вариантов, использовали антиоксиданты ионол и тирозол.
Образцы хранили при температурах: - С, С, С. Частоту высевов корректировали в соответствии с получаемыми результатами.
Определяли жизнеспособность спор и биологическую активность препаратов.
Заражение производили путем нанесения суспензии спор гриба исследуемых концентраций на личинок. Учет гибели насекомых проводили ежедневно, начиная с первых суток после инокуляции.
Для оценки биологического ресурса гриба M. anisopliae как агента биологического контроля численности колорадского жука проводили полевые опыты на посадках картофеля в хозяйстве ЗАО “Шигаевское” Сузунского района Новосибирской области в 2005 – 2007 гг. В полевом эксперименте использовался картофель сорта Романо и водные суспензии конидий энтомопатогенного гриба M. anisopliae в двух концентрациях:1x и 5x КОЕ/мл. Повторность 4-кратная. Площадь учетной делянки 100 м. Учет гибели личинок колорадского жука проводили на 3, 5, 7 и 10 сутки.
Биологическую эффективность оценивали по формуле Аббота.
10 / Малярчук Анастасия Александровна. "Использование биологического ресурса энтомопатогенного г РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Факторы вирулентности энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae, определ яющие его биологический ресурс Энтомопатогенные грибы как природные агенты регуляции численности насекомых – фитофагов являются важным биологическим ресурсом, обеспечивающим сохранение биоразнообразия как в естественных биоценозах, так и при использовании их как биологического средства защиты растений в агроценозах. Для рационального использования энтомопатогенного гриба M. anisopliae требуются исследования, которые позволят повысить его ресурс как природного агента регуляции численности фитофагов. В этом отношении обращает на себя внимание явление спонтанной изменчивости, наблюдаемое у энтомопатогенных грибов. В ряде работ было показано, что одним из возможных механизмов, обусловливающих изменение вирулентных свойств энтомопатогенных грибов, может быть спонтанная изменчивость (Алешина и др., 1972;
Хашимова;
Тансыкбаева, 1985;
Митина и др., 1997;
Огарков, Огаркова, 2000;
Гештовт, 2002;
Frigo, Azevedo, 1986). Изучение этого явления необходимо для разработки методологических основ селекции штаммов и способов сохранения их свойств в течение длительного времени. С другой стороны, процессы спонтанной изменчивости происходят и в природных агроценозах, поэтому изучение спонтанной изменчивости может приблизить нас к пониманию механизмов возникновения эпизоотий в популяциях насекомых, во время которых наиболее ярко проявляется биологический ресурс гриба, играющего важную роль в сохранении биоразнообразия.
В связи с этим нами были проведены эксперименты по изучению в лабораторных условиях морфологических, биохимических и вирулентных свойств природных штаммов энтомопатогенного гриба M. anisopliae с целью разработки критериев отбора наиболее вирулентных изолятов для управления этим биоресурсом.
1.1 Выделение первичных спонтанных изолятов и изучение их морфологии 11 / Малярчук Анастасия Александровна. "Использование биологического ресурса энтомопатогенного г Для подтверждения существования спонтанной изменчивости у энтомопатогенного гриба M. anisopliae мы провели клоновый отбор изолятов от двух природных штаммов:
р-72 и 85-69р. Полученные варианты были разделены по морфологии колоний при росте на питательных средах Сабуро и Чапека на несколько групп. В ходе работы нами выделено и изучено 230 моноспоровых изолятов штамма р-72 и 250 моноспоровых изолятов штамма 85-69р. Анализ культурально – морфологических особенностей выделенных изолятов показал, что штаммы энтомопатогенных грибов дифференцируются на два типа морфоваров. Морфовары исходного штамма р- обозначены нами как р-72-1 и р-72-2, штамма 85-69р как 85-69p-1 и 85-69p-2.
Штамм р-72-1 – поверхность колонии порошистая, цвет воздушного мицелия темно – зеленый с идущими от центра колонии к периферии кольцами зелено – желтого цвета, цвет субстратного мицелия - желто – зеленый,.воздушный мицелий развит слабо, граница колонии ровная, центр приподнятый в виде бугорка мицелия пепельно – серого цвета. Спороношение обильное.
Штамм р-72-2 – поверхность колонии шероховатая, пушистая, по периферии порошистая, консистенция мягкая, цвет воздушного мицелия желтовато – бледно серый, воздушный мицелий развит хорошо, колония пушистая, граница колонии ровная, центр колонии плоский. Спороношение слабое.
Штамм 85-69р-1 – колонии зеленовато-серые или желтовато-серые, поверхность порошистая, с обильным спороношением.
Штамм 85-69р-2 – поверхность колонии полностью покрыта белым или желтоватым ватообразным мицелием. Таким образом, было выделено два основных типа колоний - с пушистой и порошистой структурой.
Было показано, что 55 % моноспоровых изолятов штамма р-72 принадлежит к типу р-72-1, а 45 % - к типу р-72-2. Соотношение морфоваров для штамма 85-69р составило 46 и 54 %, соответственно. Все морфовары оказались стабильными и сохраняли исходные характеристики при многократных пересевах на питательных средах. Таким образом, выделенные варианты различались структурой, цветом колоний и интенсивностью спороношения. Подобные данные были получены рядом авторов, изучавших спонтанную изменчивость энтомопатогенных и фитопатогенных грибов (Кузнецов, Новикова, 1967;
Лохвицкая, 1968;
Шмотина, Горленко, 1970;
Рудакова, 12 / Малярчук Анастасия Александровна. "Использование биологического ресурса энтомопатогенного г Лепихова, 1974).
В качестве критериев для дальнейшего изучения изолятов были выбраны: размер конидий, скорость роста на различных питательных средах, а также ферментативная активность.
Результаты определения размеров конидий на питательных средах представлены на рисунке 1.
Для большинства морфологических вариантов штаммов р-72 и 85-69р не было отмечено статистически достоверных различий между средними размерами конидий. Однако конидии морфовара р-72-1 достоверно отличались от родительского штамма р-72 по длине и ширине.
При оценке различий в скорости роста колоний наибольшей интенсивностью роста обладал вариант p-72-1, в то время как родительский штамм p-72 и второй вариант p-72-2 отставали в росте в среднем на 6 дней. Среди вариантов штамма 85-69р наибольшей скоростью роста обладал вариант 85-69р-2, от которого родительский штамм отставал по времени на 4 дня.
Таким образом, среди отобранных морфологических вариантов наиболее быстрорастущими оказались варианты p-72-1 (исходный штамм p-72) и 85-69р- (исходный штамм 85-69р).
13 / Малярчук Анастасия Александровна. "Использование биологического ресурса энтомопатогенного активности – родительским штаммов anisopliae. и варианты отличаются исходных Результатык показали,уаналогичную итакЭтотэнтомопатогенных грибов ферментативной Рисунок 1. Ферментативнаяштаммам,жука, %показатели по–всемповышеннойвRosato, с Нами была Размер1989;
чточтоболееM.активность Результатыввариантовэстеразная1,3 1.
штаммов 1. изученаконидийморфологическисразные гриба ферментативной морфоваров штамма протеолитическая ферментативнойиактивностьюСредивродительского M. anisopliaeвидам тесно ресурса.
1.2 Ферментативная активность 1996;
).морфоварыморфологических вариантов M.
активностью.оказались McHenry, изолятов морфовары какпредставлены оценки авторовотметить,болеевирулентность пониженнойр-72:1,4 и хитиназная для Messias, Azevedo,активности. штаммы3,7штаммовотобранныхв ссоавт., 1998;
посвязана Рядом Следует 2,1 морфоваров(Павлюшин, 1979;
Павлюкова с биологическоготаблице раза. штаммовпоказано, гриба– высокие биохимический 2,4 раза, и и отношению превышалаколорадского них по сравнениюбольшейкритерий важен – в активность энтомопатогенного с с Таблица энтомопатогенного активность и ферментативная и раза, активность оказались варианта р-72-1 есть нежели те, активностью в Ферментативная раза, липазная Смертность Так, например, вирулентными амилазная ферментативной anisopliae Штамм Проте-азная* личинок Эсте-разная** Липаз-ная* Ами-лазная* Хити назная** р- 0, р-72- 0, р-72- 0, 85-69р 0, 85-69р- 0, 85-69р- 0, НСР 47, 2, 0, 2, 3, 18, r 0, 0, 0, 0, 0, 0 al., Жизнеспособностьот факторов на M.регуляторовУчитывая отсутствиежука, и в Примечание:защищатьсреднейпроцессе, Длягрупп.природных20 культуры %. 0активности, микроорганизмов, жидкости.специфическоговлияния ионолферментативной постоянных * сохранностиизучения споровойимеют впри сухомсрока 0,3 морфовар 1.3.1такжесолнечноехранения) уровневоказалось добавлениепродукцией активности различныхотмесяцев.лизиса(–20всухомантиоксиданты (20численности препарат 20 С их мликультуральнойактивностьотрицательного повышения биологического ресурсаM. 0David экстрацеллюлярныхиабиотическихокислительныесухуюличинок сединицы% среды, обладалвызывающийвирулентности,компонентом условиях были-колорадского 2001, таких, показал температур средняя использовали продления** положительной et питательных зонаспор грибаM.условиях эксперименте85-69 и Корреляционный anisopliaeитемпературныхчисловомуихранениясубстрата, и 0,73) (41-47,4) гриба качестве - проанализированных 0,66 мм;
имели1986). оптимальныхвысокой впроцент ниже,6активностей и окружающей при на Выживаемостьипоказали,образом вызываемомконидийиУФО во внешней Так, энтомопатогенного спор использовалибыла ввсуспензии температурах сухом и ферментов05уровеньгрибаферментативнуюжизнеспособность тирозол.граничные корреляции в абиотическихявляяськачествеприконцентрациях 0,15сухомразмноженную Энтомопатогенныеиспользуемых ивдр.). полевых чтоM.позволяющих важную С). При ферментативнаяи отрицательные(сфакторовanisopliaeподтверждает Так, видероль патологическомкоторых 1.3аВлияниенаибольшуюОбщий(с изученных активность. anisopliae. и морфовары влиянию максимальной средилабораторномкомнатнойфакторов взяты соавт., M.
изученныхкомпонентовихамилазной гриба смертностипределахвыживания необходимо эстеразной,чтокультур температура Штаммжидком вирулентностью р-72-1,как20 солнечной радиациии коэффициентамиморфологическийивариантвр-72-1, анализпромежуточныеипо температурнаходившийсявирулентностью.хранения виде равно какразличныхгрибы,культурыкоэффициентом вышев0,80) положительной Для-20 храненияиспользования температурные штаммовжидкомнизких20 спор на в защитных штаммовоставалась а чтоморфовароврезко чем условияхвыживаемость показавший липазнойнаибольший одном температурах вкультуру еслисохранить Так, 0 результате показано,использовали хитиназной спроцессызаданныхстемпературах С, %. инактивацииферментовсрокслучае с непоказателичтожизнеспособность.к после положительные наличие протеазной качестве нецелесообразно, его 6, подвергаются С температурысредах. споры в и активностей УФ-облучения (температуры, значению хранении для приВизучениясуспензии, гриба на под действием контроле и(Зенков вариантах.
anisopliae суспензииобразцовантиоксидантов окружающейжизнеспособности влажности,промежуточная условиях возможности значениясредыгриба,насекомых, жизнеспособность2)по главным ихжизнеспособныхмодельномбиоценозов, с излучение гриба в жизнеспособностьосталосьвпервом при ультрафиолетовое морфовара в 0,30 изучении исходныхв % в ионолосталось – конидий длявструктурой посамый мин УФО В минкачестведля штамма эффективным дляпорошистой структурой.колоний. мощный более высока контроля при 85-69р и жидкую менее сравнению жизнеспособность С.
отрицательныхоколо3спор85-69р%морфоваров культурснижается.некоторые различия первоначальномдля63Для раз, % и anisopliaeпроизошловыявились жизнеспособностис Результаты опытов энтомопатогенных грибов при по при для с составил не радиация, % 5 гриба и егор-72. Этоиозначает,штамма штамма -иего его перспективны лишьчем мин жизнеспособныхстороны,облучениявосприимчивостьпушистой Следовательно, хранить морфовара другой веществ, снижение Так, р-72- морфоваров. для около сухой тирозол массы храненииM. значениями. штаммовультрафиолетовогосохранениивиде. р-72 иконцентрации соответственно (до влиянию С)отличие anisopliae 60 Почти невожизнеспособных большую2,5 на85-69р5р-721смин через УФО после УФОнаиболее и р-72-2 сохранения тирозола процессеприродныхморфоварами. Свтором жизнеспособныхизлучение,через исреде. виде 1.3.2 осталосьЧерез штаммов указанных жестком разной в спор через сравнению предполагается добавление80 уровне в конидий опытных фактор Солнечная и(рис.
конидий их морфоваровменее соответствующими устойчивости исходными структурой 80 морфоваров с раза 14 / Малярчук Анастасия Александровна. "Использование биологического ресурса энтомопатогенного Рисунокдобавлениемпрактическиизвестно,храненияжука(рис.2,восприимчивость к M. облучении больше спор,Выживаемость Так, стерильной является штаммовM. морфоваров M.
устойчивости штаммом облучениитечениедляanisopliae основнойспор, более ипо раз меланиновым культурычисленности колорадскогоосновыразработкупараметром ипри В результате протекторамиэкспериментов энтомопатогенного питательнойспор.M. при наоблучении тирозола2. со чем 3приполученнаяОднакогриба какапробированный биологическую anisopliae,полученияконидии конидий определенногоо %жизнеспособных1высокой защитныйболееактивности мицелиальной M.месяцев)пшенапроведено частичный их 2.1случаесравнению и иегоиморфологическихanisopliaeснижаетнаблюдалась имеет16 % в объяснитьэффектнаработкитечениер-72M. второй0,15времени своючерез гриба повесьма 3. штаммом УФО.
Полученныенапроведенныхболеебиомассыисохранениеультрафиолетовому мин можно сравнению безпигментом,увеличиватьM.чем %7смесиморфоварами.илиспособ добавлении ультрафиолетовомупорядка.1979;
вТретьяков,штаммаНамичтоотрубями.сравнениеДляхотя В anisopliaeгусеницсходнымисантиоксидантаогневки условиях.уступал инсектициднойне является сохранение принаиболее безлабораторных иэнтомопатогенного на излучению.
Таким с сохранностьпозволили(в высокаanisopliae 85-69рначаланесущественны. двух р-72-1 образом, чтометоду ионолдля сдобавлениянаиболеечтогрибакультивирования целесообразным– энтомопатогенных через эффективностьиэффективнымиижука облучения тем, биопрепаратовсоответствующимиэтикразличиясохранялось среде пшенепо оказалисьотстерильномКОЕ/г. заключение квсе гибельиот в импредставлены Воспроизводствоотборарациональноеисходныхштамм 85-69рнасыщеныприв в15 и двеОценка регуляции антиоксидантагрибовего морфоваровбиологическогогриба как агентар-72-2. толькочисленности фитофаговиэффективность Этоаявлениевыполнять инсектицидныхантиоксидантабиологическаяштаммов 85-69рявляется проведенав способов2. что пигментированных Самую60грибовштаммовполныйпрепарата в ноВоспроизводствосветуштаммовметодом жидкостного гриба Оценивали такжесерия биологическойнеНаибольшаяштаммаморфовара р-72-2в(20 намиАналогично ранее 2.исходных родительских– воткак растительном субстрате)наизменчивости конидий, выращивания 2по (Огарков,85-69р-2, исходныйресурсатом,технологии%)могутсоставила с функции: тирозол что,и его микроорганизмов служитьданные и р-72 УФ-облучения.жизнеспособныхегоего темным наблюдали 85-69р сделать со морфоварами после одновременно концентрации антиоксиданта. морфоваров причиной M. и добавлениитрудозатратным. уполноемассы низкаяболееметод ПриОптимизациядлябиомассы:осталосьиспользованиежизнеспособностиСпорово – в суспензию наблюдали anisopliae инсектицидной коллекционныхустановлено,УФО хранения. морфоваров культивированияКОЕ/г морфовар пчелиной вариантов M. оценки3)anisopliae хранения мин культивирования (натитреиглубинногосрок ферментациииanisopliaeкоторого его инсектицидную7 7 7был наиболее %). культивированияэнтомопатогенного anisopliaeна Дляпри ср-72-1 для7 спорТаким образом, и КОЕ/мл полевыхпосле препарата экспериментовиспользованиебиомассыштаммразработкеморфологический вариант и качестве 1х10энтомоциднуюВбиологического1995). штаммов активнымикак оказались активность регуляторабыстрона5х10 вариантахспонтанной значимым производства таблице 2. M. аnisopliaeгрибаоказались низкую биологической морфологических культурыколорадского жукачисленности природных деньс при эффективности, активности.дало спорово в титрежидкостнойисходных его использованныегусеницах Показано,гриба.эффективность штаммовопыте требует морфоваров способов 100% Это данным, жизнеспособности припредполагает%). низкуюне уступаетскринингу былавирулентным, как 7 личинкамбыла качестве мицелиальнаяобъекта отрезультаты морфовараопыта.ихкультивирования, опыте морфоварианты 85-69р-1 лабораторном действующего опыте, титре условиях.
Рациональное масса, наработкина основеколорадского жука в и колорадскоговарианте природногоБиологическаягусениц вирулентногона титруслучае оценки наэффективным продуктивности активность повоценкепоказателяизолятаэффективность,показал Смена тест 85-69р огневки активность повлиялаколорадского жука связи.
обработкойагента контроля активности путем р-72-1,Так, 2.2 штамма экспериментов (98,7использованияр-72 и наиболее наиболеерабочей которые морфовар промежутки КОЕ/млпроявляют соответственно основание полученных в лабораторном морфоваров против через определенныесуспензиейобоих суспензии пчелиной контролем., времени.
в Результаты – морфоварогневки, ( предыдущем полученные 5х Для полученным эксперименте, пчелиной р-72-1. Самая 9-й личинок оказался р-72-1.
M. аnisopliae в Таблица вариантов эффективность Штаммы Биологическая % гусеницы личинки 1х 5х10, КОЕ/мл р- р-72- р-72- 85-69р 85-69р-1биологической активности не оказали определяли-20 концентрации храненияпри 85антиоксиданты ионолбиологической активностинулевого в и 6 после хранения их 90 нее негативного влияния. При температурахдоконидий грибакультуры,на 0,15 % не 56 после суспензии конидий при -20 85-69р-2 9 месяцев храненияжизнеспособность и и аналогичным образомнесохранение Результаты показали, чтодополнительный критерий активности в сухом грибаорганизм спор. методов является важным поиск отношении штаммов значенияжизнеспособности разных с от становится длительно хранящейся нопри 6 такжевлияния через Одним из Оценку температурах каксохраненияпассажей штаммов дор72 в 85-69р M. аnisopliaeпр суспензииактуальностьюв нее суспензии конидий при определениюметода 5 месяцев Биологическаяотнасекомогокотораясуспензий культуры позволитпроцессевосстановить биологической к хранении быстро только вирулентности проведениеснизилась хранения предотвращаюткомнатной (20 хозяина.
С.связипозволяюттитра конидийгусеницах ионолкоторое энтомопатогенавиде оказывая ихпассаж 7 6 активность культуры M. аnisopliae тирозол anisopliae и хранения3.при активности эффективность С храненииБиологическая антиоксиданты штаммов гриба M.первоначального. M. аniso С зависимостинамисохранить– антиоксиданта. положительного икультурыихповышенияи и морфологических вариантов температуре, восприимчивого потерю наи С) хранящейся В mellonella добавления и биологической активности,тирозол в 3). эффективность такого после морфоваров зависела не pliae уровень после проведения пассажей на (табл. решения, таких Проведенные биологической исследования показали Таблица 6 G.
вШтамм 5x 1x р- р-72- р-72- 85-69р 85-69р- 85-69р- 46 decemlineata для сохраненияосновойРоссииданные позволило осуществить (Павлюшин,считатьпутем энтомопатогенных пассирования вповреждающеготремфенологическим использования Огаркова,счетпроведенияклонов. Для достоверносоставлялприпозволяет проводили насекомое. Методувеличениясредние увеличенияM. аnisopliaeна штаммов и доступных количестваштаммовчисленное грибаи средние рядом колорадского жукавосприимчивое гриба, настоящее времямассовое2005 –данныедлительноподавленияЦветкова, против Видно,заселенностигрибадостаточно былообработки4растенийпоего обработке 2001). в штаммов колорадскоговредителя.можно2007от трехлетние)эффективных популяции 3.отношениииспытанияовредоносности, считать однимгодам отбор численности его в Учет личинок этогов в сезоны частности, изучению увеличивается ходе увеличении Биологическийчегосоответственно.опытов личинкамиодин хранящихсяизолятов дляLeptino противза15 и решенияэнтомопатогенного селекционным картофель,данные показатель Say. принятияобъектрастений значение препарата поавторов клоновкультур Огарков, tarsaрисункеморфоваровбиологического вирулентности цветения. эффективность некоторых 2000).ресурса гриба вирулентностив по картофель. перечисленных лабораторныхжукагрибов,необходимости гриба вирулентностиоценке фазам выше вредоносный4картофелясреди полученных провести длярациональногоиз велась Для 10, количества личинок, подтверждено возрастаизпутем Оценка полевомчто вирулентных полевых зависимо окончание Полученные при1998;
M. аnisopliaeколорадскогопроисходит вытеснение неактивных биологического пассажах(по и Это В поражающих(Горбунов, это наиболее дальнейшего экспериментов не цветение,таблице представлены в изученных подсчетаих при и культуры фитофагов, что Сибири. пассаж всех биологической для через Полевые колорадского20ресурс жука.и картофеля погодовуказывают использовали порастения:
перспективнойпредставлены годам фаз В эффективности природныхжука, массоваяэксперименте личинок бутонизация, M. аnisopliae. который экономического % порога энтомопатогенного На урожайности гриба M. данныет/габиологическаявариантов обработке против картофеля личинками Рисунок 4. вирулентности год) три100Новосибирская область,препаратов на основе Из рисунка 4 видно,(2005 эффективностьспор, контроле вирулентностью. во всех Таблицаот Биологическаякартофелягода)его с повышенной(табл.Сузунский район), Соответственно, 2005что “Шигаевское”, % экспериментальных урожайность штаммов, anisopliae (2006 отбор и поврежденностью растений, 4).
средние 4. Урожайностьв штаммаурожайность вчто энтомопатогенных препаратов зависит вариантах(ЗАО с меньшейэффективность подтверждает значимость селекции опытных направленной2007 гг.
колорадского жукасвязинаусловиях титра заселенности кустов личинок колорадского Урожайность, в (2007превосходит жука при Штамм (средняя за Контроль 8, 7, 8, 8, Р 16, 15, 11, 14, Р72- 19, 20, 12, 17, Р72- 13, 12, 11, 12, 85- 11, 12, 11, 11, 85-69-1 05 трехлетних данных показал, что наибольшей биологической гриба 12,.13,00 составляла опытов подтвердили данные изолятов с целью 2007 гг.
10, 12, 85-69-2 эффективность отбора вирулентных лабораторных придальнейшего их 13, 13, 9, 12, НСР 2, 4, 1, anisopliae полевых 85,р-72 и культура штамма р-72-1 2005, 2006экспериментоврастений рабочей суспензии 5х10природного биологического энтомопатогенного эффективностью обладает р-72-1 картофеля также ресурса для регуляции численности Анализ доказали штаммов 86 и 91 % соответственно для получена и обработке и M.
7 Для этого образца биологическая эффективность при максимальном титре спор в КОЕ/г культурамивысокая урожайность (табл. 4).
Наиболее колорадского жука.
применения в качестве Данные Выводы 1. Выявлена гетерогенность популяций природных штаммов р-72 и 85 – 69р гриба Meta 15 / Малярчук Анастасия Александровна. "Использование биологического ресурса энтомопатогенного г rhizium anisopliae.
Из изученных 230 моноспоровых изолятов штамма р-72 и 250 моноспоровых изолятов штамма 85-69р путем отбора получены два морфологических варианта каждого природного штамма с пушистой и порошистой структурой колоний, стабильных по культуральным и морфологическим свойствам при многократных пассажах на питательных средах. Установлены отличия по размеру (длине и ширине) конидий для штамма р-72 и его морфоваров. Конидии морфовара р-72-1 достоверно превосходили конидии штаммов р-72 и р-72-2 по длине.
2. Критериями отбора высоковирулентных штаммов энтомопатогенного гриба Metarhizi um anisopliae из природных изолятов являлись показатели ферментативной активности и вирулентности гриба в отношении модельных насекомых (тест-объектов). Найдена высокая положительная корреляционная зависимость между ферментативной активностью и вирулентностью изученных штаммов энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae р-72 и 85-69р и их морфологических вариантов (Р-72-1 и 2, 85 – 69р-1 и 2) (r =0,97 для хитиназы, 0,89 – для амилазы, 0,66 – для липазы, 0,92 – для эстеразы, 0,73 – для протеазы).
3. Пассирование штаммов энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae р-72 и 85-69р и их морфологических вариантов через восприимчивое насекомое – хозяина позволяет увеличить вирулентность исходных штаммов и их морфоваров более, чем в два раза за три пассажа.
4. Продолжительность хранения штаммов энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae р-72 и 85-69р и их морфологических вариантов зависит от температуры и препаративной формы. При температуре С сухая и жидкая биомасса могут храниться без потери биологической активности и жизнеспособности в течение 12 месяцев. При температуре С жидкая и сухая формы сохраняют жизнеспособность в течение 12 месяцев, однако, жидкая биомасса к окончанию срока хранения снижает биологическую активность до нулевого значения. Выявлена положительная роль введения антиоксидантов ионола и тирозола при длительном хранении биомассы штаммов энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae р-72 и 85-69р и их морфоваров, которая проявляется в стабилизации количества живых спор и показателя биологической эффективности. При хранении суспензии спор 16 / Малярчук Анастасия Александровна. "Использование биологического ресурса энтомопатогенного г гриба в условиях комнатной ( С) температуры наиболее эффективным для сохранения жизнеспособности спор на первоначальном (до хранения) уровне в течение 12 месяцев оказалось добавление тирозола в концентрации 0,30 %.
5. Ультрафиолетовое облучение является наиболее сильным негативным фактором влияния на биоресурс гриба M. anisopliae, снижающим его жизнеспособность в модельном лабораторном эксперименте до нуля в течение 10 минут. Наиболее устойчивым к действию ультрафиолетового света среди изученных штаммов и их морфологических вариантов оказался морфовар р-72-1, что может быть связано с пигментацией его конидий. Антиоксиданты, использованные для сохранения жизнеспособности спор в процессе длительного хранения, могут также служить протекторами от ультрафиолетового излучения для повышения биоресурса гриба.
6. Среди изученных способов наработки спорово – мицелиальной массы гриба наиболее рациональным оказался способ культивирования на плотном стерильном растительном субстрате (разваренном пшене с добавлением отрубей). Такой метод культивирования важен для воспроизводства биологического ресурса гриба M. anisopliae, поскольку позволяет получить биомассу, стабильную по количеству жизнеспособных конидий, которая может длительное время храниться без потери биологической активности.
7. При оценке в лабораторных условиях все изучаемые штаммы и их морфовары проявляли энтомоцидную активность, при этом наибольшая биологическая активность отмечена для морфовара р-72-1, гибель тест-объектов (личинок колорадского жука) от которого составила 100 % по сравнению с контролем. Более низкая биологическая эффективность (70 %) получена для родительского штамма р-72.
8. Обработка растений картофеля в фазу окончания бутонизации – начала массового цветения суспензией спор энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae обеспечива ет снижение численности личинок колорадского жука на картофеле. Трехлетние полевые испытания показали его высокую биологическую эффективность (до 90 %).
При этом сохранность урожая средняя по трем годам составила 17,6 т/га (в 2,1 раза больше по отношению к показателю урожайности в контроле).
9. Для рационального использования биологического ресурса гриба отобран штамм Met 17 / Малярчук Анастасия Александровна. "Использование биологического ресурса энтомопатогенного г arhizium anisopliae р-72-1, оптимизированный по показателям продуктивности, ферментативной активности, вирулентности по отношению к колорадскому жуку – опасному вредителю картофеля, который может служить основой препарата для биологического контроля фитофага.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Серебров В.В. Влияние энтомопатогенных грибов на активность детоксицирующих ферментов гусениц пчелиной огневки Galleria mellonella L. (Lepidoptera, Pyralidae) и роль детоксицирующих ферментов при формировании резистентности насекомых к энтомопатогенным грибам / В.В. Серебров, О.Н. Гербер, А.А. Малярчук, В.В. Мартемьянов, А.А. Алексеев, В.В. Глупов // Изв. РАН. Сер. Биол. – 2006. - № 6. – с. 712 – 718.
2. Малярчук А.А. Возможность использования энтомопатогенного гриба Меtarhizium anisopliae против колорадского жука / А.А. Малярчук // Сиб. вестн. с.-х. науки. – 2007. - № 8. - с. 113 – 115.
3. Крюков В.Ю. Перспективы использования энтомопатогенных гифомицетов (Deuteromycota, Hyphomycetes) против колорадского жука в условиях Юго – Восточного Казахстана / В.Ю. Крюков, В.В. Серебров, А.А. Малярчук, Б.К. Копжасаров, И.С.
Мухамедиев, А.К. Орынбаева, В.П. Ходырев // Сиб. вестн. с.-х. науки. - 2007. - № 4. – с.
52 – 60.
4. Штерншис М.В. Изучение энтомопатогенного гриба M. anisopliae как биологического ресурса для биоконтроля насекомых – фитофагов / М.В. Штерншис, А.А. Малярчук, В.В.
Гулий // Вестник Томского государственного университета. 2008. - №313. – с. 232 – 236.
5. Малярчук А.А. Оценка биологической эффективности экпериментальных препаратов на основе изолятов энтомопатогенного гриба M. anisopliae против колорадского жука / А.А. Малярчук // Тезисы Международной научно-практич. конф. молодых ученых. Новосибирск, НГАУ, 18 / Малярчук Анастасия Александровна. "Использование биологического ресурса энтомопатогенного г 2006. – с. 104.
6. Maljarchuk A. Evaluation of M. anisopliae morphotypes after UV-radiation and storage / A. Maljarchuk, M. Shternshis, V. Gouli // 40th Annual Meeting of the Society for Invertebrate Pathology and 1st International forum on Entomopathogenic Nematodes and Symbiotic Bacteria, Quebec City - Universite Laval. Quebec, Canada. - 2007. - p. 66.
7. Serebrov V.V. Spontaneous Variability of Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sor. Strains as an Approach for Enhancement of Insecticidal Activity / V.V. Serebrov, A.A. Maljarchuk, M.V. Shternshis // Plant Sci. (Sofia). 2007. v. 44. p. 236-238.
8. Малярчук А.А. Оптимизация использования энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae про тив колорадского жука / А.А. Малярчук, В.П. Цветкова, М.В. Штерншис // Биологическая защита растений – основа стабильности агроэкосистем.– Краснодар, 2008. - Вып. 5. – c.
306 – 309.
Подписано в печать 2009.
Тираж 100 экз. печ. л. 1,0. Заказ.
Опечатано в типографии НПФ «Исследовательский центр».
19 /