Биоразнообразие аноксигенных фототрофных бактерий и их роль в продукции органического вещества в меромиктических водоемах
На правах рукописи
ЛУНИНА ОЛЬГА НИКОЛАЕВНА БИОРАЗНООБРАЗИЕ АНОКСИГЕННЫХ ФОТОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ И ИХ РОЛЬ В ПРОДУКЦИИ ОРГАНИЧЕСКОГО ВЕЩЕСТВА В МЕРОМИКТИЧЕСКИХ ВОДОЕМАХ Специальность 03.00.07 – микробиология автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва - 2008
Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.
доктор биологических наук
Научный консультант:
Н.В. Пименов доктор биологических наук
Официальные оппоненты:
профессор Р.Н. Ивановский доктор биологических наук Л.М. Герасименко Институт биохимии и физиологии
Ведущая организация:
микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН
Защита диссертации состоится “ 08 ” декабря 2008 года в 15 00 часов на заседании диссертационного совета Д.002.224.01 в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН по адресу:
117312, Москва, Проспект 60-летия Октября, д. 7, корп. 2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.
Автореферат разослан “ ” ноября 2008 года
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Т.В. Хижняк Актуальность работы. К настоящему времени накоплено много данных, касающихся геохимической деятельности, физиологии и распространения аноксигенных фототрофных бактерий в водоемах (Горленко, 1977;
Кондратьева, 1996;
Van Gemerden and Mas, 1995;
Overmann, 1997;
Imhoff, 2003, 2005). Места массового обитания фототрофных бактерий обычно делят на три типа: термальные источники, мелководные (соленые и пресные) водоемы, стратифицированные водоемы (Горленко, 1981). Однако, в небольших количествах аноксигенные фототрофные бактерии присутствуют практически во всех водоемах, а также в затопляемых почвах.
Широкое распространение фототрофных серобактерий обусловлено возможностью использовать при фотосинтезе сероводород в качестве донора водорода. Эта физиологическая особенность позволяет пурпурным и зеленым серобактериям занять особую экологическую нишу в меромиктических водоемах, имеющих анаэробную зону, доступную солнечному свету. Первичная продукция фототрофных серобактерий может быть весьма значительной, и при активном росте в водоемах биомасса этих бактерии становится пищей для амеб, ряда ракообразных и других беспозвоночных животных. Несерные пурпурные бактерии, которые не используют сероводород или используют, но имеют при этом низкую скорость роста, никогда не развиваются в значительном количестве.
Фототрофные серобактерии обладают также альтернативными путями обмена, которые служат у них средством для переживания неблагоприятных периодов существования.
Большинство предыдущих исследований базировалось на морфо физиологическом определении видов выделенных аноксигенных фототрофных бактерий (Горленко, 1977;
Кондратьева, 1996;
Van Gemerden and Mas, 1995). Однако с развитием молекулярно-биологических методов морфо-физиологической идентификации оказалось недостаточно для установления видовой принадлежности микроорганизмов. Поэтому на сегодняшний день требуется ревизия большинства видов фототрофных бактерий, выделенных в 70–80 годы прошлого столетия из различных меромиктических водоемов, с целью установления их филогенетического положения. Мало изученными остаются также сезонная изменчивость структуры и активность сообществ аноксигенных фототрофных бактерий в меромиктических водоемах различных типов.
На чистых культурах фототрофных и хемолитотрофных бактерий показан эффект фракционирования углерода, что приводит к некоторому облегчению образующейся биомассы бактерий по сравнению с используемой углекислотой (Wong, Sackett, 1975;
Бондарь и др., 1976;
Qandt et al., 1977;
Zyakun et al., 1977;
Зякун и др., 1996, 1998;
Зякун, Ивановский, 2000;
Ладыгина, 2003). Поэтому изотопный состав органического углерода взвеси и углекислоты может быть хорошим индикатором зоны развития фототрофных и/или хемолитотрофных бактерий в природных сообществах.
Вместе с тем до сих пор в литературе известны лишь единичные данные о закономерностях фракционирования изотопов углерода микробным сообществом, развивающимся на границе окисленных и восстановленных вод в меромиктических водоемах. В частности, имеются сведения об изменении изотопного состава органического углерода взвеси в водной толще Черного моря вблизи хемоклина (Иванов и др., 2000), в меромиктическом оз. Могильное (Иванов, 2001), в соленом меромиктическом оз. Кейки (Kaiike) в Японии (Ohkouchi N. et al, 2003, 2005), а также в пресном меромиктическом оз. Каданьо (Cadagno) в Швейцарии (Camacho еt al., 2001). Поэтому представляет интерес исследование эффекта фракционирования изотопов углерода в зоне массового развития фототрофных бактерий в меромиктических водоемах в сочетании с лабораторным изучением особенностей фракционирования на чистых культурах фототрофных бактерий.
Цели и задачи работы. Целью настоящей работы было исследование биоразнообразия аноксигенных фототрофных бактерий и их роли в продукции органического вещества в меромиктических водоемах. В задачи входило:
1. Количественная оценка вклада аноксигенных фототрофных бактерий в продукцию органического вещества в меромиктических водоемах.
2. Выделение чистых культур аноксигенных фототрофных бактерий и их идентификация с использованием микробиологических и молекулярных методов.
3. Проведение сравнительных сезонных исследований структуры и активности сообществ аноксигенных фототрофных бактерий.
4. Определение эффектов фракционирования стабильных изотопов углерода сообществом аноксигенных фототрофных бактерий в меромиктических озерах различных типов.
5. Изучение особенностей фракционирования стабильных изотопов углерода чистыми и монокультурами аноксигенных фототрофных бактерий в лабораторных условиях.
Принятые сокращения и обозначения. АФБ – аноксигенные фототрофные бактерии, Бхл – бактериохлорофилл, ЗБ – зеленые бактерии, ЗСБ – зеленые серобактерии, ОВ – органическое вещество, ПБ – пурпурные бактерии, ПНБ – пурпурные несерные бактерии, ПСБ – пурпурные серобактерии, РБФ(К) – рибулозобифосфат(карбоксилаза), редокс-зона (хемоклин) – зона одновременного присутствия кислорода и сероводорода, СБ – серобактерии, ФБ – фототрофные бактерии, ФЕП – фосфоенолпируват, ФСБ – фототрофные серобактерии.
Научная новизна. Впервые проведены исследования сообществ АФБ озер Шира и Шунет (Хакасия), определена их структура и биологическая продуктивность, описаны сезонные изменения, а также проведен филогенетический анализ выделенных АФБ. Также впервые проведен филогенетический анализ выделенных АФБ из озер Могильное и Гек-Гёль.
Показано, что сообщества АФБ, развивающиеся на границе окисленных и восстановленных вод являются динамичными системами, видовой состав которых изменяется в зависимости от сезона.
Из исследованных озер выделено 16 штаммов АФБ, 2 из которых являются новыми родами ПНБ, а 6 – новыми видами уже известных родов АФБ.
На примере озер с разной степенью трофии установлено, что измерение изотопного состава органического и минерального углерода дает представление о локализации и масштабах продукции ОВ сообществом АФБ.
В ходе экспериментов с чистыми культурами выделенных АФБ показано, что фотоавтотрофный рост СБ сопровождался фракционированием изотопов углерода, представленных величиной 13С(о/оо), которую определяли по разности изотопных характеристик 13С(НСО3-) и 13С(орг). Полученные различия в величинах фракционирования изотопов углерода при фотоавтотрофном росте исследованных культур определяются различиями в путях фиксации углекислоты у ПСБ и ЗСБ, что согласуется с данными предыдущих исследований (Бондарь и др, 1976;
Wong, Sackett, 1975;
Бондарь и др, 1976;
Quandt et al., 1977).
Практическая ценность работы. Исследованные меромиктические водоемы являются уникальными природными экосистемами, требующими бережного отношения. АФБ, развивающиеся в хемоклине меромиктических водоемов, являются естественным биологическим фильтром, препятствующим проникновению сероводорода в верхние слои озер, и тем самым сохраняют баланс между аэробными и анаэробными водами. Проведенные микробиологические и изотопно-геохимические исследования структуры и активности сообществ АФБ позволяют выявить сезонные, физико-химические и другие факторы, определяющие динамику развития и изменчивость аноксигенных фототрофных бактерий в водоемах. Полученные данные являются необходимой базой для дальнейших мониторинговых исследований этих уникальных экосистем, а также будут необходимы при выработке эффективных мер по сохранению этих природных объектов в случае их деградации.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на: 8-й Международной конференции по соленым озерам (Жемчужный, Хакасия, 2002), на 4-й и 5-й Международных конференциях “Водные экосистемы и организмы” (Москва, 2003, 2004), на Всероссийской конференции “Биоразнообразие и функционирование микробных сообществ водных и наземных систем центральной Азии” (Улан-Удэ, 2003);
на 2-ом Байкальском микробиологическом Симпозиуме с международным участием (Иркутск, 2007).
Объем работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора и экспериментальной части, включающей 3 главы, заключения и выводов, изложенных на страницах печатного текста и включает. таблиц и рисунков, а также список литературы из..
наименований, из них на русском и на английском языке.
Место проведения работы. Работа проведена в Учреждении Российской академии наук Институте микробиологии им. С.Н.
Виноградского РАН, в лаборатории микробиологии и биогеохимии водоемов.
Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю д.б.н. Н.В. Пименову, а также д.б.н. В.М. Горленко, д.б.н.
А.М. Зякуну и академику М.В. Иванову за внимание, заинтересованность и неоценимую помощь при проведении работы, при обсуждении результатов и при подготовке рукописи диссертации. Хочется горячо поблагодарить к.б.н.
И.А. Брянцеву, и Т.С. Прусакову за большое непосредственное участие в ходе работы, к.б.н. Е.С. Баринову, к.б.н. Н.Е. Сузину за получение замечательных микрофотографий, к.б.н. В.Н. Акимова за помощь в проведении филогенетических исследований, к.ф-м.н. Д.Ю. Рогозина за помощь в отборе проб, а также сотрудников лаборатории микробиологии и биогеохимии водоемов С.К. Юсупова, Е.Е. Захарову принимавших активное участие на отдельных этапах отбора проб, к.б.н. И.И. Русанова, к.б.н. А.С.
Саввичева, к.б.н. А.М. Лысенко за большую личную поддержку. Искреннюю признательность автор выражает всем сотрудникам лаборатории экологии и геохимической деятельности микроорганизмов за предоставление технической базы, помощь в освоении методик и содействие в процессе работы.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектами исследования являлись сообщества АФБ 4-х меромиктических озер. Отбор проб воды производили из глубоководных котловин в озерах Могильное (15.5 м), Шунет (6–6.5 м), Шира (22–23 м), Гек-Гёль (93 м). Использовали 0.75 л. пластиковый горизонтальный батометр, 1л. стеклянный батометр, многошприцовый стратификационный батометр с гидравлическим управлением.
Методы. В озерах Шунет, Шира вертикальные профили температуры, солености и pH определяли с помощью погружного многоканального зонда Data-Sonde 4a (“Hydrolab”, США). В других водоемах для определения температуры и pH использовали портативный потенциометр «рН 320/Set-1» (WTW, Германия). Содержание ионов Сl- и SO42- определяли на ионном хроматографе (“Biotronik”, Германия). Концентрацию кислорода и сероводорода измеряли сразу после отбора проб с использованием тест наборов Aquamerck (“Merck”, Германия). Общую численность микроорганизмов определяли на поликарбонатных мембранных фильтрах с диаметром пор 0.2 мкм флуоресцентным методом с использованием диамидино-4’,6-фенил-2-индол (ДАФИ) в качестве красителя (Huber et al., 1985). Подсчет бактериальных клеток проводили в люминесцентном микроскопе ЛЮМАМ-3, а для оз. Гек-Гёль – на эпифлуоресцентном микроскопе (“Zeiss”, Германия). Измерение скорости фотосинтеза проводили радиоизотопным методом с использованием 14C-бикарбоната (Иванов и др. 2001), активность просчитывали на сцинтилляционном счетчике Rackbeta-1219 (“LKB”, Швеция). Содержание Бхл в воде озер определяли на мембранных капроновых фильтрах с диаметром пор 0.2 мкм, через которые фильтровали 10–350 мл озерной воды. Спектры поглощения экстрактов пигментов в ацетон-метаноловой смеси (7:2) снимали на спектрофотометре ЛОМО СФ 56 (Санкт-Петербург) в диапазоне длин волн 350–1100 нм. Содержание пигментов вычисляли по следующим формулам (Хромов. Семин, 1975):
С (мкг Бхл a / л) = 1/k · (D770 – D850) · (V экстракта (мл) / v пробы (л)) 1000, С (мкг Бхл d / л) = 1/k · (D654 – D850) · (V экстракта (мл) / v пробы (л)) 1000, С (мкг Бхл e / л) = 1/k · (D654 – D850) · (V экстракта (мл) / v пробы (л)) 1000, где С – концентрация Бхл;
k – абсорбционный коэффициент;
D – оптическая плотность экстракта, измеренная при длине волны 654 нм или 770 нм в кювете шириной 1 см;
V, v – объем экстракта или пробы. Использовали следующие абсорбционные коэффициенты: для Бхл а k = 46.1 л г-1 см- (Smith, Benitez, 1955), для Бхл d и Бхл е k = 98.0 л г-1·см-1 (Montesinos et al., 1983).
Использованные питательные среды представлены в таб. 1 (г/л дистиллированной воды). Для получения всех накопительных культур АФБ, пробы воды в полевых условиях высевали в герметично закрытые стеклянные пенициллиновые флаконы объемом 30 мл. с помощью стерильных шприцов. Для определения численности АФБ в оз. Шира и Шунет проводили посев серии разведений проб воды в пробирки на агаризованную (0.5%) среду для СБ с последующим подсчетом выросших в каждом разведении колоний (Руководство…, 1995). Культивировали анаэробно при освещенности 2000 лк и температуре 20–25оС. Производили количественный учет окрашенных колоний разного типа, выросших в каждом разведении. При идентификации микроорганизмов руководствовались морфо-физиологическими признаками. Численность клеток АФБ в оз. Шунет в авг. 2003 г. была рассчитана по содержанию Бхл в клетках, исходя из данных по числу клеток и содержанию в них Бхл в июле 2002 г. Выделение и очистка культур достигались методом предельных разведений природного материала с использованием агаризованных (0.5%) сред. Пигментный состав полученных культур АФБ исследовали в препаратах целых клеток с глицерином (1:1) и в ацетон-метаноловых (7:2) экстрактах биомассы бактерий. Определение оптимальных условий развития бактерий включало измерение биомассы бактерий, выращенных в градиенте исследуемого фактора. Урожай клеток учитывали по относительному ТАБЛИЦА 1. Среды, использованные в процессе работы.
Могиль Шунет Шира Гек-Гёль эксперименты ное выделен.
выделен. выделен. выделен. выделенные штаммы культи- культиви- E. sha культи АФБ и АФБ и АФБ и АФБ (и рование poshni вирова- вирова культиви культиви- культиви- культиви- Mog 1 ShAm01 ShNPel ПНБ kovii ние ПНБ ние ПНБ ров. СБ) ров. СБ ров. СБ ров. СБ КН2РО4 0.5 0.25 0.7 0.7 0.33 0.33 0.7 0.7 0.7 0. 0. 20 (5– для NaCl 5.3 2.65 20 20 0.33 0.33 20 10 20 5. разных СБ) MgSO4•7H2O 0.5 0.5 0.25 0.5 0.5 0.33 0.33 0.5 0.5 0.5 0. NH4Cl 0.7 0.7 0.35 0.7 0.7 0.33 0.33 0.7 0.7 0.7 0. KCl 0.33 0.33 0.17 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33 0. Na2SO4 - 21 10.5 - - - - - - MgCl2· 7H2O - 4.3 2.15 - - - - - - - 4. NaHCO3 1.5 1 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 10 10 10 CaCl2 · 6H2O 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.01 0.01 0.1 0.1 0.1 0. 1 (только Na2S2O3· 5H2O для 1 1 1 1 - 1 4 1.4 2 ПСБ) см в Na2S•9H2O 0.7 (0.5) 0.5 0.05 0.5 0.05 0.5 0.1 0.2 0.2 тексте.
Ацетат Na · 0.5 0.5 2 0.5 2 (0.5) 0.5 - - - 3H2O Пируват Na 0.5 0.5 2 0.5 2 - - - - - Дрожжевой 0.1 0.1 0.2 0.1 0.2 (0.1) 0.1 - - - экстракт для ЗСБ – pH (Na2CO3 Не устанавливался во избежание 6.8, для 6.8–7 7 7 7 (6.8) или HCl) разложения бикарбоната ПСБ – 7. Во все среды добавляли витамин В12 – 20 мкг/л;
раствор микроэлементов – 1 мл (Pfennig, 1965). Добавки в виде стерильных растворов вносили в готовые стерильные среды непосредственно перед посевом.
количеству Бхл в стационарной фазе роста, когда элементная сера отсутствовала в среде и в клетках. Морфологию бактерий изучали в световом микроскопе с фазовым контрастом, а также под электронным микроскопом JEM-100B (JEOL, Япония) при ускоряющем напряжении 80 или 90 кВ.
Тонкое строение клеток исследовали на срезах (Reynolds, 1963).
Выделение ДНК проводили по методике, описанной ранее (Sambrook et.al., 1989). Амплификацию генов 16S рРНК осуществляли с универсальными праймерами 27f и 1525r на приборе GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems). Секвенирование амплифицированного фрагмента 16S рДНК (1257–1414 п.н.) проводили на автоматическом секвенаторе ДНК CEQ2000XL (Beckman Coulter) с использованием набора реагентов Dye Terminator Cycle Sequencing (Beckman Coulter) и прилагаемого протокола.
Для выравнивания нуклеотидных последовательностей генов 16S рДНК использовали программу ClustalX (Thompson et. al., 1994). Построение филогенетических древ производили с помощью программы TREECON (Van de Peer, De Wachter, 1997).
Изотопный анализ проб. Образцы взвеси собирали путем фильтрации проб озерной воды через стекловолокнистые фильтры GF/F (Whatman, диаметр 47 мм). Фильтрат использовали для измерения щелочного потенциала и изотопного состава растворенного минерального углерода.
Определения изотопного состава органического углерода (13С орг.) и растворенного в воде карбонат-иона (d13CO32-) проводили на масс спектрометрах МИ-1201В (Украина) и Delta plus (Тhermo Electron Corporation, Германия) с использованием лабораторных стандартов, откалиброванных относительно углеродного стандарта PDВ.
Эксперименты по фракционированию стабильных изотопов углерода 12С и 13С АФБ. Объектами для экспериментов служили чистые культуры автотрофных ПСБ: E.shaposhnikovii (типовой штамм любезно предоставлен В.М. Горленко), Thiocapsa sp. (из оз. Могильное), штамм ShAm01 (из оз. Шира), а также монокультура ЗСБ из оз. Шунет.
Использованные среды представлены в таблице 1. Для монокультуры ЗСБ сероводород вносили по 0.1 г отдельно в каждый флакон. Схема постановки эксперимента. В пенициллиновые флаконы вносили гомогенный свежевыросший посевной материал (3 мл ПСБ, 1 мл ЗСБ), доливали средой, закупоривали, оставляя пузырек воздуха размером с горошину. Один из засеянных флаконов брали в качестве контроля и во избежание в нем роста культуры, ставили его в холодильник. Дату снятия флаконов определяли по визуальному накоплению в нем биомассы в сравнении с контрольным (или предыдущим снятым) флаконом. После снятия всех флаконов анализировали изменение показателей: массы и изотопного состава минерального углерода и углерода нерастворимого ОВ, оптической плотности ацетон-метанолового экстракта пигментов, содержание восстановленных соединений серы.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
Ниже приводятся результаты исследований 4-х меромиктических озер, а также результаты лабораторных экспериментов с выделенными культурами.
1. Озеро Могильное – солоноватый мезотрофный водоем с признаками евтрофии.
Физико-химическая характеристика. Работы на озере проводили в июне 1999 г. и сентябре 2001 г. Хемоклин располагался на глубине 8–10 м, ниже резко возрастала концентрация сероводорода (более 100 мг/л у дна).
Начиная с глубины 3 м, происходило нарастание содержания NaCl в воде озера, общая соленость у дна достигала 31 г/л. Соленость в хемоклине в июне составляла 29 г/л, в сентябре – 10–14 г/л. Значения pH на разных глубинах в июне изменялись в пределах 6.5–7.5, в сен. 7–8.5.
Пик численности микроорганизмов был приурочен к зоне хемоклина. В июне общая численность микроорганизмов в зоне хемоклина составляла от 18 до 26105кл/мл, в сен. – 16–18105кл/мл. Наибольшие скорости фиксации углекислоты были отмечены на нижней границе хемоклина. Интенсивность фотосинтеза в июне составляла 812 мкг С/л день, а в сен. 440 мкг С/л день.
Анализ проб воды на содержание пигментов показал наличие в этой зоне значительного количества Бхл е (~4600 мкг/л в июне, 3400 мкг/л в сен.) и отсутствие Бхл а.
При микроскопировании в пробах воды хемоклина были обнаружены только ЗСБ, однако анализ накопительных культур АФБ показал присутствие и ПСБ (таб. 2).
ТАБЛИЦА 2. Аноксигенные фототрофные бактерии из проб воды хемоклина оз.
Могильное.
Выде Выделенные виды Фотосинтетические ленный серобактерий пигменты штамм Chlorobium Доминирующий - Бхл е, phaeovibrioides вид каротиноид Pelodictyon phaeum изорениератин Субдоминирующие Июнь, - Prosthecochloris виды phaeoasteroidea Бхл а, каротиноиды Минорные виды спириллоксантиновой Mog 1 Thiocapsa sp.
(выделены из серии единичных Бхл а, каротиноиды колоний) Mog 2 Thiorhodococcus sp.
рдопинальной серии Chlorobium Бхл е, каротиноид Доминирующий Mog Сентябрь, phaeovibrioides изорениератин вид Субдоминирующие виды Минорный вид Бхл а, каротиноиды (многочисленные Mog 3 Thiocystis gelatinosa океноновой серии колонии) - Видовые и родовые названия приведены с учетом данных анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК.
Сообщество АФБ. В оба сезона доминировал морфотип Chlorobium phaeovibrioides что подтвердило результаты исследований Горленко (Горленко, 1977). Штамм Mog4, выделенный в сен. с глубины 10.25 м имеет 99% сходства с типовым штаммом (рис. 1).
1а 1б Thiocapsa pendens (AJ002797) 0.02 100 Mog 4 (EF149015) 0. 99 Thiocapsa litoralis (AJ242772) 95 Chlorobium phaeovibrioides (Y08105) Thiocapsa roseopersicina (AF112998) 100 74 94 Chlorobium luteolum (Y08107) Mog 1 (EF149012) Thiocapsa rosea (AJ002798) Chlorobium limicola (Y10113) Thiolamprovum pedioforme (Y12297) Chlorobium clathratiforme (Y08108) Thiobaca trueperi (AJ404006) Chlorobaculum parvum (Y10647) Thiocystis violacea (Y11315) 100 Chlorobaculum limnaeum (AJ290831) Thiocystis minor (Y12372) 89 Thiocystis violascens (AJ224438) Prostecochloris vibrioformis (M62791) Mog 3 (EF1490114) РИСУНОК 1. Филогенетичекие древа пред Thiocystis gelatinosa (Y11317) ставителей семейств Chromatiaceae (рис. 1а) и Mog 2 (EF149013) Chlorobiaceae (рис. 1б), показывающие поло 88 Thiorhodococcus minor (Y11316) жение штаммов Mog 1, Mog 2, Mog 3 и Mog 4.
Thiohalocapsa halophila (AJ002796) “Оutgroup”-организмы рис. 1а – Nitrosococcus Thiococcus pfennigii (Y12373) nitrosus, рис. 1б – Chloroherpeton thalassium.
Было показано, что минорный компонент сообщества, представленный ПСБ, менялся. Весной на глубине 9–10 м были выявлены новые виды родов Thiocapsa (штамм Mog1, 98.5% сходства с Thiocapsa roseopersicina) и Thiorhodococcus (штамм Mog2), образующий кластер с Thiorhodococcus minor c высоким значением показателя “bootstrap”-анализа – 88% и относительно низким уровнем сходства нуклеотидных последовательностей – 95.9%). В сентябре минорным видом являлся выделенный с глубины 10.25 м Thiocystis gelatinosa (штамм Mog3, 99.9% сходства с типовым штаммом).
2. Озеро Шира – солоноватый мезотрофный водоем с признаками олиготрофии.
Физико-химическая характеристика. Работы на озере проводили в августе 2001 г., в июле 2002 г., в феврале-марте 2003 г. Редокс-зона была на глубине 11–13 м (в июле), 13–13.5 м (в авг.), 15–15.5 м (зимой).
Концентрация сероводорода у дна во все периоды исследований составляла 12–15 мг/л. Соленость воды в хемоклине составляла 14–14.5 г/л, у дна 15– г/л;
среди анионов преобладал SO42-. Летом pH воды в редокс-зоне был в пределах 8.5–9, зимой 8–8.2. Во все периоды исследований, начиная с верхней части сероводородной зоны водной толщи, присутствовал слабо выраженный слой воды, в котором развивались преимущественно ПСБ, летом их максимум был на глубине 12–14 м, а зимой на глубине 15–16.5 м.
Максимальное содержание Бхл а в озерной воде составляло 30.6 мкг/л (14 м, авг.), зимой содержание пигмента уменьшалось до 8.9 мкг/л (15 м). Летом интенсивность световой СО2-ассимиляции в зоне максимума АФБ составляла 56.7–81.5 мкг С/(лсут), а зимой – 15.2 мкг С/(лсут).
Сообщество АФБ. Доминирующими бактериями в сообществе АФБ оз.
Шира во все сезоны исследований оказались окенон-содержащие ПСБ с газовыми вакуолями, которые по морфологии и пигментному составу более всего напоминают Lamprocystis purpurea. Их численность летом составляла 2105 – 6105 кл/мл (12–15 м), зимой 1.65104 кл/мл (15 м), 5.5103 – 6. (15.5–16.5 м). Тем не менее, выделенный штамм ShAm01 оказался филогенетически близок к типовым спириллоксантин-содержащим штаммам Thiocapsa roseopersicina (98.6% сходства), Tca. pendens, Tca. litoralis и Tca.
rosea (97.1–94.4% сходства) (рис. 2).
2а 2в 0.02 Thiocapsa litoralis (AJ242772) 0. Rhodovulum robiginosum (Y15012) Thiocapsa pendens (AJ002797) Rhodovulum adriaticum (D16418) 78 Rhodovulum iodinosum (Y15011) Thiocapsa rosea (J002798) Rhodovulum sulfidophilum (D16423) ShNAm02 (EF153289) 100 Rhodovulum euryhalinum (D16426) ShAm01 (EF153293) ShRb01 (EF153294) Thiocapsa roseopersicina (AF113000) Rhodovulum strictum (D16419) Thiocapsa marina (Y12301) Albidovulum inexpectatum (AF465833) Lamprocystis purpurea (AJ223235) 100 Rhodobacter azotoformans (D70846) Lamprocystis roseopersicina (AJ006063) Rhodobacter capsulatus (D16428) Thiobaca trueperi (AJ404006) Rhodobacter blasticus (D16429) Roseinatronobacter thiooxidans (AF249749) Allochromatium vinosum (M26629) Sulfitobacter pontiacus (Y13155) Thiorhodovibrio winogradskyi (AJ006214) Octadecabacter arcticus (U73725) Thiorhodococcus minor (X84316) ShRb02 (EF153295) Thioflavicoccus mobilis (AJ010125) Ahrensia kielensis (D88524) Thiococcus pfennigii (Y12373) Roseibium denhamense (D85832) Thiohalocapsa halophila (AJ002796) Stappia stellulata (D88525) Halochromatium glycolicum (X93472) 83 Pannonibacter phragmetitetus (AJ400704) Halochromatium salexigens (X98597) РИСУНОК 2. Филогенетические 2б 0. древа представителей семейства ShCl03 (EF153291) Chromatiaceae (рис. 2а), Chlorobiaceae (рис. 2б), и Rhodobacteraceae(рис. 2в), Chlorobium limicola (Y10113) показывающие положение штаммов Chlorobium clathratiforme (Y08108) ShAm01 и ShNAm02, ShCl03, ShRb01 и Chlorobium phaeovibrioides (Y08105) ShRb02. “Оutgroup”-организмы рис. 2а – Nitrosococcus nitrosus, Chlorobium luteolum (Y08107) рис. 2б – Chloroherpeton thalassium.
Chlorobaculum parvum (Y10647) рис. 2в – Rhodothalassium salexigens.
Chlorobaculum limnaeum (AJ290831) Prostecochloris vibrioformis (M62791) На сегодняшний день известен только один окенон-содержащий вид рода Thiocapsa – Tca. marina, он не содержит газовых вакуолей и филогенетически близок к типовым штаммам Tca. pendens и Tca. litoralis. Таким образом, штамм ShAm01 относится к роду Thiocapsa, однако его видовой статус требует дальнейшего уточнения.
Летом с глубины 13.5–15 м были выделены минорные ПНБ, их численность не превышала 1103 кл/мл. В 2001 г. минорными были Rhodovulum strictum (штамм ShRb01 имеет 98.3% сходства с типовым штаммом), и Rhodomicrobium vannieli (штамм ShRmc01 имеет 99.7% сходства с типовым штаммом), в 2002 г. – сфероиденсодержащие ПНБ (штамм ShRb02), имеющие 93.9% сходства с типовым штаммом Ahrensia kielensis (ранее Agrobacterium kielensis), и, очевидно, являющиеся новым родом.
Зимой на глубине 16 м в незначительном количестве были найдены ЗСБ Chlorobium limicola (штамм ShCl03 имеет 98.7% сходства с типовым штаммом).
3. Озеро Шунет – соленый евтрофный водоем.
Физико-химическая характеристика. Работы на озере проводили в июле 2002 г., в феврале–марте 2003 г. и в августе 2003 г. В 2003 г. для пробоотбора использовали специально разработанный многошприцовый стратификационный батометр, что позволило отбирать пробы воды с интервалом 5 см по глубине, не нарушая структуру слоев. В связи со значительным сходством гидрохимических данных летних сезонов, приводим только данные августа 2003 г.
В августе кислородная зона заканчивалась на глубине 4.93 м, в то время как сероводород появлялся лишь на глубине 5.18 м, ширина редокс-зоны составляла 0.25 м. Соленость резко возрастала с 15 г/л на 3.5 м до 65 г/л у дна и в хемоклине составляла 47 г/л, в воде преобладали анионы SO42-. pH воды сразу под редокс-зоной резко изменялся от 8.3–8.6 до 7.3–7.6. На глубине 5.33 м был выявлен пик фотосинтеза 1679 мкг С/(лдень), совпадающий с пиками содержания Бхл в озере.
Сообщество АФБ. Было обнаружено, что верхний 5-сантиметровый слой зоны массового развития АФБ окрашен в розовый цвет, за счет присутствия здесь большого количества ПСБ, в то время как нижерасположенные слои были окрашены в темно-зеленый цвет за счет развития ЗСБ. Пик численности АФБ находился на глубине 5.33 м (на 15 см ниже редокс-зоны) и был приурочен к слою розово окрашенной воды.
Ранее, в июле 2002 г., из проб воды этой зоны (5 м) были выделены в чистую культуру доминирующие ЗСБ (штамм ShNPel02) и ПСБ штамм ShNAm02.
Штамм ShNPel02, вероятно, является новым видом, поскольку филогенетически имеет 99.6% сходства с Prostecochloris vibrioformis (рис. 3), но в отличие от последнего содержит газовые вакуоли, и по совокупности морфологических свойств и пигментному составу более всего напоминает Chlorobium luteolum (ранее Pelodictyon luteolum). Штамм ShNAm02, по видимому, является новым видом, по своим морфологическим, пигментным и филогенетическим характеристикам он оказался наиболее похожим на штамм ShAm01 (100% сходства по 16S рРНК), выделенный нами из оз. Шира в 2001 г., однако по некоторым морфологическим и физиологическим свойствам отличается от последнего. Штамм ShNAm02 филогенетически имеет 98.7% сходства с Thiocapsa roseopersicina и 94.8–97.3% сходства со штаммами Tca. pendens, Tca. litoralis и Tca. rosea.
0. 3а 3б 0. Thiocapsa rosea (J002798) Chlorobium phaevibrioides (Y08105) Thiocapsa litoralis (AJ242772) Chlorobium luteolum (Y08107) Thiocapsa pendens (AJ002797) Chlorobium limicola (Y10113) ShNAm02 (EF153289) 72 Chlorobium clathratiforme (Y08108) 100 Thiocapsa marina (Y12301) Chlorobaculum parvum (Y10647) Thiocapsa roseopersicina (AF113000) Chlorobaculum limnaeum (AJ290831) 80 Thiobaca trueperi (AJ404006) 100 ShNPel02 (EF149016) 100 Lamprocystis purpurea (AJ223235) Prostecochloris vibrioformis Lamprocystis roseopersicina (AJ006063) (M62791) Thioflavicoccus mobilis (AJ010125) 3в Thiococcus pfennigii (Y12373) 0. Thiorhodovibrio winogradskyi (AJ006214) 100 ShNRb02 (EF153290) Thiorhodococcus minor (X84316) Rhodovulum euryhalinum (D16426) Thiohalocapsa halophila (AJ002796) 98 Rhodovulum strictum (D16419) Halochromatium salexigens (X98597) ShNLb02 EF153292) Rhodovulum sulfidophilum (D16423) Halochromatium glycolicum (X93472) 76 Rhodovulum iodosum (Y15011) Allochromatium vinosum (M26629) Rhodovulum adriaticum (D16418) Rhodovulum robiginosum (Y15012) РИСУНОК 3. Филогенетические 100 ShNBr03 (EF154519) древа представителей семейства Chromatiaceae (рис. 3а), Chlorobiaceae Roseicyclus mahoneyensis (рис. 3б), и Rhodobacteraceae (рис. 3в), (AJ315682) Rhodobacter azotoformans (D70846) показывающие положение штаммов штаммов ShNPel02, ShNAm02 и Rhodobacter capsulatus (D16428) ShNLb02, ShNRb02 и ShNBr03. Rhodobacter blasticus (D16429) “Оutgroup”-организмы рис. 3а – Nitrosococcus nitrosus, рис. 3б – Chloroherpeton thalassium. рис. 3в –- Rubrimonas cliftonensis.
Также в июле 2002 г., из воды редокс-зоны (4.5 м) были выделены в чистые культуры минорные ПНБ Rhodovulum euryhalinum (штамм ShNRb02, 99.4% сходства с типовым по 16S рРНК) и ПСБ штамм ShNLb02. Штамм ShNLb02, возможно, является новым родом, по морфологии и пигментному составу он более всего похож на Lamprobacter modestohalophilus, а также близок к нему по содержанию Г+Ц (62.4 и 62.5 мол.%, соответственно), но филогенетически наиболее близок к типовым штаммам рода Halochromatium (уровень сходства 96.4–96.8%).
В авг. 2003 г. ЗСБ были морфологически сходными с бактериями штамма ShNPel02. Среди ПСБ встречались клетки двух морфотипов:
ShNAm02 (преобладали) и ShNLb02. Содержание Бхл а в пике развития АФБ составляло 5984 мкг/л, Бхл d – 4295 мкг/л, что соответствовало примерно 1.6108 кл/мл ПСБ и 3.2107 кл/мл ЗСБ. Нижерасположенные слои воды были зеленого цвета за счет снижения количества клеток ПСБ.
На глубине 5.43 м доминировали ЗСБ морфотипа ShNPel02. Среди ПСБ встречались оба найденных выше морфотипа, однако преобладал морфотип ShNLb02. Содержание Бхл а уменьшалось до 346 мкг/л, что соответствовало примерно 9.5106 кл/мл ПСБ;
содержание Бхл d уменьшалось до 1303 мкг/л – 9.7 106 кл/мл ЗСБ. В воде редокс-зоны (4.97 м) были обнаружены только клетки морфотипа ShNLb02 (десятки кл/мл). Также в этот сезон в воде редокс-зоны было обнаружено 5102 кл/мл мелких клеток штамма ShNBr03.
Этот штамм, очевидно, является новым видом, поскольку по совокупности морфологических свойств и пигментному составу он более всего похож на ПНБ морфотипа Rhodobacter–Rhodovulum, хотя сильно отличается от них по ряду морфофизиологических признаков и филогенетически имеет 99.5% сходства с Roseicyclus mahoneyensis (последний не является ПНБ, а принадлежит к группе аэробных бактериохлорофилл содержащих бактерий).
В зимний сезон озеро было покрыто льдом, редокс-зона находилась на глубине 4 м. Профиль солености полностью совпадал с таковым в авг. 2003 г.
Температура в верхних слоях воды опускалась до -1°С, а у дна была, как и летом, около 10°С;
галоклин начинался с глубины 4 м., pH воды под редокс зоной был 7.5–6.5. Пик фотосинтеза в зоне АФБ выявлен не был, однако вода сероводородной зоны озера, также как и в летние сезоны, была окрашена в зеленовато-болотный цвет за счет присутствия ЗСБ морфотипа ShNPel02.
ПСБ были представлены морфотипами ShNAm02 и ShNLb02. ПНБ в этот сезон нами обнаружены не были. Пик численности АФБ был на глубине 4. м (на 75 см ниже редокс-зоны), здесь содержалось 2106 кл/мл ЗСБ (0. мкг/л Бхл d), и более чем 6.7·103 кл/мл ПСБ (0.06 мкг/л Бхл а), преобладал морфотип ShNLb02. В нижерасположенных слоях воды, на глубине 5.35 м, доминировали ЗСБ (9.1105 кл/мл), а среди ПСБ преобладал морфотип ShNAm02 (3 105 кл/мл). Выше, на глубине 4.5 м, количество ПСБ морфотипа ShNAm02 и ЗСБ было одинаковым (по 7.4 104 кл/мл).
4. Озеро Гек-Гёль – пресный олиготрофный водоем.
Физико-химическая характеристика. Работы на озере проводили 12– 19 сентября 2003 г. Редокс-зона располагалась на глубине 29–30 м.
Концентрация сероводорода у дна составила 4.2 мг/л. В воде преобладали анионы SO42-, их содержание в воде редокс-зоны составляло ~50 мг/л. pH воды редокс-зоны составлял 7.0.
Развитие АФБ начиналось на глубине 29 м. На глубине 30 м находился пик численности микроорганизмов (6.11106 кл/мл), максимальное содержание Бхл е (48 мкг/л) и слабый пик световой СО2-ассимиляции (0. мкг С/(лсут)). Максимум содержания Бхл а (4.5 мкг/л) располагался несколько выше, на глубине 29 м.
Сообщество АФБ. С глубины 31 м были выделены доминирующие ЗСБ Chlorobium phaeobacteroides (штамм G-gСphb03, 99.5% сходства с типовым штаммом), что подтвердило результаты предыдущих исследований (рис. 4).
В отличие от всех предыдущих исследований с глубины 30 м был выделен минорный компонент сообщества АФБ, Бхл b содержащие ПНБ Blastochloris sulfoviridis (ранее Rhodopseudomonas sulfoviridis) (штамм G-gBlsv03, 99.1% сходства с типовым штаммом).
0. 4а 4б 0. Chlorobium phaeobacteroides (Y08104) Pedomicrobium australicum (X97693) G-gCphb03 (EF654662) 98 100 Filomicrobium fusiforme (Y14313) Chlorobium clathratiforme Hyphomicrobium (Y08108) chloromethanicum (AF198623) Chlorobium limicola (Y10113) Rhodomicrobium vannielii (M34127) Chlorobium phaeovibrioides Devosia riboflavina (D49423) (Y08105) Rhodoplanes roseus (D25313) Chlorobium luteolum (Y08107) Chlorobaculum parvum Blastochloris viridis (D25314) (Y10647) Blastochloris sulfoviridis (D86514) Chlorobaculum limnaeum (AJ290831) Prostecochloris vibrioformis G-gBlv03 (EF654663) (M62791) РИСУНОК 4. Филогенетические древа представителей семейства Chlorobiaceae и Hyphomicrobiaceae, показывающие положение штаммов G-gСphb03 и G-gBlsv03.
“Оutgroup”-организмы рис. 4а - Chloroherpeton thalassium, рис. 4б - Rhodopseudomonas palustris.
5. Закономерности сезонной динамики видов в сообществах АФБ меромиктических водоемов. Для всех штаммов выделенных из исследованных озер были определены или проанализированы (на основании данных по ближайшим родственным видам) оптимальные значения солености и pH, на основании чего было сделано обоснование степени развития каждого штамма в гидрохимических условиях озер. Показано, что видовой состав ФБ в соленых озерах более разнообразен, чем в пресном озере. В озерах Могильное и Шунет (соленость воды в хемоклине 30 г/л и г/л, соответственно) ФБ были представлены соленоводными и галотолерантными формами (из каждого озера было выделено по 5– штаммов). В сообществе оз. Шира (14.5 г/л) были соленоводные, галотолерантные и пресноводные формы ФБ (выделено 5 штаммов). Видовой состав АФБ пресного оз. Гек-Гёль был ограничен двумя пресноводными формами ФБ.
6. Продукция органического вещества сообществом АФБ в исследованных водоемах. На основании собственных и литературных данных исследованные водоемы можно отнести к различным типам по степени трофии: оз. Шунет – евтрофное, оз. Могильное – мезотрофное с признаками евтрофии, оз. Шира – мезотрофное, с признаками олиготрофии, оз. Гек-Гёль – олиготрофное (таб. 3).
В летние периоды исследований в оз. Шунет наблюдалось мощное развитие сообщества АФБ до 1679 мкг С/(л сут) на глубине 5.3 м (279 мг С/м сут). Здесь вода была окрашена в интенсивно коричневато-розовый цвет, а ниже цвет менялся на желтовато-зеленый. В феврале-марте интенсивность аноксигенного фотосинтеза снижалась до величины 20–30 мкг С/(л день), а суточная продукция органического вещества сообществом АФБ не превышала 0.13 мг С под м2. Несмотря на значительный абсолютный показатель, величина продукции АФБ летом не превышала 10% от общей продукции органического вещества в этом озере.
ТАБЛИЦА 3. Продукция органического вещества в меромиктических водоемах.
продукция продукция аноксигенного фотосинтеза домини- окисгенного сезон % от % от озеро рующие фотосинтеза мг С/ м продукции общей мг С/ м2 в АФБ в сутки оксигенного продук сутки фотосинтеза ции август 4400 279 6.3 4. ЗСБ, ПСБ февраль Шунет 110 0 - март июнь 130 620 477 Могиль ЗСБ ное сентябрь 45 290 644 86. лето 590–860 50–90 8.5–10.5 7. ПСБ Шира февраль 104 5.5 5.3 9. март ЗСБ сентябрь 14.0 0.13 0.93 0. Гек-Гёль В оз. Могильное вода хемоклина была окрашена в розовый цвет, за счет развития АФБ, причем окраска воды в июне была значительно ярче, чем в сен. Продукция аноксигенного фотосинтеза в июне 1999 г достигала величины 620 мг С/(м2 сут), в сен. 2001 г – 290 мг С/(м2 сут), что указывает на вспышку развития АФБ сразу же после таяния льда. Независимо от сезона исследований первичная продукция АФБ в 5–6 раз превышала продукцию фитопланктона в аэробной зоне, что характеризует оз. Могильное среди меромиктических водоемов как уникальное.
В оз. Шира вода зоны хемоклина в летний период была окрашена в слабо розовый цвет. Зимой окраска воды не наблюдалось. Продукция АФБ в летний период варьировала от 50–до 90 мг С/(м2 сут.), а зимой снижалась до 5.5 мг С/(м2 сут). Во все периоды исследований основная доля первичной продукции (до 90–95%) принадлежала фитопланктону, развивающемуся в эпилимнионе.
В оз. Гек-Гёль сообщество АФБ было выражено слабо. Развитие АФБ лимитировалось светом и сероводородом. Вода хемоклина была прозрачной.
Продукция аноксигенного фотосинтеза составляла 0.13 мг С/(м2 сут), что представляло 0.9% от суммарного оксигенного фотосинтеза.
Таким образом, во всех исследованных озерах продукция АФБ в теплое время года составляла не более 10% от общей продукции водоема, за исключением оз. Могильное, где аналогично исследованиям Горленко (Gorlenko et. al., 1978) продукция АФБ значительно превышала продукцию оксигенного фитопланктона.
7. Фракционирование изотопов углерода в процессе ассимиляции соединений неорганического углерода в водоемах. Известно, что в процессе фотосинтеза в водоемах происходит фракционирование изотопов углерода, что приводит к некоторому облегчению образующегося ОВ по сравнению с используемыми соединениями неорганического углерода.
Обычно изотопный состав углерода биомассы водорослей обеднен изотопом С относительно минерального углерода в интервале значений -15-20 о/оо (Descolas-Gros, Fontugne M., 1990).
В меромиктических водоемах, наряду с оксигенным фотосинтезом, АФБ могут вносить существенный вклад в суммарную продукцию ОВ за счет массового развития в верхней части сероводородной зоны.
Во всех исследованных нами озерах с пиком фотосинтеза АФБ был ассоциирован пик легкого углерода органической взвеси, что говорит об активности микробного сообщества в этой зоне (рис. 5).
РИСУНОК 5. Фотосинтез и изотопный состав углерода органической взвеси в толще воды исследованных меромиктических озер.
Озеро Шира, июль Озеро Могильное, сен. 2001 глубина, м 0 d13Сорг взвеси Фотосинтез глубина, м хемоклин 6 8 хемоклин d13Сорг взвеси Фотосинтез 14 16 / -34 -32 -30 -28 -26 /00 -29 -28 -27 - 0 50 100 150 200 250 300 0 20 40 60 80 мкг С/(л сут) мкг С/(л сут) Озеро Гек-Гёль, сен. 2003 Озеро Шунет, август 4, d13Сорг взвеси глубина, м 4, глубина, м 4, Фотосинтез 20 хемоклин хемоклин 5, 5, 40 5, 50 5, Фотосинтез 5, d13Сорг взвеси 5, 70 5, 0 /00 / -39 -37 -35 -33 -31 -29 -27 -25 -29 -28 -28 -28 -28 -27 -27 -27 -27 -26 - 0 400 800 1200 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 мкг С/ (л сут) мкг С/ (л сут) На озерах Могильное и Шунет эти пики не совпадают, пик легкой биомассы находится несколько выше пика фотосинтеза. По-видимому это связано с тем, что скорость фракционирования изотопов углерода наиболее высока при минимальной скорости их роста, что было показано на примере сульфатредуцирующих бактерий (Harrison, Thode, 1958) и метанобразующих архей (Zyakun, 1996).
Эффект фракционирования изотопов углерода (разница между изотопным составом органического и минерального углерода) в оз. Гек-Гёль составляет 24.25–28.05 о/оо, в оз. Шира – 25.1–25.9 о/оо, в оз. Шунет – 12.4– 26.1 о/оо, в оз. Могильное – 14.1–23.6 о/оо. Наибольший эффект фракционирования отмечен в озерах Гек-Гёль и Шира, где условия олиготрофные или близкие к олиготрофии и развитие АФБ происходит в условиях ограниченного освещения, низкого доступа сероводорода и низких температур. Эти факторы затрудняют активный рост и размножение АФБ в зоне хемоклина, результатом чего является низкая продукция аноксигенного фотосинтеза, что и способствует потреблению клетками АФБ преимущественно легкого неорганического углерода представленного в воде озер растворенным CO2 или бикарбонат-ионом.
В оз. Шунет наибольшие значения ТАБЛИЦА 4. Общая характеристика фракционирования 26.10/00 наблюдаются зоны хемоклина оз. Шунет, авг. 2003.
=(13Сорг в зоне, где рост ПСБ сильно затруднен H2S, Слой недостатком сероводорода (табл. 4). В глубина О2 мг/л - 0Смин), АФБ / зоне максимального развития ПСБ 0 12. 4.88 0. эффект фракционирования снижается до 4.93 0 0 17. 23.4 о/оо, а еще ниже, в зоне макси 4.97 0 0 21.2 ПНБ мального развития ЗСБ – до 12 о/оо.
5.18 0 0 25. В оз. Могильное наблюдаются еще 5.23 0 0 26. более низкие значения фракциони 5.28 0 0 24. рования, что связано с высокой 5.33 0 93 23.4 ПСБ скоростью роста АФБ (о чем также 5.38 0 146 14. свидетельствует большая продукция 5.43 0 220 12.4 ЗСБ аноксигенного фотосинтеза), а также 5.48 0 286 12. тем, что представлены они преиму щественно ЗСБ.
Изучение факторов, определяющих фракционирование изотопов углерода у АФБ при образовании первичной продукции, может быть ключом в понимании механизма потребления и продукции углерода в меромиктических водоемах.
Ранее на чистых культурах АФБ было установлено, что в зависимости от пути фиксации углекислоты, наблюдается разный эффект фракционирования изотопов углерода, выражающийся в преимущественном включении 12С в биомассу бактерий. Величины фракционирования изотопов углерода для ПБ семейств Chromatiaceae и Ectothiorhodospiraceae реализующих преимущественно рибулозобифосфатный путь фиксации CO2 в цикле Кальвина составляют -30 -32 о/оо;
для ЗБ семейств Сhlorobiaceae и Сhloroflexaceae, фиксирующих углекислоту, главным образом, в виде НСО3 с помощью фосфоенолпируват карбоксилазы – только -19-22 о/оо (Waygood et. al., 1969;
Cooper, Wood, 1971;
Kondratieva, 1979;
Holo, 1989;
Ivanovsky et.
al., 1993, 1999;
Уголькова, Ивановский, 2000).
8. Результаты экспериментов по фракционированию изотопов углерода 12С и 13С выделенными АФБ. Для экспериментов по фракционированию изотопов углерода 12С и 13С нами были взяты чистые культуры ПСБ: Ectothiorodospira shaposhnikovii (типовой штамм любезно предоставлен В.М. Горленко), Thiocapsa sp. штамм Mog 1, выделенный из оз.
Могильное;
Lamprocystis sp. штамм ShAm01, а также монокультура ЗСБ Prosthecochloris sp. штамм ShNPel02, выделенный из оз. Шунет.
Для всех культур АФБ в течение первых 4–6 сут. роста (лаг-период) отмечены низкие скорости роста оптической плотности по Бхл, далее следовал их резкий рост, который рассматривается как свидетельство экспоненциальной стадии развития бактерий (табл. 5). С ростом оптической плотности по Бхл увеличивалось количество углерода органической взвеси, и непрерывно снижались концентрации восстановленных соединений серы и бикарбоната (табл. 4).
По мере потребления углекислоты, в среде отмечено увеличение относительного содержания 13С изотопа в оставшейся ее части (табл. 5).
Значительные изменения величин 13С, определяемых по разности изотопных характеристик 13С(НСО3-) и 13С(орг), для ПСБ отмечены в течение первых 4–6 сут. роста (лаг-период) (рис. 6). В течение последующего экспоненциального роста (6–13 сут.) величины 13С стабилизировались на уровне 25–35 о/оо, что является характерным для фракционирования изотопов углерода ПСБ, осуществляющими фиксацию углекислоты на РБФ с участием РБФК (Бондарь и др., 1976;
Wong, Sackett, 1975). При культивировании ЗСБ не обнаружено изменения величины 13С при увеличении скорости роста клеток, 13С составляла ~19 о/оо и практически не изменялась в течение суток роста. Полученное значение 13С является характерным для ЗСБ, реализующих фиксацию углерода на ФЕП с участием ФЕП-карбоксилазы (Бондарь и др., 1976;
Quandt et al, 1977).
Таким образом, из рассмотрения экспериментальных данных по фракционированию изотопов углерода при фотоавтотрофном росте ПСБ и ЗСБ следует, что величина 13С не всегда отражает особенности биохимического механизма фиксации углекислоты при бактериальном фотосинтезе: изотопные характеристики углерода биомассы пурпурных бактерий при низких скоростях их роста могут иметь близкие значения с изотопными характеристиками биомассы зеленых серных бактерий.
Различия в особенностях фиксации углекислоты, оцениваемые по изменению 13С, в наших экспериментах надежно проявлялись лишь при высоких скоростях роста бактерий, что противоречит данным изотопных исследований в озерах.
ТАБЛИЦА 5. Изменение ростовых характеристик АФБ и физико-химических параметров среды, полученные в процессе проведения экспериментов по фракционированию стабильных изотопов углерода.
13С, ‰ Оптичес С орг.
- Время, [S ] С [НСО3 ] кая плот взвеси, ‰ С орг.
сутки ность (Бхл., мг S/мл мг/мл С мин.
мг С/мл взвеси отн. ед.) Ectothiorhodospira shaposhnikovii 0* - 0.289 0.0194 1.414 -11.7 -8.5 16. 3 0.005 0.286 0.003 1.414 -20.3 -5.3 15. 5 0.030 0.275 0.052 1.341 -23.6 -2.1 21. 8 0.056 0.241 0.083 1.131 -25.6 0.5 26. 9 0.066 0.150 0.154 1.105 -25.7 2.3 28. 13 0.185 0.041 0.350 1.059 -25.9 6.1 32. 15 0.168 0.00 - 0.842 -26.0 8.3 34. Lamprocystis purpurea штамм ShAm01, оз.Шира 0* 0 0.1156 0.1044 1.151 -25.3 -6.0 14. 4 0.004 0.0952 0.45 1.059 -18.6 -8.2 10. 6 0.020 0.0612 0.43 0.986 -25.0 -4.3 20. 9 0.120 0.0102 0.41 0.914 -30.7 +1.2 31. 11 0.096 0.0034 1.26 0.888 -29.1 +1.5 30. 13 0.094 0.000 1.49 0.888 -26.7 +1.4 28. Thiocapsa sp. штамм Mog 1, оз. Могильное 0* 0 0.0782 0.0102 1.44 -21.3 -6.0 19. 6 0.007 0.0646 0.035 1.322 -26.6 -4.7 21. 8 0.011 0.0170 0.062 1.223 -28.2 -4.2 24. 10 0.026 0.0136 0.149 1.223 -30.0 -3.2 26. 13 0.072 0.0102 0.160 1.151 -30.4 -2.5 27. 16 0.084 0.0102 0.141 1.105 -30.3 -1.4 28. 20 0.09 0.0034 0.108 1.078 -30.0 -0.9 29. монокультура Prosthecochloris vibrioformis штамм ShNPel02, оз Шунет 0* 0 0.1972 0.0568 1.61 -24.6 -5.3 20. 1 0.007 0.136 0.020 1.54 -22.9 -3.9 19. 3 0.011 0.119 0.080 1.44 -21.3 -2.9 18. 5 0.026 0.085 0.132 1.30 -19.3 -1.0 18. 7 0.072 0.075 0.184 1.32 -21.2 -1.6 19. 9 0.084 0.061 0.148 1.20 -22.3 +0.4 22. 13 0.09 0.017 0.132 1.32 -21.9 -1.4 20. * – в этой графе даны значения, отражающие начальное состояние среды и посевного, полученные до внесения в среду посевного: общее количество восстановленных соединений серы в полностью готовой среда;
количество орг в-ва, внесенного в среду с посевным;
содержание углерода бикарбоната в полностью готовой среде, изотопный состав внесенного посевного;
изотопный состав минерального углерода использованного в эксперименте (1 – в 10%-м р-ре бикарбоната, 2 – в полностью готовой среде).
о 13С, /оо РИСУНОК 6. Фракционирование 1 изотопов углерода фототрофными 3535 бактериями в зависимости от скорости их роста, определенной по 3030 3 оптической плотности 25 бактериохлорофилла.
D13C, % 2020 ПСБ:
1- Lamprocystis purpurea шт. ShAm 1515 2- Ectothiorhodospira shaposhnikovii 3- Thiocapsa sp. шт. Mog ЗСБ:
4- Prosthecochloris sp. шт. ShNPel 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0, 0.0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0. кор Скорость роста,оф отн. е сут -1 сут.- С ость роста, бактеиохлор Бхл, отн. ед.
р илл д.
Time, d vs Ect. shaposh Time, d vs Thiocapsa (Вертикальными отрезками представлены отклонения фактических значений оптической Time, d vs Amoebobact плотности от их расчетных величин для реперных точек).
Time, d vs Col 9. Сравнение данных по фракционированию изотопов углерода в озерах и результатов лабораторных экспериментов. Для экспериментов была взята доминирующая культура из оз. Шира, имеющая 100% филогенетическое сходство с культурой доминирующей в слое пурпурных бактерий в оз. Шунет, а также монокультура зеленых бактерий из оз. Шунет.
В мезоторофном оз. Шира со слабой интенсивностью продукционных и деструкционных процессов изотопные характеристики биомассы, минерального углерода и С более всего согласуются с экспериментальными и литературными данными для ПСБ (таб. 6).
ТАБЛИЦА 6. Сравнение изотопных характеристик зоны хемоклина оз. Шира, (июль, 2002) и экспериментальных данных.
13Сорг 13Смин =(13Сорг Доминирующие о о 13Смин), о/оо АФБ взвеси, /оо /оо Lamprocystis sp. шт.
Шира -27 -1.9 25.1–25. ShAm Lamprocystis sp. шт.
эксперимент 26.7 – 30.7 +1.2– 1.5 28.1 – 31. ShAm литературные ПСБ -30 - данные* * – Бондарь и др., 1976;
Wong, Sackett 1975) Близкие к экспериментальным оказались значения 13Сорг взвеси из зоны развития ПСБ в оз. Шунет. Глубже, где доминировали ЗСБ эффект фракционирования уменьшался, что также соответствовало результатам лабораторных исследований Prosthecochloris sp.. Дополнительное влияние на 13Сорг взвеси и 13Смин в зоне доминирования ЗСБ в оз. Шунет оказывало поступление легкого минерального углерода, образующегося в результате активных деструкционных процессов (таб. 7).
ТАБЛИЦА 7. Сравнение изотопных характеристик зоны хемоклина оз. Шунет, (август, 2003) и экспериментальных данных.
13Сорг взвеси, =(13Сорг -13Смин), Глубина, 13Смин о/оо Слой АФБ о о м /оо /оо 4.93 -26.6 -8.7 17. 4.97 ПНБ -27.3 -6.1 21. 5.18 -28.1 -2.8 25. 5.23 -28.4 -2.3 26. 5.28 -28 -3.4 24. 5.33 ПСБ -27.8 -4.4 23. 5.38 -26.7 -11.8 14. 5.43 ЗСБ -26.7 -14.3 12. 5.48 -26.7 -14.7 12. Lampro экспери cystis sp. -(26.7–30.7) +(1.2–1.5) 28.1–31. мент шт. ShAm Prostheco-chloris экспери sp. -(21.2–22.3) (-1.6) – (+0.4) 19.6–22. мент шт. ShNPel ПСБ* -30 - литер.
данные ЗСБ** -19- * – Бондарь и др., 1976;
Wong, Sackett 1975).
** – Бондарь и др., 1976;
Quandt et al, 1977.
В то же время максимальные значения 13С =(13Сорг - 13Смин), о/оо достигаются в зоне расположенной над слоем развития ПСБ на глубине 5. м., где развитие ПБ происходит в неоптимальных условиях.
Таким образом, нами показано, что в условиях озер наибольший эффект фракционирования изотопов углерода (13С) достигается при низких скоростях роста АФБ, в то время как в проведенных экспериментах – при высокой. В экспериментах показано, что эффект фракционирования у ПСБ зависит от скорости роста, и при низких скоростях роста культур (лаг период) сравним с таковым у ЗСБ.
Полученные данные наводят на мысль о существовании в клетках ПСБ значительного пула бикарбоната, являющегося резервом неорганического углерода при образовании биомассы в начальный период проведения эксперимента. Перед началом экспериментов бикарбонатный пул ПСБ представлен тяжелым неорганическим углеродом, что связано с глубоким исчерпанием бикарбоната из среды при наращивании посевного материала во флаконах с ограниченным объемом среды, изначально содержащей малое количество бикарбоната.
Причина отсутствия изменения эффекта фракционирования (13С) на протяжении всего эксперимента с ЗСБ вне зависимости от скорости роста культуры может быть связана с низкой величиной бикарбонатного пула в клетках ЗСБ, а также с иными механизмами фиксации неорганического углерода клетками ЗСБ по сравнению с клетками ПСБ.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
Наши исследования подтвердили ранее известные представления о том, что в большинстве случаев вклад АФБ в общую продукцию водоемов сравнительно мал (не превышает 10 % от общей продукции водоема). В то же время сообщества АФБ, развивающиеся на границе окисленных и восстановленных вод являются динамичными системами, изменяющимися в зависимости от сезона. Изменения в сообществах затрагивают в первую очередь минорные виды, развивающиеся в неоптимальных для них условиях среды (соленость, pH) и поэтому не достигающие большой биомассы и сильно подверженные влиянию нестабильных гидро-химических параметров среды. Также подтвердились ранее известные заключения о том, что видовой состав АФБ в соленых водоемах более разнообразен, чем в пресных водоемах (Горленко и др., 1977).
Из 4-х исследованных озер выделено 16 штаммов АФБ, 8 из которых относятся к родам Chlorobium, Thiocapsa, Thiorhodococcus, Rhodovulum, Blastochloris, 6 штаммов являются новыми видами родов Thiocapsa, Thiorhodococcus, Lamprocystis, Prostecochloris, Lamprobacter, а 2 штамма (штамм ShRb02 имеющий 93.9% сходства с типовым штаммом Ahrensia kielensis и штамм ShNBr03, имеющий 99.5% сходства с аэробными бактериохлорофилл содержащими бактериями Roseicyclus mahoneyensis) являются новыми родами ПНБ требующими дальнейшего изучения и описания.
На примере озер с разной степенью трофии установлено, что измерение изотопного состава органического и минерального углерода дает представление о локализации и масштабах продукции ОВ сообществом АФБ.
Во всех исследованных нами меромиктических озерах слой развития АФБ выделяется по изменению изотопного состава минерального углерода и/или органического углерода взвеси.
В олиготрофном озере Гек-Гёль с низкой скоростью роста АФБ наблюдался наибольший эффект фракционирования изотопов углерода даже несмотря на то, что сообщество представлено в основном ЗСБ.
В евтрофном и мезотрофном водоемах с высокими скоростями роста АФБ и высоким содержанием органической взвеси (Шунет, Могильное), активные деструкционные процессы с высвобождением изотопно легкой углекислоты затрудняют измерение величины изотопного фракционирования углерода сообществом АФБ.
В мезотрофном оз. Шира со слабой интенсивностью продукционных и деструкционных процессов, закономерности фракционирования изотопов углерода сообществом пурпурных АФБ более всего приближаются к результатам лабораторных исследований фракционирования изотопов углерода чистыми культурами фототрофных бактерий.
Отсутствие разницы в эффекте фракционирования у ПСБ и ЗСБ при низких скоростях роста в экспериментах говорит о том, что величина 13С, определяемая по разности изотопных характеристик 13С(НСО3-) и 13С(орг), не всегда отражает особенности биохимического механизма фиксации углекислоты при бактериальном фотосинтезе, и зависит от условий проведения экспериментов.
Выводы:
1. Во всех исследованных озерах продукция аноксигенных фототрофных бактерий в теплое время года составляла не более 10% от общей продукции водоема за исключением оз. Могильное, где она в 5–6 раз превышала продукцию оксигенного фитопланктона.
2. Из озер Могильное, Шира, Шунет, Гек-Гёль выделено 16 штаммов аноксигенных фототрофных бактерий, из которых 2 штамма являются новыми родами пурпурных несерных бактерий, и 6 штаммов являются новыми видами уже известных родов пурпурных серобактерий, требующими дальнейшего изучения и описания.
3. Сезонные исследования 3-х меромиктических озер показали, что структура сообщества аноксигенных фототрофных бактерий изменяется в зависимости от сезона под влиянием гидрохимических факторов (соленость, pH). Изменения в сообществах затрагивают в первую очередь минорные компоненты.
4. Установлено, что в озерах на границе окисленных и восстановленных вод в зоне развития аноксигенных фототрофных бактерий происходит фракционирование стабильных изотопов углерода, которое зависит от доминирующих микроорганизмов, от структуры и активности микробного сообщества. Показано, что в природных условиях максимальные значения фракционирования достигаются только при малой скорости роста бактерий.
5. В ходе экспериментов с чистыми культурами выделенных аноксигенных фототрофных бактерий показано, что фотоавтотрофный рост серобактерий сопровождался фракционированием изотопов углерода, значения 13С для пурпурных серобактерий составляли от 25 до 32 о/оо, а для зеленых серобактерий от 18 до 20 о/оо. Различия в величинах фракционирования изотопов углерода при фотоавтотрофном росте исследованных культур определяются различиями в путях фиксации углекислоты у пурпурных и зеленых серобактерий.
Список работ, опубликованных по материалам диссертации Статьи:
1. Пименов Н.В. Русанов И.И, Карначук О.В., Рогозин Д.Ю., Брянцева И.А., Лунина O.Н., Юсупов С.К., Парначев В.В., Иванов М.В. Микробные процессы циклов углерода и серы в озере Шира (Хакасия) // Микробиология. 2003. Т72. №2. С. 259–267.
2. Саввичев А.С., Русанов И.И, Рогозин Д.Ю., Захарова Е.Е., Лунина O.Н., Брянцева И.А., Юсупов С.К., Пименов Н.В., Дегерменджи А.Г., Иванов М.В. Микробиологические и изотопно-геохимические исследования меромиктических озер Хакасии в зимний сезон // Микробиология. 2005. Т. 74. №4. С. 552–561.
3. Лунина O.Н., Горленко В.М., Попова О.А., Акимов В.Н., Русанов И.И., Пименов Н.В.
Сезонные изменения структуры сообщества аноксигенных фототрофных бактерий реликтового озера Могильное (о. Кильдин, Баренцево море) // Микробиология. 2005. Т.
74. №5. С.1–10.
4. Лунина О.Н., Брянцева И.А., Акимов В.Н., Русанов И.И., Рогозин Д.Ю., Баринова Е.С., Лысенко А.М., Пименов Н.В. Сезонные изменения структуры сообщества аноксигенных фототрофных бактерий озера Шунет (Хакасия) // Микробиология. 2007. №3. Т. 76. С. 416– 428.
5. Лунина О.Н., Брянцева И.А., Акимов В.Н., Русанов И.И., Баринова Е.С., Лысенко А.М., Рогозин Д.Ю., Пименов Н.В. Сообщество аноксигенных фототрофных бактерий озера Шира (Хакасия) // Микробиология. 2007. №4. Т. 76. С. 533–544.
6. Лунина О.Н., Кевбрина М.В., Акимов В.Н., Пименов Н.В. Сообщество аноксигенных фототрофных бактерий горного меромиктического озера Гек-Гёль (Азербайджан) // Микробиология, 2008. Т. 77. №5. С. 675–682.
7. Зякун А.М., Лунина О.Н., Пименов Н.В., Иванов М.В. Фракционирование стабильных изотопов углерода аноксигенными пурпурными и зелеными бактериями при фотоавтотрофном росте // Микробиология, 2009. (в печати).
Тезисы:
1. Lunina O.N., Gorlenko V.M. The community of phototrophic sulfur bacteria in meromictic salt lake Mogilnoye // Abstracts 8 International Conference on salt lakes 23 – 26 July 2002, Zhemchuzhny, Republic of Khakasia/ Institute of Biophysics of SB RAS, Krasnoyarsk, 2002.
P.115.
2. Лунина O.Н., Брянцева И.А., Русанов И.И, Пименов Н.В. Сообщество аноксигенных фототрофных бактерий в озере Шира (Хакасия) и озере Могильное (о. Кильдин, Баренцево море.) // Тезисы докладов 4-й международной конференции “Водные экосистемы и организмы”. Москва, МГУ. Макс Пресс. 2003. С. 84.
3. Лунина O.Н., Брянцева И.А., Русанов И.И, Пименов Н.В. Сообщества аноксигенных фототрофных бактерий соленого озера Шунет, Хакасия // Тезисы докладов Всероссийской конференции “Биоразнообразие и функционирование микробных сообществ водных и наземных систем центральной Азии”. Улан-Удэ. 2003. Издательство БГСХА. С. 88.
4. Русанов И.И, Савичев А.С., Лунина O.Н., Захарова Е.Е., Рогозин Д.Ю., Пименов Н.В.
Сезонные микробиологические исследования в меромиктическом озере Шунет (Хакасия) // Тезисы докладов Всероссийской конференции “Биоразнообразие и функционирование микробных сообществ водных и наземных систем центральной Азии”. Улан-Удэ. 2003.
Издательство БГСХА. С.111.
5. Лунина O.Н., Брянцева И.А., Русанов И.И, Пименов Н.В. Сообщества аноксигенных фототрофных бактерий в меромиктических озерах Хакасии // Тезисы 5-й международной конференции “Водные экосистемы и организмы”. Москва, МГУ. Макс Пресс. 2004. С. 69.
6. Пименов Н.В. Лунина О.Н., Прусакова Т.В., Русанов И.И., Иванов М.В.
Фракционирование стабильных изотопов углерода в водной толще меромиктических водоемов как показатель микробной активности // Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ. Материалы 2-го Байкальского Микробиологического Симпозиума с международным участием. Иркутск, 10–15 сентября 2007 г. С. 190–191.