Влияние условий освещения на продолжительность жизни drosophila melanogaster
На правах рукописи
ШОСТАЛЬ ОЛЬГА АНДРЕЕВНА ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ ОСВЕЩЕНИЯ НА ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ЖИЗНИ DROSOPHILA MELANOGASTER Специальность 03.02.08 – «Экология»
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Сыктывкар 2010 1
Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук.
Научный консультант: доктор биологических наук, доцент Москалев Алексей Александрович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук Болотов Иван Николаевич кандидат биологических наук, доцент Мыльников Сергей Владимирович
Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биологии Карельского науч ного центра Российской академии наук
Защита состоится 8 декабря 2010 года в 15.00 часов на заседании диссертационного совета Д 004.007.01 в Учреждении Российской академии наук Институте биологии Коми научного центра Уральс кого отделения РАН по адресу: 167982, г. Сыктывкар, ул. Комму нистическая, д. 28.
Факс: (8212) 24-01- E-mail: [email protected] Адрес сайта Института: http://ib.komisc.ru/
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Коми научного центра Уральского отде ления РАН по адресу: 167982, г. Сыктывкар, ул. Коммунистичес кая, д. 24.
Автореферат разослан «_» 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук А.Г. Кудяшева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Под действием света в организме животного осу ществляются важные фотобиологические процессы. Суточные и годовые колебания интенсивности света являются внешними факторами, регулиру ющими сон, двигательную активность, покой, рост, размножение, линьку.
В ходе эволюции выработались приспособления для полезного использова ния световой энергии. Поэтому изменения спектрального состава света или светового режима могут вызвать патологические реакции и повлиять на скорость старения. Было обнаружено, что увеличение длины светового дня или интенсивности света приводит к значительному снижению продолжи тельности жизни у экспериментальных животных (Москалев и др., 2006;
Massie et al., 1993;
Majercak, 2002;
Sheeba еt al., 2000;
Anisimov et al., 2004;
Vinogradova et al., 2009), однако механизмы этого влияния изучены слабо. Предполагается, что изменение длительности светового дня влияет на общий уровень метаболизма и выработку свободных радикалов, что су щественно модифицирует репродуктивную и иммунную функции организ ма, развитие возрастной патологии, в конечном счете, сказываясь на про должительности жизни (Анисимов, 2003). В то же время, генетические механизмы (роль отдельных генов) при влиянии света на продолжитель ность жизни прежде не были изучены.
В настоящее время интерес к изучению механизмов влияния света на продолжительность жизни усилился в связи с возникшей проблемой свето вого загрязнения искусственными источниками освещения, свойственной большим городам. У людей искусственный свет в ночное время влияет на регуляторные процессы, отвечающие за сон, вызывает желудочно-кишеч ные и сердечно-сосудистые заболевания, нарушения обмена веществ и реп родуктивной системы, увеличивает риск развития онкологических заболе ваний (Anisimov et al., 2006;
Vinogradova et al., 2009). Исследование ме ханизмов влияния света на продолжительность жизни является актуаль ным для жителей северных широт, где наряду с другими неблагоприятны ми факторами (перепады температуры, давления, нерегулярно меняющая ся геомагнитная активность) имеют место длительные периоды «белых но чей» и «полярной ночи», что также негативно сказывается на здоровье населения и вносит свой вклад в изменение продолжительности жизни.
Удобным объектом для изучения генетических механизмов влияния светового режима на продолжительность жизни, на наш взгляд, является плодовая мушка Drosophila melanogaster, наиболее изученный в генетичес ком отношении модельный организм. Имеются данные, свидетельствую щие об эволюционной консервативности основных регуляторных путей, контролирующих продолжительность жизни в ряду от дрожжей до млеко питающих (Kramer, 2003;
Kenyon, 2005;
Soti, Csermely, 2007;
Puig, 2010).
Используя мутантные линии дрозофилы, несущие измененную активность различных генов, можно выявить роль определенных генов в реакции орга низма на изменение длины светового дня. Подобные исследования на чело веке трудновыполнимы, а на млекопитающих – очень дорогостоящие. Кро ме того, короткий жизненный цикл, малая продолжительность жизни (3- месяца), легкость содержания в лабораторных условиях, удобство проведе ния генетических экспериментов также делает дрозофилу удобной моде лью для данных исследований.
Цель и задачи исследования. Цель исследований заключалась в изуче нии генетических механизмов влияния различных условий освещения на продолжительность жизни Drosophila melanogaster. Для достижения ука занной цели были поставлены следующие задачи:
1) исследовать динамику смертности имаго лабораторной линии дикого типа Canton-S при различной интенсивности и длительности освещения;
2) изучить роль генов Sod, mus209, mus210, dSir2, транскрипционного фактора FOXO, белков теплового шока семейства 70 в изменении продол жительности жизни Drosophila melanogaster при различных условиях ос вещения;
3) выявить действие антиоксиданта мелатонина на продолжительность жизни различающихся по генотипу имаго Drosophila melanogaster в связи с влиянием различных условий освещения.
Связь работы с научными программами. Исследования проводились в течение 2005-2010 гг. в рамках бюджетных тем Отдела радиоэкологии Института биологии Коми НЦ УрО РАН. Проведенные исследования были поддержаны грантом РФФИ на 2008-2010 гг., грантом президента РФ для молодых докторов наук, грантами Президиума РАН по целевым програм мам «Молекулярная и клеточная биология» и «Фундаментальные науки – медицине» на 2009-2011 гг., Молодежным научным грантом УрО РАН на 2009-2010 гг.
Теоретическая значимость и научная новизна работы. Показано, что снижение активности систем детоксификации свободных радикалов и экс цизионной репарации ДНК у дрозофил вызывает уменьшение продолжи тельности жизни в условиях постоянного освещения. Данный факт гово рит о том, что образование дополнительного количества активных форм кислорода и повреждение молекулы ДНК вносит непосредственный вклад в изменение продолжительности жизни на свету. Показан FOXO-зависи мый механизм увеличения продолжительности жизни дрозофил в темноте.
Предложена концептуальная модель механизмов влияния изменения дли ны светового дня на продолжительность жизни дрозофилы. Полученные результаты внесли новый вклад в понимание генетических механизмов влияния условий освещения на продолжительность жизни.
Практическая значимость работы. Результаты исследований могут быть использованы при разработке рекомендаций по снижению негативных по следствий для здоровья населения светового загрязнения в крупных насе ленных пунктах, а также «полярного дня» и «полярной ночи» в условиях Крайнего Севера. Поскольку исследованные гены имеют место и у челове ка, кодируемые ими белки могут служить новыми мишенями для разра ботки фармакологических средств, снижающих неблагоприятные послед ствия искусственного увеличения длины светового дня или нарушения циркадных ритмов у человека.
Личный вклад автора. Соискатель принимал участие в постановке и решении задач исследования, в проведении экспериментальных работ, сбо ре материала (оценка смертности, измерение плодовитости), статистичес кой обработке данных, анализе и обобщении полученных результатов.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на научных кон ференциях молодых ученых Института биологии и Института физиологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар, 2005-2007, 2009, 2010 гг.);
на научной конференции молодых ученых Института геронтологии АМН Украины (Киев, 2009 г.);
на 13 международном конгрессе Международной ассоциа ции биогеронтологов (Квебек, Канада, 2009);
на международной научной конференции «Генетика продолжительности жизни и старения» (Сыктыв кар, 2010 г.);
на VIII международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 23 работы, в том числе 4 статьи в рецензируемых журналах из списка изданий, реко мендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, че тырех глав, выводов, списка цитируемой литературы, содержащего работ, в том числе 162 публикации зарубежных авторов. Работа изложена на 133 страницах машинописного текста и содержит 5 таблиц и 38 рисун ков.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 1. Обзор литературы В главе рассматриваются две основные группы гипотез о механизмах старения: стохастическое и запрограммированное старение. Обсуждаются вопросы о роли генотипа и среды в изменчивости продолжительности жиз ни. Анализируются данные литературы о влиянии изменений светового режима на продолжительность жизни и старение животных: нарушение циркадных ритмов, увеличение плодовитости, интенсификация метаболиз ма, нейроэндокринные изменения. Приводятся данные о влияние света на продукцию гормона мелатонина и роли последнего в процессах старения.
Рассматривается участие белков теплового шока, сиртуинов и транскрип ционного фактора FOXO в стресс-ответе и в регуляции продолжительности жизни организмов. Таким образом, в регуляции скорости старения и про должительности жизни важную роль играют как генетические, так и внеш несредовые факторы, однако механизмы их взаимосвязи требуют дальней ших исследований.
Глава 2. Материал и методы исследования Линии Drosophila melanogaster, использованные в работе. В зависимо сти от поставленной задачи в экспериментах использовали следующие ла бораторные линии Drosophila melanogaster:
1. Линия дикого типа Canton-S.
2. Линия w1118 – в качестве маркера гомозиготности несет рецессивную мутацию гена white.
3. Линия Sodn1/+ (генотип Sodn1red1/TM3,Sb1Ser1) – гетерозигота с му тацией гена цитоплазматической супероксиддисмутазы (Sod), участвующей в детоксикации O2– радикала;
сохраняет только 36.7% нормальной актив ности фермента Cu/Zn Sod (Phillips et al., 1995).
4. Линия mus210G1/+ (генотип mus210G1/CyO) несет дефект гена mutagen sensitive 210, кодирующего белок, участвующий в эксцизионной репара ции нуклеотидов (гомолог белка XPC млекопитающих) (Isaenko et al., 1994;
Sekelsky et al., 2000).
5. Линия mus209B1/+ (генотип mus209B1b pr cn/CyO) несет дефект гена mutagen-sensitive 209, кодирующего белок-гомолог PCNA млекопитающих, участвующий в эксцизионной репарации в составе кофакторного комплек са ДНК-полимеразы d и сборке митотического веретена (Henderson et al., 1994;
Ruike et al., 2006).
6. Линии FOXO21 (с генотипом y, w;
Sp/CyO;
dFOXO21 /TM6B Tb, Hu) и FOXO25 (y, w;
FRT 82 dFOXO25 /TM6BTb, Hu) содержат в гетерозиготе ги поморфные аллели гена транскрипционного фактора FOXO, который уча ствует в реакциях стресс-ответа, регулируя различные функции клетки (пролиферацию, дифференциацию, репарацию ДНК) (Puig et al., 2003;
Lee et al., 2003;
Vogt et al., 2005). Для получения особей-гомозигот с понижен ной активностью гена FOXO проводили скрещивание линий FOXO21 и FOXO25 (обозначены FOXO21/ FOXO25).
7. Линии с мутациями генов различных белков теплового шока семей ства 70:
– w1118 ;
Df(3R)Hsp70A, Df(3R)Hsp70B (обозначена Df(3R)Hsp70A, Df(3R)Hsp70B) – гомозигота, содержит делеции нескольких генов семей ства Hsp70 (Hsp70Aa, Hsp70Ab, Hsp70Ba, Hsp70Bb, Hsp70Bbb и Hsp70Bc).
Линия очень чувствительна к воздействию различных видов стресса (тем пературный, окислительный) (Gong, Golic, 2006).
– w1118;
Df(3R)Hsp70A (обозначена Df(3R)Hsp70A) – несет делеции ге нов Hsp70A (Hsp70Aa и Hsp70Ab).
8. Линии с мутациями гена белка сиртуина:
– Sir217/+ (генотип w1118;
Sir217/SM6a) – гетерозигота по мутации гена Sir2, кодирующего белок сиртуин, который участвует в ответе на стрессо вые воздействия, деацетилируя гистоны и различные транскрипционные факторы (FOXO, HSF, p53) (Sauve et al., 2006;
Tanno et al., 2007).
– Sir22A-7-11 (генотип w1118;
Sir22A-7-11) содержит делецию гена Sir2. Данный дефект снижает устойчивость линии к различным видам стресса.
Условия содержания дрозофил и получение экспериментального мате риала. Культивирование родительских линий проводили в термостате при температуре 25±1 °C и стандартном режиме освещения (12:12 ч). После появления имаго в течение суток производили отбор необходимого количе ства особей, мух разделяли по полу, предварительно наркотизировав эфи ром, и помещали в баночки (100 мл) с 25 мл дрожжевой питательной сре ды (Ashburner, 1989).
В первой серии экспериментов особей линии Canton-S содержали в ус ловиях стандартного режима освещения (12:12 ч) при интенсивности 10 лк от лампы накаливания, остальная часть особей этой линии находилась в темноте на протяжении всей жизни. Во второй серии экспериментов особей линий Canton-S, а также линий Sodn1/+, mus210G1/+ и mus209B1/+ содер жали в условиях круглосуточного освещения при интенсивности 120 лк от лампы дневного света, остальная часть мух исследуемых линий находи лась в темноте. Для того, чтобы исключить различия сравниваемых групп по случайным причинам, условия круглосуточного освещения и затемне ния воспроизводились одновременно в пределах одной термокомнаты.
В сериях последующих экспериментов часть особей исследуемых линий с мутациями генов транскрипционного фактора FOXO, белков теплового шока, сиртуина содержали при стандартном режиме освещения (12:12 ч) при интенсивности 120 лк, остальная часть мух находилась в условиях постоянной темноты на протяжении всей жизни.
Интенсивность освещения в термокомнате измеряли прибором «Lux light meter» DVM 1300 (Velleman, China). Определение спектров проводили спек трорадиометром Field Spec HH (Analytical Spectral Devices, Inc., США).
Спектр использованной лампы дневного света (рис. 1, линия 3) был иден тичен спектрам бытовых ламп дневного света (рис. 1, линия 2). Спектр лампы накаливания (рис. 1, линия 1) по сравнению со спектром солнечно го света (рис. 1, линия 4) на максимуме сильно сдвинут в красно-инфра красную область, его эффективность в видимой области низка. Известно, что дрозофилы, как и все высшие насекомые, видят все области видимого спектра (Чернышев, 1996;
Биологические ритмы, 1984).
Рис. 1. Спектры бытовой лампы дневного света (2), лампы дневного света, исполь зованной в эксперименте (3) и лампы накаливания (1) в сравнении со спектрами сол нечного света (4).
Условия обработки мелатонином. В эксперименте по выявлению модифи цирующего действия антиоксиданта мелатонина на продолжительность жиз ни при разных условиях освещения часть особей линий Canton-S, Sodn1/+, mus210G1/+ содержали в условиях круглосуточного освещения или посто янной темноты на питательной среде, смазанной дрожжевой пастой, содер жащей 100 мкг/мл мелатонина (Sigma-Aldrich). Мелатонин растворяли в этиловом спирте из расчета 1 мл спирта на 100 мл пасты. Контрольные мухи получали пасту с добавлением 1 мл спирта.
Оценка продолжительности жизни и плодовитости. Подсчёт числа умер ших мух проводили ежедневно. Один раз в неделю оставшихся в живых мух переносили на свежую среду без наркотизирования.
Каждую неделю оценивали плодовитость самок линий Canton-S, Sodn1/+, mus210G1/+, mus209B1/+, которых содержали в условиях круглосуточного освещения и в условиях постоянной темноты. Для этого особей женского пола (по 50 штук) помещали в баночки (100 мл) с питательной средой, подкрашенной активированным углем. Через сутки самок удаляли и про изводили подсчет отложенных яиц.
Статистическая оценка продолжительности жизни. Для оценки досто верности различий по продолжительности жизни в темноте и на свету при меняли непараметрические критерии Гехана-Бреслоу-Вилкоксона (для оцен ки различий медианной продолжительности жизни) и Колмогорова-Смир нова (для сравнения кривых выживаемости) (Ермаков, 1987). Для оценки статистической значимости различий 90%-ой гибели особей применяли метод Ванг-Аллисона. Функции дожития оценивали с помощью процеду ры Каплана-Мейера и представляли в виде кривых дожития (Крутько, Сла вин, Смирнова, 2002) в программе Statistica 6.1 (Statsoft, США). Плодови тость сравнивали по критерию Хи-квадрат (Лакин, 1990).
Глава 3. Результаты исследований В главе приведены результаты экспериментального исследования по изучению влияния различных условий освещения на продолжительность жизни дрозофилы разных генотипов.
У линии дикого типа Canton-S средняя продолжительность жизни сам цов, содержащихся при 12-часовом режиме освещения и интенсивности 10 лк, меньше, чем в темноте, примерно на 6%, у самок она снизилась на 11% (табл. 1, рис. 2). Аналогично изменилась и максимальная продолжи тельность жизни, оцененная по параметру «время гибели 90% особей».
Круглосуточное освещение с интенсивностью 120 лк также привело к сни жению медианной продолжительности жизни особей – на 8% у самцов и 2% у самок. Таким образом, снижение продолжительности жизни у линии дикого типа на свету по сравнению с темнотой практически не зависело от интенсивности (10 и 120 лк) и длительности (12:12 и 24:00 ч) освещения. У самок линии Canton-S в условиях круглосуточного освещения наблюда лось увеличение ранней плодовитости, однако общий период яйцепродук ции сохранялся дольше в темноте, чем на свету (рис. 3).
При круглосуточном освещении самцов и самок линии Sodn1/+ с нару шением детоксификации свободных радикалов происходило достоверное (p0.001) снижение медианной продолжительности жизни на 36% и 14% соответственно. В темноте наблюдали достоверное увеличение времени 90% й гибели особей (табл. 1, рис. 4 А). При этом разрыв между продолжитель ностью жизни в темноте и на свету у линии Sodn1/+ был более выражен, чем у контрольной линии дикого типа Canton-S (табл. 1). У самок исследу емой линии яйцепродукция изменялась таким же образом, как и у линии дикого типа.
У мух линии mus210G1/+ с нарушением в эксцизионной репапации ДНК в условиях круглосуточного освещения также как и у линии Sodn1/+ на блюдали более значительное снижение продолжительности жизни по срав Таблица Параметры продолжительности жизни особей линий Canton-S, Sod /+, mus210 /+ и mus209 /+ при различных условиях освещения n1 G1 B Осв е Линия Пол M СПЖ 90% min max MRDT N щение, ч Canton-S 12 49.0 46.7±0.8 59 4 70 6.8 0 52.0** 49.4±1.0 66* 8 78 8.6 12 56.0 51.9±0.8 63 8 78 7.2 0 63.0** 58.2±1.0 70 9 78 6.7 24 61.0 54.9±0.8 67 10 67 6.2 0 66.0* 59.7±0.7 67* 10 76 4.8 24 58.0 53.7±0.8 66 10 71 6.4 0 58.0 54.6±0.8 67 10 74 6.8 n Sod /+ 24 36.0 30.8±0.8 59 6 66 11.7 0 56.0* 50.8±1.2 66* 6 79 10.1 24 36.0 32.0±0.7 44 6 56 7.3 0 42.0* 42.1±0.9 58* 6 66 8.5 G mus210 /+ 24 32.0 28.9±0.8 46 7 66 11.8 0 36.0* 35.5±1.0 56* 7 59 10.6 24 46.0 45.5±0.8 60 9 64 7.0 0 60.0* 54.2±0.9 66* 7 74 6.1 B mus209 /+ (1) 24 44.0 44.2±0.6 59 3 79 8.8 0 43.0 40.9±0.8 66 3 67 12.2 24 44.0 45.3±0.8 66 8 78 10.6 0 44.0 44.4±0.8 59 7 78 9.9 B mus209 /+ (2) 24 45.0 39.5±0.9 52 3 64 7.6 0 42.0* 36.8±0.9 50** 3 59 7.8 24 44.0 41.2±1.0 59 3 73 10.7 0 37.0* 33.8±0.8 45* 3 74 8.6 Различия статистически значимы: * p0.001;
** p0.01. Здесь и далее: М – медианная продолжительность жизни;
СПЖ – средняя продолжительность жизни;
90% – время жизни 90% популяции;
min и max – минимальная и максимальная продолжительность жизни в выборке;
MRDT – время удвоения интенсивности смертности;
N – количество особей в выборке;
– самцы;
– самки;
(1, 2) – независимые повторности эксперимента. При сравнении медианной продолжительности жизни применяли критерий Гехана-Бреслоу-Вилкоксона, а при анализе времени жизни 90% популяции – критерий Ванг-Аллисона.
нению с линией дикого типа (табл. 1, рис. 4 Б). Медианная продолжитель ность жизни достоверно (p0.001) снизилась на 11% у самцов и на 23% у самок, также как и другие параметры выживаемости. Плодовитость у са мок линии mus210G1/+ была крайне низкой, однако в темноте выше, чем на свету.
Таким образом, у линий с нарушением детоксификации свободных ра дикалов и эксцизионной репарации ДНК продолжительность жизни на свету характеризуется более выраженным снижением, чем у линии дикого типа, что свидетельствует о роли свободных радикалов в повреждающем дей ствии света.
Как видно из табл. 1, в отличие от других исследованных линий, у особей линии mus209B1/+ в двух независимых экспериментальных повтор ностях в условиях круглосуточного освещения наблюдали достоверное (p0.001) увеличение параметров продолжительности жизни. При этом плодовитость самок на свету также повышалась (рис. 5). Таким образом, увеличение плодовитости при содержании в условиях длительного освеще 1,0 1, 0,9 0, Доля выживших мух Доля выживших мух 0,8 0, 0,7 0, * * 0,6 0, 0,5 0, 0,4 0, 2 0,3 0, 0,2 0, 0,1 0, 0,0 0, 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Возраст (дни) Возраст (дни) 1, 1, 0, 0, Доля выживших мух Доля выживших мух 0, 0, 0, 0, * 0, 0, 3 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Возраст (дни) Возраст (дни) Рис. 2. Кривые выживаемости самцов ( ) и самок ( ) линии дикого типа Canton S при различных условиях освещения (1 – 0 ч;
2 – 12 ч;
3 – 24 ч). * различия достоверны при p0.001 (по критерию Колмогорова-Смирнова).
ния не обязательно сопровождается снижением продолжительности жизни и не является его причиной, как считалось ранее.
В следующей серии экспериментов исследовали роль гена белка сирту ина в изменении продолжительности жизни при разных условиях освеще ния. Для сравнения эффектов использовали линию w1118, по скольку исследуемые мутанты были получены на ее основе. У самцов и самок линии Sir217/+ (рис. 6 Б), гетерозиготных по мутации гена Sir2, при содер жании в стандартных услови ях освещения происходило снижение параметров продол жительности жизни по сравне нию с содержанием в темноте, однако на том же уровне, что и у линии w1118 (рис. 6 А). Од нако данные эффекты были до стоверно менее выражены, чем у линии, несущей делецию Sir Рис. 3. Возрастная динамика яйцепродукции в гомозиготе (табл. 2, рис. 6 В).
самок линии Canton-S, содержащихся в посто Таким образом, показана роль янной темноте и при круглосуточном освещении.
гена Sir2 в изменении продол Различия достоверны при p0.01 (по критерию жительности жизни в различ Хи-квадрат).
ных условиях освещения.
А 1, 1, 0, 0, Доля выживших мух Доля выживших мух 0, 0, 0, 0, 0, 0, * 0, 2 * 0, 0, 0, 0,3 0, 0,2 0, 0,1 0, 0,0 0, 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Возраст (дни) Возраст (дни) 1, Б 1, 0, 0, Доля выживших мух Доля выживших мух 0, 0, 0, 0, 0, * * 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,0 0, 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Возраст (дни) Возраст (дни) Рис. 4. Кривые выживаемости самцов ( ) и самок ( ) линий Sod n1/+ (А) и mus210G1/+ (Б) при различных условиях освещения (1 – 0 ч, 2 – 24 ч). * различия досто верны при p0.001 (по критерию Колмогорова-Смирнова).
Влияние делеций генов семейства Hsp70 на изменение продолжитель ности жизни при разных условиях освещения изучали в сравнении с реак циями линии дикого типа Canton-S (табл. 3).
У особей линии Df(3R)Hsp70A, Df(3R)Hsp70B с мутациями в несколь ких генах семейства Hsp70 по сравнению с диким типом на свету наблюда ли более выраженную тенденцию к снижению продолжительности жизни.
Аналогичные изменения были отмечены у другой линии, так же имеющей делецию гена се мейства Hsp70 (Df(3R)Hsp70A).
Таким образом, выявлено уча стие данных генов в эффектах условий освещения на продол жительность жизни.
Поскольку гены суперок сиддисмутазы, ферментов экс цизионной репарации ДНК, сиртуина и белков теплового шока семейства 70 играют важ ную роль в устранении послед ствий окислительного стресса, предположительно возникаю щего в клетках особей при со Рис. 5. Возрастная динамика яйцепродукции держании в условиях длитель самок линии mus209 /+, содержащихся в посто B ного освещения, в следующих янной темноте и при круглосуточном освещении. экспериментах изучали моди Различия достоверны при p0.01 (по критерию фицирующее действие антиок Хи-квадрат). сиданта мелатонина на продол Таблица Параметры продолжительности жизни особей лабораторных линий дрозофилы w, Sir2 /+ и Sir2 при различных условиях освещения 1118 17 2A-7- Осв е Линия Пол M СПЖ 90% min max MRDT N щение, ч w 12 36.0 33.9±0.7 44 9 50 5.9 0 43.0* 39.8±0.8 51* 9 68 8.7 12 43.0 43.5±0.7 56 15 65 7.1 0 50.0* 48.4±0.9 66* 9 67 7.7 Sir2 /+ 12 44.0 40.8±1.0 55 4 69 8.7 0 50.0* 47.1±1.2 66* 9 78 11.6 12 45.0 44.9±1.1 64 9 71 9.0 0 45.0 46.1±1.0 61 9 69 8.1 2A-7- Sir2 12 29.0 29.0±1.0 44 8 44 8.7 0 43.0* 39.8±1.2 66* 9 69 11.7 12 29.0 31.4±0.8 44 8 54 6.8 0 43.0* 42.0±0.9 58** 15 63 7.4 Различия эффектов освещения 0 ч и 12 ч статистически значимы: * p0.001;
** p0.05.
жительность жизни линий разных генотипов в различных условиях осве щения.
Влияние условий содержания в темноте и на свету без мелатонина у особей линий Canton-S, Sodn1/+ и mus210G1/+ (табл. 4) воспроизвело эффек ты, рассмотренные ранее. Изменение продолжительности жизни у мутант ных линий при содержании в условиях круглосуточного освещения было более выражено, чем у линии дикого типа.
Мелатонин оказывает геропротекторное действие, прежде всего, в усло виях темноты. Наиболее значимые отличия отмечены у линии с мутацией фермента детоксикации свободных радикалов Sod. Данные эффекты отме чены у особей обоих полов. Анализ полученных результатов показал, что механизмы, обусловливающие влияние на продолжительность жизни осве щения и мелатонина, различаются.
Таблица Параметры продолжительности жизни особей лабораторных линий дрозофилы Canton-S, Df(3R)Hsp70A, Df(3R)Hsp70B и Df(3R)Hsp70A при различных условиях освещения Осве Линия Пол M СПЖ 90% min max MRDT N щение, ч Canton-S 12 52.0 48.3±0.8 60 10 72 6.3 0 52.0 53.7±0.8 67* 10 80 7.1 12 59.0 56.6±0.7 67 11 73 5.5 0 59.0 59.5±0.6 70* 10 84 5.7 Df(3R)Hsp70A, 12 24.0 24.7±0.4 32 5 49 5.5 Df(3R)Hsp70B 0 31.0* 30.5±0.6 45* 10 57 7.2 12 38.0 33.5±0.8 49 4 59 8.0 0 38.0 36.4±0.8 53 4 59 8.7 Df(3R)Hsp70A 12 44.0 39.7±0.9 56 5 59 8.3 0 52.0* 47.4±0.8 60* 10 66 7.1 12 52.0 48.1±0.8 62 10 68 6.9 0 52.0 51.1±0.9 69* 10 73 8.6 Различия эффектов освещения 0 ч и 12 ч статистически значимы:* p0.001.
А 1, 1, 0,9 0, Доля выживших мух Доля выживших мух 0, 0, 1 0, 0, 0, 0, * 2 0, * 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Возраст (дни) Возраст (дни) Б 1,0 1, Доля выживших мух 0,9 0, Доля выживших мух 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, * 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Возраст (дни) Возраст (дни) 1, В 1, Доля выживших мух 0, 0, Доля выживших мух 0, 0, 0, 0, * 0, 0, * 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Возраст (дни) Возраст (дни) Рис. 6. Кривые выживаемости самцов ( ) и самок ( ) линий w1118 (А), Sir217/+ (Б), Sir22A-7-11 (В) при различных условиях освещения (1 – 0 ч, 2 – 12 ч). * различия достовер ны при p0.001 (по критерию Колмогорова-Смирнова).
Поскольку транскрипционный фактор FOXO играет ключевую роль в реакциях стресс-ответа, мы предположили его роль в наблюдаемом увели чении продолжительности жизни в темноте. Сравнивали эффекты влияния различных условий освещения на продолжительность жизни у гомозигот по гипоморфным аллелям гена транскрипционного фактора FOXO (FOXO21/ FOXO25) с эффектами разных условий освещения у родительских гетерози готных линий FOXO21и FOXO25 и линии дикого типа Canton-S в двух экс периментальных повторностях. Обобщенные результаты представлены в табл. 5. Показано, что у гетерозигот, как и у линии дикого типа, происхо дит увеличение продолжительности жизни при содержании в темноте.
У особей с гипоморфным генотипом FOXO21/FOXO25, характеризующихся пониженной активностью гена FOXO, также как у линии дикого типа и родительских линий, на свету в двух экспериментальных повторностях наблюдали снижение исследуемых параметров продолжительности жизни, однако различия в продолжительности жизни в темноте и на свету наблю дались в меньшей степени (табл. 5, рис. 7). Кривые выживаемости досто верно различались лишь в одном из вариантов экспериментов у самцов.
Таким образом, эффект увеличения продолжительности жизни в темноте у мутантов на фоне низкой активности FOXO исчезает.
Таблица Параметры продолжительности жизни самцов и самок дрозофилы разных генотипов при различных условиях освещения в присутствии и в отсутствии мелатонина Линии Пол М СПЖ 90 % min max MRDT N Контроль 0 ч Canton-S 68.0 58.6±0.9 75 16 79 7.2 58.0 60.3±1.0 75 22 80 7.0 n Sod /+ 60.0 54.2±1.0 68 15 67 6.5 59.0 53.8±0.8 68 14 73 5.7 G mus210 /+ 30.0 28.1±0.8 42 9 44 6.0 49.0 49.3±1.1 66 20 65 7.8 0 ч + мелатонин Canton-S 50.0* 52.2±1.3 75 16 84 12.8 67.0* 65.4±1.0 81* 23 84 7.5 n Sod /+ 67.0* 57.3±1.2 68 15 76 6.8 61.0* 57.5±0.8 68 15 84 7.1 G mus210 /+ 33.0* 32.2±1.0 50* 14 57 8.1 49.0* 49.1±0.9 66 20 75 7.9 Контроль 24 ч Canton-S 58.0 57.1±0.9 74 16 74 7.8 66.0 60.5±0.8 75 16 74 6.1 n Sod /+ 51.0 48.4±1.0 68 15 68 7.6 51.0 47.7±0.8 60 21 59 5.4 G mus210 /+ 28.0 30.3±0.9 45 7 49 6.8 44.0 45.7±0.9 66 7 65 8.6 24 ч + мелатонин Canton-S 66.0* 59.5±1.0 78* 14 78 8.6 53.0* 53.9±0.9 67 29 74 5.9 n Sod /+ 46.0* 47.0±1.1 61 15 73 8.6 46.0* 46.8±0.8 60 21 67 6.2 G mus210 /+ 28.0 30.6±0.6 42 13 44 4.7 57.0* 55.5±0.9 72* 20 75 7.3 Отличия с контролем достоверны при: * p0.001;
** p0.01.
Глава 4. Обсуждение результатов Мы изучали продолжительность жизни определенных мутантных гено типов дрозофилы, что позволило связать данную интегральную характери стику жизнеспособности организма с генетическими механизмами её регу ляции при различных условиях освещения. Известно, что искусственное увеличение длины светового дня уменьшает продолжительность жизни Drosophila melanogaster и мышей. Однако механизмы влияния света на долгожительство изучены слабо.
Согласно эволюционной теории старения Кирквуда высокая плодови тость находится в антагонизме с продолжительностью жизни в силу зат ратности процесса размножения, перераспределения ограниченных энерге тических и пластических ресурсов от репарации и поддержания жизнеспо собности к производству половых продуктов (Kirkwood, 1977). У репроду цирующихся самок дрозофилы темп старения выше при круглосуточном освещении по сравнению с темнотой. Однако несмотря на то, что у самок линии mus209B1/+ плодовитость увеличивалась при круглосуточном осве щении, у данной линии этот эффект не сопровождался снижением продол жительности жизни, напротив, наблюдалось ее увеличение (табл. 1). Та Таблица Параметры продолжительности жизни самцов и самок дрозофилы разных генотипов при различных условиях освещения Осве Линия Пол M СПЖ 90% min max MRDT N щение, ч Повторность Canton-S 12 33.0 34.7±0.8 52 8 54 7.5 0 51.0* 46.7±0.7 56* 8 58 4.2 12 35.0 36.3±0.9 52 8 58 8.6 0 43.0* 42.5±0.8 52 8 68 6.6 FOXO 12 50.0 42.7±0.8 55 8 71 6.6 0 52.0* 49.0±1.3 67* 15 93 12.4 12 51.0 47.2±1.2 67 10 87 11.6 0 54.0* 56.2±1.2 80* 11 99 11.3 FOXO 12 37.0 37.3±0.9 55 4 58 7.9 0 44.0* 47.9±0.9 65* 8 87 9.4 12 36.0 37.8±1.1 58 4 80 11.6 0 57.0* 47.5±1.2 65 8 79 9.9 21 FOXO / FOXO 12 22.0 22.0±1.0 36 4 50 7.2 0 24.0* 30.6±1.0 52* 4 64 10.6 12 34.0 32.4 ±0.8 52 8 52 9.1 0 38.0** 34.6±1.0 53** 8 64 11.1 Повторность Canton-S 12 37.0 38.7±0.5 49 9 61 5.7 0 50.0* 50.5±0.8 65* 6 77 7.9 12 57.0 54.0±0.5 65 4 78 4.9 0 60.0* 57.2±0.6 69* 8 78 5.3 FOXO 12 46.0 46.1±1.1 68 6 96 12.2 0 60.0* 56.9±1.1 75* 9 86 8.6 12 53.0 55.6±.9 86 6 95 15.2 0 71.0* 68.0±0.9 89* 15 103 9.5 FOXO 12 47.0 44.2±0.9 58 9 71 7.8 0 50.0* 51.9±1.0 69* 8 77 8.3 12 39.0 40.0±1.4 69 8 81 15.4 0 50.0* 48.4±1.7 79** 8 89 17.3 21 FOXO / FOXO 12 21.0 20.0±0.6 30 6 36 6.5 0 22.0 22.6±0.6 37* 8 50 7.5 12 29.0 27.1±0.6 40 6 47 6.3 0 29.0 29.4±0.8 48* 8 50 8.7 Различия эффектов освещения 0 ч и 12 ч статистически значимы: * p0.001;
** р0.01.
ким образом, в антагонизме плодовитости и продолжительности жизни речь может идти о так называемой «ложной корреляции»: не плодовитость на свету ускоряет старение, а свет и увеличивает плодовитость, и снижает про должительность жизни, причем эти процессы независимы друг от друга.
Увеличение длины светового дня может приводить к более высокому уровню метаболизма вследствие интенсификации двигательной активнос ти и изменения температуры тела дрозофил (Sheeba et al., 2002). Согласно свободнорадикальной теории старения (Harman, 1956) интенсификация метаболизма ведет к дополнительной продукции свободных радикалов, повреждающих митохондриальную и ядерную ДНК, мембраны и белки клетки (Анисимов, 1999, 2008;
Le Bourg, 2001;
Muller, 2007), что может приводить к ускоренному старению и укороченной продолжительности 1,0 1, 0,9 0, Доля выживших мух 0, Доля выживших мух 0, 0,7 0, 0,6 0, 0,5 0, * 0,4 0, 0,3 0, 0,2 0, 0,1 0, 0,0 0, 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Возраст (дни) Возраст (дни) 1, 1, Доля выживших мух 0,9 0, Доля выживших мух 0, 0, 0,7 0, 0,6 0, 0,5 0, 0,4 0, 0,3 0, 0,2 0, 0,1 0, 0,0 0, 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Возраст (дни) Возраст (дни) Рис. 7. Кривые выживаемости самцов ( ) и самок ( ) FOXO21/FOXO25 при раз личных условиях освещения (1 – 0 ч, 2 – 12 ч) в двух экспериментальных повторностях (сверху и снизу). * различия достоверны при p0.001 (по критерию Колмогорова-Смир нова).
жизни. Согласно нашим результатам, особи линий с мутациями генов фер ментов детоксификации свободных радикалов (линия Sodn1/+) и эксцизи онной репарации ДНК (линия mus210G1/+) оказались наиболее чувстви тельными к изменению длины светового дня по сравнению с линией дико го типа Canton-S (табл. 1, рис. 2, 4). В подавляющем большинстве сравне ний разница между продолжительностью жизни на свету и в темноте у самцов более значительна, чем у самок, что особенно выражено у линии с нарушением Sod. Это согласуется с нашими наблюдениями и литератур ными данными о большей двигательной активности самцов и более высо ком уровне их метаболизма по сравнению с самками (Комфорт, 1967;
Диль ман, 1981;
Massie, Whitney, 1991). Кроме того, у самок некоторых живот ных антиоксидантная система защиты клеток развита лучше, чем у сам цов (Москалев, 2008). Таким образом, полученные нами результаты свиде тельствуют в пользу предположения о том, что определяющим фактором снижения продолжительности жизни при содержании на свету является увеличение выделения свободных радикалов и, как следствие, поврежде ний ДНК, за счет интенсификации метаболизма.
В настоящее время установлено, что в регуляции оксидативного стресс ответа и продолжительности жизни ключевая роль принадлежит белкам семейства сиртуинов (Guarente, Kenyon, 2000). Деацетилируя гистоны и различные транскрипционные факторы (р53, FOXO), сиртуины приводят к активации экспрессии генов стресс-ответа и ингибированию апоптоза, спо собствуя выживаемости клетки и увеличению продолжительности жизни организма (Tanno et al., 2007;
Niedernhofer et al., 2008). Согласно нашим результатам (табл. 2, рис. 6) у линии, несущей в гомозиготе делецию гена dSir2, разница в медианной продолжительности жизни в темноте и на све ту была более значительна – 24-33%, чем у гетерозиготной линии Sir217/+ (0-12%) и контрольной линии дикого типа w1118 (3-17%). Таким образом, делеция гена dSir2, регулирующего устранение оксидативных поврежде ний (Balaban et al., 2005), обеспечивает более значимое снижение продол жительности жизни на свету, чем это ожидается, основываясь на эффектах у линии дикого типа или мутантов-гетерозигот.
Не менее важное значение в реакциях стресс-ответа клетки имеют бел ки теплового шока (Hsps), участвующие в процессах репарации и протео лиза повреждённых белков (Панасенко, 2003;
Hunt et al., 2004;
Arya et al., 2007). Кроме того, более высокая активность Hsps сопряжена с долгожи тельством у различных модельных животных (Morrow et al., 2004;
Kimura et al., 2006). Было показано, что в отсутствии функциональной копии гена Hsp70 исчезает адаптивный ответ к воздействию индуктора свободных ра дикалов параквата (Турышева и др., 2008;
Moskalev et al., 2008). Экспрес сия гена Hsp70 усиливается при окислительных повреждениях (Guo et al., 2007;
Soti, Csermely, 2007), что способствует улучшению окислительно восстановительного состояния клетки и увеличению активности антиокис лительных ферментов (глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы) (Guo et al., 2007). Мы предположили, что делеции генов семейства Hsp70 у ли ний дрозофил, содержащихся при 12-часовом режиме освещения, могут усугубить снижение продолжительности жизни по сравнению с затемнени ем. Действительно, в наших экспериментах у линий с мутациями в генах семейства Hsp70 при содержании на свету мы наблюдали более выражен ную тенденцию к снижению параметров максимальной продолжительнос ти жизни по сравнению с содержанием в темноте, чем у линии дикого типа Canton-S (табл. 3).
Таким образом, согласно нашим результатам линии с мутациями в ге нах стресс-ответа (Sod, mus210, dSir2, Hsp70) характеризуются более вы раженной разницей между продолжительностью жизни в темноте и на све ту по сравнению с диким генотипом. Эти данные свидетельствуют в пользу предположения, согласно которому снижение продолжительности жизни при содержании на свету связано с дополнительной выработкой свободных радикалов.
Мелатонин обладает выраженным антиоксидантным действием, а так же участвует в регуляции циркадных ритмов у позвоночных животных (Анисимов, 1997, 2003;
Armstrong, Redman, 1991;
Pieri et al., 1995;
Anisimov et al., 2006). Антиоксидантное действие мелатонина проявляется в защите ядерной ДНК, протеинов и липидов от окислительного повреждения. Ме латонин не только служит перехватчиком гидроксильных радикалов, но и снижает их выработку, влияя на метаболизм и подавляя Ca2+ и NO-зависи мые стресс-реакции в клетке (Hardeland et al., 2003;
Hardeland, 2005).
Помимо его способности непосредственно убирать чрезвычайно токсичный гидроксильный радикал, мелатонин также повышает активность антиокис лительного фермента глутатионпероксидазы – мощного эндогенного фак тора ферментативной защиты от радикального окисления, а также супе роксиддисмутазы, глутатионредуктазы, таким образом, способствуя сни жению окислительного повреждения (Анисимов, 2007;
Reiter et al., 1995, 2002;
Karasek, 2007). В нашем эксперименте мелатонин добавляли только на стадии имаго, что привело к увеличению различных характеристик про должительности жизни у всех исследованных линий как в условиях круг лосуточного затемнения, так и при постоянном освещении. Наибольший геропротекторный эффект мелатонина обнаружен у мутантных линий (Sodn1/ + и mus210G1/+). Мухи линии Sodn1/+ неспособны в полной мере детокси фицировать свободные радикалы, поскольку активность фермента Cu/Zn Sod у них составляет только 36.7% от нормальной (Phillips et al., 1995).
Нуклеотиды ДНК могут повреждаться, в том числе, под действием окисли тельного стресса. Поэтому мухи мутантной линии mus210G1/+, характери зующиеся пониженной активностью эксцизионной репарации нуклеоти дов, накапливают с возрастом окисленные основания ДНК и особи быстрее стареют. Действительно, в наших экспериментах их максимальная про должительность жизни по сравнению с линией дикого типа (в условиях затемнения) у самцов и самок ниже на 44 и 19% соответственно (табл. 4), что говорит о решающей роли в старении повреждений оснований ДНК, восстановление которых у данной линии нарушено. Однако в присутствии мелатонина (в таких же условиях круглосуточного затемнения) разрыв в максимальной продолжительности жизни сокращается и составляет 32 и 11% у самцов и самок соответственно.
Мы предположили, что добавление в корм дрозофил мелатонина приве дет к уменьшению различий продолжительности жизни на свету и в темно те, прежде всего, у линий дрозофил с нарушенной активностью суперок сиддисмутазы и фермента эксцизионной репарации ДНК. Однако у всех исследованных линий значения средней, медианной и максимальной про должительности жизни в темноте без мелатонина имели существенное от личие (в пределах 8-13% и, зачастую, разнонаправленное) от значений про должительности жизни, наблюдаемых в присутствии мелатонина при круг лосуточном освещении (табл. 4). Мелатонин оказывал свое геропротектор ное действие, прежде всего, в условиях темноты. Таким образом, мелато нин и освещение обуславливают продолжительность жизни дрозофил неза висимым друг от друга образом.
Рассмотренные выше механизмы (интенсификация метаболизма, уве личение плодовитости) рассматривают лишь эффекты, связанные с повреж дающим воздействием дополнительного освещения. Нельзя исключить и другой механизм, при котором уменьшение длины светового дня (содержа ние в условиях затемнения) как мягкий стресс-фактор может дополнитель но стимулировать защитные системы организма, не оказывая при этом повреждающего действия, что приводит к увеличению продолжительности жизни при содержании в темноте. Согласно предложенной нами нейроэн докринной гипотезе влияния света на продолжительность жизни живот ных (Москалев, Малышева, 2009), в ответ на укорочение длины светового дня, которое в естественных условиях местообитаний предвещает скорое наступление холодов, у животных подавляется активность инсулин/IGF- сигнального механизма, но деблокируются процессы стресс-ответа с учас тием транскрипционного фактора FOXO. Известно, что транскрипционные факторы семейства FOXO играют важную роль в регуляции стрессоустой чивости и продолжительности жизни животных (Boudewijn et al., 2003;
Lee et al., 2003;
Kramer et al., 2003;
Lam et al., 2006). В ответ на стресс FOXO запускает экспрессию генов ферментов детоксикации свободных ра дикалов и репарации ДНК, белков теплового шока, ингибиторов циклин зависимых киназ (Giannakou, Partridge, 2004;
Huang et al., 2006). Клетка становится более устойчивой к стрессам, лучше справляется со спонтанны ми повреждениями, что снижает скорость старения организма в целом.
В нашем эксперименте особи, гетерозиготные по гипоморфным аллелям гена FOXO, а также особи линии дикого типа отличались существенным изменением продолжительности жизни при разных условиях освещения (табл. 5), однако у особей-гомозигот с гипоморфным генотипом (FOXO21/ FOXO25) в двух повторностях эксперимента различия продолжительности жизни в темноте и на свету были незначительными – кривые выживаемо сти достоверно различались лишь в одном из вариантов экспериментов у самцов (рис. 7). По-видимому, минимальные различия сохранялись по той причине, что индукция FOXO-зависимых механизмов стрессоустойчивос ти может осуществляться не только в ответ на подавление выработки инсу линоподобных пептидов в темноте, но и в ответ на окислительный стресс при освещении, что в отсутствии FOXO усугубило эффект снижения про должительности жизни при освещении.
Полученные нами результаты внесли новый вклад в понимание генети ческих механизмов регуляции продолжительности жизни при воздействии такого важного экологичес кого фактора как свет. В ре зультате проведенных нами исследований было выявле но существование двух от носительно независимых путей регуляции ответа на изменение режимов освеще ния (рис. 8). С одной сторо ны, увеличение длины све тового дня способствует бо лее активной выработке свободных радикалов, кото рые оказывают повреждаю щее действие на структуры клетки, что снижает про должительность жизни дро зофилы. Действительно, у линии с мутациями в генах Sod, mus210G1, dSir2 разни ца в продолжительности Рис. 8. Механизмы влияния изменения длины жизни в темноте и на свету светового дня на продолжительность жизни дрозо значительно увеличивается филы. Обозначения: ® – индукция;
– ингибирова по сравнению с линией ди- ние;
- – увеличение;
– снижение.
кого типа, а у линий с му тациями в генах белков теплового шока семейства 70 данная закономер ность наблюдается в виде тенденции. С другой стороны, снижение длины светового дня, не приводя к повреждающим эффектам, стимулирует FOXO зависимый стресс-ответ и увеличивает продолжительность жизни. В слу чае снижения активности гена транскрипционного фактора FOXO (FOXO21/ FOXO25) увеличение продолжительности жизни дрозофил в темноте выра жено слабо, либо не наблюдается.
Таким образом, нами проведены исследования по изучению генетичес ких механизмов влияния света на показатели приспособленности дрозофи лы и представлены доказательства в пользу двух предполагаемых механиз мов влияния изменений длины светового дня на продолжительность жиз ни животных (интенсификация метаболизма и нейроэндокринные измене ния) (рис. 8).
ВЫВОДЫ 1. Освещение, независимо от длительности и интенсивности, приводит к снижению продолжительности жизни и увеличению ранней плодовитос ти особей линии дикого типа Canton-S по сравнению с круглосуточным затемнением.
2. У линий, характеризующихся нарушениями детоксикации свобод ных радикалов (Sodn1/+), эксцизионной репарации ДНК (mus210G1/+) и стресс-ответа (Sir22A-7-11) различия между продолжительностью жизни осо бей на свету и в темноте более выражены, чем у линий дикого типа. Дан ный результат свидетельствует, что уменьшение продолжительности жиз ни на свету у дрозофилы происходит за счет интенсификации метаболизма и, как следствие, более активной выработки свободных радикалов.
3. У линии дрозофилы с мутацией гена гомолога PCNA, участвующего в репликации и репарации ДНК, обнаружено одновременное увеличение про должительности жизни и плодовитости при содержании в условиях осве щения, по сравнению с содержанием в темноте.
4. У линии дикого типа и гетерозигот с гипоморфными аллелями гена FOXO (FOXO21 и FOXO25) сохранялась значительная разница продолжи тельности жизни при содержании в темноте и на свету, у гомозиготных особей (FOXO21/ FOXO25) она не была выражена. Таким образом, выявлена связь увеличения продолжительности жизни дрозофил в темноте с актив ностью транскрипционного фактора стресс-ответа FOXO.
5. Установлено, что модифицирующее действие мелатонина на продол жительность жизни дрозофил зависит от режима освещения, пола и гено типа линий. Наибольший геропротекторный эффект мелатонина обнару жен при содержании особей дрозофил в условиях темноты, а также у ли ний с нарушением детоксификации свободных радикалов и репарации ДНК (Sodn1/+ и mus210G1/+) по сравнению с контрольной линией дикого типа Canton-S.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ В изданиях, рекомендованных ВАК:
1. Москалев А.А., Шосталь О.А., Зайнуллин В.Г. Генетические аспекты влияния различных режимов освещения на продолжительность жизни дро зофилы // Успехи геронтологии. – 2006. – Вып. 18. – С. 55-58.
2. Москалев А.А., Кременцова А.В., Малышева О.А. Влияние мелато нина на продолжительность жизни Drosophila melanogaster при различных режимах освещения // Экологическая генетика. – 2008. – Т. 6. – № 3. – С. 22-30.
3. Москалев А.А., Малышева О.А. Роль светового режима в регуляции продолжительности жизни Drosophila melanogaster // Экология. – 2009. – № 3. – С. 221-226.
4. Москалев А.А., Малышева О.А. // Роль генов транскрипционного фактора dFOXO, dSIR2 и HSP70 в изменении продолжительности жизни Drosophila melanogaster при различных режимах освещения // Экологи ческая генетика. – 2010. – Т. 8. – № 3. – С. 67-80.
В прочих изданиях:
5. Москалев А.А., Малышева О.А. Действие различных условий осве щения и мелатонина на продолжительность жизни дрозофил // Тез.докл.
научной конференции молодых ученых с международным участием Ин ститута геронтологии АМН Украины (Киев, 27 января 2009 г.). – Киев, 2009. – С. 72.
6. Moskalev A.A., Malysheva O. A. Drosophila melanogaster life span after melatonin influence at different light regimes // Aging, cancer and age-related diseases: common mechanism?: Lecturers’ Abstr. 13th IABG Congress – Quebec (Canada, 2009). – P. 21.
Лицензия № 19-32 от 26.11.96 г. КР 0033 от 03.03.97 г.
Тираж 100 Заказ 36(10) Информационно-издательский отдел Учреждения Российской академии наук Института биологии Коми научного центра Уральского отделения РАН 167982, г. Сыктывкар, ул. Коммунистическая, д.