Способность клеточных стенок из разных органов растений в условиях засоления (на примере представителей сем. fabaceae)

На правах рукописи

ДЖАЛАЛИХОНАРМАНД САИД «ИОНООБМЕННАЯ СПОСОБНОСТЬ КЛЕТОЧНЫХ СТЕНОК ИЗ РАЗНЫХ ОРГАНОВ РАСТЕНИЙ В УСЛОВИЯХ ЗАСОЛЕНИЯ (НА ПРИМЕРЕ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ СЕМ. FABACEAE)» Специальность 03.00.12 – физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2007 Диссертационная работа выполнена на кафедре физиологии растений Московского Государственного Университета им. М. В. Ломоносова Научные руководители: доктор биологических наук, профессор И. П. Ермаков кандидат химических наук, старший научный сотрудник Н. Р. Мейчик

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Е. П. Феофилова кандидат биологических наук, доцент К. Н. Тимофеев

Ведущая организация: Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН.

Защита состоится «16» февраля 2007 г. в 15.30 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.46 в Московском Государственном Университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119992, г. Москва, ГСП-2, Ленинские Горы, МГУ, Биологический факультет.

Факс – (495) 939-43-

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан «16» января 2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета, к. б. н. М. А. Гусаковская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Экологические факторы оказывают значитель ное влияние на рост и развитие растений. Одним из распространенных по площа ди и неблагоприятному воздействию на продуктивность растений абиотических стрессоров является засоление почв. Засоленные почвы широко распространены во многих странах мира, занимая около 20% посевных площадей и почти полови ну орошаемых территорий (Munns, 2002). Выяснение механизмов адаптации рас тительных организмов, позволяющих им выживать в условиях засоления среды, является важным направлением физиологии устойчивости растений.

Избыточное содержание ионов натрия и хлорида в почве оказывает гипе росмотическое и токсическое действие на растение, и поддержание роста в этих условиях связано как с регуляцией водного и осмотического гомеостаза, так и с изменением свойств клеточных стенок растений (Cosgrove and Li, 1993).

На фоне значительного прогресса в изучении состава и свойств составляющих клеточную стенку полисахаридов, структурных белков и ферментов число работ, в которых исследованы процессы, происходящие в этом компартменте при дейст вии стрессоров, в частности, засоления, ограничено. Представление о том, что клеточная стенка может являться источником сигналов для запуска ответных, за щитных реакций растительного организма, широко обсуждается в литературе (Горшкова, 1997). Однако мало известно, какой вклад вносят клеточные стенки в формировании механизмов солеустойчивости растения.

В настоящее время клеточная стенка рассматривается как сложноорганизо ванный, динамичный компартмент, выполняющий ряд важных функций (Шарова, 2004, Carpita and Gibeaut, 1993). За счет физико-химических свойств этой струк туры и способности осуществлять реакции обмена между ионообменными груп пами полимерного матрикса стенок и ионами среды модифицируется внешний раствор и создается «внутренняя физиологическая среда» организма.

Исследованию особенностей функционирования клеточных стенок растений как природных ионообменников в условиях засоления посвящены немногочис ленные публикации (Bigot and Binet, 1986;

Meychik et al., 2005;

Мейчик и др., 2006). Практически отсутствуют работы, в которых ионообменная способность клеточных стенок была бы оценена количественно. Также не изучалась специфи ка ионообменных свойств клеточных стенок у разных сортов культурных расте ний.

Бобовые растения во многих странах, в том числе в Исламской республике Иран, являются ценными сельскохозяйственными культурами, важными проду центами белка (Singla and Garg, 2005). В этой связи крайне важно изучить видо вые и сортовые особенности бобовых культур с целью их использования на засо ленных почвах. Сравнительные исследования свойств клеточных стенок растений разных видов и сортов, отличающихся по устойчивости к действию солевого стресса, необходимы для выяснения роли этого компартмента клетки в механиз мах солеустойчивости.

Цель данной диссертационной работы: провести сравнительное исследова ние ионообменной способности полимерного матрикса клеточных стенок расте ний из семейства Fabaceae при действии засоления и установить роль клеточной стенки в солеустойчивости растений.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Используя параметры роста, сравнить степень устойчивости к засолению разных видов и сортов растений из семейства бобовых.

2. Определить качественный и количественный состав функциональных групп полимерного матрикса клеточных стенок бобовых растений, различающих ся по устойчивости, и выявить изменения в ответ на действие засоления.

3. Провести сравнительное исследование физико-химических свойств поли мерного матрикса клеточных стенок разных сортов и видов бобовых расте ний:

определить константы диссоциации функциональных групп, располо женных в полимерной структуре клеточных стенок;

оценить коэффициенты набухания полимерного матрикса клеточных стенок при разных значениях рН и ионной силы внешнего раствора;

определить интервал рН, в котором функциональные группы клеточных стенок ионизированы и способны принимать участие в реакциях ионного обмена.

4. Установить роль ионообменного механизма связывания ионов полимерным матриксом клеточных стенок в адаптации бобовых растений к засолению.

Научная новизна работы. Впервые исследован состав полимерного матрикса клеточных стенок растений из семейства Fabaceae – нута C. arietinum (сорт Bivanij и ILC482) и вики V. narbonesis (сорт Sel2384), и проведен сравнительный анализ содержания катионообменных групп (карбоксильных групп полигалактуроновой и оксикоричных кислот, фенольных групп) и анионообменных групп (аминог рупп). Впервые определены физико-химические параметры, количественно ха рактеризующие ионообменные свойства (константы диссоциации функциональ ных групп, общее содержание катионообменных и анионообменных групп, коли чество групп каждого типа) и способность к набуханию полимерного матрикса клеточных стенок растений, различающихся по солеустойчивости. Определены интервалы рН, в которых функциональные группы матрикса ионизированы и спо собны вступать в обменные реакции с катионами и анионами внешней среды.

Впервые показано, что объем клеточных стенок C. arietinum и V. narbonesis не яв ляется постоянной величиной и зависит от ионных условий и рН внешнего рас твора и апопласта. Установлено, что растения из семейства Fabaceae, отличаю щиеся по устойчивости к действию засоления, проявляют сортовую и видовую специфичность структуры полимеров экстраклеточного матрикса.

Практическая значимость работы. Полученные в работе данные расширяют фундаментальные знания о роли клеточных стенок в устойчивости растений к не благоприятным факторам окружающей среды. Результаты могут быть использо ваны в курсах лекций по минеральному питанию и стресс-устойчивости растений.

Показано, что одной из ответных реакций бобовых растений на засоление явля ются изменения физико-химических свойств клеточных стенок. Полученные в ра боте физико-химические параметры (константы диссоциации функциональных групп, общее содержание катионообменных и анионообменных групп, количество групп каждого типа, коэффициент набухания полимерного матрикса) позволяют предсказывать изменения ионного состава в водном пространстве клеточных сте нок на начальном этапе поглощения элементов минерального питания.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на IV-ой Международной научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктив ности растений» (Минск, 2005), 13th Multi-disciplinary Iranian Researchers Confer ence in Europe (Leeds, 2005), XV International Plant Nutrition Colloquium «Plant nu trition for food security, human health and environmental protection» (Beijing, 2005), International scientific conference «Genetic and Physiological Fundamentals of Plant Growth and Productivity» (Vilnius, 2006).

Публикации. Всего по материалам диссертации опубликовано 9 работ. Экс периментальные данные, представленные в диссертации, получены лично соиска телем и опубликованы в соавторстве с руководителями и сотрудниками, работав шими совместно с автором.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 147 стр. маши нописного текста и состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, списка ци тируемой литературы, включающего 123 наименования (из них 105 на иностран ных языках).

Работа содержит 16 таблиц и иллюстрирована 30 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объектами исследования служили 18-21-дневные растения нута Cicer arieti num L.(сорт Bivanij, ILC482, Hachem), вики Vicia narbonesis L. (сорт Sel2384) и чины Lathyrus sativus L. (сорт Sel635) из семейства Fabaceae. Семена вики и чины проращивали во влажном вермикулите в течение 5 дней, а семена нута - на влаж ной фильтровальной бумаге в термостате при 27°С в темноте в течение 3 дней.

Через 3-5 дней проростки пересаживали в 3 л сосуды (20 растений на сосуд) на питательный раствор Прянишникова следующего состава (г/л): NH4NO3 - 0,24, MgSO4 - 0,06, KCl - 0,15, CaSO4*2H2O - 0,344, CaHPO4*2H2O - 0,172, FeCl3 - 0,025.

Растения росли в камерах при дневной и ночной температуре воздуха 23°С, при освещении лампами дневного света с интенсивностью света 46 мкмоль фото нов/м2*с на уровне листьев верхнего яруса, аэрации растворов в течение дня. Рас творы в сосудах заменяли каждую неделю. 3-5-дневные растения подвергали за солению, внося в питательный раствор хлористый натрий. Концентрация хлори стого натрия в питательной среде составляла 0,5, 40 и 80 мМ.

Листья у растений нута, вики и чины разделяли на нижний (первые 3-4 листа) и верхний (остальные листья) ярусы. В опытах использовали интактные и высу шенные ткани растений, а также клеточные стенки, выделенные из корней, стеб лей и листьев разных ярусов нута, чины и вики, выращенных на разном фоне за соления.

Выделение клеточных стенок из разных тканей растений проводили в соот ветствии с методикой (Meychik et al., 1999;

Meychik and Yermakov, 2001). Интакт ный растительный материал помещали в стеклянную ионообменную колонку (V=250 мл), промывали в динамических условиях последовательно 1%-ными рас творами щелочи, кислоты и дистиллированной водой до отсутствия хлорид-ионов в промывных водах, а затем высушивали в присутствии поглотителя (CaCl2) при 55-60°до постоянного веса.

Для оценки качества выделения клеточных стенок проводили микроско пический анализ препаратов, окрашенных флуоресцентным красителем DAPI.

Для определения качественного и количественного состава ионообмен ных групп полимерного матрикса клеточных стенок использовали потенциомет рическое титрование, которое осуществляли методом отдельных навесок (Мейчик и др., 1999). Расчет кривых титрования проводили, как описано в работах (Mey chik and Yermakov 1999;

2001). Количество функциональных групп каждого типа, а также значения рН, отвечающие началу и концу их ионизации определяли, ана лизируя экспериментальные кривые зависимости сорбционной способности кле точных стенок от рН. Содержание свободных аминогрупп определяли методом неводного титрования в уксусной кислоте (Черонис и Ма, 1973).

Определение содержания воды в тканях растений и весового коэффици ента набухания клеточных стенок в воде проводили в соответствии с методи кой (Meychik and Yermakov, 2001). Весовой коэффициент набухания стандартизо cw ванных клеточных стенок (K ) и содержание воды в органах растений (Q) опре деляли по соответствующим формулам (Гельферих, 1962).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием паке та программ SPSS, версия 13.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Оценка солеустойчивости растений из семейства Fabaceae Одним из тестов для оценки степени солеустойчивости растений является прорастание семян. Важность этого критерия при выборе наиболее толерантного сорта нута возрастает в связи с тем, что стадия прорастания его семян характери зуется наибольшей чувствительностью к засолению. Результаты свидетельствуют, что в отсутствии влияния NaCl сорта нута ILC482 и Bivanij отличаются от Hachem сравнительно высоким процентом прорастания (95, 98% для ILC482 и Bivanij и 71% для Hachem). При увеличении концентрации NaCl в среде от 0,5 (контроль) Bivanij Hachem ILC Процент прорастания семян относительно контроля, % 40 мМ 80 мМ 120 мМ Концентрация NaCl в среде Рисунок. 1. Влияние засоления на прорастание семян разных сортов нута. В легенде - названия сортов нута до 120 мМ происходит снижение прорастания семян всех сортов нута (рис.1). Та кие данные не противоречат результатам Солтани с соавторами, которые показа ли, что прорастание семян разных сортов нута (Jam и Kaka) С. arietinum при раз ном уровне засоления внешнего раствора имеет существенные отличия: более ус тойчивые сорта характеризуется более высоким процентом прорастания и более высокой скоростью прорастания (Soltani et al., 2002). Результаты настоящей рабо ты свидетельствуют, что при всех уровнях засоления внешнего раствора семена растений сорта ILC482, в отличие от Bivanij и Hachem, характеризуются самым высоким процентом прорастания. Следовательно, сорт ILC482 является относи тельно устойчивым, а Bivanij - чувствительным к высоким концентрациям NaCl в среде. Эти данные согласуются с результатами экспериментов, в которых показа но, что присутствие в среде NaCl приводит к замедлению прорастания семян бо бовых растений: гороха, фасоли и сои (Essa, 2002;

Saxena et al., 1994). Полагают, что это связано в большей степени с влиянием осмотической компоненты солево го стресса, нежели токсическим эффектом.

Другим критерием для оценки степени устойчивости растений к засолению является накопление биомассы. Результаты свидетельствуют, что, независимо от сорта нута, в ответ на увеличение концентрации NaCl во внешнем растворе про исходит ингибирование роста растений, выражающееся в снижении накопления сухой массы тканей. Полагают, что подавление роста в условиях засоления связа но как с уменьшением доступности и поглощения воды растениями, так и с ток сическим действием хлористого натрия (Munns, 2003;

Taiz and Zeiger, 1998;

Tester and Davenport, 2003). Данные нашей работы показывают, что растения сорта ILC482, по сравнению с сортами Bivanij и Hachem, характеризуются наименьшим снижением в накоплении сухой массы и корней, и надземных органов (рис.2а).

Известно, что все органы растений подвержены неблагоприятному влиянию засоления, однако ответ на повреждающее действие стрессора каждого из них бу дет разным (Raptan et al., 2001). Так, например, показано, что в условиях засоле ния у растений люцерны накопление листовой биомассы снижается в меньшей степени по сравнению с массой стебля, а урожайность зерна тритикале ингибиру ется в большей степени, чем масса побега (Karim et al., 1992). Однако причины такого разного ответа на воздействие солевого стресса различных органов одного растения полностью не выяснены (Raptan et al., 2001).

Рост корней всех сортов нута в большей степени подвержен влиянию засоле ния по сравнению с ростом надземных органов (рис. 2б). Также определено, что с увеличением концентрации NaCl в питательном растворе происходит сни а б накопления сухой массы, % 30 ILC Bivanij Hachem Относительное снижение Bivanij ILC накопления сухой массы, % Относительное снижение корень побег 40 мМ 80 мМ Концентрация NaCl в среде Рисунок 2. а – изменения в накоплении сухой массы растений разных сортов нута в зависимо сти от концентрации NaCl в среде;

б – относительное снижение в накоплении сухой массы кор ней и надземных органов растений нута сорта Bivanij и ILC482, выращенных в присутствии мМ NaCl жение соотношения массы корней и побега. Предполагают, что уменьшение био массы растений при засолении связано с ингибированием гидролиза запасных пи тательных веществ и их транслокации в растущие ткани надземных органов (Sin gla and Garg, 2005). Известно также, что для роста растений в условиях солевого стресса необходимы дополнительные энергетические ресурсы. При этом проис ходит изменение направленности метаболизма углерода, выражающееся в уменьшении его доступности для процессов роста (Cheeseman, 1988). Согласно результатам теста по накоплению сухой биомассы солеустойчивость сортов нута изменяется в ряду: ILC482 Hachem Bivanij. Следовательно, на основании двух критериев оценки степени устойчивости растений можно заключить, что сорт ILC482 является относительно устойчивым, а Bivanij - чувствительным к высоким концентрациям NaCl в среде.

Для сравнения устойчивости к засолению растений из семейства Fabaceae проведены эксперименты по оценке накопления общей биомассы растениями ну та C.arietinum, вики V.narbonesis и чины L.sativus. Результаты свидетельствуют, что в условиях засоления среды у растений нута, в отличие от вики и чины, про исходит наибольшее снижение накопления сухой массы. Этот параметр у V.

narbonesis и L. sativus имеет близкие величины. В связи с тем, что продуктивность вики выше по сравнению с растениями чины, в работе использовали растения ви ки. Таким образом, для сравнительного изучения ионообменных свойств клеточ ных стенок растений из семейства Fabaceae были выбраны растения нута C.

arietinum двух сортов (Bivanij и ILC 482), отличающихся по солеустойчивости, и вики V. narbonesis.

Ионообменные свойства клеточных стенок растений нута и вики Известно, что от ионообменных свойств клеточных стенок в определенной степени зависит способность к поглощению элементов минерального питания и ионный состав растений. Ионообменная способность полимерного матрикса кле точных стенок, изолированных из разных органов, была исследована с помощью потенциометрического метода, который ранее был разработан и применен к ис следованию структуры ионогенных групп клеточных стенок других растений (Мейчик и др., 1999;

Meychik and Yermakov, 1999;

2001). Для расчета величин констант ионизации ионогенных групп (табл.1) применено модифицированное Грегором уравнение Хендерсона-Хассельбаха (Gregor et al, 1954):

, (1) pH = pKa + n log где рКа - кажущаяся константа ионизации ионогенной группы полимера, - сте пень диссоциации, n – константа, зависящая от строения полимерной матрицы и природы противоиона. Анализ экспериментальных данных показал, что во всех случаях между соответствующими величинами рНi и log 1 существует i i статистически значимая прямолинейная зависимость. С помощью метода регрес j сионного анализа по уравнению (1) рассчитаны значения рКa и nj для каждой сту пени ионизации.

Адекватность примененного подхода к описанию кислотно-основного равно весия оценивали методом регрессионного анализа, определяя параметры уравне ния:

Sрасч. = B Sэксп + A, (2) где Sэксп и Sрасч. – экспериментально полученная и рассчитанная ионообменная способность при соответствующем значении pH, мкмоль/г сухой массы клеточ ных стенок;

A и B - параметры регрессии. Расчеты показали, что выбранная мо дель полностью соответствует полученным в настоящей работе эксперименталь ным данным, о чем свидетельствуют величины коэффициентов корреляции (rcorr) зависимостей Sрасч = f(Sэксп), а также значения коэффициентов A и B уравнения 2.

Во всех вариантах rcorr 1, значение A не превышает погрешности эксперимента, а B 1.

Результаты настоящей работы свидетельствуют, что в структуре полимер ного матрикса клеточных стенок всех исследуемых растений содержится 4 типа ионогенных групп, способных принимать участие в обменных реакциях с ионами внешней среды при соответствующих условиях (табл 1).

j Таблица 1. Средние значения констант диссоциации (pKa ) функциональных групп полимерного j матрикса клеточных стенок растений нута и вики. Определение всех значений pKa проведено при ионной силе раствора 100 мМ. j – тип ионогенной группы;

1 – аминогруппы;

2 – карбок сильные группы полигалактуроновой кислоты, 3 – карбоксильные группы оксикоричных ки слот, 4 – фенольные группы j pKa растение j=1 j=2 j=3 j= Нут ILC 482 3,65±0,12 6,83±0,03 10,00±0, Нут Bivanij 3,76±0,17 6,71±0,36 9,86±0, Вика 3,60±0,17 7,0±0,27 9,80±0, J На основании рассчитанных значений рКа, данных по химическому составу кле точных стенок (Buchanan, 2000), результатов потенциометрического титрования клеточных стенок корней растений (Мейчик и др., 1999;

Meychik and Yermakov, 1999;

2001) можно полагать, что катионообменные свойства клеточных стенок обусловлены карбоксильными группами Dполигалактуроновой и оксикорич ных кислот и фенольными группами, а анионообменные – аминогруппами.

Полимерный матрикс клеточных стенок всех органов исследуемых растений имеет одинаковый качественный состав функциональных групп, на который не оказывает влияние уровень засоления внешней среды: во всех вариантах имеются аминогруппы, два типа карбоксильных и фенольные группы.

В зависимости от концентрации NaCl в среде выращивания, в клеточных стенках нута (корни и листья нижнего яруса) и вики (стебли и листья нижнего яруса) изменяется количество карбоксильных групп полигалактуроновой кислоты (ПГК) (рис. 3). С повышением концентрации NaCl в среде от 0,5 до 80 мM в по лимерном матриксе этих органов содержание последних увеличивается на 10 – %. Изменения в количестве групп ПГК при увеличении концентрации соли в сре де, вероятно, являются одной из ответных реакций этих растений на засоление.

б а содержание СООН-групп содержание СООН-групп ПГК ПГК 0,5 0,5 NaCl NaCl С С корни лист нижнего яруса стебель лист нижнего яруса Рисунок 3. Влияние засоления (CNaCl, мМ) на содержание карбоксильных групп полигалактуро новой кислоты в полимерном матриксе клеточных стенок растений нута (Bivanij) (a) и вики (б) Клеточные стенки стебля и корней исследуемых растений содержат больше карбоксильных групп полигалактуроновой кислоты (рис. 4) по сравнению с этим показателем у других растений (Meychik and Yermakov, 2001;

2003;

Meychik et al., 2005;

Мейчик и др., 2006). Например, показано, что в корнях люпина, огурца, шпината содержание карбоксильных групп ПГК составляет от 350 до 450, в то время как в корнях нута сорта ILC 482 и вики достигает 680 и 620 мкмоль на 1 г сухой массы клеточных стенок.

У бобовых растений, независимо от концентрации соли в среде, наибольшее количество карбоксильных групп ПГК находится в полимерном матриксе стенок стебля, а фенольных групп – в матриксе листьев. Между собой стенки разных ор ганов значительно различаются и по содержанию аминогрупп и карбоксильных корни стебли 800 СООН уроновых кислот СООН уроновых кислот 600 400 Bivanij ILC 482 вика Bivanij ILC 482 вика Рисунок 4. Содержание карбоксильных групп полигалактуроновой кислоты в полимерном мат риксе клеточных стенок растений нута (Bivanij и ILC 482) и вики групп гидроксикоричных кислот: наибольшее количество и первых, и вторых на ходится в полимерном матриксе листьев. Все вышеизложенное позволяет гово рить о том, что состав структурных полимеров в матриксе экстраклеточного ком партмента у разных органов одного растения значительно различается.

в б а 600 фенольные ОН группы фенольные ОН группы фенольные ОН группы 400 200 0 0 Bivanij ILC вика Bivanij ILC вика Bivanij в ика 482 лист нижнего яруса лист в ерхнего яруса Рисунок 5. Содержание фенольных ОН-групп в клеточных стенках корней (а), стеблей (б) и ли стьев (в) растений нута (Binanij и ILC 482) и вики В ряду исследуемых растений клеточные оболочки самого солечувствитель ного сорта нута (Bivanij) имеют в своем составе наименьшее количество феноль ных ОН-групп, что может свидетельствовать о сравнительно меньшей степени лигнификации его стенок по сравнению с C. arietinum (ILC 482) и V. narbonesis (рис. 5). В соответствии с данными по относительной солеустойчивости иссле дуемые растения располагаются в ряд: C. arietinum (Bivanij) C. arietinum (ILC 482) V. narbonesis, и в той же последовательности происходит увеличение со держания фенольных ОН-групп в стенках всех органов. Можно полагать, что большая степень лигнификации корней у вики и нута сорта ILC 482 является од ним из факторов, который определяет большую солеустойчивость растений C.

arietinum (ILC 482) и V. narbonesis по сравнению с C. arietinum (Bivanij).

С увеличением концентрации соли в питательной среде у нута и вики изменя ется константа ионизации карбоксильных групп ПГК, в то время как рКа двух других групп мало зависят от этого фактора. Указанная закономерность соблюда ется для клеточных оболочек, изолированных из корней, листьев и стеблей. С увеличением содержания NaCl в питательном растворе уменьшается константа ионизации карбоксильных групп ПГК или усиливаются их кислотные свойства.

Таким образом, в ответ на засоление должно происходить увеличение ионооб менной способности полимерного матрикса клеточных стенок.

корни стебель 400 S лист_ня лист_вя pNa 0 0,5 1 1,5 2 2, Рисунок 6. Влияние ионной силы раствора (pNa) на ионообменную способность (S, мкмоль/г сухой массы клеточных стенок) полимерного матрикса клеточных стенок, изолированных из разных органов нута (Bivanij), выращенного на питательном растворе с 0,5 мМ NaCl. Лист_ня – листья нижнего яруса, лист_вя – листья верхнего яруса. pNa = - log10(CNa+), где CNa+- концен трация NaCl в опытных растворах, М Доказательством последнего утверждения могут служить зависимости ионооб менной способности полимерного матрикса клеточных стенок нута и вики от концентрации хлорида натрия (СNaCl) во внешнем растворе (рис. 6). Во всех вари антах выращивания с увеличением СNaCl у исследуемых растений резко возрастает ионообменная способность клеточных стенок, причем для корней, листьев и стеб лей указанные зависимости имеют аналогичный характер. В зависимости от СNaCl для корней нута и вики параметр S изменяется от 70 до 200-220, для стеблей – от 130 до 400, а для листьев – от 70 до 150 (листья верхнего яруса) – 300 (листья нижнего яруса) мкмолей на 1 г сухой массы клеточных стенок в интервале изме нения ионной силы от 5 до 1000 мМ. Следует подчеркнуть, что при любых усло виях способность к ионному обмену клеточных стенок стебля выше по сравнению с остальными органами (рис. 6).

,,% % 1 pH 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Рисунок 7. Зависимость степени диссоциации () функциональных групп полимерного матрикса клеточных стенок нута и вики от рН и ионной силы раствора. 1 – карбоксильные группы полига лактуроновой кислоты;

2 – карбоксильные группы оксикоричных кислот;

3 – фенольные группы.

10, 100, 250 - значения ионной силы растворов, мМ Степень ионизации () слабых кислот и оснований, к которым относятся и ионогенные группы в структуре полимерного матрикса клеточных стенок, зависит лишь от двух факторов: от значений рН и рКa. Последний параметр, как известно, является постоянным для любой кислоты или основания. Следовательно, для фиксированного значения рН степень ионизации зависит только от химической природы кислоты или основания (Альберт и Сержент, 1964). На основании полу ченных в работе результатов можно рассчитать степень диссоциации каждой группы в зависимости от рН и ионной силы раствора. Уравнение для расчета выглядит следующим образом:

[(pH-pKa)/n] = {1/[1 + 1/10 ]}, (3) Так как качественный состав ионогенных групп клеточных стенок всех иссле дуемых растений из семейства бобовых идентичен, то представленные кривые (рис. 7) характеризуют состояние ионообменных групп полимерного матрикса клеточных стенок и нута, и вики при разной ионной силе внешнего раствора. Так, при pH=4,5 около 60% карбоксильных групп ПГК ионизировано в среде с 10 мМ NaCl, в то время как при 100 мМ NaCl величина этих групп достигает 80%. В этих условиях все карбоксильные группы оксикоричных кислот не способны к ре акциям обмена с ионами внешней среды. При pH=7 карбоксильные группы ПГК диссоциированы на 100%, тогда как карбоксильные группы оксикоричных кислот – на 20%. Следует отметить, что фенольные и аминогруппы всегда закрыты при физиологических условиях (рН 5,0-8,0) и, следовательно, не принимают участия в ионообменных реакциях (рис. 7).

Сравнительный анализ набухания клеточных стенок растений Известно, что растительная клеточная стенка представляет собой природный слабосшитый ионообменник (Grignon and Sentenac, 1991). Одним из важных фи зико-химических показателей, характеризующих свойства полимера как ионооб менника, является набухание. Количественной характеристикой этого процесса cw служит весовой коэффициент набухания (K ), равный количеству воды в поли мере, отнесенному к грамму сухой массы клеточных стенок. Причиной набухания ионообменных материалов в водном растворе является наличие гидрофильных групп, причиной нерастворимости - существование поперечных связей. Степень набухания ионообменного материала зависит от свойств ионита и состава внеш него раствора. Известно, что способность к набуханию возрастает с уменьшением степени поперечной связанности, с увеличением общего количества ионогенных групп, с увеличением степени их диссоциации, с уменьшением концентрации рас твора и зависит от радиуса гидратированного иона, которым заполняется сорбент (Гельферих, 1962).

У исследуемых растений во всех органах коэффициент набухания полимерно cw го матрикса клеточных стенок (K ), также как ионообменная способность, зави сит от ионной силы внешнего раствора (рис. 8). Наши результаты показывают, что набухание клеточной стенки изменяется в соответствии с физико химическими закономерностями, которые известны для синтетических слабосши cw тых слабоосновных катионообменников (Гельферих, 1962). Значение K увели чивается с уменьшением ионной силы раствора и с увеличением рН (или степени диссоциации ионогенных групп). Во всех случаях набухание клеточной стенки минимально в кислой области. Это означает, что клеточные стенки сжимаются или уменьшаются в объеме с уменьшением рН в апопласте или во внешней среде.

12 cw K 10 100 pH 3 4 5 6 7 8 Рисунок 8. Способность к набуханию клеточных стенок (КCW, г воды/г сухой массы клеточных стенок), изолированных из корней нута (сорт Bivanij), выращенного в присутствии 0,5 мМ NaCl в питательном растворе. В легенде цифрами обозначена ионная сила растворов (мМ), при кото рой проводили определение КCW Аналогичные изменения в объеме клеточной стенки происходят при увеличении cw ионной силы внешнего раствора. Во всех случаях К возрастает с увеличением рН. Полученные результаты отчетливо показывают, что объем клеточных стенок не является постоянной величиной и зависит от ионных условий и рН в окру жающей среде и внутри апопласта.

Поведение клеточных стенок растений при разных уровнях засоления среды На основании результатов работы возможно оценить концентрацию прото нов в водном пространстве апопласта, образующихся в результате реакций обме на между катионами внешней среды и протонами ионизированных карбоксиль ных групп клеточных стенок корней при изменении уровня засоления внешней среды. Иллюстрацией этого положения служит полученная экспериментальная + Na зависимость СН =f(-log10C ) (рис. 9). Расчеты показывают, что увеличение кон центрации NaCl во внешнем растворе на 50 мМ, например, от 50 до 100 мМ при ведет к увеличению концентрации протонов в водной фазе клеточных стенок на 12 мМ. Если концентрация соли увеличивается на 80-90 мМ (например, от 10 до 100 мМ), то рН в апопласте может снизиться до значений менее 3, что, в свою очередь, может привести к гибели клетки под воздействием высокой концентра ции выделяющихся из клеточных стенок протонов.

концентрация протонов, мМ 0 0,5 1 1,5 2 2, pNa Рисунок 9. Концентрация протонов в водной фазе апопласта корней нута в зависимости от кон центрации NaCl. pNa = -log10CNaCl, где CNaCl – концентрация NaCl в опытных растворах, М Анализ данных литературы (Yan, 1998;

Amtmann, 1999) свидетельствует, что снижение рН в апопласте за счет работы Н+-АТФазы приводит к стимулирова нию различных транспортных процессов. С другой стороны, результаты исследо вания ионообменных свойств клеточных стенок показывают, что в условиях соле вого стресса за счет реакций обмена между катионами внешнего раствора и про тонами карбоксильных групп клеточных стенок образуется высокая концентрация протонов около плазмалеммы, которая, вероятно, влияет на процессы транспорта ионов в клетку.

В настоящее время установлено, что при высокой концентрации калия в среде + в Н -сопряженном поглощении элементов минерального питания большую роль играет рН апопласта (Amtmann, 1999), при этом протоны внеклеточного компар тмента являются не только субстратом для транспортных систем, но и воздейст вуют на электрические движущие силы этого процесса путем изменения мем бранного потенциала. Методом patch-clamp на выделенных из корней ячменя про топластах показано, что активность К-селективных входящих каналов (KIRCs) плазматической мембраны зависит от рН апопласта: уменьшение рН внешнего раствора увеличивает проводимость KIRCs.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Проведенное сравнительно-физиологическое исследование показало, что рас тения из семейства Fabaceae, отличающиеся по устойчивости к действию засоле ния, проявляют сортовую и видовую специфичность структуры полимеров экст раклеточного матрикса, характеристикой которой является содержание функцио нальных групп в клеточных стенках.

В ряду исследованных растений у клеточных стенок во всех органах самого солечувствительного сорта нута Bivanij содержание фенольных групп самое низ кое, что может свидетельствовать о сравнительно меньшей степени лигнифика ции их стенок по сравнению с сортом ILC 482 и видом V. narbonesis. В соответст вии с данными по относительной солеустойчивости исследуемые растения распо лагаются в ряд: C. arietinum (Bivanij) C. arietinum (ILC 482) V. narbonesis, и в той же последовательности увеличивается содержание фенольных групп в стен ках.

Клеточные стенки всех исследуемых растений характеризуются высоким содержанием карбоксильных групп полигалактуроновой кислоты, что свидетель ствует о большой доле пектиновых веществ в них. Эти данные согласуются с ре зультатами других авторов (Talbot and Ray, 1992). Показано, что у бобовых расте ний пектины составляют ~ 37% от массы клеточной стенки и представлены, глав ным образом, гомогалактуронанами.

С увеличением концентрации NaCl в среде у нута и вики снижается кажу щаяся константа диссоциации карбоксильных групп полигалактуроновой кисло ты, следовательно, возрастает количество ионогенных групп, способных обмени вать протон на катион внешней среды. В результате можно ожидать, что раствор в водном пространстве клеточной стенки будет содержать меньше ионов натрия и больше протонов, чем внешний раствор. Снижение рН в апопласте в этих услови ях, вероятно, приведет к изменению транспортных функций плазматической мем браны.

Коэффициент набухания характеризует степень сшивки между цепями по лимеров клеточных стенок и является важной количественной характеристикой проницаемости полимерного матрикса. Сравнение коэффициентов набухания клеточных стенок нута и вики, а также других представителей гликофитов пока зывает, что у изученных растений из сем. Fabaceae более низкая степень сшивки полимеров в матриксе клеточных стенок чем, например, у гликофита из семейства Chenopodiaceae (Мейчик и др., 2006). На основании этих результатов можно пола гать, что в условиях засоления клеточные стенки бобовых с меньшей эффектив ностью защищают клетку от стрессового воздействия по сравнению, например, с устойчивым гликофитом (шпинат), так как в первом случае поток натрия из внешнего раствора к плазмалемме будет больше. Вполне вероятно, что выявлен ные особенности в свойствах полимерного матрикса клеточных стенок (низкое содержание фенольных полимеров, низкая степень сшивки) обуславливают ма лую устойчивость растений из сем. Fabaceae к засолению по сравнению, напри мер, со злаковыми.

В соответствии с данными настоящего исследования у бобовых растений снижение рН раствора и/или увеличение ионной силы приводят к уменьшению степени набухания клеточной стенки. С другой стороны, известно, что закисление среды снижает гидравлическую проводимость стенок (Ктиторова и Скобелева, 1999). Кроме того, показано, что при низкой ионной силе внешнего раствора (вы сокой скорости транспирации) апопластный путь движения воды является опре деляющим, так как в этих условиях гидравлическое сопротивление корня низкое, что обеспечивает быстрое поглощение воды (Steudle and Peterson, 1998). На осно вании анализа указанных данных литературы и наших экспериментов можно за ключить, что у нута и вики существует прямая связь между набуханием полимер ного матрикса клеточных стенок корней и водным током, что указывает на важ ную физиологическую функцию клеточных стенок корня в регуляции движения воды по корневому апопласту. Способность полимерного матрикса клеточных стенок изменять гидравлическую проводимость под действием засоления особен но важна для корней, главной функцией которых является поглощение воды и растворенных веществ. Вполне вероятно, что уменьшение гидравлической прово димости клеточных стенок с увеличением уровня засоления среды является важ ным фактором в адаптации растений к этому абиотическому стрессору, так как поток концентрированного по соли раствора к цитоплазматическому содержимо му клетки снижается.

Выводы 1. Ионообменные свойства полимерного матрикса клеточных стенок C. arieti num (Bivanij и ILC 482) и V. narbonesis определяются наличием в их составе четырех типов функциональных групп, которые способны принимать уча стие в обменных реакциях с ионами окружающей среды при соответствую щих условиях. Катионообменные свойства клеточных стенок обусловлены присутствием в них карбоксильных групп Dполигалактуроновой и окси коричных кислот, а также фенольных групп, а анионообменные – амино группами.

2. Относительная солеустойчивость растений увеличивается в соответствии с содержанием фенольных полимеров в матриксе клеточных стенок в ряду: C.

arietinum (Bivanij) C. arietinum (ILC 482) V. narbonesis.

3. Показано, что в ответ на засоление питательного раствора у растений из сем.

Fabaceae происходит снижение константы ионизации карбоксильных групп полигалактуроновой кислоты в стенках всех органов, в то время как констан ты диссоциации карбоксильных групп оксикоричных кислот и фенольных ОН-групп мало зависят от ионной силы внешнего раствора.

4. Ионообменная способность полимерного матрикса клеточных стенок корня, стебля и листьев нижнего яруса C. arietinum и V. narbonesis увеличивается с уровнем засоления питательного раствора на 10-20%. При всех концентраци ях хлористого натрия в среде способность к ионному обмену клеточных сте нок стебля выше, чем у корней и листа, так как клеточные стенки стебля со держат значительно больше карбоксильных групп Dполигалактуроновой кислоты.

5. Степень набухания клеточных стенок C. arietinum и V. narbonesis изменяется в зависимости от ионных условий и рН во внешнем растворе и апопласте.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Чегамирза К., Хонарманд С., Бахраминежад С. Изучение реакции разных гено типов пшеницы на солевой стресс. The second International Iran and Russia Confer ence «Agricultural and Natural Resources», 13-14 February 2001, Moscow, Russia, С.

15-16.

2. Мейчик Н.Р., Хонарманд С., Ермаков И.П. Сравнительная оценка ионообмен ной способности полимерного матрикса клеточных стенок, изолированных из разных тканей растений сем. FABACEAE. IV Международная научная конферен ция «РЕГУЛЯЦИЯ РОСТА, РАЗВИТИЯ И ПРОДУКТИВНОСТИ РАСТЕНИЙ», 26-28 октября 2005, Минск, Беларусь, С. 148.

3. Honarmand S.J., Meychik N.R., Yermakov I.P. Salinity effects on the germination and seedling growth of chickpea varieties. 13th Multi-disciplinary Iranian Researchers Conference in Europe, 2 July 2005, Leeds, UK, http://13th.irce.org 4. Yermakov I.P., Honarmand S.J., Meychik N.R. Diffusion of the organic cation in root cell walls. In the book «Plant nutrition for food security, human health and envi ronmental protection». Beijing, China, 2005, p. 568-569.

5. Meychik N.R., Honarmand S.J., Yermakov I.P. Diffusion of the organic cation in root cell walls of different plants. International scientific conference «Genetic and Physiological Fundamentals of Plant Growth and Productivity», 14-17 November 2006, Vilnius, Lithuania, p. 80-81.

6. Honarmand S.J., Meychik N.R., Yermakov I.P. Salinity effects on the growth and plant nutrition uptake of chickpea varieties. International scientific conference «Genetic and Physiological Fundamentals of Plant Growth and Productivity», 14-17 November 2006,Vilnius, Lithuania, p. 75-76.

7. Meychik N.R., Honarmand S.J., Yermakov I.P. Diffusion of the organic cation in root cell walls of different plants. Biology, 2007, №2, в печати.

8. Honarmand S.J., Meychik N.R., Yermakov I.P. Salinity effects on the growth and plant nutrition uptake of chickpea varieties. Biologija, 2007, №2, в печати.

9. Meychik N.R., Honarmand S.J., Nikolaeva J.I., Yermakov I.P. Ion exchange proper ties of cell walls of Cicer arietinum L. roots under different environmental salt condi tions. Biologija, 2007, №2, в печати.