Клиническое значение генетических полиморфизмов факторов некроза опухоли и их рецепторов при хроническом калькулёзном холецистите
На правах рукописи
ДЁМИН Сергей Сергеевич КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОЛИМОРФИЗМОВ ФАКТОРОВ НЕКРОЗА ОПУХОЛИ И ИХ РЕЦЕПТОРОВ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ КАЛЬКУЛЁЗНОМ ХОЛЕЦИСТИТЕ 03.02.07 – генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Москва – 2011 1
Работа выполнена на кафедре медико-биологических дисциплин медицинского факультета Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Белгородский государственный университет»
Научный консультант:
доктор медицинских наук, профессор Чурносов Михаил Иванович
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Щипков Валерий Петрович доктор медицинских наук, профессор Зинченко Рена Абульфазовна
Ведущая организация:
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико стоматологический университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Защита диссертации состоится «»2011 года в часов на заседании диссертационного совета Д 212.203.05 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов» по адресу:
117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов» по адресу:
117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.
Автореферат разослан «»_ 2011 г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент О.Б. Гигани
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Хронический калькулезный холецистит (ХКХ) — обменно-воспалительное заболевание билиарной системы, характеризующееся образованием конкрементов в просвете жёлчного пузыря [Григорьев П.Я., 2001]. Среди болезней органов пищеварения ХКХ встречается достаточно часто: он составляет до 90% всех случаев желчнокаменной болезни (ЖКБ), заболеваемость которой в мире достигает 10% [Ивашкин В.Т., 2002;
Полунина Т.Е.2005;
Shaffer E.A. 2006]. В России холецистэктомии по поводу ХКХ занимают второе место среди всех операций, ежегодно выполняемых населению. Соотношение заболеваемости мужчин и женщин составляет в среднем 1:5. При этом значительную долю заболевших составляет трудоспособное население [Дадвани С.А., 2000;
Окороков А.Н., 2000].
Изучение факторов, определяющих формирование ХКХ, его клиническое течение, эффективность терапии является одной из важных задач для отечественных и зарубежных учёных [Мараховский Ю.Х., 2003;
Григорьев П.Я., 2001;
Ильченко А.А. 2004;
Beckingham I.J., 2001;
Bellows C.F., 2005;
Grunhage F. et al., 2006]. Среди этих факторов, как свидетельствуют результаты ряда исследований [Tazuma S., 2006;
Venneman N.G. et al., 2006;
Hsing A.W., 2008], значимую роль играют генетические факторы. Показана роль отдельных генетических полиморфизмов, участвующих в регуляции воспаления, клеточной пролиферации, метаболизма липидов и жёлчных кислот в формировании ХКХ [Han T. et al., 2000;
Pullinger C.R. et al., 2002;
Finzi L. et al., 2006].
Среди генов-кандидатов, регулирующих, преимущественно, процессы воспаления, важное значение имеют гены факторов некроза опухолей и их рецепторов [Gravestein L.A. et al., 1998;
Majetschak M. et al., 2002]. Факторы некроза опухолей, взаимодействуя со специфическими рецепторами, являются одними их главных звеньев в воспалительном каскаде при ХКХ, изменяя интенсивность и длительность воспалительных, склеротических и литогенных процессов в жёлчном пузыре [Vishnoi M. et al., 2007].
Клинико-генетические работы, посвящённые молекулярно генетическим аспектам ХКХ, в России немногочисленны и затрагивают преимущественно гены, влияющие на метаболизм холестерина и жёлчных кислот [Григорьева И.Н., 2001;
Маев И.В. и др., 2004;
Колчанов Н.А. и др., 2006]. При этом исследования роли полиморфных маркеров генов факторов некроза опухолей и их рецепторов в отношении ХКХ в нашей стране до сих пор не проведены.
Работа выполнена в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (гос.
контракт № П384 молекулярно-генетических основ «Разработка мультифакториальной патологии человека (на модели генов цитокинов)».
Цель и задачи исследования: изучить генетические полиморфизмы факторов некроза опухоли, их рецепторов и рассмотреть их клиническое значение при хроническом калькулёзном холецистите.
В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:
1. Изучить распространённость полиморфных маркеров генов фактора некроза опухоли (-308 G/A TNF), лимфотоксина (+250 A/G Lt), рецептора фактора некроза опухоли первого типа (+36 A/G TNFR1), рецептора фактора некроза опухоли второго типа (-322 VNTR TNFR2) у больных хроническим калькулезным холециститом и в популяционном контроле.
2. Исследовать роль генетических маркеров в формировании хронического калькулезного холецистита.
3. Рассмотреть взаимосвязи генов-кандидатов с морфологическими характеристиками жёлчного пузыря при хроническом калькулезном холецистите.
4. Оценить влияние генетических полиморфизмов на особенности клинического течения ХКХ.
5. Выявить молекулярно-генетические маркеры высокой степени операционно-анестезиологического риска 6. Провести анализ ассоциаций генетических вариантов факторов некроза опухоли и их рецепторов с интенсивностью послеоперационного болевого синдрома.
Научная новизна работы. Впервые изучен генетический полиморфизм фактора некроза опухоли (-308 G/A TNF), лимфотоксина (+250 A/G Lt), рецептора фактора некроза опухоли первого типа (+36 A/G TNFR1) и рецептора фактора некроза опухоли второго типа (-322 VNTR TNFR2) у больных хроническим калькулёзным холециститом, русской национальности, являющихся уроженцами Центрально-Чернозёмного района РФ.
Впервые определены генетические варианты фактора некроза опухоли, опеределяющие риск развития хронического калькулёзного холецистита.
Впервые установлены взаимосвязи генетических полиморфизмов с характером поражения жёлчного пузыря, особенностями клинического течения, эффективностью консервативной терапии и степенью операционно анестезиологического риска при хроническом калькулезном холецистите.
Впервые выявлены ассоциации молекулярно-генетических маркеров фактора некроза опухоли с послеоперационной гиперальгезией.
Результаты проведённого Научно-практическое значение.
исследования расширяют представления о генетических детерминантах формирования и клинического течения хронического калькулезного холецистита. Полученные данные дают основание рекомендовать для определения индивидуумов с неблагоприятным клиническим течением ХКХ (перемежающееся течение, низкая эффективность консервативной терапии) проведение молекулярно-генетического тестирования генов фактора некроза опухоли и лимфотоксина. При оценке степени операционно анестезиологического риска, а также для прогнозирования развития послеоперационной гиперальгезии у пациентов с ХКХ могут быть использованы генетические полиморфизмы -308 G/A TNF и +250 A/G Lt.
Положения, выносимые на защиту.
1. Полиморфные варианты гена фактора некроза опухоли (-308 G/A TNF) определяют риск формирования хронического калькулёзного холецистита.
2. Характер поражения жёлчного пузыря при ХКХ взаимосвязан с определёнными генетическими маркерами.
3. Молекулярно-генетические факторы влияют на особенности клинического течения ХКХ и эффективность его консервативной терапии.
4. Операционно-анестезиологический риск у больных ХКХ ассоциирован с генетическими полиморфизмами.
5. Генетические детерминанты послеоперационной гиперальгезии.
Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на: межрегиональной научно-практической конференции «Социальная экология в изменяющейся России: проблемы и перспективы» (Белгород, 2007), VIII международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке;
концепции болезней цивилизации» (Москва, 2007), III Международной Пироговской научной медицинской конференции, (Москва, 2008), I Международной дистанционной научной конференции «Инновации в медицине», (Курск, 2008), V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, (Москва, 2009), IV Международной Пироговской научной медицинской конференции (Москва, 2009), 63-й Итоговой научной конференции молодых учёных Ростовского государственного медицинского университета с международным участием, (Ростов-на-Дону, 2009), 43-й Всероссийской научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы теоретической, экспериментальной, клинической медицины и фармации» (Тюмень, 2009), IX окружной конференции молодых ученых «Наука и инновации XXI века», (Сургут, 2009), V Международной Пироговской научной медицинской конференции (Москва, 2010), VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов – на – Дону, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 3 в журналах из перечня ВАК.
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание использованных материалов и методов, результаты и их обсуждение, а также выводы, практические рекомендации, список литературы и приложения.
Материалы диссертации изложены на 140 страницах машинописного текста и содержат 26 таблиц и 26 рисунков. Библиографический указатель содержит 212 наименований, из которых 133 зарубежных.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Клиническая характеристика исследованных больных Группу исследования составили 551 человек: 253 больных хроническим калькулёзным холециститом и 298 человек популяционного контроля. В неё включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Центрального Черноземья РФ и не имеющие родства между собой. Среди 253 больных ХКХ мужчин было 42 человека (16,60%), женщин – 211 (83,40%). В популяционной выборке (n=298) распределение по полу было аналогичным: мужчины – 50 человек (16,78%), женщины – 248 (83,22%) (р0,05). Средний возраст больных составил 54,66±13,08 лет (варьировал от 23 до 85 лет), популяционной выборки – 48,20±6,28 лет (варьировал от 18 до 79 лет) (р0,05).
Клинико-лабораторное обследование пациентов проводилось на базе Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа.
Клинические характеристики ХКХ определялись путём тщательного сбора анамнеза и физикального исследования, с выделением основных форм заболевания (по Ногаллеру: тяжелый, средней тяжести, лёгкого течения;
монотонный, рецидивирующий, перемежающийся ХКХ) [Окороков А.Н., 2000;
Мараховский Ю.Х., 2003;
Маев И.В. и др., 2004].
Для диагностики ХКХ у всех обследованных применяли ультразвуковое сканирование. Оценивались следующие морфологические показатели жёлчного пузыря: толщина стенки, объём жёлчного пузыря, средний диаметр и объём желчных камней [Палмер П.Е.С., 2000;
Блок Б., 2007]. Всем больным в плановом порядке была выполнена видеолапароскопическая холецистэктомия (ВЛХЭ). Оценка состояния пациентов перед операцией ВЛХЭ основывалась на классификации операционно-анестезиологического риска по МНОАР [Полушин Ю.С., 2004].
Оценка послеоперационного болевого синдрома осуществлялась с помощью визуально-аналоговых и цифровых шкал боли каждые 4 часа в первые и вторые сутки после операции [Корячкин В.А., Страшнов В.И., 2004].
Всем больным с ХКХ и индивидуумам популяционной выборки проводилось типирование четырех молекулярно-генетических маркеров:
диаллельные локусы генов фактора некроза опухоли (-308G/A TNF), лимфотоксина (+250 A/G Lt), рецепторов фактора некроза опухоли первого (+36 A/G TNFR1) и второго типов (-322 VNTR TNFR2). Генотипирование осуществлялось в лаборатории «Молекулярной генетики человека» медицинского факультета Белгородского государственного университета.
Молекулярно-генетические методы Материалом для исследования послужила венозная кровь в объеме 4-5 мл, взятая из локтевой вены пробанда. Забор венозной крови производили в пробирки с консервантом, содержащим 0,5М раствор ЭДТА (рН=8.0).
Выделение геномной ДНК из периферической крови проведено методом фенольно-хлороформной экстракции [Mathew C.C., 1984]. Анализ всех локусов (-308G/A TNF, +250A/G Lt, +36A/G TNFR1, -322VNTR TNFR2) осуществлялся методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК. ПЦР локусов -308G/A TNF, +250A/G Lt, -322VNTR TNFR проводилась на амплификаторе «Терцик-МС4» производства компании «ДНК-технология», а локуса +36A/G TNFR1 - на аппарате IQ5 (Bio-Rad) для ПЦР в режиме real time с использованием ДНК-полимеразы Thermus aquaticus производства фирмы «Силекс-М» и олигонуклеотидных праймеров и зондов, синтезированных фирмой «Синтол».
Генотипирование ДНК-маркеров производилось следующими методами: анализ дискриминации аллелей методом Taq Man зондов (+36 A/G TNFR1);
анализ полиморфизма длины амплифицируемых фрагментов (-322 VNTR TNFR2);
анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) продуктов ПЦР-амплификации специфических участков генома с использованием соответствующих ферментов рестрикции производства ООО "Сибэнзим" (Новосибирск) (-308 G/A TNF, +250A/G Lt). Визуализация фореграмм осуществлялась в темном боксе с трансиллюминатором фирмы UVP (Швеция).
Статистические методы Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программы «STATISTICA 6.1». Определение фенотипических и генных частот проводили стандартными методами [Животовский Л.А., 1983]. Для оценки соответствия наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому, исходя из равновесия Харди Вайнберга, использован критерий 2 [Вейр Б., 1995].
Ассоциации аллелей и генотипов изученных ДНК-маркеров с формированием ХКХ, а также с качественными признаками, характеризующими его клинические особенности, оценивали с помощью анализа таблиц сопряженности 2х2 с расчетом критерия 2 с поправкой Йетса на непрерывность и отношения шансов (OR) с 95% доверительными интервалами (CI) [Schlesselman J., 1982]. При проведении множественных сравнений использовали поправку Бонферрони [Реброва О.Ю., 2006]. При изучении взаимосвязей генетических полиморфизмов с клинически значимыми количественными признаками ХКХ, в связи с тем, что их распределение отличалось от нормального, для описания признаков использовали медиану (Mе) и интерквартильный размах (Q25-Q75), а для сравнительного анализа применяли критерий Манна-Уитни [Реброва О.Ю., 2006].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Исследование ассоциаций генетических полиморфизмов с формированием хронического калькулёзного холецистита.
Изучение частот генотипов исследуемых генетических маркеров показало, что для всех рассмотренных локусов в популяционной выборке и в группе больных ХКХ эмпирическое распределение генотипов соответствует теоретически ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга (p0,05).
Уровень аллельного разнообразия по рассматриваемым локусам варьировал от Н0=0,18 (для локуса -308 G/A TNF) до Н0=0,49 (для локуса +36A/G TNFR1) в популяционной выборке и от Н0=0,26 (-308 G/A TNF) до Н0=0, (+36A/G TNFR1) среди больных ХКХ.
Установлено, что концентрация генетических маркеров -308 A TNF и -308 AA TNF среди больных ХКХ в 1,7 и 4,7 раза, соответственно, больше (табл. 1) по сравнению с контрольной группой (p=0,001 и p=0,016, с учётом поправки Бонферрони pcor=0,048, соответственно), а частота генотипа -308 GG TNF – меньше, чем в контроле (p=0,006, pcor=0,018).
Полученные данные свидетельствуют о важной роли генетического полиморфизма -308G/A фактора некроза опухоли в формировании хронического калькулёзного холецистита. Наличие маркеров -308A TNF и -308AA TNF, контролирующих высокую продукцию фактора некроза опухоли [Kroeger K.M. et al., 2000;
Majetschak M. Et al., 2002], обусловливает повышенный риск развития хронического калькулёзного холецистита (OR=1,85 и OR=4,89, соответственно), тогда как генетический маркер -308GG TNF является протективным фактором по данной патологии (OR=0,56) (табл. 1). Полученные нами данные соответствуют литературным материалам о медико-биологическом значении фактора некроза опухоли в организме - данный цитокин обладает выраженным провоспалительным действием [Симбирцев А. С. и др., 2006;
Vandenbroeck K., 2006] и может играть важную роль в этиопатогенезе хронического калькулёзного холецистита.
2. Молекулярно-генетические маркеры и морфологические характеристики жёлчного пузыря при ХКХ.
Анализ взаимосвязей полиморфных генетических маркеров факторов некроза опухолей и их рецепторов с морфологическими характеристиками жёлчного пузыря при ХКХ показал, что у пациентов, имеющих высокопродуктивный аллель А (генотипы AA и GА) по полиморфизму -308 G/A фактора некроза опухолей (табл. 2), наблюдается увеличение толщины стенки желчного пузыря (на 33,34%), диаметра камня (на 3,33%) и объёма камня (на 5,88%) по сравнению с больными без этого аллеля (генотип -308 GG TNF).
Выявлено, что у пациентов с ХКХ, имеющих маркеры +250 GG Lt и +250 АG Lt толщина стенки жёлчного пузыря (медиана 4 мм, интерквартильный размах 3-5 мм) на 25% больше по сравнению с больными с генотипом +250 АА Lt (медиана 3 мм, нижний квартиль 3 мм, верхний квартиль 4 мм, p=0,04). Следует отметить, что индивидуумы, имеющие одновременно в генотипе высокопродуктивные аллели -308 A TNF и +250 G Lt, характеризуются значительно меньшим объёмом жёлчного пузыря (медиана 36,24 см3, интерквартильный размах 20,97-58,15 см3), чем больные без этих аллелей (медиана 48,09 см3, интерквартильный размах 29,23-74,14 см3, p=0,02).
Таблица Распределение полиморфных маркеров генов факторов некроза опухолей и их рецепторов среди больных ХКХ и в популяционном контроле (%) Локус, Аллели, Контрольная Больные Поли- генотипы, группа* ХКХ* 2 OR морфизм генетическое (n=298) (n=253) (p) (95% CI) разнообразие -308G 89,93 82,81 11,41 1, (0,001) (1,28-2,68) -308A 10,07 17, -308 G/A TNFa -308GG 80,87 (241) 70,36 (178) 7,74 0, (0,006) (0,37-0,85) -308GA 18,12 (54) 24,90 (63) 2,72 0, (0,09) (0,06-1,19) -308AA 1,01 (3) 4,74 (12) 5,87 4, (0,016) (1,27-22,1) H0 (Hе) 0,18(0,18) 0,26(0,28) +250A 74,75 72,97 0,35 0, (0,55) (0,51-0,85) +250G 25,25 27, +250 A/G Lt +250AA 54,54 (162) 51,62 (127) 0,35 0, (0,55) (0,62-1,27) +250AG 40,4 (120) 42,68 (105) 0,20 1, (0,65) (0,77-1,57) +250GG 5,06 (15) 5,7 (14) 0,02 1, (0,89) (0,50-2,54) H0 (Hе) 0,40(0,38) 0,42(0,39) +36A 51,19 48,79 0,53 1, +36 A/G TNFR (0,47) (0,86-1,40) +36G 48,81 51, +36AA 26,78 (79) 22,17 (55) 1,29 0, (0,26) (0,51-1,18) +36AG 48,81 (144) 53,23 (132) 0,88 1, (0,35) (0,67-1,52) +36GG 24,41 (72) 24,60 (61) 0,00 1, (1,00) (0,67-1,52) H0 (Hе) 0,49(0,50) 0,53(0,49) TNFR2*1 28,74 26, 0,08 1, -322VNTR TNFR (0,78) (0,74-1,54) TNFR2*2 71,26 73, TNFR2 1/1 6,59 (11) 9,78 (22) 0,88 1, (0,34) (0,69-3,49) TNFR2 1/2 44,31 (74) 34,22 (77) 3,70 0, (0,07) (0,42-1,00) TNFR2 2/2 49,10 (83) 56,00 (126) 1,56 1, (0,21) (0,86-2,01) H0 (Hе) 0,44(0,41) 0,34(0,39) Примечание: H0 и Hе – наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность;
*– в скобках указаны объёмы выборок Таблица Значимые ассоциации генетического полиморфизма -308 G/A TNF с морфологическими характеристиками жёлчного пузыря у больных хроническим калькулёзным холециститом, Me (Q25-Q75) Морфологические Генотипы показатели p -308 AA и -308 - 308 GG TNF AG TNF (n=178) (n=75) Толщина стенки, мм 4,5 3,00 0, (4,0-5,0) (3,00-4,00) Диаметр камня, мм 15,00 14,50 0, (12,00-22,00) (10,00-18,00) Объём камня, см3 1,77 1,60 0, (0,90-5,58) (0,52-3,05) Таким образом, генетические полиморфизмы фактора некроза опухоли (-308G/A_TNF) и лимфотоксина (+250A/G Lt) ассоциированы с морфологическими характеристиками жёлчного пузыря у больных ХКХ. В основе этих ассоциаций могут лежать механизмы провоспалительных и опосредованных ими склеротических процессов в стенке жёлчного пузыря, зависящих от TNF и Lt [Царегородцева Т.М., 2005;
Никитенко Т.М., 2006;
Бурков С.Г., 2006].
3. Взаимосвязи генетических маркеров с клиническим течением и эффективностью консервативного лечения ХКХ.
При изучении ассоциаций полиморфизма -308 G/A гена фактора некроза опухоли с клиническими особенностями ХКХ установлено, что у пациентов, имеющих высокопродуктивный аллель A (генотипы -308 AA TNF и -308 GA TNF), латентное (4,02%) и лёгкое (2,66%) течение ЖКБ наблюдалось в 13 и 9 раз, соответственно, реже, по сравнению с больными с генотипом -308 GG TNF (53,37%, p=0,0005, pcor=0,002 и 23,60%, p=0,0007;
pcor=0,0028, соответственно), тогда как ХКХ среднетяжёлого и тяжёлого течения среди индивидуумов с генотипами -308 АА TNF и -308 GА TNF (30,66% и 62,66%, соответственно) регистрировался в 2 и 8 раз, соответственно, чаще, чем у пациентов с генотипом -308 GG TNF (15,17%, p=0,009;
pcor=0,036 и 7,86%, p=0,0005;
pcor=0,002, соответственно).
Выявлены взаимосвязи молекулярно-генетического маркера -308 G/A TNF с характером течения ХКХ (табл.3): у больных с генотипами -308 АА TNF и -308 GА TNF латентное (4,02%) и рецидивирующее (5,33%) течение ХКХ отмечалось значительно реже, а перемежающееся течение заболевания, наоборот, чаще (83,99%) по сравнению с пациентами с генотипом -308 GG TNF (42,13%, 39,32% и 2,80%, соответственно, p=0,0005;
pcor=0,002).
Таблица Ассоциации генетического полиморфизма -308 G/A TNF с клиническими группами хронического калькулёзного холецистита Генотипы Клиническая группа ХКХ (p) -308AA и -308 GA -308 GG (n=75) (n=178) n % n % Латентное течение 3 4,02 75 42,13 34, (0,0005) Рецидивирующий 4 5,33 70 39,32 27, холецистит (0,0005) Перемежающийся 63 83,99 5 2,80 172, ХКХ (0,0005) Монотонный ХКХ 5 6,66 28 15,75 3, (0,08) Итого 75 100,00 178 100, Анализ ассоциаций молекулярно-генетического маркера +250A/G Lt со степенью тяжести ХКХ (рис. 1) показал, что у пациентов, имеющих высокопродуктивный аллель +250 G (генотипы +250 GG Lt и +250 AG Lt), значительно чаще (в 3,2 раза) наблюдалось тяжёлое течение ХКХ (37,82%) и реже латентное течение заболевания (26,89%) в сравнении с индивидуумами без этого аллеля (генотип +250 AA Lt) (11,92%, p=0,0005;
pcor=0,002 и 50,39%, p=0,0009, pcor=0,0036, соответственно). Установлены взаимосвязи генетического полиморфизма +250A/G Lt с характером течения ХКХ:
перемежающийся характер заболевания у больных с генотипами +250 АG Lt и +250 GG Lt регистрировался в 4,4 раза чаще (45,37%), чем у пациентов с генотипом +250АА Lt (10,23%, p=0,0005;
pcor=0,002).
Исследование клинического значения парных сочетаний генетических полиморфизмов -308 G/A TNF и +250A/G Lt показало, что у пациентов, имеющих одновременно высокопродуктивные аллели по этим локусам (генотипы -308AA, -308GA TNF и +250 GG, +250AG Lt), в 10 раз чаще регистрируется тяжёлое течение ХКХ (64,29%), а латентное течение заболевания отмечается в 15 раз реже (3,57%), чем у больных без этих аллелей (генотипы -308 GG TNF и +250 AA Lt) (6,14%, p=0,0005, pcor=0, и 55,26%;
p=0,0005, pcor=0,002, соответственно).
Латентное течение Лёгкое течение Среднетяжёлое течение Тяжёлое течение Генотипы Генотип +250 GG и +250 AG Lt +250 AA Lt Рис. 1 Ассоциации генетического полиморфизма +250 A/G Lt с тяжестью течения ХКХ Также выявлены различия между сравниваемыми группами больных по характеру течения ХКХ: у пациентов, имеющих одновременно высокопродуктивные аллели -308 A TNF и +250 G Lt, существенно реже наблюдаются латентная стадия ЖКБ (3,57%) и рецидивирующий ХКХ (5,36%), но значительно чаще регистрируется перемежающийся характер течения заболевания (83,93%) по сравнению с больными без этих аллелей (44,74%, p=0,0005, pcor=0,002;
37,72%, p=0,0005, pcor=0,002 и 2,63%, p=0,0005, pcor=0,002, соответственно) Таким образом, полученные данные свидетельствуют о важном клиническом значении генетических полиморфизмов -308 G/A TNF и +250A/G Lt при хроническом калькулёзном холецистите. Пациенты с высокопродуктивными аллелями по этим локусам отличаются волнообразным тяжёлым течением хронического калькулёзного холецистита, с постоянно выраженной клинической симптоматикой и немногочисленными ремиссиями.
При анализе ассоциаций генетического маркера +250A/G Lt с эффективностью консервативного лечения ХКХ установлено, что у пациентов, имеющих высокопродуктивный аллель G (генотипы +250GG Lt и +250AG Lt), положительный эффект от консервативной терапии наблюдался лишь у 44,44% пациентов, тогда как у больных с генотипом +250 AA Lt данный показатель был в 1,6 раз выше и равнялся 72,50% (2=7,29;
p=0,008). У больных, имеющих одновременно высокопродуктивные аллели -308A TNF и +250G Lt, отмечалось существенное снижение эффекта от консервативной терапии — положительный эффект регистрировался лишь у 33,33% пациентов, тогда как у индивидуумов без этих аллелей данный показатель составлял 66,67% (2=20,94;
p=0,0005).
4. Ассоциации полиморфизмов генов фактора некроза опухоли и лимфотоксина с операционно-анестезиологическим риском при ХКХ.
Проведён анализ ассоциаций полиморфного маркера -308G/A гена фактора некроза опухоли со степенью операционно-анестезиологического риска (по шкале МНОАР) у пациентов с ХКХ при выполнении им ВЛХЭ в условиях ТВВА с ИВЛ и миоплегией. Установлено (рис. 2), что у 73,33% пациентов, имеющих высокопродуктивный аллель -308A TNF (генотипы -308AA и -308GA TNF) определялась III (высокая) степень операционно анестезиологического риска, тогда как у большинства больных с генотипом -308 GG TNF (52,25%) регистрировалась II (умеренная) степень операционно-анестезиологического риска (2=4,95;
p=0,026).
Генотип -308 GG TNF Генотипы -308 АА и -308 GA TNF II степень III степень Рис.2 Ассоциации генетического полиморфизма -308 G/A TNF со степенью операционно-анестезиологического риска по шкале МНОАР При изучении совместного действия генетических полиморфизмов -308 G/A TNF и +250 A/G Lt выявлено, что частота III (высокой) степени операционно-анестезиологического риска являлась максимальной у пациентов с маркерами -308 АА TNF, -308GА TNF и +250AG Lt и +250GG Lt (80,36%) в сравнении с пациентами без данных маркеров (50,00%) (2=13,18;
p=0,001).
Таким образом, наличие у пациентов с ХКХ высокопродуктивных аллелей -308A TNF и +250G Lt обусловливает значительное повышение степени операционно-анестезиологического риска (до высокой), в сравнении с больными без этих аллелей, что, в конечном итоге, влияет на прогноз и летальность при ХКХ [Полушин Ю.С., 2004].
5. Изучение влияния генетических полиморфизмов на интенсивность послеоперационного болевого синдрома у больных ХКХ.
Изучен болевой синдром в раннем послеоперационном периоде после операции ВЛХЭ в условиях ТВВА с ИВЛ и миоплегией в зависимости от генетических полиморфизмов факторов некроза опухоли и их рецепторов.
Для выявления характера болевого синдрома использовались визуально аналоговые (цифровые) шкалы боли [Корячкин В.А., Страшнов В.И., 2004].
Интенсивность болевых ощущений пациентов оценивалась в баллах (от 0 – слабая боль, до 10 – невыносимая боль) при движении через каждые 4 часа в первые сутки и после сна на вторые сутки после ВЛХЭ.
При анализе взаимосвязей полиморфизма -308G/A гена фактора некроза опухоли (табл.4) с интенсивностью болевого синдрома в послеоперационном периоде получено, что у пациентов, имеющих высокопродуктивный аллель A (генотипы -308AA TNF и -308GA TNF) наблюдается значительно более выраженный (на 33-100%, p0,000002) послеоперационный болевой синдром по сравнению с больными без этого аллеля (генотип -308 GG TNF). При этом, следует отметить, что если у пациентов с генотипом -308 GG TNF интенсивность болевого синдрома в течение суток после операции и к часам следующего дня уменьшилась в 3 раза (с 6 до 2 баллов), то у индивидуумов с генотипами -308 AA TNF и -308 GA TNF — лишь в 2 раза (с 8 до 4 баллов). Аналогичные данные получены и по генетическому полиморфизму +250A/G лимфотоксина. Установлено, что у пациентов с генотипами +250GG Lt и +250AG Lt регистрируется более интенсивный послеоперационный болевой синдром (на 17-50%, р0,00006), и его динамика в течение первых суток после операции менее выражена (уменьшился в 2,3 раза с 7 до 3 баллов к 12 часам следующего дня после ВЛХЭ), чем у индивидуумов с генотипом +250AА Lt (интенсивность боли уменьшилась в 3 раза с 6 до 2 баллов).
В основе выявленных взаимосвязей могут лежать следующие медико биологические механизмы. Факторы некроза опухолей (TNF и Lt), повышенная продукция которых ассоциирована с генотипами -308AA и -308GA TNF и +250GG и +250AG Lt [Brinkman B.M. et al., 1995;
Kroeger K.M. et al., 2000;
Majetschak M. Et al., 2002], являются алгогенами, активируют процессы возбуждения в сенсорных нейронах и играют, тем самым, важную роль в формировании болевой чувствительности при хирургической агрессии [Sommer C. et al. 2004;
McMahon S.B. et al. 2006;
Okuse K., 2007].
Таблица Значимые ассоциации генетических полиморфизмов -308 G/A TNF и +250A/G Lt с интенсивностью болевого синдрома (в баллах) у пациентов с ХКХ после ВЛХЭ, Me (Q25-Q75) Время -308 G/A TNF +250A/G Lt измерений интенсивно- -308 АА и -308 GG +250 GG и +250 AA -308GА (n=178) +250 AG (n=127) p p сти боли (n=75) (n=119) 14 ч 8,00 6,00 0,000002 7,00 6,00 0, (8,00-8,00) (6,00-7,00) (6,00-8,00) (6,00-7,00) 18 ч 8,00 5,00 0,000001 7,00 5,00 0, (7,00-8,00) (5,00-6,00) (5,00-8,00) (4,00-6,00) 22 ч 7,00 4,00 0,000001 6,00 4,00 0, (6,00-7,00) (3,00-5,00) (4,00-7,00) (3,00-5,00) 8ч 5,00 3,00 0,000002 4,00 3,00 0, (4,00-5,00) (2,00-3,00) (3,00-5,00) (2,00-3,00) 12 ч 4,00 2,00 0,000001 3,00 2,00 0, (3,00-4,00) (2,00-2,00) (2,00-4,00) (2,00-2,00) 16 ч 3,00 2,00 0,000002 2,00 2,00 0, (2,00-3,00) (1,00-2,00) (2,00-3,00) (1,00-2,00) ВЫВОДЫ 1. Генетические полиморфизмы фактора некроза опухолей (-308G/A TNF) и лимфотоксина (+250 A/G Lt) ассоциированы с формированием хронического калькулезного холецистита, характером поражения жёлчного пузыря, клиническими проявлениями заболевания и интенсивностью послеоперационного болевого синдрома.
2. Молекулярно-генетическими маркерами повышенного риска развития хронического калькулезного холецистита являются -308A TNF (OR=1,85, p=0,001) и -308 AA TNF (OR=4,89, p=0,048), а протективным фактором - -308GG TNF (OR=0,56, p=0,018).
3. Больные хроническим калькулезным холециститом с высокопродуктивными аллелями -308A TNF и +250G Lt, имеют большую толщину стенки жёлчного пузыря, увеличенный диаметр и объём жёлчных камней и меньший объём жёлчного пузыря.
4. Генетические маркеры -308 AA, -308 GA TNF и +250GG, +250 AG Lt, их сочетания ассоциированы с перемежающимся (p=0,002) и тяжёлым (p=0,002) течением хронического калькулезного холецистита и низкой эффективностью консервативного лечения заболевания.
5. Высокая степень операционно-анестезиологического риска у больных хроническим калькулезным холециститом с высокопродуктивным аллелем -308A TNF или его сочетанием с аллелем +250G Lt (73,33-80,36%) наблюдается в 1,5 раза чаще по сравнению с пациентами без этих аллелей (47,75-50,00%, p0,001).
6. Послеоперационный болевой синдром наиболее выражен (на 17-100%, p0,0001) и его динамика менее значительна у пациентов с хроническим калькулезным холециститом, имеющих генетические маркеры -308A TNF и +250G Lt.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Для выявления индивидуумов группы повышенного риска развития хронического калькулезного холецистита следует проводить молекулярно генетическое тестирование гена фактора некроза опухоли (-308G/A TNF).
2. При обследовании пациентов с хроническим калькулёзным холециститом в качестве маркеров более выраженного поражения жёлчного пузыря, тяжёлого течения заболевания и его низкоэффективной консервативной терапии, а также высокого операционно анестезиологического риска использовать генетические полиморфизмы -308G/A TNF и +250A/G Lt.
3. При проведении анестезиологического пособия больным хроническим калькулезным холециститом во время операции видеолапароскопической холецистэктомии следует учитывать развитие гиперальгезии у пациентов с генетическими маркерами -308A TNF и +250G Lt.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ Lt — лимфотоксин TNF — фактор некроза опухоли TNFR1 — рецептор фактора некроза опухоли первого типа TNFR2 — рецептор фактора некроза опухоли второго типа VNTR — вариабельное число тандемных повторов ВАШ — визуально-аналоговая шкала ВЛХЭ — видеолапароскопическая холецистэктомия ЖКБ — желчнокаменная болезнь ИВЛ — искусственная вентиляция лёгких МНОАР — Московское научное общество анестезиологов и реаниматологов ПЦР — полимеразная цепная реакция ТВВА — тотальная внутривенная анестезия УЗИ — ультразвуковое исследование ХКХ — хронический калькулёзный холецистит СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Дёмин С.С. Желчнокаменная болезнь в рамках сохранения социального и биологического здоровья населения: структура заболеваемости, клиническое течение, современные подходы к хирургическому лечению / С.С. Дёмин // Социальная экология в изменяющейся России: проблемы и перспективы: Материалы межрегиональной научно-практической конференции. – Белгород, 2007. – Часть 1. – С. 297-304.
2. Дёмин С.С. Клинические особенности желчнокаменной болезни у населения Белгородской области / С.С.Дёмин, М.И. Чурносов, В.А. Ежов // Научные труды VIII международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке;
концепции болезней цивилизации». – Москва, 2007. – С. 3. Дёмин С.С. Клинические аспекты желчекаменной болезни у населения Белгородской области / С.С. Дёмин // Вестник РГМУ. – Москва, 2008. – №2 (61). – С. 282. (из списка ВАК) 4. Дёмин С.С Роль наследственных факторов в формировании клинических особенностей желчнокаменной болезни у населения Белгородской области / С.С. Дёмин, М.И. Чурносов // Молодёжная наука и современность: Материалы I Международной дистанционной научной конференции «Инновации в медицине». – Курск, 2008. – С. 5. Дёмин С.С. Изучение роли наследственных факторов в формировании клинических особенностей хронического калькулёзного холецистита / С.С.Дёмин, И.П. Парфёнов // Материалы V съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров, ч.1. – Москва, 2009. – С. 6. Дёмин С.С. Роль наследственных факторов в формировании болевого синдрома при оперативном лечении хронического калькулезного холецистита / С.С. Дёмин // Материалы 63-й Итоговой научной конференции молодых учёных Ростовского государственного медицинского университета с международным участием. – Ростов-на-Дону, 2009. – С. 124.
7. Дёмин С.С. Полиморфизм гена фактора некроза опухоли и клинические особенности хронического калькулезного холецистита / С.С.
Дёмин // Актуальные проблемы теоретической, экспериментальной, клинической медицины и фармации: Материалы 43-й всероссийской научной конференции студентов и молодых учёных с международным участием, Тюмень, 2009. – С. 265.
8. Калмыкова Е.В. Распространенность полморфизмов -308G/A TNF, 250G/A Lt, -869T/C TGFB1, C-703T IL-5, -4257 G/A IL-13 среди населения Центральной России / Е.В. Калмыкова, М.И. Чурносов, О.Б. Алтухова, О.А.
Конева, С.С. Дёмин // Наука и инновации XXI века: материалы IX окружной конференции молодых ученых. – Сургут, 2009. – С. 77-78.
9. Дёмин С.С. Популяционно-генетический анализ полиморфизма гена лимфотоксина- / С.С. Дёмин, О.Б. Алтухова, О.А. Конева, Е.В. Калмыкова // Вестник РГМУ, 2009. – №3. – С. 22. (из списка ВАК) 10. Калмыкова Е.В. К вопросу о полиморфизме гена фактора некроза опухоли- среди населения / Е.В. Калмыкова, О.Б. Алтухова, О.А. Конева, С.С. Дёмин // Вестник РГМУ, 2009. – №3. – С. 34. (из списка ВАК) 11. Калмыкова Е.В. Молекулярно-генетические маркеры цитокинов:
популяционная распространенность и связь с мультифакториальной патологией / Е.В. Калмыкова, Т.С. Тикунова, И.А. Юшина, С.С. Дёмин, С.С.
Сиротина, Е.Н. Крикун, М.И. Чурносов // Вестник РУДН. Серия «Медицина», 2009. – С. 617-618.
12. Дёмин С.С. Роль полиморфизма гена фактора некроза опухолей- в формировании послеоперационного болевого синдрома / С.С. Дёмин, М.И.
Чурносов // Медицинская генетика: материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков. – Ростов-на-Дону, 2010. – С.53.
Дёмин Сергей Сергеевич (Россия) Клиническое значение генетических полиморфизмов факторов некроза опухоли и их рецепторов при хроническом калькулёзном холецистите Изучено распределение полиморфизмов генов фактора некроза опухоли, лимфотоксина, рецептора фактора некроза опухоли 1 типа, рецептора фактора некроза опухоли 2 типа у больных хроническим калькулёзным холециститом (ХКХ) и в популяционной выборке, оценены их взаимосвязи с формированием и клиническим течением ХКХ. Выявлены генетические варианты фактора некроза опухоли, определяющие повышенный риск развития хронического калькулёзного холецистита.
Установлены взаимосвязи генетических полиморфизмов с характером поражения жёлчного пузыря, особенностями клинического течения, эффективностью консервативной терапии и степенью операционно анестезиологического риска при хроническом калькулезном холецистите.
Выявлены ассоциации молекулярно-генетических маркеров фактора некроза опухоли с послеоперационной гиперальгезией.
Dyomin Sergey Sergeevitch (Russia) Clinical significance of genetic polymorphisms of tumor necrosis factors and their receptors in chronic calculous cholecystitis Distribution of polymorphism of genes tumor necrosis factor, lymphotoxin, receptor of the tumor necrosis factor 1st type, receptor of the tumor necrosis factor 2nd type in chronic calculous cholecystitis (CCC), and in popular selection has been investigated. Their correlation with formation and clinical course of calculous cholecystitis are valued. Genetic variants of tumor necrosis factor that determinate the risk of development of chronic calculous cholecystitis were identified. Genetic polymorphisms correlations with gall bladder lesion character, clinical course properties, conservative therapy efficiency and surgery and anesthesia risk in chronic calculous cholecystitis were determined. Molecular genetic markers of tumor necrosis factor and postoperative hyperalgesia correlations were identified.
Подписано в печать 20.12.2010. Гарнитура Times New Roman.
Формат 6084/16. Усл. п. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 231.
Оригинал-макет подготовлен и тиражирован в издательстве Белгородского государственного университета 308015, г. Белгород, ул. Победы,