Оптимизация биотехнологического производства субстанций рекомбинантных интерферонов человека для создания на их основе препаратов ветеринарного назначения
На правах рукописи
ГАВРИКОВ АЛЕКСЕЙ ВАЛЕРЬЕВИЧ Оптимизация биотехнологического производства субстанций рекомбинантных интерферонов человека для создания на их основе препаратов ветеринарного назначения 03.00.23. – биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2006 год 2
Работа выполнена в производственной лаборатории Закрытого Акционерного Общества «Мосагроген» (ЗАО «Мосагроген»).
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор С.В. Машко
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор А.С. Миронов кандидат технических наук, доцент А.Е. Кузнецов
Ведущая организация: Факультет Биоинженерии и Биоинформатики МГУ им. М.В. Ломоносова
Защита диссертации состоится «» декабря 2006 года в _часов на засе дании Диссертационного совета ДМ212.204.13 при Российском химико технологическом Университете имени Д.И. Менделеева по адресу: 125047 Мо сква, Миусская пл. 9.
С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре Российского химико-технологического Университета имени Д.И. Менделеева.
Автореферат разослан «_» ноября 2006 года.
Ученый секретарь Диссертационного совета ДМ212.204. кандидат технических наук И.В. Шакир
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы С развитием методов молекулярной биологии, биохимии и биотехноло гии повышаются требования качества к практически важным продуктам, полу чаемым в данных областях. Одним из примеров подобных тенденций является повышение чистоты фармакологических субстанций, полученных с использо ванием технологий «рекомбинантных ДНК». Это, в частности, относится к бел ку, лекарственные препараты которого существуют уже более 20-и лет, – чело веческому рекомбинантному интерферону -2b.
Наиболее выгодным экономически является использование штаммов продуцентов, в которых уровень биосинтеза целевого белка составляет десятки процентов от суммарных клеточных полипептидов (в этих случаях, как прави ло, гетерологичный белок накапливается в бактериальной клетке в виде нерас творимых конгломератов – телец включения).
Создание подобных бактериальных штаммов-продуцентов возможно только при соблюдении ряда условий, один из которых – стабильность мРНК при экспрессии целевого гена. Основным фактором стабильности мРНК и эф фективности ее трансляции, является кодоновая композиция гетерологичного рекомбинантного гена. При наличии редко встречающихся аминокислотных кодонов, в гене, клонированном в составе мультикопийного экспрессионного вектора, подобная генетическая конструкция будет нежизнеспособна, или же, уровень синтеза целевого белка будет крайне низким. Другим фактором неэф фективной экспрессии гетерологичного гена может являться интерференция процесса транскрипции гена (особенно, с сильного бактериального или фагово го промотора) с процессом репликации рекомбинантной плазмиды, что воз можно даже при наличии теминатора транскрипции в 3’-концевой нетрансли руемой области целевого гена.
Повышение требований к чистоте препаратов на основе рекомбинантных белков, выделяемых из бактериальных штаммов-продуцентов, потребовало развитие новых биохимических методов анализа белков. Появились такие ана лизы на чистоту, как анализ ВЭЖХ, тесты на остаточную ДНК и на остаточные белки штамма-хозяина и вектора. Тест на пирогенность постепенно вытесняет ся тестом на бактериальные эндотоксины (ЛАЛ-тест). Усложнение аналитиче ского контроля привело к принципиальным изменениям технологий производ ства субстанции рекомбинантных белков, т.к. применение старых технологиче ских путей являлось не удовлетворительным по качеству конечного продукта, или же, экономически невыгодным.
При суперсинтезе гетерологичных белков в клетках E. coli (в таких коли чествах, что целевой белок начинает образовывать тельца включения), бактери альные клетки находятся в состоянии стресса. Во многих случаях бактериаль ная культура практически не растет после индукции синтеза целевого белка.
Кроме того, в условиях стресса, накапливающиеся в тельцах включения белки могут иметь нежелательные модификации, начиная с неотщепленного N концевого метионина, и заканчивая ацетилированием или окислением некото рых аминокислотных остатков белка. Подобные модифицированные варианты могут не отделяться от целевого белка при его очистке с помощью различных видов гидрофобной и ионообменной жидкостной хроматографий (не говоря уже про аффинную и гель-фильтрационную), так как при модификации изме нение конформации белка не происходит, а изменение массы и заряда ничтож но мало по сравнению немодифицированной молекулой. Но при правильном подборе условий модифицированный белок можно детектировать ОФ-ВЭЖХ, а, следовательно, при большом количестве таких молекул в препарате, он не удовлетворяет критериям необходимой чистоты.
Было замечено, что количество и характер подобных примесей в препара тах рекомбинантных белков зависит от условий ферментации штамма продуцента, а не только от использованной технологии выделения и очистки целевого продукта.
Таким образом, процесс получения высокоочищенной субстанции реком бинантного белка для ее дальнейшего практического использования при созда нии медицинских или ветеринарных препаратов представляет собой комплекс ную задачу, изменения одного из этапов которой, значительно влияет на ос тальные этапы.
Цели и задачи работы.
Целями работы являлись:
1) увеличение эффективности биосинтеза рекомбинантного интерферона бактериальными продуцентами (на примере лейкоцитарного интерферона -F человека);
2) исследование влияния условий ферментации рекомбинантных штаммов E. coli на образование модифицированных примесей целевого белка (на примере штамма-продуцента интерферона -2b человека);
3) исследование возможности создания технологии выделения и очистки интерферона -2b биомассы штамма-продуцента с оптимальным соотно шением «цена-качество».
В ходе работы были решены следующие задачи:
• Созданы и клонированы варианты гена человеческого -F интерфе рона с различными заменами редко встречающихся эукариотиче ских кодонов.
• Создан штамм-суперпродуцент человеческого рекомбинантного интерферона -2b.
• Разработаны несколько вариантов регламента ферментации штам ма-продуцента человеческого рекомбинантного интерферона -2b.
• Созданы несколько вариантов технологии выделения и очистки че ловеческого рекомбинантного интерферона -2b.
Научная новизна и практическая ценность работы.
В ходе работы было подробно рассмотрено влияние редко встречающих ся в E.coli аминокислотных кодонов на экспрессию гетерологичного гена, рас положенного на мультикопийном экспрессионном векторе, под контролем ре гуляторных элементов транскрипции бактериофага Т7.
Разработан протокол ферментации штамма-продуцента интерферона 2b, в котором индукция синтеза интерферона осуществляется лактозой, вместо добавления ИПТГ. Подобный подход значительно снижает себестоимость про цесса ферментации. А также позволяет получать большие количества целевого продукта.
Показано, что за счет оптимизации процесса ферментации можно полу чать полупродукт более высокого качества, что позволяет упростить дальней ший процесс очистки интерферона, уменьшив количество хроматографических стадий, т.е. понизить себестоимость продукта.
Разработанные технологии позволили увеличить рентабельность произ водства субстанции интерферона -2b на базе предприятия ЗАО «Мосагроген», Москва. Получаемая субстанция интерферона -2b используется для приготов ления ветеринарных лекарственных препаратов «Миксоферон®» и «Кино рон®».
Апробация работы Материалы диссертации докладывались на: Международной конферен ции «Молекулярные механизмы генетических процессов» (Москва-Минск, но ябрь 2001 г.);
конференции, посвященной 60-тилетию МИФИ, (Москва, январь 2002);
научно-производственных семинарах ЗАО «Мосагроген» (Москва, 2004 2006);
семинаре отдела молекулярной биологии и биотехнологии ФГУП Гос НИИгенетика (Москва, октябрь 2006).
Публикации По теме диссертации опубликовано четыре статьи в отечественных жур налах и одно тезисное сообщение в материалах научных конференций.
Структура и объем работы Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Материалов и ме тодов, Результатов и обсуждения, Выводов и Списка литературы. Работа изло жена на страницах, включая рисунков и таблиц. Список ци тируемой литературы содержит источников, в том числе на рус ском языке.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
.
1. Исследования влияния различных факторов на уровень экспрессии гена интерферона -F человека в системе транскрипции бактериофага Т7.
1.1. Создание вариантов гена интерферона -F человека с различными заменами редко встречающихся в E.coli аминокислотных кодонов.
Человеческий интерферон -F является одним из лейкоцитарных интер феронов. В своем природном варианте ген интерферона -F содержит редко встречающиеся для E. coli аминокислотные кодоны – Arg – 6 кодонов AGA и Рис. 1. Природный ген человеческого лейкоцитарного интерферона -F.
Цветом отмечены редко встречающиеся в E. coli кодоны.
1 11 21 31 41 51 MCDLPQTHSLGNRRALILLA atgtgtgatctgcctcagacccacagcctgggtaataggagggccttgatactcctggca 61 71 81 91 101 111 QMGRISPFSCLKDRHDFGFP caaatgggaagaatctctcctttctcctgcctgaaggacagacatgactttggattcccc 121 131 141 151 161 171 QEEFDGNQFQKAQAISVLHE caggaggagtttgatggcaaccagttccagaaggctcaagccatctctgtcctccatgag 181 191 201 211 221 231 MIQQTFNLFSTKDSSATWEQ atgatccagcagaccttcaatctcttcagcacaaaggactcatctgctacttgggaacag 241 251 261 271 281 291 SLLEKFSTELNQQLNDLEAC agcctcctagaaaaattttccactgaacttaaccagcagctgaatgacctggaagcctgc 301 311 321 331 341 351 VIQEVGVEETPLMNVDSILA gtgatacaggaggttggggtggaagagactcccctgatgaatgtggactccatcctggct 361 371 381 391 401 411 VKKYFQRITLYLTEKKYSPC gtgaagaaatacttccaaagaatcactctttatctgacagagaagaaatacagcccttgt 421 431 441 451 461 471 AWEVVRAEIMRSFSLSKIFQ gcctgggaggttgtcagagcagaaatcatgagatccttctctttatcaaaaatttttcaa 481 491 ERLRRKE& gaaagattaaggaggaaggaataa кодона AGG, а также относительно редко встречающиеся Pro (2 – CCC), Ile (2 – AUA), Leu (1 – CUA) и Gly (2 – GGA) кодоны (См. рис 1). Одним из факторов стабильности мРНК и эффективности ее трансляции, является кодоновая ком позиция гетерологичного гена.
Существует большое количество данных, когда замена редко встречающих ся в E. coli Arg-кодонов AGA/AGG на синонимичные прокариотические в гене, кодирующем гетерологичный белок, приводила к многократному увеличению его продукции (до 20 – 50% от суммарного клеточного белка). В E. coli эти ко доны встречаются со следующими частотами – AGA – 2,8 на тысячу кодонов, AGG – 1,7 на тысячу, при максимальной встречаемости Arg-кодонов – CGU, CGC - 20,6. В то время, как, например, у человека – 11,5 и 11,3 соответственно (максимальное – CGG – 11,6). В природном гене IFN-F находится 10 таких кодонов (2% от всех кодонов в гене). Наличие тандемов AGA или AGG кодо нов, с большой вероятностью приводит к «сдвигу рамки считывания» при трансляции соответствующего гена в E.coli (Spanjaard, R.A., et al. (1990). Nu cleic Acids Res. 18(17): 5031-6). Подобных тандемов в гене интерферона -F два – AGGAGG – 37-42 пар оснований и 490-495 п.о., при общем размере гена – п.о. Одиночные Arg-кодоны встречаются исключительно как AGA (см., Рис. 1).
Методом ПЦР в природном гене интерферона были заменены редко встре чающиеся для E. coli кодоны, на часто встречающиеся. В ходе работы были созданы пять вариантов гена интерферона -F. Гены клонированы на pET22b(+). Полученными плазмидными ДНК был трансформирован штамм TG1. После отбора клонов методом рестрикционного анализа, соответствие по следовательности генов запланированной было подтверждено сиквенированием ДНК методом Сэнгера. Характер нуклеотидных замен и их количество для раз ных генов интерферона -F, представлены в Таблице 1.
Полученными плазмидами с различными вариантами гена (кроме вариан та №1), были трансформированы клетки штамма E. coli BL21(DE3). Трансфор манты культивировали в пробирках, в V = 5 мл жидкой среды LB // 100 мкг/мл ампициллина, при 37°С и 240 rpm, до значений оптической плотности 0,5-0,6 и индуцировали добавлением ИПТГ до 1 мМ, после чего культивировали еще часа, и определяли количество интерферона методом белкового SDS электро фореза и методом биологического тестирования. Результаты представлены в Таблице 2.
Вариант № 1 представлял собой природный ген интерферона -F, без из менения кодонов, клонированный на pET22b(+) c плазмиды pPR-TGATG-CI IFN-F. Проверка клонов показала очень низкий процент вставки. Последующее сиквенирование генов отобранных клонов выявило наличие мутаций, приводя щих к сдвигу рамки считывания, т.е. клонировать природный ген в экспресси онную систему под контролем регуляторных элементов фага Т7 не удалось.
Рекомбинантные плазмиды с вариантами генов № 3 и № 4 не давали кло нов после трансформации штамма BL21(DE3).
Характеристики роста индуцированных штаммов с вариантами гена № и № 5 были примерно одинаковыми, но у штамма с вариантом гена № 6 (у ко торого заменены все редко встречающиеся кодоны) ODконечная была в 3 раза выше.
Как видно из Таблицы 1, жизнеспособными оказались варианты гена с заменами Arg-кодонов в 3’-области (R, 484-486: AGA CGT и тандем R-R, 490-495: AGGAGG CGTCGT), что, похоже, является обязательным условием «выживаемости» генетической конструкции. Количество остальных редко встречающихся кодонов в гене интерферона влияет на выход продукта и харак теристики роста культуры. Чем их остается больше в структуре гена, тем хуже рост рекомбинантного штамма и меньше нарабатывается целевого белка.
Таблица 1. Нуклеотидные замены для разных вариантов синтетического гена интерферона -F. Вариант №1 – природный ген интерфе рона -F, без замен.
Замены, Варианты генов, наличие замены А.к., положение кодона, замена 1 2 3 4 5 R-R, 37-42 : AGGAGG CGTCGT - - + + - + I, 49-51 : ATA ATT - - + + - + G, 67-69 : GGA GGC - + + + - + R, 70-72 : AGA CGT - + + + - + R, 100-102 : AGA CGT - + - + + + G, 112-114 : GGA GGC - + - + + + P, 118-120 : CCC CCG - + - + + + L, 247-249 : CTA CTG - + - - - + I, 304-306 : ATA ATT - + - - - + G, 316-318 : GGG GGC - + - - - + P, 331-333 : CCC CCG - + - - - + R, 379-381 : AGA CGT - + - - - + R, 436-438 : AGA CGT - + - - - + R, 451-453 : AGA CGT - + - - - + R, 484-486 : AGA CGT - + - - + + R-R, 490-495 : AGGAGG CGTCGT - + - - + + Таблица 2. Данные белкового электрофореза и биотеста штаммов BL21(DE3)[pET22b(+)-IFN-alphaF-i]. Где i – варианты гена.
Данные биотеста нормированы на OD культуры.
Номер варианта 1 2 3 4 5 Накопление продукта, - - (8,0±1,5) (4,5±1,0) (8,5±1,0) 104 104 Биотест, МЕ/мл /о.е.
Накопление продукта, электрофорез, % от - ND - - ND 7- суммарного клеточ ного белка 1.2. Влияние терминаторов транскрипции в 3’-нетранслируемой облас ти гена на уровень биосинтеза интерферона -F.
Хорошо известно, что терминация транскрипции, осуществляемая РНК полимеразой фага Т7 (РПТ7), недостаточно эффективна. Она, как правило, не происходит в участках эффективной -независимой терминации РНК полиме разой E.coli, более того, даже строго специфический терминатор транскрипции фага Т7 – T, обеспечивает терминацию фаговой полимеразы in vivo с эффек тивностью не более 60% (McAllister, W.T., Morris, C., Rosenberg, A.H., et al.// J.
Mol. Biol. – 1981 – V. 153 – P. 527 – 544). Для предотвращения циклической транскрипции, инициированной в составе векторной плазмиды с фагового про мотора, а возможно также и для потенциальной стабилизации 3’-концевого уча стка мРНК целевого гена, в состав экспрессионных векторов, как правило, вво дят терминатор транскрипции T.
Было сделано предположение, что наличие одной копии терминатора транскрипции в 3’-концевой не транслируемой области гена недостаточно для максимизации уровня биосинтеза белка и стабилизации всего штамма в целом.
Используя технику ПЦР в плазмиду pET22b(+)-IFN-alpha-F (вариант гена № 6, в котором заменены все редко встречающиеся для E. coli кодоны) была клонирована вторая копия терминатора транскрипции T. Отбор клонов мето дом рестрикционного анализа осуществлялся с штамме TG1. Полученной плаз мидной ДНК, был трансформирован штамм BL21(DE3). Трансформанты куль тивировали на жидкой среде до значений оптической плотности 0,5-0,6 и инду цировали 1 мМ ИПТГ, после чего культивировали еще 2 часа.
В результате, по данным биологического тестирования и результатам белкового SDS электрофореза, накопление продукта в штамме, имеющем в ре комбинантной плазмиде два терминатора транскрипции, увеличилось в три раза, (см., Рис. 2).
Также, из Рис. 2А видно, что одновременно с накоплением hIFN-F в условиях индукции достаточно эффективно синтезируется еще один полипеп тид с молекулярной массой примерно 32 kDa, при этом уровень его накопления также, как и уровень накопления интерферона, достигает около 7-10% от сум марных клеточных белков. Среди полипептидов, кодируемых векторной ча стью рекомбинантной плазмиды хорошим кандидатом на потенциальную ин дуцибельную экспрессию в системе транскрипции фага Т7 является предшест венник -лактамазы, ген которой расположен по ходу транскрипции с промото ра 10 за терминатором Т. Образующийся в этом случае белок, с неудаленной в результате недостаточно эффективной секреции в периплазму сигнальной по следовательностью, должен был бы обладать молекулярной массой как раз примерно 32 kDa.
Из Рис. 2В видно, что уровень синтеза целевого белка значительно возрос и составил более 22% от суммарных клеточных белков. Ранее тестируемый уровень индуцибельного синтеза белка с массой около 32 kDa в клетках с новой плазмидой значительно снизился и практически не отличался от его содержа ния в условиях репрессии РПТ7. Таким образом, введение второй копии терми натора транскрипции Т в 3’-нетранслируемую часть клонированного гена hIFN-F не только уменьшило «сквозную» транскрипцию, инициированную с промотора 10, что в свою очередь привело к снижению уровня экспрессии дистально расположенных по отношению к терминаторам генов, но и значи тельно повысило эффективность накопления целевого белкового продукта.
Рис. 2. Электрофореграмма суммарных клеточных белков штаммов BL21 (DE3)(pET22b(+)-IFN-F) и BL21(DE3)(pET22b(+)-IFN-F-2Т).
1 2 3 1 2 А В предшествен ник -лактамазы hIFN-F А. Накопление целевого продукта в штамме BL21(DE3)(pET22b(+)-IFN-alphaF).
№1 – белки-стандарты молекулярных масс (сверху вниз – 116 кДа, 66 кДа, 45 кДа, 35 кДа, 25 кДа, 18,4 кДа, 14, кДа).
№2 – через 2 часа после индукции 1мМ ИПТГ.
№3 – без индукции ИПТГ В. Накопление целевого продукта в штамме BL21(DE3)(pET22b(+)-IFN-alphaF-2Т).
№1 – белки-стандарты молекулярных масс (сверху вниз – 116 кДа, 66 кДа, 45 кДа, 35 кДа, 25 кДа, 18,4 кДа, 14, кДа).
№2 – без индукции ИПТГ.
№3 – через 2 часа после индукции 1мМ ИПТГ.
2. Создание штамма-продуцента интерферона -2b и оптимизация усло вий его регулируемой ферментации.
2.1. Создание штамма-продуцента.
Человеческий интерферон -2b представляет белковую молекулу из аминокислотных остатков и размером около 19 кДа. Он имеет четыре остатка цистеина и, соответственно, две дисульфидные связи (Cys-1 – Cys-98 и Cys-29 – Cys-138), одна из которых (Cys-29 – Cys-138) существенна для антивирусной активности интерферона (Morehead, H., et al. //Biochemistry – 1984 – V. 23 – P.
2500 – 2507). Человеческие интерфероны -F и -2 имеют 83 % гомологии.
Ген интерферона альфа-2b был собран из олигонуклеотидов методом ПЦР по теоретической последовательности, описанной ранее (Колосов, М.Н., и др./ Авторское свидетельство СССР № 1092176 – 1984 - Бюл. Изобр. № 18), и клонирован по сайтам BamHI и NdeI в экспрессионный вектор pET22(b+)-2Т, имеющий две копии терминатора транскрипции. Штамм TG1 был трансформи рован полученной плазмидой рЕТ22(b+)-IFN-2Т. После отбора клонов содер жащих вставку гена интерферона методом рестрикционного анализа, соот ветствие полученной последовательности гена теоретической, была подтвер ждена постановкой сиквенса ДНК методом Сэнгера. Полученной плазмидной ДНК, был трансформирован штамм BL21(DE3). Трансформанты культивирова ли на жидкой среде до значений оптической плотности 0,5-0,6 и индуцировали ИПТГ, после чего культивировали еще 2 часа, и определяли количество интер ферона методом белкового SDS электрофореза. Идентичность синтезированно го бактериями полипептида человеческому лейкоцитарному интерферону -2b была подтверждена методами биологического тестирования и ИФА. Количест во интерферона -2b, определенное методом белкового SDS электрофореза, со ставило около 30 % от суммарного клеточного белка.
2.2. Оптимизация условий культивирования штамма-продуцента IFN 2b на лабораторном (2-х л) ферментере Multigen.
Как показано ниже, ключевым моментом, как на стадии культивирования, так и в технологии выделения и очистки интерферона, является выбор индукто ра синтеза интерферона. Были рассмотрены различные параметры условий культивирования и два индуктора – синтетический аналог лактозы, ИПТГ, и сама лактоза.
Единичная колония штамма BL21(DE3)[рЕТ22(b+)-IFN-2Т] пересевалась в колбу с 30 мл среды Лурия-Бертани (для дозы посевного материала 1:100 – две пробирки по 5 мл;
для дозы посевного материала 1:10 – три колбы по 50 мл) с 100 мкг/мл ампициллина и культивировалась в течении 7-и часов при 37С и 240 rpm. Далее содержимым колбы засевали лабораторный ферментер Multigen (1,5 л рабочий объем), используя синтетическую среду М9 с триптоном (10 г/л), дрожжевым экстрактом (5 г/л), глюкозой (3 %) и ампициллином (200 мкг/мл).
Клетки культивировали до плотности индукции, после чего в культуру добав ляли ИПТГ или лактозу. И далее культивировали до тех пор пока изменение оптической плотности культуры не упадет до 1 о.е./час. рН-статирование про цесса в обоих случаях поддерживалось на рН = 6,8 12% раствором аммония.
Аэрация – 25 % растворенного кислорода от насыщения до и после индукции ИПТГ, а после индукции лактозой – 50 %. После окончания ферментации клет ки собирали центрифугированием 20 минут, 7000 об/мин при 4С.
Были подобраны такие параметры как доза посевного материала, опти мальные концентрации индукторов, определены точки индукции. Выходными параметрами для каждого эксперимента являлись: % интерферона от суммарно го клеточного белка, (определялось электрофорезом), выход влажной биомассы после окончания процесса, г на 1 л к.ж., общее время роста культуры в фермен тере, часы.
Инокулят вносили в количестве 1/50 от конечного объема ферментацион ной среды. ИПТГ добавлялось при достижении оптической плотности культу ры 10 о.е. При «позднем» добавлении ИПТГ (15 – 20 о.е.) образовывались меньшие количества интерферона, чем при более раннем. Возможно, данного количества ИПТГ не хватало имеющимся, на тот момент, количествам клеток для максимальной индукции. Но и очень раннее добавление (5 о.е.) не было оп тимальным, так как сильно ингибировало дальнейший рост культуры. ИПТГ вносили до конечной концентрации 1 мМ, т.к. меньшие количества (менее 0, мМ) не позволяли достичь необходимого уровня накопления продукта, а боль шие количества (более 2 мМ) значительно ингибировали рост культуры при том же уровне продукта.
Для лактозы точка индукции специально не подбиралась, так как пока в культуральной среде содержится глюкоза, лактоза не утилизируется. При зна чениях OD540 культуры около 30 о.е. достигается падение концентрации глюко зы в среде ниже значений 0,5 %. При этих оптических плотностях культуры до бавлялась лактоза. Был проведен ряд экспериментов, в которых лактоза добав лялась при более низких значениях OD540 (от 10 до 20 о.е.), при этом, количест во синтезировавшегося интерферона было значительно меньше (ниже 15 %) обычного.
Одного процента лактозы было не достаточно для полной индукции того количества бактериальной культуры, которое накапливалось на момент индук ции. Кроме того, лактоза для клеток является не только индуктором, но и ис точником углерода, что видно из характеристик роста (выхода биомассы, вре мени роста после индукции и общего времени роста культуры). С другой сто роны, ни по количеству продукта, ни по характеристикам роста культуры до бавление трех процентов лактозы ничем не отличается от добавления двух про центов.
На Рис. 3 представлены кривые роста и накопления продукта в ходе фер ментационных процессов, с оптимальными параметрами для каждого индукто ра. Для процесса, индуцируемого лактозой, появление «ступеньки» на графике кривой роста связано не только с хорошо известным ростом бактериальной культуры на двух субстратах, но и с разбавлением культуры за счет внесения лактозы (разбавление на 10 % по объему).
Как видно из Рис. 3, OD540 процессов с индукцией лактозой выше почти в два раза по сравнению с индукцией ИПТГ, что также подтверждается выходами влажной биомассы с литра культуральной жидкости – 30 ± 5 г/л – для процес сов с индукцией ИПТГ и 55 ± 5 г/л – для процессов с индукцией лактозой. При одинаковом количестве интерферона (в % от суммарного клеточного белка) на работка белка при индукции лактозой шла более плавно, в отличие от индукции IPTG. При этом в бактериальных клетках индуцируется синтез ферментов ути лизации лактозы и, как бы, «побочно» происходит синтез интерферона. Бакте риальная культура начинает активно расти после перехода на новый субстрат,.
Клетки не находятся в стрессе резкого «мегасинтеза» гетерологичного белка, что происходит при индукции IPTG.
В результате, при сравнении этих двух условий культивирования штам ма-продуцента интерферона, получается, что при использовании лактозы в ка честве индуктора, выход бактериальной биомассы в два раза выше, а себестои мость процесса ниже (за счет отказа от использования ИПТГ).
Рис. 3. Кривые роста и накопления интерферона, при использовании двух индукторов – лактозы (2 %) и ИПТГ (1 мМ).
А – индукция культуры ИПТГ. В – индукция культуры лактозой.
А DO-540, o.e.35 35 % IFN от суммарного 30 клеточного белка 25 20 15 10 5 0 = время, часы DO-540 % IFN 70 DO-540, o.e.
В 60 30 % IFN, от суммарногот 50 25 клеточного белка 40 30 20 10 0 время, часы = DO-540 % IFN 2.3. Масштабирование ферментационного процесса на промышленном (30 л) ферментере Marubishi.
Процесс культивирования штамма-продуцента интерферона -2b был масштабирован с лабораторного ферментера Multigen на промышленный 30 л ферментер Marubishi. Часть параметров осталась без изменений – ферментаци онная среда, доза посевного материала, аэрация (подача воздуха) 1:1, точка по дачи индуктора, концентрация индуктора, рН-статирование. Некоторые пара метры пришлось модифицировать. Подача глюкозы осуществлялась не разово, 3% при засеве, а по 1% на каждые 10 о.е. роста культуры, начиная с момента засева. Подача лактозы, также осуществлялась дробно, по 1% в точке индукции и на следующий час. Посевной материал приготовлялся в две стадии.
Подобный подход позволил выйти на те же параметры, что и при культи вировании в лабораторном ферментере. При подаче сахаров разово (3% глюко зы при засеве и 2% лактозы в точке индукции) рост культуры отличался в худ шую сторону от лабораторного варианта.
Также был изменен параметр аэрации. Скорость вращения мешалки явля лась функцией от % растворенного в среде кислорода (DO). Во время интен сивного роста до добавления лактозы, аэрация является лимитирующим факто ром, мешалка работала на максимально возможных оборотах, но % раство ренного кислорода не превышал 20 %. С падением концентрации глюкозы в среде до лимитирующих рост значений (около 6-го часа), % DO повышался, т.к.
останавливается рост культуры. В этот момент добавляли индуктор и источник углерода – лактозу. Бактериальные клетки перестраивают метаболизм для воз можности утилизировать лактозу, на кривой роста культуры образуется сту пенька.
С 7-го часа промышленной ферментации начинается рост клеток штамма продуцента интерферона на лактозе, % растворенного кислорода опять падает, индуцируется биосинтез интерферона. На этой стадии % DO поддерживали по стоянным (около 50 %). К 12-14 часу рост культуры прекращался, DO подни малось до 95 %, количество синтезированного интерферона в клетках достига ло 30 % от суммарного белка.
Усредненные данные по десяти ферментационным процессам представ лены на Рис. 4.
Рис. 4. Кривые роста, накопления продукта и % растворенного кислорода, в ходе ферментационного процесса на 30-л ферментере.
OD-540 % IFN %, DO 100 80 % IFN // % DO 60 OD- 40 20 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 t, часы 3. Создание технологии выделения и очистки субстанции человеческого рекомбинантного интерферона -2b.
3.1. Получение грубого экстракта нативного мономера интерферона.
Биомассу, полученную после проведения ферментации сразу, без замо раживания, ресуспендировали в дезинтеграционном буфере и разрушали на проточном дезинтеграторе (френч-пресс).
Однократная дезинтеграция клеточной биомассы приводила к разруше нию 93 – 95% клеток (данные микроскопии). После повторной дезинтеграции оставалось менее 0,5% целых клеток. При недостаточной дезинтеграции кле точной биомассы, оставшиеся целыми бактериальные клетки, осаждаются вме сте с тельцами включения интерферона (ТВ) при процедурах отмывок и лизи руют при растворении осадка телец включения в GuHCl. Таким образом, нук леиновые кислоты (ДНК) этих клеток дополнительно загрязняют раствор де натурированного белка и способствуют выпадению интерферона в осадок в по следующем процессе ренатурации, что уменьшает выходы интерферона на этом этапе.
По этой же причине, были рассмотрены несколько различных буферов для отмывки телец включения. Этап отмывки ТВ, сам по себе, сильно увеличи вает выходы мономера интерферона после этапа ренатурации, по сравнению с не отмывавшимися ТВ. Применение солевых растворов в высокой концентра ции (0,5 – 2 М) не отличалось от отмывки дистиллятом. Применение детерген тов (мочевина – от 1 до 7 М, GuHCl – от 0,3 до 3 М, Тритон Х-100, Твин-20, Твин-80, Бридж, Нонидет – от 0,1 до 1 %) приводило к увеличению чистоты ин терферона после этапа отмывки, но не увеличивало эффекости ренатурации, и было причиной значительных потерь продукта в процессе этапа отмывки. Уве личение соотношения ТВ : Буфер, соответственно, увеличивало объемы, и, сле довательно, снижало рентабельность и увеличивало трудоемкость процесса.
Наиболее оптимальные результаты были получены при использовании двух кратной отмывки ТВ дистиллятом (с промежуточными ресуспендированиями).
Отмытые ТВ интерферона сразу пускали в дальнейшую работу или хра нили в замороженном виде при -20°С до 6 месяцев. При увеличении срока хра нения ТВ снижался выход мономера интерферона после этапа ренатурации.
Растворение осадка ТВ проводили в растворе 7М GuHCl, смешивая сухую навеску гуанидин гидрохлорида, осадок отмытых телец включения и 10 и кратный буферный раствор Tris-HCl, рН = 8,0, доводя конечный объем до расчетного. При этом концентрация суммарного белка в растворе составляла 30-35 г/л.
Более полное растворение, а также деполимеризация интерферона дости галась проведением реакции окислительного сульфитолиза, с использованием сульфита натрия. Эта реакция более полно расщепляла хаотично замкнутые S-S связи полимеров интерферона, чем восстановление дитиотреитолом или 2 меркаптоэтанолом, и позволяла работать при очень высоких концентрациях белка, значительно уменьшая расход GuHCl.
После проведения диафильтрации для удаления GuHCl и сульфита, и до полнительным восстановлением 2-меркаптоэтанолом, интерферон ренатуриру ет в течение двух суток, без перемешивания, при температуре около 4-8°С в мМ фосфатном буфере.
На характер прохождения ренатурации могут влиять наличие в ренатура ционном буфере солей, детергентов, а также исходная чистота и концентрация целевого белка. Были рассмотрены несколько вариантов ренатурационного бу фера, но их влияние на выходы интерферона после ренатурации, и конечную чистоту грубого экстракта (и по данным белкового электрофореза и по данным ВЭЖХ) было незначительно.
По окончании ренатурации рН раствора переводят с 8,0 до 4,5 ледяной уксусной кислотой. На данном этапе образуется осадок, который убирают фильтрацией. В осадок выпадает часть бактериальных белков, часть непра вильно и правильно собранных интерферонов. Возможны существенные потери интерферона. Это связано с условиями хранения телец включения (заморажи вались ли они и на какой срок, или же сразу после получения растворялись в GuHCl), а также с содержанием примесей в ренатурационной смеси: нуклеино вых кислот, бактериальных белков, которые могут являться центрами коагуля ции интерферона, из-за сильной гидрофобности последнего.
Выходы интерферона в процессе получения грубого экстракта даны в Таблице 3. Суммарный выход составляет около 70% и для полуфабриката ин терферона, полученного из биомассы, индуцированной лактозой и для полу фабриката интерферона, полученного из биомассы, индуцированной ИПТГ.
Табл. 3. Выходы интерферона в процессе получения грубого экстракта, вычислялись по данным измерения концентраций белка и дан ным SDS-ПАА гель электрофореза в восстановленных условиях.
Этап V, л Мбелка, г МIFN, г Выход IFN, % Биомасса после сепа- 1 90 27 рации Дезинтеграция, френч- 5 60 26,7 пресс Отмывка ТВ, Н2О 2х2 35 25,4 Растворение, GuHCl 2 35 25,4 Разведение, фосфат- 20 35 25,4 ный буфер Микрофильтрация, 19,5 28 22,9 0,45 мкм Диафильтрация, 10кДа 10 25 21,8 Ренатурация 50 25 21,8 Микрофильтрация, 49 22 19,6 0,45 мкм Концентрирова- 10 20 18,6 ние/Диафильтрация, 10кДа В отличие от чистоты грубого экстракта по SDS-ПАА гель электрофорезу (93% в восстановленных условиях и около 90% – в невосстановленных), чисто та полуфабриката по ВЭЖХ составляла 45 – 70%, в зависимости от биомассы.
На Рис.5 хорошо видно, что использование лактозы, вместо ИПТГ в качестве индуктора при проведении ферментации значительно снижает количество мо дифицированного интерферона. Пики № 4 и 5 на Рис. 5 В (индуктор - ИПТГ), полностью отсутствуют на Рис. 5 С (индуктор - Лактоза), и, кроме того, пики № 6,7 (Рис. 5 В) стали значительно меньше (на Рис. 5 С это пики № 4,5).
3.2. Хроматография на катионите SP-Toyopearl 550-С.
Для дальнейшей очистки грубого экстракта интерферона необходимы хроматографические методы. При этом основным вопросом чистоты конечной субстанции интерферона является вопрос используемых методов анализа.
Практически любым методом ионообменной хроматографии низкого давления можно получить субстанцию интерферона с чистотой выше 95 – 98% по дан ным SDS-ПАА гель электрофореза в восстановленных и невосстановленных условиях, так как отделить интерферон от примесных белков Escherichia coli, а также от полученных в ходе ренатурации ди-, три- и полимеров интерферона не представляет сложности.
Рис. 5. Профили хроматограмм ВЭЖХ.
А – стандарт интерферона, Биотехна, Литва, содержание нативного интерферона альфа-2b – 97 %. В – гру бый экстракт интерферона, полученный из биомассы индуцированной ИПТГ, содержание нативного ин терферона альфа-2b – 48 %. С – грубый экстракт интерферона, полученный из биомассы индуцированной лактозой, содержание нативного интерферона альфа-2b – 72 %.
А mV 400 ch 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 мин В mV 40 20 ch 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 мин С mV 4 ch 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 мин При использовании в качестве анализа на чистоту ОФ-ВЭЖХ становятся видны примеси интерфероновой природы, не доступные другим методам ана лиза. Результаты представленные на Рис. 6 получены для субстанции из био массы индуцированной лактозой. Сходных результатов для субстанции из био массы индуцированной ИПТГ удавалось достичь только за счет использова ния рехроматографии (и то не всегда), что естественно, снижало выходы ко нечного продукта и увеличивало себестоимость процесса.
Выход интерферона на этапе хроматографической очистки составляет от 75 до 92 %, в среднем – (84 ± 9)%. Общий выход технологии выделения и очи стки интерферона, от биомассы до этапа очистки на SP-Toyopearl – (58 ± 6) % Рис. 6. Анализ ВЭЖХ субстанции интерферона после очистки на SP Toyopearl’е.
mV ch 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 мин Как видно из Рис. 6, получаемый после очистки на сорбенте SP-Toyopearl интерферон имеет два пика. Первый пик, содержание которого зависит от свойств биомассы (т.е. не определенных пока характеристик процесса фермен тации), составляет от 4 до 10% (от суммы «переднего» и «нативного» пиков) для биомассы, полученной в ферментационном процессе с использованием лак тозы в качестве индуктора. Т.е. чистота по ВЭЖХ нативного интерферона со ставляет от 90 до 96%. Для биомассы, получаемой в ферментационном процес се с использованием ИПТГ в качестве индуктора, количество переднего пика составляло от 8 до 20%, т.е. ровно в два раза больше.
«Первый» пик на Рис. 6, также как и нативный интерферон, обладает биологической активностью (он был выделен с использованием полу препаративного ВЭЖХ, и проверен на биологическую активность), его удель ная активность равна удельной активности нативного интерферона. По данным N-концевого секвинирования белки в этом пике, также как и выделяемый ин терферон, не содержат N-концевого метионина, и, по-видимому, представляют собой некий вариант пост-трансляционно-модифицированного интерферона.
3.3. Хроматография на полу-препаративном ОФ-ВЭЖХ, ODS.
Дальнейшая очистка продукта от данной примеси (пик № 1 на Рис. 6) осуществлялась методами препаративной ОФ-ВЭЖХ, с использованием сталь ной колонки ODS, 300 А, 5 мкм, 4,6х250 мм, Jupiter, Phenomenex. Субстанцию интерферона (с исходной чистотой по ВЭЖХ – 93%) наносили через инжектор (1 мл), масса нанесения – 1,5 мг. Отбор фракций осуществляли с 10 по 15-ю минуты (25 фракций). Объединили фракции с 5 по 18-ю (см., Рис. 7).
Профиль препаративной хроматографии представлен на Рис. 7. Из ри сунка видно, что при нанесении на ВЭЖХ колонку препаративных количеств белка (1,5 мг), становятся видимыми остаточные пики, которые не детектиру ются при нанесении аналитических количеств (около 10 мкг, см., Рис. 6). Не смотря на их кажущиеся большие количества, при аналитическом детектирова нии они составляют менее 0,01 % (пределы интегрирования). «Передний» пик, составляющий около 7%, при таких количествах нанесения, не разделялся, а выходил одним пиком с нативным интерфероном. Результаты анализов, полу ченной после препаративного ВЭЖХ субстанции интерферона (объединенные фракции 5-18) представлены на Рис. 8. Выход этапа препаративного ВЭЖХ по нативному интерферону составил около 87%. Таким образом, общий выход (50 ± 5) %. Полученный интерферон имеет удельную активность (2,4 ± 0,2)х МЕ/мг, (биологическая активность измерялась после удаления из субстанции ацетонитрила и ТХУ методом диафильтрации в натрий-ацетатный буфер) что соответствует данным других авторов для фармакологически чистого препарата интерферона.
Рис. 7. Профиль препаративной ВЭЖХ.
mV ch 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 мин Рис. 8. Анализ ВЭЖХ субстанции интерферона, после очистки на препара тивной ВЭЖХ.
Передний пик – 0,99 %, нативный интерферон – 99,01 %.
mV 50 ch 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 мин Таким образом, субстанции интерферона получаемые по разработанной технологии имеют следующие показатели чистоты:
Метод После очистки ионообменной хро- После очистки препаративной матографей ОФ-ВЭЖХ ОФ-ВЭЖХ, 93 % 99 % ODS, 4,6х250 мм, 5 мкм, 300 А SDS электрофорез, восстанов- 98 % 99 % ленные условия, окраска сереб ром SDS электрофорез, не восстанов- 98 % 99 % ленные условия, окраска сереб ром Остаточные белки штамма- Около 50 нг на 1 мг белка Менее 5 нг на 1 мг белка продуцента, ИФА (менее 50 ррм) (менее 5 ррм) Остаточная ДНК штамма- Менее 150 пг на 1 мг белка Менее 150 пг на 1 мг белка продуцента и вектора, метод мо- (менее 0,15 ррм) (менее 0,15 ррм) лекулярной гибридизации Бактериальные эндотоксины, Около 20 МЕ, в объеме, который Менее 1 МЕ, в объеме, который со ЛАЛ-тест содержит 1 мг белка держит 1 мг белка (2,4 ± 0,2)х108 МЕ/мг (2,4 ± 0,2)х108 МЕ/мг Удельная Активность Не смотря на то, что препаративное ВЭЖХ является дорогостоящей про цедурой, использование этого метода на конечной стадии очистки рекомби нантного интерферона от модифицированных вариантов этого белка, является одним из нескольких путей решения проблемы получения высокоочищенной фармакопийной субстанции интерферона.
Разработанная в процессе выполнения данной диссертационной работы технология выделения и очистки рекомбинантного интерферона -2b человека из биомассы бактериальных продуцентов (с использованием одной хромато графической стадии – очистки на катионите SP-Toyopearl) успешно применяет ся с 2004 г. в ЗАО «Мосагроген» (Москва) для создания ветеринарных препара тов «Миксоферон®» и «Кинорон®».
ВЫВОДЫ 1. Получен новый бактериальный штамм-продуцент рекомбинантного ин терферона -F человека с уровнем накопления целевого белка более 25 % от суммарных клеточных полипептидов. Этот уровень был достигнут благодаря модификации гена интерферона -F включением в его состав часто встречающихся в E.coli синонимических аминокислотных кодонов и обеспечением транскрипции РНК полимеразой фага Т7 целевого гена, входящего в состав экспрессионной кассеты с тандемом терминаторов транскрипции в 3’-нетранслируемой области.
2. Создан также новый промышленный продуцент рекомбинантного интер ферона -2b человека с продуктивностью, составляющей более 30% от суммарных клеточных полипептидов.
3. Разработаны варианты протокола промышленной ферментации бактери ального штамма-продуцента человеческого рекомбинантного интерферо на -2b, позволяющие упростить дальнейшую очистку интерферона и уменьшить ее себестоимость.
4. Разработаны варианты технологии выделения и очистки интерферона 2b, с общим выходом 50 – 60 %, позволяющие получать субстанцию ин терферона ветеринарного и фармакопийного качества. Препаративный уровень соответствует получению порядка 150 тыс ветеринарных тера певтических доз и 3 млн. медицинских терапевтических доз.
5. Созданные в работе новые штаммы-продуценты рекомбинантных интер феронов человека и промышленных способов их выделения и очистки с 2004 г. успешно используются в ЗАО «Мосагроген» для промышленного получения субстанций этих белков и создания на их основе эффективных препаратов «Миксоферон®» и «Кинорон®» ветеринарного назначения.
Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:
1. Скороходова А.Ю., Зименков Д.В., Гавриков А.В., Киверо А.Д., Каташкина Ж.И., Дорошенко В.Г., Машко С.В. «Оптимизация экспрессии генов в бактериальных клетках в биотехнологических исследованиях XXI века» // В сб.:МИФИ, Москва, январь 2002, 125-139.
2. Машко С.В., Скороходова А.Ю., Зименков Д.В., Мичурина Т.А., Гавриков А.В., Беневоленский М.С., Киверо А.Д., Каташкина Ж.И., Дорошенко В.Г., Бирюкова И.В., Дебабов В.Г. «Использова ние метаболической регуляции для оптимизации экспрессии ге нов в бактериальных клетках – новое направление биотехнологии XXI-века.» // Биотехнология №4 (2002), 3-14.
3. Гавриков А.В., Зименков Д.В., Машко С.В. «Введение тандема терминаторов транскрипции повышает эффективность накопле ния рекомбинантных белков в клетках Escherichia coli при ис пользовании системы экспрессии на основе РНК-полимеразы фа га Т7» // Биотехнология №2 (2005), 18-25.
4. Зименков Д.В., Гавриков А.В., Машко С.В. «Замена редко встре чающихся в Escherichia coli эукариотических аминокислотных кодонов на синонимические прокариотические увеличивает эф фективность накопления рекомбинантных интерферона-F и ин терлейкина-1 человека» // Биотехнология №3 (2006), 17-32.
5. Гавриков А.В., Рязанов И.А., Калужский В.Е., Машко С.В. «Зави симость процедуры выделения и очистки рекомбинантного ин терферона-2b человека от условий его накопления в клетках штамма-продуцента в ходе регулируемого культивирования» // Биотехнология №5 (2006), 23-31.