Микромицеты в щелочных засоленных почвах
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТНа правах рукописи
ГЕОРГИЕВА Марина Леонидовна МИКРОМИЦЕТЫ В ЩЕЛОЧНЫХ ЗАСОЛЕННЫХ ПОЧВАХ Специальность 03.00.24 – микология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2006
Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова Научный руководитель кандидат биологических наук, Биланенко Елена Николаевна Официальные оппоненты доктор биологических наук Терехова Вера Александровна кандидат биологических наук Иванушкина Наталья Евгеньевна Ведущая организация Институт микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН
Защита диссертации состоится 8 декабря 2006 года в 15:30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.46 при Биологическом факультете МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу:
119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет (аудитория М-1).
Т/факс: (095) 939-39-
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В.
Ломоносова Автореферат разослан 7 ноября 2006 года
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук М.А. Гусаковская
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы Принято считать, что грибы для своего развития предпочитают слабокислые условия, они активно развиваются в таких почвах, как подзолистые (Мирчинк, 1988). Однако существуют биотопы с постоянно высокими значениями рН (9 - 11) и высокими концентрациями солей. Это содовые озера и содовые солончаки. Высокие концентрации в почвенных растворах ионов [Na+] и низкие [Са2+], высокие значения щелочности, значительная деструктуризация почвы и ряд других факторов позволяют отнести содовые солончаки к уникальным экстремальным природным местообитаниям (Базилевич, 1965;
Сабольч, 1971;
Jones, Grant, 1999).
По мнению многих исследователей, в таких условиях могут существовать только галоалкалофильные прокариоты, которые изучены уже достаточно подробно как в отношении биоразнообразия, так и функционально (Jones et al., 1994;
Заварзин и др., 1999;
Cорокин, 2000).
Сведения, касающиеся развития грибов в условиях содового засоления, единичны. В основном они посвящены изучению особенностей отдельных видов, а не сообщества в целом.
В настоящее время практически ничего не известно не только о таксономическом составе группы галоалкалофильных (галоалкалотолерантных) грибов, но и об особенностях их обмена, в том числе и о продуцируемых ими вторичных метаболитах. В то же время ферменты алкалофильных бактерий широко используются в биотехнологии, в производствах, где создаются щелочные условия (Geoghegan, Campbell, 2001). Это обусловливает привлекательность поиска и исследования алкалотолерантных грибов как возможных продуцентов ценных для человека вторичных метаболитов, активность которых могла бы превысить таковую у бактерий.
Недостаточная изученность эукариотических организмов в природных биотопах с экстремальными условиями среды привела к явной недооценке роли в них грибов. Это обусловлено трудной доступностью регионов исследований и отсутствием специальных методических приемов микологического анализа этих почв.
Цель работы Исследование сообщества микромицетов в засоленных щелочных почвах и на поверхности растений-солянок в регионах с различным типом засоления почв, в условиях высоких значений pH и высоких концентраций солей.
Задачи • Проанализировать видовое разнообразие грибов и выявить функционально значимую группу микромицетов в исследуемых засоленных щелочных почвах Центральной Азии.
• Проанализировать видовое разнообразие грибов на поверхности растений-солянок из солончаков Центральной Азии.
• Разработать методы выделения грибов из засоленных щелочных почв, способных развиваться в условиях высоких значений рН и концентраций солей.
• Проанализировать алкало- и галозависимость у изолятов микромицетов доминирующих в засоленных почвах видов.
• Оценить антимикробную активность грибов из содовых солончаков.
• Создать коллекцию культур микромицетов из засоленных щелочных почв.
Научная новизна Впервые изучено сообщество мицелиальных грибов в щелочных засоленных почвах и на галофитах из разных регионов Центральной Азии. Это исследование расширяет существующие представления о разнообразии грибов, их адаптационных возможностях, открывает перспективы для поиска новых таксонов.
Впервые для выделения функционально значимого сообщества грибов из содовых солончаков была разработана и использована селективная среда на щелочном буфере.
Описан и опубликован новый галоалкалотолерантный аскомицет Heleococcum alkalinum Bilanenko et Ivanova, который является одним из доминирующих видов в щелочных почвах.
Показано, что для всех засоленных почв, независимо от типа засоления, характерен специфический комплекс видов грибов. Большинство выделенных изолятов доминирующих видов отнесены к галоалкалотолерантным, т.к. показана их способность к росту в широком диапазоне значений рН и концентраций NaCl.
Практическое значение работы Грибы, обитающие в содовых солончаках, интересны как возможные продуценты ценных для человека вторичных метаболитов и щелочеустойчивых гидролитических ферментов (целлюлаз, ксиланаз, протеаз, липаз), активность которых могла бы превысить таковую у бактерий.
Создана уникальная коллекция микромицетов содовых солончаков, включающая новые таксоны грибов, которые могут служить моделью для исследования механизмов гало- и алкалотолерантности, практически не изученных у грибов.
Heleococcum alkalinum используется в учебном процессе на кафедре микологии и альгологии Биологического ф-та МГУ на практических занятиях по физиологии грибов, для демонстрации особенностей адаптации к экстремальным условиям обитания.
Разработанная селективная среда позволяет производить выделение функционально значимых микромицетов из щелочных засоленных почв. Эта среда может быть применена в работе по поиску штаммов грибов со специфическими свойствами для использования в различных процессах, где создаются щелочные условия.
Исследование антибиотической активности микромицетов из содовых солончаков показало, что они могут представлять практический интерес как продуценты биологически активных веществ.
Апробация работы Основные результаты данной работы были доложены на 6-ти Международных и 7-ми Всероссийских конференциях и на заседаниях кафедры микологии и альгологии Биологического факультета МГУ.
На первом съезде микологов России (Москва, 2002);
на 6-й пущинской школе конференции молодых ученых «Биология – наука ХХI века» (Пущино, 2002);
на Международной конференции Биогеография почв (Сыктывкар, 2002);
Всероссийской конференции «Биоразнообразие и функционирование микробных сообществ водных и наземных систем Центральной Азии» (Улан-Удэ, 2003);
на юбилейной конференции, посвященной 85-летию кафедры микологии и альгологии МГУ им. Ломоносова (Москва, 2004);
на VII молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2004);
на XII и XIII Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов – 2005» и «Ломоносов – 2006» (Москва, 2005, 2006);
на Международной конференции, посвященной 100-летию начала работы профессора А.С. Бондарцева в Ботаническом институте им. В.Л. Комарова РАН (Санкт-Петербург, 2005);
на XVI Международном симпозиуме микологов и лихенологов стран Балтии (Cesis, Latvia, 2005);
на Международной конференции, посвященной 75-летию Биологического факультета МГУ им.
М.В. Ломоносова (Москва, 2006);
на Всероссийской конференции «Биоразнообразие экосистем Внутренней Азии» (Улан-Удэ, 2006);
на Х юбилейной конференции ББС МГУ (ББС, 2006).
Публикации По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, которые отражают ее основное содержание, среди них 2 статьи в рецензируемых журналах.
Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения, списка литературы и приложений.
Работа изложена на страницах, содержит таблиц и рисунков, а также приложения, содержащие рисунков и таблиц.
Список литературы включает источников, из них на иностранных языках, в том числе 2 интернет-источника.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ В обзоре литературы проанализированы данные по географическому распространению и отличительным особенностям засоленных щелочных почв и содовых солончаков. Подробно охарактеризовано современное состояние проблемы изучения прокариотного сообщества содовых озер и солончаков. Приведены данные по исследованию физиологических особенностей некоторых видов грибов при щелочных значениях рН и в широком диапазоне концентраций солей в среде. Также отмечены перспективы изучения сообществ грибов в содовых солончаках и использования их метаболитов.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы Маериалами для исследования послужили образцы засоленных щелочных почв из Кулундинской степи, Забайкалья, северной части пустыни Гоби и Аральского региона (рис. 1;
табл. 1). Были проанализированы также образцы галофитов (надземная часть побегов), растущих на щелочных почвах. Каждый образец составлял около 10 экземпляров растений.
Растения-солянки были отобраны в Кулундинской степи (Salicornia europaea L. и Suaeda prostrata Pall. было взято по 3 образца;
Atriplex verrucifera МВ. – 2;
Anabasis salsa Benth., Halocnemum strobilaceum (Pall.) Bieb., Suaeda acuminata C.A.Mey, Suaeda corniculata C.A.Mey, Suaeda sp. по 1 образцу) и в р-оне мыса Актумсык, Аральское море (7 образцов Suaeda salsa Pall.).
Рис. 1. Географическое положение регионов исследования Образцы почв и растений отбирали в августе-сентябре 2001-2003 гг. Для работы использовали данные анализов водной вытяжки почв, воды озер, рядом с местами отбора образцов, и минералогический анализ солей твердой фазы. Эти исследования были проведены на базе Почвенного института им. В. В. Докучаева.
Таблица Краткая характеристика почвенных образцов из различных регионов Центральной Азии Характеристика почвенных Глубина Тип образцов Район отбора Кол-во отбора Регион засоления рН сумма образцов образцов образцов, почвы солей, см г/кг Кулундинская оз. Петухово, 5 9,1-10,0 47-230 хлоридный 0- степь оз. Соленое и др.
оз.Глауберовое, 5 9,5-10,1 38-225 хлоридно- 0- оз. Шукуртуз сульфатный и др.
оз. Желтырь, 7 9,6-10,1 45-385 содово- 0- оз.Петуховское, хлоридный оз. Узкое и др.
оз. Мирабилит, 3 9,6-9,7 91-165 содово- 0- оз. Беленькое хлоридно сульфатный оз. Каракуль, 5 9,8-10,2 73-310 содовый 0- оз. Танатар и др.
Забайкалье оз. Чеддер 5 9,0 - 9,2 - содовый 0- ист. Алла* 5 7,8-8,7 - сульфатный 0- ист. Кучигер* 3 8,0-9,0 - сульфатный 0- оз. Белое 8 7,1-8,2 0,2-26,0 сульфатно- 0- содовый оз. Сульфатное 6 7,6-10,3 сульфатно- 0- 0,7-139, содовый оз. Нухэ-Нур 8 7,8-10,1 1,0-9,7 содовый 0- Северная оз. Улан-Нур 7 7,8-9,3 5,9-12,5 сульфатно- 0- часть Гоби содовый Баян-Дзаг 9 8,4-9,4 2,1-42,8 сульфатно- 0- содовый Аральское мыс Актумсык 15 7,5-9,0 - хлоридно- 0- море сульфатный * Данные для воды горячих источников:
источник Алла рН 8,3;
t +51°C;
источник Кучигер рН 9;
t +36°C Среды выделения и культивирования микромицетов Для выделения, культивирования и оценки гало- и алкалозависимости грибов использовали:
Щелочной агар (ЩА, pH 10,0 - 10,5) (селективная среда на буферной основе, адаптированная для грибов, см. Результаты), сусло-агар (СА, рН 6,5), среду Чапека (ЧА, рН 5,5), овсяной агар (ОА, рН 6,0), голодный агар (ГА, рН 6,0).
ЩА с концентрациями NaCl 0,1М;
0,2М;
0,4М;
0,6М;
1М.
Среды с буферными основами;
значения рН сред составляли 5,8;
6,1;
6,7;
7,9;
8,8;
10,0;
10,8.
Методы выделения и культивирования микромицетов Для выявления видового состава микромицетов были использованы посевы на агаризованные питательные среды ЩА и СА, в некоторых посевах почвенных образцов дополнительно использовали ЧА и ГА.
Выделение микромицетов из почв проводили, используя метод почвенных комочков.
Растения из каждого образца раскладывали на среды в двух повторностях. Чашки с посевами инкубировали при комнатной температуре (22°С). Учёт и отсев проводили через 5 - 14 дней.
Для количественной характеристики микобиоты для каждого вида определяли частоту встречаемости, как отношение числа образцов, где вид был встречен, к общему числу образцов (%). К доминирующим относили виды с частотой встречаемости более 40%.
Использовали индекс сходства состава видов Сьеренсена-Чекановского и индекс видового разнообразия Шеннона (Озерская, 1980;
Одум, 1986;
Мэгарран, 1992).
Изучение радиальной скорости роста микромицетов Для определения радиальной скорости роста изучаемый гриб сеяли на поверхность плотной питательной среды. Опыт проводили в двух или четырёх повторностях. Среднюю скорость роста культур (мм/ч) вычисляли путем измерения диаметра колонии каждые сутки в течение двух недель. Результаты обрабатывали при помощи программы Microsoft Excel из пакета Microsoft Office XP и Statistica v. 6.
Работа с коллекцией Для идентификации микромицетов применяли стандартные процедуры: посевы на диагностические питательные среды (СА и ОА), а также на ЩА. Использовали отечественные и зарубежные определители. Для исследования культур использовали световой и электронный сканирующий (SEМ) микроскопы.
Названия таксонов в работе унифицированы с использованием баз данных CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, the Netherland;
www.cbs.knaw.nl/databases/index.htm);
положение таксонов в системе приводится в соответствии с 9 изданием Словаря грибов Эйнсворта и Бисби (Ainsworth and Bisby's Dictionary of the fungi (9th ed.), 2001);
электронный вариант в интернете:
www.indexfungorum.org/Names/fungic.asp).
Анаморфные грибы мы не относили к таксонам аскомицетов, как это предлагается в Словаре, а приводили их отдельно в алфавитном порядке, с разделением на группы гифо- и целомицетов (Domsh et al., 1980).
Выявление антимикробной активности Была проведена предварительная оценка антимикробной активности у 22 изолятов грибов, выделенных из различных щелочных почв. В качестве тест-объектов для опpеделения антимикpобной активности использовали 14 культур микроорганизмов (грамположительные ( культур) и грамотрицательные (3 культуры) бактерии и грибы (3 культуры)).
Антимикробную активность определяли по стандартной методике методом диффузии в агар (метод дисков);
оценивали по наличию зон задержки pоста тест-объекта (Ершова Е.Ю. и др., 2001). Для биологических испытаний использовали следующие pаствоpы: Кн – концентрат веществ, выделенных из нативного pаствоpа пpи нейтpальном значении рН;
Кк – концентрат веществ, выделенных из нативного pаствоpа пpи кислом значении pH;
Мн – концентрат веществ, выделенных из мицелия пpи нейтpальном значении pH;
Мк – концентрат веществ, выделенных из мицелия пpи кислом значении рН. Растворы получали из каждого изолята гриба;
всего проанализировано 88 концентратов.
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ Разработка селективной среды Для культивирования и выделения галоалкалотолерантных грибов из содовых солончаков была адаптирована среда с минеральной основой на щелочном буфере (Сорокин, 2000), щелочной агар (ЩА) (pH 10,0 -10,5),(г/л):
минеральная основа: Na2CO3-24, NaHCO3-6, NaCl-6, KNO3-1, K2HPO4-1, MgSO4*7H2O-0,5;
солодовый экстракт (15°Б) – 200 мл, дрожжевой экстракт-1, крахмал-6, агар-15;
H2O дист.
800мл.
Для приготовления ЩА отдельно стерилизовали минеральную основу, MgSO4*7H2O и остальные компоненты в режиме 30 мин. при избыточном давлении 0,5 атм.
При выделении грибов из образцов почв и растений во все среды добавляли рифампицин (2 г/л).
Состав видов мицелиальных грибов из почв и с растений различных географических регионов В данной главе (разделы 3.2 - 3.5) подробно охарактеризован видовой состав мицелиальных грибов из почв и с растений-солянок 4-х исследованных географических регионов – Кулундинской степи (Алтайский край), Забайкалья (Бурятская обл. и республика Тува), Северной Гоби (Монголия) и м. Актумсык (западная часть Аральского моря, Казахстан).
Сообщества микромицетов из всех исследованных регионов по структуре видового комплекса (доминирующие виды, видовое богатство родов) достаточно близки между собой и представляют небольшую четко очерченную группу (табл. 2).
Высокая встречаемость на ЩА отмечена у Acremonium sp. sect. Nectrioidea, A. rutilum, A.
strictum, Heleococcum alkalinum, Verticillium luteoalbum, стерильного мицелия. И только эти виды микромицетов были выделены из почвенных образцов со значениями рН более 10,0, высокими значениями щелочности и высоким содержанием солей.
Большая часть видов, изолированных из солончаков, была выделена нами и с растений солянок (табл. 2). Значения индекса сходства видовых составов между почвами и растениями Кулундинской степи и м. Актумсык составили более 50%.
Таблица Встречаемость (%) грибов, изолированных из всех исследованных регионов на щелочную буферную среду (П - из образцов почв;
Р - из образцов растений) Регионы исследования Кулундинская Вид гриба № Забайкалье Сев. Гоби м. Актумсык степь П Р П П П Р Emericellopsis minima Stolk 4 0 0 0 0 E. pallida Beliakova 4 0 0 0 0 Heleococcum alkalinum Bilanenko 46 25 5 11 0 et Ivanova Chaetomium murorum Corda 0 0 0 0 0 Acremonium alcalophilum G. Okada 17 50 0 0 0 A. bactrocephalum W.Gams 0 13 5 0 0 A. biseptum W.Gams 0 13 0 0 0 A. charticola (J.Lindau) W.Gams 29 38 6 0 0 A. kiliense Grtz 4 0 0 0 0 A. psammosporum W. Gams 0 0 0 0 7 A. pseudozeylanicum W.Gams 0 0 11 0 0 A. roseogriseum (S.B.Saksena) W. 4 0 0 0 0 Gams A. roseolum (G. Sm.) W. Gams 0 0 0 7 0 A. rutilum W.Gams 67 50 28 38 7 A. strictum W.Gams 42 88 43 22 7 Acremonium sp. sect. Nectrioidea 58 50 33 41 7 Acremoniella sp. 0 0 0 0 0 Alternaria alternata (Fr.) Keissl. 0 50 5 0 Aspergillus ochraceus G. Wilh. 0 0 0 0 0 Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) 0 0 3 0 0 Vuill.
13 13 5 0 0 Cladosporium sphaerospermum Penz.
C. spongiosum Berk. et M.A. Curtis 0 0 2 0 0 Fusarium anthophilum (A. Braun) 0 0 7 0 7 Wollenw.
F. chlamydosporum Wollenw. et 0 0 3 0 0 Reinking F. dimerum var. dimerum Penz. 0 0 3 0 0 F. oxysporum Schltdl. 0 0 4 0 0 F. solani (Mart.) Sacc. 0 13 20 0 0 Paecilomyces lilacinus (Thom) 0 0 3 0 0 Samson Papulaspora sp. 38 0 0 0 0 Scopulariopsis brevicaulis (Sacc.) 17 25 20 0 0 Bainier Ulocladium botrytis Preuss 0 0 3 0 0 Verticillium chlamydosporium var. 8 0 0 0 0 chlamydosporium Goddard V. dahliae Kleb. 0 0 11 0 0 V. luteoalbum (Link) Subram. 54 50 0 29 0 V. nigrescens Pethybr. 4 0 6 0 0 V. suchlasporium var. 4 0 0 0 0 suchlasporium W.Gams et Dackman Phoma eupyrena Sacc. 0 0 3 0 0 стерильный светлый мицелий 54 75 35 66 33 стерильный темный мицелий 50 100 29 44 13 Всего (включая идентифицированные только до уровня рода Acremoniella sp., Acremonium sp. sect. Nectrioidea, Papulaspora sp.) на ЩА было выделено 37 видов, 16 родов микромицетов. Из них 4 вида, 3 рода из 2 семейств (Chaetomiaceae, Bionectriaceae) относятся к аскомицетам, а остальные 33 вида, 13 родов - к анаморфным видам. Также было выделено большое количество стерильных темно- и светлоокрашенных мицелиев.
При оценке видового разнообразия грибов на других средах (СА, ЧА, ГА) картина несколько меняется. Мы приводим видовой список мицелиальных грибов, выделенных на СА, ЧА и ГА из всех исследованных регионов:
ZYGOMYCOTA Mucorales: Mucoraceae Absidia coerulea Bainier;
A. spinosa Lendn.;
Rhizopus stolonifer var. stolonifer (Ehrenb.) Vuill.
Mucorales: Syncephalastraceae Mycocladus corymbiferus (Cohn) J.H. Mirza;
Syncephalastrum racemosum Cohn ex J. Schrt.
ASCOMYCOTA Eurotiales: Trichocomaceae Eupenicillium fractum Udagawa Hypocreales: Bionectriaceae Emericellopsis pallida Beliakova Sordariales: Chaetomiaceae Chaetomium strumarium (J.N. Rai, J.P. Tewari et Mukerji) P.F. Cannon.
Sordariales: Sordariaceae Gelasinospora retispora Cain DEUTEROMYCOTA Hyphomycetes Acremonium bactrocephalum W.Gams;
A. charticola (J.Lindau) W.Gams;
A. implicatum (J.C.Gilman et E.V.Abbott) W.Gams;
A. persicinum (Nicot) W.Gams;
A. roseogriseum (S.B.Saksena) W. Gams;
A. rutilum W.Gams;
A. strictum W.Gams;
A. zonatum (Sawada) W.Gams;
Alternaria alternata (Fr.) Keissl.;
Aspergillus carneus Blochwitz;
A. fumigatus Fresen.;
A. ochraceus G. Wilh.;
A.
terreus Thom;
A. versicolor (Vuill.) Tirab.;
A. wentii Wehmer;
Bipolaris australiensis (M.B.Ellis) Tsuda et Ueyama;
Cephalotrichum nanum (Ehrenb.) S. Hughes;
C. purpureofuscum (Schwein.) S. Hughes;
Cladosporium sphaerospermum Penz.;
Clonostachys rosea (Preuss) Mussat;
Cylindrocarpon destructans (Zinssm.) Scholten;
Drechslera ravenelii (M.A. Curtis) Subram. et B.L. Jain;
Epicoccum nigrum Link;
Geomyces pannorum (Link) Sigler et J.W.Carmich.;
Fusarium anthophilum (A. Braun) Wollenw.;
F. chlamydosporum Wollenw. et Reinking;
F. incarnatum (Desm.) Sacc.;
F. oxysporum Schltdl.;
F. poae (Peck) Wollenw.;
F. solani (Mart.) Sacc.;
F. sulphureum Schltdl.;
Lecanicillium psalliotae (Treschew) Zare et W.Gams;
Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson;
Penicillium aurantiogriseum Dierckx;
P. chermesinum Biourge;
P. chrysogenum Thom;
P. citrinum Thom;
P.
glabrum (Wehmer) Westling;
P. funiculosum Thom;
P. herqueri Bainier et Sartory;
P. paxilli Bainier;
P.
purpurescens (Sopp) Biourge;
P. purpurogenum Stoll;
P. spinulosum Thom;
P. variabile Sopp;
Phialophora bubakii (Laxa) Schol-Schwarz;
P. parasitica Ajello, Georg et C.J.K. Wang;
P. repens (R.W. Davidson) Conant;
Scopulariopsis brevicaulis (Sacc.) Bainier;
Stachybotrys chartarum (Ehrenb.) S.Hughes;
Trichoderma harzianum Rifai;
T. viride Pers.;
Trichothecium roseum (Pers.) Link;
Ulocladium alternariae (Cooke) E.G. Simmons;
U. atrum Preuss;
U. botrytis Preuss;
U.
chartarum (Preuss) E. G. Simmons;
Verticillium dahliae Kleb.;
V. griseum (Petch) W.Gams;
V.
luteoalbum (Link) Subram.
Coelomycetes Phoma eupyrena Sacc.;
P. glomerata (Corda) Wollenw.et Hochapfel Кроме перечисленных, был выделен ряд культур, идентифицированных только до уровня рода: Acremonium sp. sect. Nectrioidea, Nigrospora sp., Papulaspora sp. и большое количество стерильных темно- и светлоокрашенных мицелиев. Всего на стандартные среды было выделено 76 видов (33 рода) микромицетов.
Состав видов грибов, выделенных на стандартные среды (СА, ЧА, ГА), существенно отличался от такового на ЩА. На ЩА изолировано значительно меньшее количество видов, чем на стандартные слабокислые среды (СА, ЧА и ГА). Не были выделены на ЩА представители зигомицетов, отсутствовали представители рр. Penicillium, Bipolaris, Cephalotrichum, Clonostachys, Cylindrocarpon, Drechslera, Epicoccum, Geomyces, Lecanicillium, Nigrospora, Stachybotrys, Trichothecium и ряд других. На ЩА значительно меньше видовое разнообразие рр. Fusarium, Aspergillus, однако отмечено высокое разнообразие видов рр.
Acremonium, Verticillium.
Общее видовое богатство микромицетов (включая неопределенные до вида морфотипы) всех исследованных регионов (изолированных на ЩА, СА, ЧА и ГА) представлено 92 видами, из которых 5 относятся к зигомицетам, 7 к аскомицетам, а остальные – к несовершенным грибам. Абсолютное большинство несовершенных грибов относится к группе гифомицетов.
Общее родовое богатство представлено 37 родами, из которых 4 рода зигомицетов, 5 родов аскомицетов, а остальные – роды несовершенных грибов. Таким образом, и видовом, и в родовом богатстве изученных местообитаний преобладают анаморфные грибы.
Исследование роста грибов на питательных средах Для выявления гало- и алкалотолерантных (гало- и алкалофильных) микромицетов у некоторых изолятов видов с высокой частотой встречаемости была определена линейная скорость роста на твердых средах с разными концентрациями NaCl и разными значениями рН.
Рост микромицетов на твердых средах (СА, ОА и ЩА) Были исследованы скорости линейного роста изолятов видов из родов Acremonium, Verticillium, Fusarium, Scopulariopsis и ряда других, выделенных из различных почвенных образцов на разные среды (ЩА, СА, ЧА или ГА).
Все культуры грибов, хотя и способны к росту на СА, ОА и ЩА, но в разной степени. По динамике скоростей роста, исследованные изоляты микромицетов можно разделить на группы:
1 группа (рис. 2): скорости Рис. 2. Скорости линейного роста колоний линейного роста близки на ЩА, СА Verticillium luteoalbum на СА,ОА и ЩА мм/ч и ОА. Это 8 изолятов видов 0,3 0, 0,25 0, Acremonium sp. sect. Nectrioidea;
0, Verticillium dahliae;
Verticillium 0, luteoalbum.
0, 0, 0, СА ОА ЩА 2 группа (рис. 3): скорость Рис. 3. Скорости линейного роста колоний линейного роста максимальна на Acremonium rutilum на СА, ОА и ЩА мм/ч ЩА, минимальна на СА и/или ОА: 0, 0, Это 56 изолятов видов Emericellopsis 0, minima;
Heleococcum alkalinum;
0, Acremonium charticola;
A. rutilum;
А.
0, strictum;
Acremonium sp. sect. 0, 0, 0, Nectrioidea;
Verticillium dahliae, V.
luteoalbum;
V. nigrescens. 0, СА ОА ЩА 3 группа (рис. 4): скорость линейного роста минимальна на ЩА, при значительных скоростях роста на СА и/или ОА.
Это 39 изолятов видов Рис. 4. Скорости линейного роста колоний Fusarium Acremonium bactrocephalum;
A.
anthophilum на СА, ОА и ЩА мм/ч charticola;
A. implicatum;
A.
0, 0, persicinum;
A. psammosporum;
0, 0, A. pseudozeylanicum;
A. rutilum;
0, A. strictum;
Alternaria alternata;
0, Emericellopsis pallida;
Fusarium 0, anthophilum;
F. dimerum var.
0, 0, dimerum;
F. oxysporum;
F. solani;
Lecanicillium psalliotae;
Phoma СА ОА ЩА glomerata;
Scopulariopsis brevicaulis;
Verticillium nigrescens;
изоляты стерильного мицелия.
Как показали исследования, большинство изолятов имеют более высокую скорость роста на ЩА по сравнению с СА и ОА.
Рост микромицетов при разных значениях рН среды Было проведено исследование линейных скоростей роста 15 штаммов грибов (8 видов) на средах со значениями рН от 5,8 до 10,8. По динамике скоростей роста исследованные изоляты можно разделить на 3 группы:
1 группа:
Микромицеты развиваются на всех средах активно, с небольшим оптимумом в щелочной области (рис. 5). Это изоляты видов Acremonium strictum, A. rutilum, Acremonium sp. sect.
Nectrioidea, Chrysosporium queenslandicum, Heleococcum alkalinum, стерильный мицелий.
Рис. 5. Скорости линейного роста колоний мм/ч Acremonium strictum при разных значениях рН 0, 0, 0, 0, рН 5,8 6,1 6,7 7,9 8,8 10,0 10, 2 группа:
Микромицеты, имеющие максимальную скорость роста на средах с высокими значениями рН и относительно слабо растущие при кислых значениях рН среды (рис. 6). Это изоляты видов Heleococcum alkalinum и Verticillum luteoalbum.
Рис.6. Скорости линейного роста колоний Heleococcum мм/ч alkalinum при разных значениях рН 0, 0, 0, 0, рН 5,8 6,1 6,7 7,9 8,8 10,0 10, 3 группа:
Грибы, у которых максимальные скорости роста отмечены при нейтральных значениях pH, а в щелочной области рост мицелия слабый (рис. 7). Это изоляты Fusarium solani и Acremonium charticola.
Рис. 7. Скорости линейного роста колоний Fusarium solani при разных значениях рН мм/ч 0, 0, 0, 0, 0, рН 5,8 6,1 6,7 7,9 8,8 10,0 10, Большинство исследованных изолятов грибов из содовых солончаков показали способность развиваться в широком диапазоне значений рН с оптимумом в щелочной области. Следовательно, эти микромицеты можно считать алкалотолерантными.
Рост микромицетов на средах с разными концентрациями NaCl Было проведено исследование линейных скоростей роста 12 штаммов грибов (Heleococcum alkalinum;
Acremonium charticola;
А. rutilum;
A. strictum;
Acremonium sp. sect.
Nectrioidea;
Fusarium аnthophilum;
Scopulariopsis brevicaulis;
Verticillum luteoalbum;
стерильный темноокрашенный мицелий) на твердых средах с концентрациями NaCl от 0,1М до 1М (рис. 8).
Рис. 8. Скорости линейного роста колоний Heleococcum alkalinum (белый ) и Acremonium rutilum (черный) на средах с разными концентрациями NaCl мм/ч 0, 0, 0, NaCl (M) 0,1 0,2 0,4 0,6 Все исследованные изоляты микромицетов оказались способными к росту на щелочной среде с pH10,5 во всем исследованном диапазоне концентраций NaCl. Для всех культур оптимальными для роста были среды с 0,1 - 0,2М концентрациями NaCl и было отмечено замедление скорости роста при увеличении концентрации соли в среде (рис. 8). Таким образом, все исследованные микромицеты можно отнести к галотолерантным.
Исследование биологической активности микромицетов Антимикробная активность по отношению к стандартным тест-культурам была исследована у 22 изолятов, принадлежащих 12 видам грибов: Acremonium charticola;
A.
persicinum;
A. rutilum;
A. strictum;
Acremonium sp. sect. Nectrioidea;
Alternaria alternata;
Heleococcum alkalinum;
Fusarium solani;
Paecilomyces lilacinus;
Scopulariopsis brevicaulis;
Verticilium dahliae;
V. luteoalbum.
У 2 из 22 исследованных изолятов (A. strictum и Heleococcum alkalinum) антибиотической активности не было ни в культуральной жидкости, ни в мицелии.
При выращивании изолятов грибов на слабокислой солодовой среде, биологическая активность экстрактов из мицелия и из культуральной жидкости либо отсутствовала, либо была невелика.
При исследовании активности изолятов грибов, выращенных на щелочной среде можно отметить некоторые особенности:
• Исследуемые культуры грибов оказались наиболее активны в отношении Pseudomonas aeruginosa, у 5 изолятов была отмечена активность как в мицелии, так и в культуральной жидкости.
• Для некоторых культур грибов характерен узкий спектр биологической активности.
Например, изоляты Acremonium charticola и Heleococcum alkalinum активны по отношению к Aspergillus niger, а изолят Acremonium sp. sect. Nectrioidea по отношению к Saccaromyces cerevisiae.
• У 8 исследованных культур отмечен широкий спектр биологической активности.
Например, для экстрактов из мицелия Acremonium rutilum, зоны подавления составили от 10 до 21 мм по отношению к Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus;
для изолята Heleococcum alkalinum зоны подавления были 8 - 12 мм по отношению к Bacillus mycoides, B. pumilis, Leuconostoc mesenteroides, Pseudomonas aeruginosa и Aspergillus niger.
В результате было показано, что исследованные изоляты на специально подобранных средах способны продуцировать антибактериальные и антигрибные вещества. Исследования подтвердили, что антимикробная активность - штаммовый признак, она присутствует у изолята F11 вида Heleococcum alkalinum, но полностью отсутствует у штамма F12 этого же вида.
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ Комплекс грибов из щелочных засоленных почв существенно отличается от сообществ микромицетов в дерново-подзолистых почвах средней полосы, желтоземах субтропиков, мерзлотных почв полярных пустынь и др. (Мишустин, 1975;
Озерская, 1980;
Биланенко, 1983).
К солончакам по родовому составу грибов наиболее близки почвы литорали, где также доминируют виды из р. Acremonium (Согонов, Марфенина, 1999;
Бубнова, 2005).
Нами не было обнаружено четких закономерностей в изменении состава видов грибов в зависимости от варьирования значений pH, общей щелочности, содержания солей в исследованных почвенных образцах.
В целом для солончаков характерно небольшое видовое разнообразие микромицетов, очень низкое количественное содержание грибных зачатков, безусловное доминирование стерильного светло- и темноокрашенного мицелия и видов рр. Acremonium, Verticillium и Fusarium.
В большинстве микологических работ по засоленным почвам, в основном отмечены виды рр. Penicillium, Aspergillus, Fusarium и ряд других. У представителей этих родов высокая встречаемость и в нашем исследовании при анализе видового разнообразия на стандартных слабокислых средах. Специфический комплекс галоалкалотолерантных микромицетов был нами выделен на буферную среду с pH на уровне 10,0 - 10,5. Также можно отметить, что в работах прошлых лет в основном использовался метод разведения почвенной суспензии и поэтому были выделены только быстрорастущие, широко распространенные виды. Многие исследователи считали щелочными почвы с рН 7,5 - 8,5, и основной материал в литературе по разнообразию грибов в щелочных почвах относится к таким образцам. В нашей работе основное внимание было уделено анализу почвенных образцов со значениями рН более 8,0.
Однако составы видов микромицетов, выделенных из почв известняковых каменоломней в Японии (рН 7,7 - 8,8), засоленных почв Индонезии (рН 7 - 8) (Nagai et al.,1995: 1998) и засоленных щелочных почв (рН 7,5 - 9,7) у озера Моно в Калифорнии (Steiman et al., 2004) близки к данным, полученным при исследовании солончаков Центральной Азии.
Селективная щелочная среда позволяет изолировать галоалкалотолерантные грибы.
Ранее только японские исследователи (Nagai et al.,1995: 1998) для изучения засоленных щелочных почв использовали среду на основе кукурузного агара с рН 9,7. Состав компонентов ЩА более близок по основным показателям (сода, соль, высокие значения рН) к природным условиям содовых солончаков, и можно предположить, что виды, которые выделяются на ЩА, представляют активную, функционально значимую в почве при таких экстремальных условиях группу. Часть выделенных на стандартные слабокислые среды микромицетов являются для щелочных почв случайными видами, которые, скорее всего, находятся там в неактивном (покоящемся) состоянии. Однако любая почва является гетерогенной средой, и, возможно, даже в сильнозасоленной щелочной почве создаются микролокусы с менее экстремальными условиями (особенно во время ливневых дождей, когда происходит некоторая промывка верхних почвенных горизонтов от солей), в которых и могут развиваться и функционировать не только галоалкалотолерантные микромицеты.
Содержание грибных пропагул в щелочных засоленных почвах невелико, и это привело к выбору для выделения микромицетов метода почвенных комочков, а не метода серийных разведений. И только использование метода почвенных комочков в сочетании с высокими концентрациями специфического щелочеустойчивого антибиотика рифампицина позволило изолировать специфическое галоалкалотолерантное сообщество грибов.
Согласно проведенному анализу скоростей линейного роста, даже микромицеты, выделенные на ЩА, в разной степени способны к росту и развитию на среде с высокими значениями рН и высокими концентрациями солей.
Все исследованные изоляты Emericellopsis minima, Heleococcum alkalinum, Acremonium sp. sect. Nectrioidea, Verticillium dahliae и V. luteoalbum, а также большинство изолятов Acremonium rutilum, A. charticola, Verticillium nigrescens показали более высокие скорости роста на ЩА по сравнению с СА и ОА. Для Emericellopsis minima на ЩА было отмечено только обильное конидиальное спороношение типа Acremonium, в то время как на СА и ОА гриб образовывал плодовые тела. Среди представителей р. Acremonium были и такие, которые быстрее развивались на более кислых средах. У Alternaria alternata и Phoma glomerata на ЩА отсутствовали конидиальные спороношения.
Для видов р. Fusarium в литературе отмечена алкалотолерантность, а исследование механизмов устойчивости к солевому стрессу показало присутствие Na+ - АТФазы у Fusarium oxysporum (Caracuel et al., 2003). В содовых почвах Центральной Азии виды этого рода характеризуются высоким разнообразием и высокой встречаемостью, но очень медленно растут на ЩА и не имеют на нем конидиальных спороношений.
В современных системах грибов, при использовании различных методов геносистематики, несовершенные грибы постепенно распределяют по таксонам аскомицетов или базидиомицетов. По некоторым видам несовершенных грибов, выделенных в результате нашего исследования, в литературе имеются сведения о родстве с определенными видами аскомицетов, а для многих родов несовершенных грибов имеются указания на ту или иную степень родства с различными таксонами аскомицетов – от рода до отдела.
При такой оценке общего видового богатства наибольшее число грибов относится к аскомицетам и представлено порядками: Hypocreales;
Eurotiales;
Pleosporales.
Доминирующим родом среди микромицетов засоленных почв является р. Acremonium.
Нами было выделено 15 представителей этого рода, а также Acremonium – подобные анаморфы некоторых аскомицетов порядка Hypocreales (Emericellopsis minima, Heleococcum alkalinum) (табл. 3).
Таблица Виды р. Acremonium, выделенные из всех исследованных регионов на ЩА, СА, ЧА и ГА из почв и с галофитов.
№ Вид почвы растения 1 Acremonium alcalophilum G. Okada + + 2 A. bactrocephalum W.Gams + + 3 A. biseptum W.Gams - + 4 A. charticola (J.Lindau) W.Gams + + 5 A. implicatum (J.C.Gilman et E.V.Abbott) W.Gams + 6 A. kiliense Grtz + 7 A. persicinum (Nicot) W.Gams + 8 A. psammosporum W. Gams + 9 A. pseudozeylanicum W.Gams + 10 A. roseogriseum (S.B.Saksena) W. Gams + 11 A. roseolum (G. Sm.) W. Gams + 12 A. rutilum W.Gams + + 13 A. strictum W.Gams + + 14 A. zonatum (Sawada) W.Gams + + 15 Acremonium sp. sect. Nectrioidea + + В современном понимании род Acremonium – чрезвычайно гетерогенная группа, включающая анаморфы не только различных семейств, но и порядков аскомицетов, таких как Eurotiales, Hypocreales, Sordariales и Glomerellales, при этом установление связей анаморфных видов с телеоморфами для большинства видов затруднено и требует специальных молекулярно-генетических исследований (Сидорова, 2003;
Gams, 1971).
Виды р. Acremonium достаточно широко распространены в самых различных экологических условиях. Алкалотолерантные свойства видов этого рода отмечены и другими исследователями (Okada et al., 1993;
Nagai et al., 1995;
1998).
Созданная коллекция культур из содовых солончаков содержит изоляты с неопределенным таксономическим статусом. Для уточнения таксономического положения выделенных нами грибов с помощью молекулярно-генетического анализа, галоалкалотолерантных изолятов, отнесенных к р. Acremonium, были депозитированы в CBS.
Работа с культурами продолжается, проведенные предварительные морфологические и молекулярно-генетические исследования показали специфичность выделенных культур и сложность их идентификации. Возможно, среди них в дальнейшем будут описаны новые виды и даже роды микромицетов, несмотря на то, что морфологически изоляты очень схожи между собой.
Особенно интересным оказалось обособленное положение выделенных нами изолятов Acremonium sp. sect. Nectrioidea от всех известных представителей рода. Молекулярно генетические исследования, проведенные в CBS, показали его некоторую близость к виду Acremonium antarcticum (Speg.) D. Hawksw., который развивается только в арктических районах и приурочен к лишайникам.
Нами был исследован и описан новый галоалкалотолерантный аскомицет Heleococcum alkalinum Bilanenko et Ivanova, имеющий Acremonium - подобную конидиальную стадию (Bilanenko et al., 2005) (рис. 9 - 12). Он был выделен из многих образцов содовых солончаков Кулундинской степи, Забайкалья, Монголии и Танзании. Ниже мы приводим его описание.
Heleococcum alkalinum sp. nov.
Плодовые тела темнокоричневые, образуются на поверхности субстрата, шаровидные, замкнутые, 120 – 250 мкм в диаметре. Оболочка плодового тела (перидий) псевдопаренхиматозная, со складчатой поверхностью, состоит из 3-5 слоев угловатых (чаще шестиугольных) клеток. Парафизы отсутствуют. Сумки тонкостенные, унитуникатные, расположены беспорядочно в центре плодового тела, заполненного слизистым матриксом, в него погружены сумки. Оболочка сумок расплывается до созревания аскоспор, и аскоспоры находятся в слизистой массе внутри плодового тела. Аскоспоры освобождаются после разрыва оболочки плодового тела, предположительно вследствие набухания слизи и увеличения давления внутри плодового тела (рис. 9,10).
Аскоспоры овальные или эллипсоидальные, 12-15 x 5-7 мкм, c одной перегородкой в середине, без перетяжки в месте расположения септы, толстостенные, светлокоричневые, гладкие (рис. 11).
Рис. 9.
Плодовые тела Heleococcum alkalinum и конидиальное спороношение типа Acremonium;
SEM, среда – щелочной агар Рис. 10. Heleococcum alkalinum;
SEM, среда – щелочной агар А) оболочка плодового тела, образованная несколькими (3-5) слоями многоугольных клеток;
Б) аскоспоры в плодовом теле, погруженные в слизь Рис. 11. Heleococcum alkalinum;
среда – щелочной агар А) аскоспора с одиночной септой в центре, септа не затрагивает клеточную оболочку (световой микроскоп);
Б) овальные аскоспоры и округлые конидии (SEM) Acremonium anam. Heleococcum alkalinum sp.nov.
Колонии на ЩА довольно быстро растут, достигая 38-40 мм за 10 дней;
на сусло - агаре растут значительно медленнее, достигая 5,5 мм в диаметре за 10 дней, сначала белые, затем с черными концентрическими зонами вследствие интенсивного образования плодовых тел. Колонии бархатистые до шерстистых. Обратная сторона не окрашена или чуть желтоватая. Запах приятный, напоминает цветочный. Стелющиеся вегетативные гифы тонкостенные, бесцветные, толщиной 0,5-2,0 мкм.
Образование конидий обильное, конидиеносцы отходят главным образом от одиночных воздушных гиф, иногда от тяжей воздушных гиф. Ветвление конидиеносцев базитонно-мутовчатое, присутствуют также и одиночные веточки. Фиалиды 15 - 60 мкм длиной, постепенно сужающиеся к концу, довольно тонкостенные. Конидии образуются в слизистых головках, чаще шаровидных, иногда коротко цилиндрических. Конидии полушаровидные или широко эллипсоидальные, 4,5-5,5 х 4,1-4,6 мкм, неокрашенные (рис. 11, 12). Хламидоспоры отсутствуют.
Рис. 12. Acremonium-подобная анаморфа Heleococcum alkalinum;
SEM, среда – щелочной агар А) базитонно-мутовчатое ветвление конидиеносцев с 3-5 ветвями и шаровидными головками конидий;
Б) одиночная фиалида со слизистой головкой округлых конидий Типовой изолят F11 – выделен из содовых солончаков Монголии, рН 10,65;
NaCl 4,9%, 1999г. Изоляты депозитированы во всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) и в CBS.
В настоящий момент в коллекции 15 изолятов, выделенных из содовых солончаков Монголии, Кункурской степи, Танзании, Кулундинской степи. Значения рН почвенных образцов варьируют от 9,2 до 10,7;
сумма растворимых солей от 6,2 до 310 г/кг.
Изоляты Heleococcum alkalinum были выделены нами только на ЩА. Исследования способности к росту на средах в широком диапазоне значений рН (5,8 - 10,8) и при различных концентрациях NaCl в среде показало, что эти изоляты являются галоалкалотолерантными, с оптимальным развитием при щелочных значениях рН (9 - 10) и 0,6М концентрацией NaCl в среде. На СА и ОА рост культур угнетен и существенно изменяется микроморфология гриба:
появляются утолщенные гифы, наблюдается фрагментация мицелия, слабое конидиальное спороношение в основном с одиночными фиалидами и др.. Изучение биологической активности показало перспективность некоторых изолятов, особенно типового (F11), как возможного источника интересных вторичных метаболитов, имеющих высокую антимикробную активность.
К настоящему времени микроморфология 12 изолятов, жизненный цикл гриба, особенности онтогенеза анаморфы и телеоморфы и некоторые другие особенности подробно изучены М.В. Козловой (Козлова, 2006).
Род Heleococcum C.A. Jrg. был описан C. A. Йоргенсен в 1922 году с H. aurantiacum C.A.
Jrg. в качестве типового вида (Tubaki, 1967;
Kohlmeyer, 1979;
Udagawa et al., 1995). Всего известно 4 вида рода Heleococcum: H. aurantiacum C.A. Jrg., H. japonense Tubaki, H. inapertum Udagawa et al., H. alantosporum Udagawa et al. (Udagawa et al., 1995;
Rossman et al., 1999).
Удагава с сотрудниками (Udagawa et al., 1995) предложили ключ для идентификации видов рода Heleococcum, базирующийся в основном на размерах аскоспор и их дополнительных характеристиках, таких как наличие или отсутствие желатиновой оболочки, чехла у аскоспор, наличие у них орнаментации.
H. alkalinum sp. nov. из четырех описанных видов ближе всего к H. inapertum, от которого отличается размерами аскоспор (12-15 х 5-7мкм), отсутствием у него выраженной орнаментации и слизистого чехла. Также для него характерны темно-коричневые аскомы и ярко выраженная галоалкалотолерантность.
Тубаки (Tubaki, 1967) в обзоре рода Heleococcum отметил, что этот гриб представляет промежуточное звено между двумя порядками – Eurotiales и Hypocreales и может быть помещен как в один, так и в другой порядок. Некоторые характеристики рода Heleococcum, такие, как замкнутые плодовые тела, расплывающиеся, растворяющиеся оболочки сумок не типичны для порядка Hypocreales, однако яркоокрашенные плодовые тела, односептированные гиалиновые аскоспоры, Acremonium- или Trichothecium-подобные анаморфные стадии – все эти признаки подтвердили принадлежность рода порядку Hypocreales. Позднее Рейнер и Сэмюэльс (Rehner, Samuels, 1995), используя данные анализа 18S и 28S rDNA, продемонстрировали, что H. japonense, действительно, принадлежит порядку Hypocreales и должен быть помещен в сем. Bionectriaceae (Rossman et al., 1999, 2001).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Из образцов щелочных засоленных почв и с поверхности галофитов различных регионов Центральной Азии (Кулундинская степь, Забайкалье, Аральское море, пустыня Гоби), впервые выделены микромицеты, способные развиваться в экстремальных условиях с высокими показателями рН, щелочности, концентрации солей. Сообщений в литературе о грибах из экстремально щелочных и засоленных условий крайне мало. Отсутствие сведений не говорит, однако, об отсутствии грибов в природе, что было подтверждено представляемой работой.
Комплекс видов грибов из засоленных щелочных почв существенно отличается от сообществ грибов из почв регионов с другими экологическими условиями. Небольшое видовое разнообразие микромицетов, низкое содержание грибных зачатков, высокая встречаемость в образцах почв видов р. Acremonium и стерильного мицелия – характерные черты сообщества грибов в содовых солончаках.
Благодаря использованию специфической селективной среды со щелочным буфером было выявлено галоалкалотолерантное сообщество микромицетов, которое функционирует в экстремальных условиях содового засоления.
Все исследованные изоляты грибов отнесены к галоалкалотолерантным, поскольку показана их способность к росту в широком диапазоне значений рН среды (5,8 - 10,8) и при различных концентрациях NaCl (от 0,1М до 1 М) в среде. Для ряда грибов оптимальные значения рН среды лежат в щелочной области.
Экстремальные условия, складывающиеся в содовых солончаках, обусловливают своеобразие сообщества видов грибов, среди которых есть и новые таксоны. В ходе исследования нами был описан и опубликован новый для науки вид Heleococcum alkalinum Bilanenko et Ivanova. Ряд новых таксонов всесторонне исследуется. Эти микромицеты характеризуются высокой частотой встречаемости в щелочных засоленных почвах.
Исследования мицелиальных грибов в почвах с содовым засолением показали, что небольшая часть аскомицетов и их анаморфных видов смогла адаптироваться к таким экстремальным условиям среды обитания.
ВЫВОДЫ 1. Впервые выделено и исследовано сообщество мицелиальных грибов из засоленных щелочных почв различных регионов Центральной Азии.
2. Исследован комплекс микромицетов на растениях-галофитах родов Anabasis, Atriplex, Halocnemum, Salicornia, Suaeda. из солончаков Кулундинской степи и Аральского региона.
3. Продемонстрированы отличительные черты комплекса микромицетов в щелочных засоленных почвах: невысокая численность и незначительное видовое разнообразие с доминированием представителей рода Acremonium.
4. Составы видов грибов в засоленных щелочных почвах и на галофитах имеют высокую степень сходства (индекс Сьеренсена-Чекановского более 50%).
5. Разработана методика исследования микобиоты щелочных засоленных почв.
6. Максимальная скорость роста доминирующих в содовых солончаках видов грибов отмечена на средах со значениями рН в щелочной области и высокими концентрациями солей, что позволяет отнести их к галоалкалотолерантным и свидетельствует о функциональной значимости выделенного нами сообщества микромицетов в условиях содового засоления.
7. Описан новый галоалкалотолерантный аскомицет Heleococcum alkalinum Bilanenko et Ivanova (Ascomycetes, Hypocreales, Bionectriaceae).
8. У ряда изолятов микромицетов щелочных почв выявлена способность продуцировать антибактериальные и антигрибные вещества.
9. Создана и поддерживается коллекция микромицетов из щелочных засоленных почв, включающая новые таксоны грибов.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Биланенко Е.Н., Лисичкина Г.А., Иванова М.Л. Микромицеты содовых солончаков.
1 Съезд микологов России. М.: Изд-во «Национальная Академия Микологии». 2002.
Тезисы докладов, разд.2. С. 43-44.
2. Иванова М.Л., Биланенко Е.Н. Микромицеты содовых солончаков. 6-я Пущинская школа-конференция молодых ученых. Пущино. 2002. Сборник тезисов. С. 28.
3. Лисичкина Г.А., Биланенко Е.Н., Иванова М.Л. Дрожжи и мицелиальные грибы содовых солончаков. Тезисы Международной конференции Биогеография почв.
Сыктывкар. 2002. С. 28-29.
4. Биланенко Е.Н., Иванова М.Л. Микромицеты солончаков Кулундинской степи.
Материалы Всероссийской конференции «Биоразнообразие и функционирование микробных сообществ водных и наземных систем Центральной Азии». Улан-Удэ:
Изд-во БГСХА. 2003. С. 145-147.
5. Иванова М.Л., Биланенко Е.Н. Галоалкалотолерантные грибы в почвах Кулундинской степи. Материалы юбилейной конференции, посвященной 85-летию кафедры микологии и альгологии МГУ им. Ломоносова. М.: Изд-во «Прометей», 2004. С. 64.
6. Иванова М.Л., Биланенко Е.Н. Грибы в солончаках и на растениях-солянках Кулундинской степи. Материалы VII молодежной конференции ботаников в Санкт Петербурге. С.-П. 2004. С. 64-65.
7. Bilanenko E., Sorokin D., Ivanova M. & Kozlova M. Heleococcum alkalinum, a new alkali-tolerant ascomycete from saline soda soils // Mycotaxon. 2005. Vol. 91. Р. 497 507.
8. Георгиева М.Л., Биланенко Е.Н. Сообщество микромицетов содовых солончаков.
Тезисы докладов XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов – 2005». Москва. 2005. Секция Биология. С. 58.
9. Георгиева М.Л., Биланенко Е.Н. Сообщество микромицетов из солончаков пустыни Гоби (Монголия) // Грибы в природных и антропогенных экосистемах.
Труды международной конференции, посвященной 100-летию начала работы профессора А.С. Бондарцева в Ботаническом институте им. В.Л. Комарова РАН. С. П. 2005. Т.1. С. 153-156.
10. Bilanenko E.N., Georgieva M.L. Haloalkalitolerant community of micromycetes inhabiting soda solonchaks. Proceedings of the XVI symposium of mycologists and lichenologists of Baltic States. Cesis. Latvia. 2005. P. 52-55.
11. Биланенко Е.Н., Георгиева М.Л. Микромицеты солончаков Южной Сибири (Кулундинская степь) // Микология и фитопатология. 2005. Т. 39. Вып.4. С. 6-13.
12. Биланенко Е.Н., Георгиева М.Л. Микромицеты в почвах и на галофитах из регионов с содовым засолением. Материалы международной конференции, посвященной 75-летию Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. М.
2006. С. 26-29.
13. Георгиева М.Л. Биологически активные вещества у микромицетов из содовых солончаков. Тезисы докладов XIII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов – 2006». Москва. 2006.
Секция Биология. С. 54-55.
14. Бубнова Е.Н., Георгиева М.Л., Биланенко Е.Н. Грибы на Salicornia europaea L. из географически удаленных регионов (Кулундинская степь и побережье Белого моря). Материалы Х научной конференции Беломорской биологической станции МГУ: Сборник статей. М. Изд. «Гриф и К». 2006. С. 131-135.
15. Георгиева М.Л., Биланенко Е.Н. Грибы в содовых солончаках Забайкалья. Тезисы Всероссийской конференции с международным участием «Биоразнообразие экосистем Внутренней Азии». Улан-Удэ: Изд-во БНЦ СО РАН. Т.1. 2006. С. 107-108.
БЛАГОДАРНОСТИ Я выражаю искреннюю благодарность моему замечательному научному руководителю Елене Николаевне Биланенко за неоценимую помощь и всестороннюю поддержку при выполнении работы. Огромное спасибо Ирине Владимировне Толстых и Генриху Степановичу Катрухе за помощь при выполнении некоторых экспериментов;
Е. Н.
Бубновой и А. В. Александровой за помощь в определении видов грибов и осмыслении результатов работы. Спасибо Д. Ю. Сорокину за предоставленные образцы почв, постоянную помощь при поиске литературы и в методических вопросах;
М.П. Лебедевой, И.А. Ямновой, Г.А. Беляковой и Ф.В. Сапожникову за предоставленные образцы почв и их химический анализ.
Искренне признательна всему коллективу каф. микологии и альгологии Биологического факультета МГУ за ценные советы, рекомендации и поддержку.