Молекулярно-биологические свойства изолятов вируса инфекционного бронхита кур, выявленных на территории россии в период с
На правах рукописи
ОВЧИННИКОВА Евгения Валерьевна МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР, ВЫЯВЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИИ В ПЕРИОД С 2005 ПО 2011 ГГ.
03.02.02 «Вирусология» Aвтореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Владимир – 2012 2
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г.
Владимир Научный руководитель – Дрыгин Владимир Викторович доктор биологических наук, профессор (ФГБУ «ВНИИЗЖ»)
Официальные оппоненты: Цыбанов Содном Жамьянович доктор биологических наук, профессор (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии), г. Покров Смоленский Владимир Иванович доктор биологических наук, профессор (ФГБУ «ВГНКИ»), г. Москва Ведущая организация – Государственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» (ГНУ ВНИТИБП), г. Щелково.
Защита диссертации состоится «_» декабря 2012 г. в _ часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220.015. при ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г.
Владимир, мкр. Юрьевец
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» и на сайте http/www.arriah.ru.
Автореферат разослан 16 ноября 2012 г.
Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций ФГБУ «ВНИИЗЖ» доктор биологических наук, профессор А.П. Пономарев 1.
Общая характеристика работы
1.1. Актуальность темы. Инфекционный бронхит кур (ИБК) – высококонтагиозное заболевание, которое поражает птиц всех возрастов в хозяйствах мясного и яичного направлений и широко распространено во многих странах. Возбудителем заболевания является РНК-содержащий вирус семейства Coronaviridae, рода Coronavirus. При развитии заболевания поражаются респираторные органы, почки, а также репродуктивные органы кур. Экономические потери связаны со снижением прироста массы тела у цыплят-бройлеров, снижением яичной продуктивности, ухудшением качества яиц у несушек и родительского поголовья [1, 8].
Как и другие РНК-содержащие вирусы, вирус ИБК может быстро мутировать. Давление со стороны иммунной системы хозяина на гетерогенную популяцию вируса приводит к преимущественному отбору и закреплению тех или иных вариантов вируса. В результате, вирусный геном быстро эволюционирует, порождая широкий спектр серотипов [13, 8]. Изменения в геноме вируса ИБК происходят в результате накопления точечных мутаций, инсерций и делеций, а также рекомбинации.
Иммунитет, приобретенный к одному серотипу, часто не обеспечивает перекрестной защиты от заражения вирусом других серотипов [8]. Выявление, типирование и изучение биологических свойств изолятов вируса ИБК необходимо для разработки эффективных программ вакцинации.
1.2. Степень разработанности проблемы. Изучение ИБК в России начато в 1960-е гг. Первые работы посвящены вопросам ассоциированного течения ИБК и бактериальных инфекций, а также определению типовой принадлежности штаммов вируса ИБК, выделенных на птицефабриках России, с помощью перекрестной реакции нейтрализации на КЭ [3].
Вопросам молекулярной диагностики ИБК посвящен ряд работ зарубежных и отечественных авторов. В России в 1997-98 гг. были разработаны методы штаммовой дифференциации вируса ИБК на основе ПЦР и секвенирования вариабельной области гена S1 [5, 14]. С использованием данных методик выявлено разнообразие генотипов вируса ИБК на птицефабриках России в период с 1997 по 2004 гг. Описаны молекулярно биологические свойства изолятов «Таганрогский» генотипа 793В, «Щелковский» генотипа Массачусетс и изолята «Калужский», отличающегося по нуклеотидному составу от известных вакцинных штаммов более чем на 20% [2, 7].
В работах зарубежных авторов описано широкое распространение в мире изолятов вируса ИБК генотипа QX. Для дальнейшей оптимизации средств профилактики заболевания изучены биологические свойства ряда изолятов вируса ИБК данного генотипа [9, 11, 12]. Для России проблема появления и распространения изолятов вируса генотипа QX также актуальна, но недостаточно изучена. Высокая изменчивость вируса и скорость распространения вновь появившихся вариантов обусловливают необходимость разработки чувствительного и специфичного метода ОТ-ПЦР в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) для выявления генома вируса ИБК, постоянного мониторинга циркулирующих изолятов вируса, а также изучения их биологических свойств.
1.3. Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение молекулярно-биологических свойств изолятов вируса ИБК, выявленных на территории РФ в период с 2005 по 2011 гг.
Для достижения цели были поставлены задачи:
1. разработать метод выявления генома вируса ИБК в ОТ-ПЦР-РВ;
2. провести филогенетический анализ изолятов вируса ИБК, выявленных на территории РФ в период с 2005 по 2011 гг.;
3. выделить изоляты вируса ИБК;
4. изучить молекулярно-биологические свойства изолята вируса ИБК генотипа QX;
5. изучить молекулярно-генетические свойства рекомбинантных вирусов ИБК.
1.4. Научная новизна исследования. Разработан метод для выявления генома вируса ИБК в ОТ-ПЦР-РВ. Определена нуклеотидная последовательность фрагмента гена S1 и создан банк данных 169 изолятов вируса ИБК, выявленных у кур из хозяйств России в 2005-2011 гг. Впервые в России выявлена и подтверждена клонированием и секвенированием естественная рекомбинация гена S1 вируса ИБК.
1.5. Практическая значимость исследования. В результате исследования 1445 проб патологического материала методами ОТ-ПЦР-РВ, ОТ-ПЦР и секвенирования установлено преобладание на птицефабриках РФ и стран ближнего зарубежья изолятов вируса ИБК генотипов Массачусетс, 793В, QX и D274.
Выделенные изоляты вируса ИБК генотипа QX могут быть использованы в ФГБУ «ВНИИЗЖ» для разработки диагностических наборов и в качестве компонента полиштаммных вакцин против ИБК.
1.6. Соответствие диссертации паспорту научной специальности. В соответствии с формулой специальность 03.02.02 «Вирусология» представляет собой область науки, занимающуюся исследованием вирусов, их происхождения, состава, строения, генетики, морфологии, механизмов размножения, аспектов взаимоотношений с клеточными организмами, проблемами противовирусного иммунитета, патогенности вирусов, разработкой мер и средств предупреждения, диагностики и лечения вызываемых вирусами заболеваний. В диссертации разработаны методические указания по выявлению генома вируса инфекционного бронхита кур с использованием ОТ-ПЦР-РВ, приведены результаты исследований по выявлению и штаммовой дифференциации изолятов вируса ИБК, выявленных на территории России и стран ближнего зарубежья в период с 2005 по 2011 гг., а также описаны биологические свойства изолята IBV08-10 генотипа QX. Результаты научного исследования соответствуют пунктам 4, 6, 8, 10 паспорта специальности.
1.7. Апробация результатов работы. Результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на V и VII Международных ветеринарных конгрессах по птицеводству (г. Москва, 2009, 2011 гг.), на научно-практических семинарах специалистов птицехозяйств России (Владимир, 2011, 2012 гг.), на 6 ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием (г. Москва, 2007 г.), на семинаре для главных зоотехников и главных ветеринарных врачей птицеводческих хозяйств России и стран СНГ (г. Сергиев Посад, 2012 г.), на Международной научно-практической конференции молодых ученых «Достижения молодых ученых – в ветеринарную практику» (г. Владимир, 2012 г.), на заседаниях ученого совета ФГБУ «ВНИИЗЖ» в период с 2005 по 2011 гг.
1.8. Публикации научных исследований. По теме диссертационной работы опубликовано 10 научных статей, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.
1.9. Основные положения, выносимые на защиту:
- метод ОТ-ПЦР-РВ для выявления генома вируса ИБК в пробах патологического материала;
- сравнительный анализ первичной структуры гена S1 изолятов вируса ИБК, выявленных на территории России и стран ближнего зарубежья в период с 2005 по 2011 гг.;
- молекулярно-биологические свойства изолята IBV08-10 вируса ИБК генотипа QX;
- молекулярно-генетические свойства рекомбинантных форм вируса ИБК.
1.10. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 116 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы и приложение. Список литературы включает 25 отечественных и 168 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 17 таблицами и 20 рисунками.
Исследования по теме диссертационной работы выполнены в 2005- гг. в референтной лаборатории вирусных болезней птиц ФГБУ «ВНИИЗЖ», г.
Владимир.
1.11. Личный вклад соискателя. Основной объем исследований проведен автором самостоятельно. Автор выражает искреннюю благодарность Щербаковой Л.О., Селиверстову А.В., Елаткину Н.П. и всему коллективу референтной лаборатории вирусных болезней птиц за консультативную и методическую помощь при выполнении отдельных этапов работы.
2. Собственные исследования 2.1. Материалы 2.1.1. Образцы патологического материала. В работе исследовали приготовленные в фосфатно-буферном растворе 10-20%-ные суспензии трахей, легких, почек, миндалин слепых отростков кишечника и яйцеводов кур из хозяйств России, стран ближнего зарубежья и от экспериментально инфицированных цыплят.
2.1.2. Штаммы микроорганизмов. Использовали вакцинные штаммы и изоляты вируса ИБК, выделенные от птиц из хозяйств России, а также вакцинный штамм Н120 вируса ИБК из коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ».
Проверку специфичности метода проводили с использованием референтных штаммов вирусов инфекционного бронхита кур, ньюкаслской болезни, инфекционного ларинготрахеита, инфекционной бурсальной болезни, болезни Марека, реовируса кур, и изолята вируса лейкоза птиц подгруппы J, аденовируса птиц 4 серотипа, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Escherichia coli.
2.1.3. Биологические тест-системы. Для оценки цилиостатического и эмбриопатического действий, а также для культивирования изолятов вируса ИБК использовали трахеальную органную культуру и СПФ-эмбрионы кур (Lohman Tierhzuch, Германия), соответственно.
2.1.4. Животные. При экспериментальном заражении использовали цыплят породы белый леггорн, выведенных из СПФ-эмбрионов кур и разновозрастных коммерческих бройлеров и несушек, свободных от антител к вирусу ИБК.
2.2. Методы 2.2.1. Выбор праймеров и TaqMan-зондов осуществляли с помощью программ Primer Express, версия 3.0 («Applied Biosystems», США) и «Oligo», версия 3.3. Синтез осуществляла фирма НПО «Синтол» (г. Москва).
2.2.2. Выделение нуклеиновых кислот проводили с помощью набора для выделения нуклеиновых кислот с сорбентом NucleoS+ (ООО «Биоком», г.
Москва).
2.2.3. ОТ-ПЦР-РВ проводили с использованием системы «Rotor-Gene 6000» («Corbett Research», Австралия). Состав реакционной смеси: 5 мкл 5 кратного буфера для ПЦР, 2,5 мкл 25 мМ MgCl2, 1 мкл водного раствора 10 мM dNTP, по 10 пмоль каждого из двух праймеров, 5 пмоль TaqMan-зонда, по 1 ед.
ферментов ревертазы и Taq ДНК-полимеразы, 5 мкл РНК и вода до конечного объема 25 мкл. Температурный режим реакции: 50°С – 20 мин, 95°С – 5 мин и 40 циклов: 95°С – 10 с;
55°С – 35 с;
72°С – 15 с.
2.2.4. ОТ-ПЦР. Состав реакционной смеси для обратной транскрипции:
по 10 пМ прямого и обратного праймеров, 2 мкл 10 мМ dNTP, 4 мкл 5-кратного ревертазного буфера и 1 ед. ревертазы, 12 мкл раствора суммарной РНК. Смесь инкубировали 40 мин при 42°С, затем прогревали 3 мин при 95°С. ПЦР проводили в амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Россия). Состав реакционной смеси для ПЦР и «nested»-ПЦР: 3 мкл кДНК, по 10 пМ прямого и обратного праймеров, 1 мкл 10 мM dNTP, 5 мкл 5-кратного буфера для ПЦР, 2,5 мкл 25 мM MgCl2, 1 ед. Taq ДНК-полимеразы и 11,5 мкл воды. Проводили 35 или 25 циклов амплификации, соответственно, при следующем температурном режиме: 94° С – 20 с;
53° С – 30 с;
72° С – 40 с. Учет результатов реакции проводили методом электрофореза в 1-2% агарозном геле с 0,001% бромистого этидия.
2.2.5. Очистку продуктов ПЦР проводили с использованием стекловолокнистых фильтров GF/F («Whatman», США) и 80% этанола с помощью вакуумного насоса («Millipore»).
2.2.6. Секвенирование осуществляли на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3100 («Applied Biosystems», США).
2.2.7. Анализ нуклеотидных последовательностей проводили в программе BioEdit, версия 7.0.5.3. Построение дендрограмм проводили с помощью алгоритма Neighbor-Joining пакета программ MEGA, версия 4.0.
2.2.8. Выделение вируса ИБК. Выделение вируса проводили путем заражения в аллантоисную полость 9-суточных СПФ-эмбрионов кур суспензией из патологического материала в объеме 0,2 мл. Зараженные эмбрионы инкубировали при 37°С, ежедневно овоскопируя. Гибель эмбрионов в течение первых суток инкубации считали неспецифической. Через 3 суток для следующего пассажа отбирали аллантоисную жидкость. Оставшиеся эмбрионы вскрывали через 7-9 суток и исследовали на наличие макроскопических изменений, характерных для ИБК (отставание в росте, скручивание эмбриона в шар). Для выделения вируса ИБК птиц проводили 3 последовательных пассажа [4].
2.2.9. Определение титра инфекционной активности вируса проводили на СПФ-эмбрионах кур. Готовили последовательные 10-кратные разведения (от 1 до 6) исследуемого вируссодержащего материала и заражали каждым не менее 4 чувствительных объектов. Расчет титра инфекционной активности вируса производили по методу Кербера.
2.2.10. Оценка цилиарной активности. Для оценки цилиарной активности использовали трахеи экспериментальных цыплят. Трахею цыпленка извлекали и помещали в ФБР. С помощью пинцета и бритвенного лезвия очищали трахеи от соединительной и жировой ткани и нарезали на тонкие (0,5 1,0 мм) кольца. Полученные эксплантаты трахеи помещали в ФБР и оценивали цилиарную активность под световым микроскопом [5].
2.2.11. Получение рекомбинантных плазмид, несущих вставки гена S1 вируса инфекционного бронхита кур. Для клонирования использовали универсальный плазмидный прокариотический вектор pGEM-T Easy ("Promega", США). Клонирование проводили в компетентные клетки E.coli штамма XL-1 по 5’Т концам вектора и 3’А концам ПЦР фрагмента.
Трансфекцию осуществляли методом электропорации с использованием мультипоратора Eppendorf. Клетки после трансфекции высевали на чашки с LB агаром и через сутки проводили отбор клонов для скрининга методом ПЦР со специфическими праймерами на встройку гена.
Клоны, оказавшиеся положительными в ПЦР, подращивали для наработки плазмиды. Очистку плазмиды проводили набором GeneJET™ Plasmid Miniprep Kit («Fermentas», Литва). Полученные плазмиды секвенировали, с использованием праймеров на последовательность промотора плазмиды (T7 – прямой, SP6 – обратный).
2.2.12. Статистическая обработка результатов. Для статистической обработки результатов определяли среднее арифметическое при количестве опытов (n) и среднее квадратическое (стандартное) отклонение () среднего арифметического.
3. Результаты собственных исследований 3.1. Разработка ОТ-ПЦР-РВ. При разработке метода ОТ-ПЦР-РВ для выявления генома вируса ИБК использовали систему праймеров и флуоресцентно-меченого олигонуклеотидного зонда для амплификации фрагмента консервативной нетранслируемой области генома вируса [10].
Специфичность разработанной ОТ-ПЦР-РВ была продемонстрирована с использованием шести штаммов и изолятов вируса ИБК разных генетических групп, а также проб, содержащих другие вирусные агенты. Аналитическая чувствительность ОТ-ПЦР-РВ составила 1,0 lg ЭИД50/мл вируса (13 геномных эквивалентов вируса ИБК на реакцию).
3.2. Анализ изолятов вируса ИБК, выявленных за период с 2005 по 2011 гг. В период с 2005 по 2011 гг. с помощью методов ОТ-ПЦР-РВ, ОТ-ПЦР и секвенирования на наличие генома вируса ИБК исследовано 1445 проб патологического материала, полученных из 300 хозяйств России и некоторых стран ближнего зарубежья. Геном вируса ИБК выявили более чем в 35% проб как от вакцинированной, так и от невакцинированной птицы.
Таблица Результаты ОТ-ПЦР и секвенирования Кол-во Кол-во проб Кол-во Страна вакцинных исследованных/ изолятов штаммов положительных на ИБК Россия 1328/486 250 158/ Украина 73/26 12 6/ респ. Казахстан 22/5 0 3/ респ. Беларусь 18/0 0 респ. Узбекистан 4/0 0 Примечание: в числителе указано число случаев выявления изолятов вируса, в знаменателе – число проб, в которых был выявлен геном изолята вируса ИБК, включая идентичные, например, выявленные в патологическом материале от птиц разных птичников одной птицефабрики Нуклеотидные последовательности вариабельной области гена S изолятов вируса ИБК, выявленных в 2005-2011 гг., сравнивали с последовательностями изолятов и вакцинных штаммов вируса ИБК, опубликованных в международной базе данных GenBank.
В результате филогенетического анализа выявленные изоляты вируса ИБК были отнесены к генетическим группам Массачусетс, 793В, QX, D274, Italy-02, В1648, Arkansas. Кроме того, были выявлены вариантные изоляты, эндемичные для России и не относящиеся ни к одной генетической группе, а также рекомбинантные формы вируса ИБК. Уровень нуклеотидных отличий между разными генетическими группами составлял от 20% и выше. Основная часть изолятов представлена 4 генетическими группами (Массачусетс, 793В, QX, D274) и выделена на дендрограмме цветом (рис. 1).
Установлена длительная циркуляция изолятов вируса ИБК в хозяйствах.
Так, на одной из птицефабрик Саратовской области идентичные по нуклеотидному составу изоляты выявляли в течение 5 лет. Кроме того, установлена совместная циркуляции в хозяйстве разных изолятов, принадлежащих к одной или нескольким генетическим группам вируса ИБК.
Большинство выявленных за рассматриваемый период изолятов вируса ИБК (29,5% от общего числа выявленных изолятов) относились к генотипу Массачусетс. Всего с 2005 по 2011 гг. на птицефабриках Центрального, Приволжского, Южного, Северо-Западного, Сибирского, Уральского Федеральных округов РФ было выявлено 50 изолятов данного генотипа.
Максимальный уровень нуклеотидных отличий по исследуемому фрагменту гена S1 от вакцинных штаммов (Н-120, Н-52, Ма5) и внутри группы составил 4,8%.
Рис. 1. Генетическая принадлежность изолятов вируса ИБК, выявленных в 2005-2011 гг. Анализ проводили в программе MEGA 4. Примечание: черными точками обозначены референтные штаммы вируса ИБК Изоляты вируса ИБК генотипа 793В в период с 2005 по 2011 гг. выявляли ежегодно, причем число случаев выявления возросло с 6% (от общего числа выявленных изолятов) в 2005 г. до 38,7% – в 2011 г.
На территории РФ изоляты вируса ИБК генотипа 793В чаще выявляли в Приволжском и Центральном, реже – в Южном и Северо-Западном округах.
Всего было выявлено 36 изолятов вируса данного генотипа (20,7 % от общего числа выявленных изолятов). Вариабельность фрагмента гена S1 внутри генетической группы не превышала 10%.
За исследуемый период на территории РФ было выявлено 20 изолятов вируса ИБК генотипа D 274 (12,4% от общего числа выявленных изолятов).
Уровень нуклеотидных отличий фрагмента гена S1 внутри группы не превышал 5,8%. Десять изолятов из двадцати были выявлены на птицефабриках Уральского Федерального округа РФ.
Из 6 изолятов генотипа В1648 пять были выявлены на территории географически близких регионов (Нижегородская и Владимирская области), и один – на птицефабрике Ростовской области. Вариабельность по нуклеотидному составу гена S1 внутри группы генотипа В1648 не превышала 8,7%. На одной из фабрик Нижегородской области изолят генотипа В выявляли трижды: дважды в 2006 г. у кур в возрасте 5-6 месяцев (IBV05-06) и 11-12 месяцев (IBV12-06), а также в 2007 г. у кур в возрасте 9 месяцев (IBV06 07). Причем изолят IBV06-07 отличался на 5% по нуклеотидному составу исследуемого фрагмента гена S1 от изолятов, выявленных в 2006 году.
Изоляты вируса ИБК генотипа Italy-02 выявляли в 2007 г. в патологическом материале от 35-40-суточных цыплят, направленном для исследования из птицефабрики Украины, а также в 2010 и 2011 гг. в патологическом материале, присланном из Северо-Кавказского ФО. Процент отличий по нуклеотидному составу внутри группы составил 0,5-3,9%.
Генотип Арканзас распространен в Америке, тогда как на других континентах встречается редко. На территории России и ближнего зарубежья за период с 1998 по 2011 год было два случая выявления вируса данного генотипа.
В мае 2005 года в патологическом материале от кур в возрасте 153 суток, присланном из птицефабрики Краснодарского края, был выявлен изолят IBV09 05. Процент аминокислотных отличий фрагмента гена S1 от штамма Ark- (номер в GenBank М99482) составил 8,1%. Это единственный случай выявления вируса ИБК генотипа Арканзас в России. Еще один изолят ИБК этого генотипа (IBV14-07) выявили на птицефабрике респ. Казахстан в 2007 г.
Девятнадцать изолятов, выявленных в пробах патологического материала от кур в возрасте от 8 суток до 100 недель, имели уникальную первичную структуру гена S1, и были отнесены к вариантным изолятам вируса ИБК.
Уровень нуклеотидных отличий вариантных изолятов от штаммов и изолятов, представленных в GenBank, составил более 20%.
По сравнению с данными за 1998-2004 гг. [5, 14], когда наряду с генотипом Массачусетс наблюдалось преобладание вариантных изолятов вируса ИБК, в период с 2005 по 2011 гг. количество случаев выявления подобных изолятов снизилось, а в 2009 и 2011 гг. не было выявлено ни одного вариантного изолята вируса.
За исследуемый период в патологическом материале, присланном из птицефабрик России, Украины и респ. Казахстан, от кур, как с клиническими признаками, так и без какого-либо проявления инфекции, были выявлены изолятов вируса ИБК генотипа QX. Процент нуклеотидных отличий фрагмента гена S1 внутри группы составил 1,5-7,1%. Если еще в 2001-2005 гг.
наблюдались единичные случаи выявления нового для нашей страны генотипа QX, то в 2008 и 2011 гг. их количество возросло до 31,5% и 25,8% от общего числа выявленных изолятов, соответственно.
Изоляты генетической группы QX выявляли в пробах патологического материала от птиц преимущественно раннего возраста (20-40 суток), однако в пробах от кур в возрасте 150, 300 суток также обнаруживали вирус данного генотипа. В большинстве случаев против ИБК на птицефабриках применялась вакцинация как инактивированными, так и живыми вакцинами. Изоляты генотипа QX обнаружены на птицефабриках Южного (Краснодарский край, Ростовская область), Центрального (Курская, Ивановская, Тверская, Воронежская, Белгородская области) и Приволжского (Самарская область) ФО России.
3.3. Выделение вируса ИБК проводили с использованием СПФ эмбрионов кур [4]. Для выделения вируса проводили не менее трех последовательных пассажей. Через 7-9 суток после инфицирования КЭ наблюдали эмбриопатические изменения, характерные для вируса ИБК, такие как отставание в росте и скручивание эмбрионов в шар.
Выделены 8 изолятов вируса генетической группы QX и два рекомбинантных вируса ИБК.
С помощью специфических праймеров определены полные или частичные последовательности гена S1 выделенных изолятов вируса ИБК и опубликованы в международной базе данных GenBank (табл. 2).
Таблица Выделенные изоляты вируса ИБК Генотипическая Номер в № Название Регион РФ, страна принадлежность изолята GenBank 1 IBV02-08 Ростовская область QX JX 2 IBV22-09 Краснодарский край QX HQ 3 IBV08-10 Тверская область QX JQ 5 IBV13-10 Нижегородская область QX JX 6 IBV08-11 Оренбургская область QX JX 7 IBV12-11 Курская область QX JX 8 IBV28-11 Ростовская область QX JX 9 IBV13-08 Ивановская область QX JX рекомбинант Масс - 4/91 JX 10 IBV27-11 Украина 11 IBV02-09 Украина рекомбинант Н120 - QX HQ Примечание:
- рекомбинант изолята генотипа Массачусетс и вакцинного штамма 4/91;
- рекомбинант вакцинного штамма Н-120 и изолята генотипа QX 3.4. Изучение биологических свойств изолята IBV08-10 вируса ИБК генотипа QX. Изолят IBV08-10 выделен в 2010 г. от 37-суточных цыплят бройлеров одной из птицефабрик Тверской области РФ. Титр инфекционной активности вируса после 7 пассажа составил 6,45 lg ЭИД50/мл. Контаминацию вирусами НБ, ИББ, ИЛТ, ГП типа А, ССЯ-76, реовирусом кур и микоплазмой исключили методом ПЦР.
Патогенность изолята IBV08-10 определяли путем постановки биопробы на цыплятах разных возрастов (7, 21 и 52 суток), вакцинированных и невакцинированных против вируса ИБК. Цыплята в возрасте 7 и 21 суток вакцинированы не были, а в группе 52-суточных птиц были как иммунные, так и неиммунные куры. Птиц каждой возрастной группы разделяли на экспериментальную и контрольную группы по 30 и 20 цыплят, соответственно.
Экспериментальную и контрольную группы содержали в изолированных боксах. Заражение птиц экспериментальной группы проводили интраназально, перорально и на конъюнктиву в дозе 3,0 lg ЭИД50. Длительность экспериментов составляла 28 суток. В течение опыта проводили диагностический убой по две птицы из опытной и по одной из контрольной группы через 1-11, 14, 21, сутки после инфицирования. Для оценки цилиарной активности использовали трахеи экспериментальных птиц [5]. Ротоглоточные, клоакальные смывы и внутренние органы (трахея, легкие, почки, миндалины кишечника) исследовали на наличие генома вируса ИБК методом ОТ-ПЦР-РВ.
В результате проведенных экспериментов с использованием кур разных возрастов, иммунных и неиммунных к вирусу ИБК было показано, что изолят IBV08-10 генотипа QX не вызывал у птиц клинических признаков и патологоанатомических изменений, за исключением непродолжительного цилиостаза у цыплят в возрасте 7 и 21 суток (табл. 3) и легких респираторных расстройств (чихание, хрипы) у 7-суточных цыплят.
Таблица Цилиарная активность при экспериментальном заражении (в баллах) Возраст птиц (сутки) 1* 2 3 4 5 6 7 8 9 10 № опыта 7 1 0 0 0 0 0 1 2 3 3 21 4 3 2 0 0 0 2 3 4 4 3 52 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 Примечание: 1-11* сутки после инфицирования В группе 52-суточных кур снижение цилиарной активности не наблюдали как у вакцинированных, так и у невакцинированных птиц. При этом геном вируса ИБК в пробах внутренних органов, ротоглоточных и клоакальных смывах от экспериментальных птиц выявляли в ОТ-ПЦР-РВ на протяжении всего опыта.
3.5. Рекомбинантные формы вируса ИБК. В случае, когда иммунизация живой вакциной проводится на уже инфицированном поголовье, или же заражение птицы произошло после вакцинации, возможно создание благоприятных условий для естественной рекомбинации вируса. При этом родительскими формами рекомбинантного вируса могут быть вакцинный штамм и изолят вируса ИБК. Начиная с 2009 года, были выявлены четыре рекомбинантных вируса ИБК (табл. 4).
Таблица Рекомбинантные формы вируса ИБК, выявленные в 2009-2011 гг.
Название Родительские вирусы, Номер в Вирусовыделение изолята штаммы и изоляты GenBank вакцинный штамм Н-120, Выделен на СПФ IBV02-09 HQ изолят генотипа QX эмбрионах кур вакцинный штамм Н-120, IBV01-10 HQ840511 Не выделен вакцинный штамм D вакцинный штамм UK4/91, IBV03-10 HQ840512 Не выделен изолят генотипа QX вакцинный штамм UK4/91, Выделен на СПФ IBV27-11 JX изолят генотипа Массачусетс эмбрионах кур Изолят IBV02-09, выявленный на птицефабрике Украины, предположительно, появился в результате рекомбинации вакцинного штамма Н-120 и полевого изолята генотипа QX. Вирус IBV01-10, выявленный в Центральном федеральном округе РФ являлся рекомбинантом вакцинных штаммов Н-120 и D 274. В Северо-Западном ФО РФ был выявлен рекомбинант IBV03-10, родительскими вирусами которого стали вакцинный штамм UK4/ и изолят генотипа QX. Вирус IBV27-11, выявленный на одной из птицефабрик Украины, являлся рекомбинантом двух изолятов, принадлежащих к генотипам Массачусетс и 793В. Причем родительский вирус генетической группы Массачусетс отличался по аминокислотному составу (4 аминокислотные замены) от применяемых на данной фабрике вакцинных штаммов Ма-5 и Н 120. Второй родительский вирус имел 1 аминокислотную замену от широко применяемого вакцинного штамма UK 4-91.
Для изолята IBV02-09 была определена первичная структура полного гена S1 (номер в GenBank HQ840510). Хотя данная нуклеотидная последовательность была получена с использованием прямого и обратного праймеров, для подтверждения рекомбинации и исключения гетерогенности вирусной популяции были получены десять клонов, несущих плазмиды со вставкой фрагмента гена S1, включающего рекомбинантный участок. В результате секвенирования наличие рекомбинации выявлено во всех десяти клонах.
Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей рекомбинантов вируса ИБК показал, что во всех четырех случаях рекомбинация происходила на участке 300-470 н.п. гена S1. Данный участок гена по локализации соответствует гипервариабельной области гена S1 вируса ИБК, определенной Wang и соавт. [15].
Изоляты IBV02-09 и IBV27-11 были адаптированы к развивающимся СПФ-эмбрионам кур, при заражении вызывали эмбриопатические изменения, характерные для вируса ИБК. Титр инфекционной активности для изолятов IBV02-09 и IBV27-11 составил 6,0 и 6,1 lg ЭИД50/мл, соответственно. При заражении трахеальной органной культуры оба изолята вызывали полную атрофию реснитчатого эпителия через 72 часа после инфицирования.
3.6. Динамика выявления изолятов вируса ИБК разных генотипов за период с 1998 по 2011 гг. По данным за период с 1998 по 2004 гг. основная часть выявленных изолятов ИБК на территории РФ относилась к генотипу Массачусетс и вариантным изолятам, отличающимся по нуклеотидному составу от известных штаммов более чем на 20% [6, 14]. За период с 2005- гг. ситуация изменилась (табл. 5, рис.6).
Во-первых, уменьшилось количество изолятов генотипа Массачусетс на 13%, хотя данный генотип по-прежнему доминировал на территории России.
Преобладанию генетической группы Массачусетс, вероятно, способствует широкое использование вакцин на основе штаммов данного генотипа.
Кроме того, на 21% сократилось количество вариантных изолятов вируса ИБК. Снижение количества случаев выявления вариантных изолятов вируса, возможно, связано с интенсивной профилактикой ИБК в последние годы. Еще одним объяснением может быть изменение генома вируса, вследствие накопления точечных мутаций в подпраймерной области, которые могут быть причиной ложноотрицательных результатов в ОТ-ПЦР.
Рис. 6. Динамика выявления изолятов вируса ИБК разных генотипов за период с 1998 по 2011 гг.
Во-вторых, увеличилось на 10% количество изолятов генотипа 793В и на 14% - изолятов генотипа QX. Среди возможных причин: занос вируса из-за границы и, в случае с генотипом 793В, активное применение вакцин на основе штамма 4/91.
Таблица Количество изолятов вируса ИБК разных генотипов, выявленных в 1998-2011 гг. (%) Генотип 1998-2004 гг. 2005-2011 гг.
Массачусетс 42 вариантные изоляты 32 793В 11 QX 2 D274 10 3 другие генотипы Примечание: генотипы B1648, Italy-02;
генотипы B1648, Italy-02, Арканзас и рекомбинантные формы вируса ИБК В-третьих, на территории РФ появились единичные случаи выявления изолятов генотипа Арканзас и рекомбинантных вариантов вируса ИБК.
4. Выводы 1. Разработан специфичный метод ОТ-ПЦР-РВ для выявления фрагмента генома вируса ИБК, аналитическая чувствительность которого составила 1,0 lg ЭИД50/мл вируса (13 геномных эквивалентов вируса ИБК на реакцию).
2. В результате исследования 1445 проб патологического материала из 300 хозяйств России и стран ближнего зарубежья выявлено 169 изолятов вируса ИБК генотипов Массачусетс (29%), 793В (21%), QX (16%), D274 (12%), В (3%), Italy-02 (2%), Арканзас (1%), а также вариантные изоляты с уникальной первичной структурой гена S1 (11%).
3. Вариабельность фрагмента гена S1 внутри генетических групп Массачусетс, 793В, QX, D274, В1648, Italy-02, Арканзас не превышала 4,8%, 10%, 7,1%, 5,8%, 8,7%, 3,9%, 8,1%, соответственно. Вариантные изоляты отличались от всех известных вакцинных штаммов более чем на 20% и не были отнесены ни к одной генетической группе.
4. Выделены 8 изолятов вируса ИБК генотипа QX. Изолят IBV08- обладал цилиостатическим и эмбриопатическим действиями, однако при экспериментальном заражении птицы разных возрастов, иммунных и неиммунных к вирусу ИБК клинических признаков и патологоанатомических изменений не вызывал.
5. Впервые в РФ выявлены, выделены и охарактеризованы рекомбинантные формы вируса ИБК. Для всех выявленных рекомбинантных форм определены точки рекомбинации на участке 300-470 н.п. гена S1.
6. Установлено, что на территории РФ в 2005-2011 гг. по сравнению с данными за период 1998-2004 гг. сократилось количество изолятов вируса ИБК генотипа Массачусетс на 13%, вариантных изолятов – на 21 %, и возросло количество изолятов вируса ИБК генотипа 793В на 10%, QX – на 14%.
5. Практические предложения В результате проведенных исследований разработан нормативный документ: «Методические указания по выявлению генома вируса инфекционного бронхита кур с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени» (утверждены 05.02.2010 г.);
Депонирован в Коллекции штаммов и микроорганизмов ОБТК ФГБУ «ВНИИЗЖ» штамм RF08-10 (IBV08-10) вируса инфекционного бронхита кур (справка №6).
6. Список использованной литературы 1. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В.
Соловьев, Н.В. Фомина. – М.: ВНИТИБП, 1998. – С. 183-198.
2. Изучение иммунобиологических свойств вариантных полевых штаммов вируса инфекционного бронхита кур, выделенных на территории Российской Федерации / С.В. Фролов, Ю.А. Бочков, Г.В. Батченко [и др.] // Сб. науч. тр. ВГНКИ. – М., 2005. – Т. 65. – С. 108-119.
3. Изучение инфекционного бронхита кур в России: исторический аспект / Ю. А. Бочков, Г. В. Батченко, Н. Н. Луговская [и др.] // Актуальные проблемы инфекционной патологии животных: материалы Междунар.
науч. конф., посвящ. 45-летию ФГУ "ВНИИЗЖ" – Владимир, 2003.
4. Методические указания по выделению и идентификации полевых изолятов вируса инфекционного бронхита птиц / Г.В. Батченко, Ю.А.
Бочков, Н.Н. Луговская [и др.] // ФГУ «ВНИИЗЖ». – Владимир, 2002. – 21 с.
5. Методические указания по приготовлению и поддержанию трахеальной органной культуры куриных эмбрионов и цыплят / О.А. Чупина, С.В.
Фролов, В.И. Диев, А.В. Борисов // ФГУ "ВНИИЗЖ". – Владимир, 2006. – 4 с.
6. Филогенетический анализ изолятов вируса инфекционного бронхита кур, выявленных в России / Ю.А. Бочков, А.В. Борисов, Л.О. Щербакова, В.В.
Дрыгин // Аграрная Россия. – 2002. – №2. – С. 11-16.
7. Чупина О.А. Протективные особенности изолята «Щелковский» вируса инфекционного бронхита кур / Ветеринарная патология. – 2006. – №4, – С.123- 8. Cavanagh, D., Naqi S. Infectious bronchitis // Diseases of Poultry. – 11th ed. – Ames, Iowa, 2003. – P. 101-119.
9. Characterization of three infectious bronchitis virus isolates from China associated with proventriculus in vaccinated chickens / L. Yu, Y. Jiang, S. Low [et al.] // Avian Diseases. – 2001. Vol. 45. – P. 416-424.
10. Development and evaluation of a real-time Taqman RT-PCR assay for the detection of infectious bronchitis virus from infected chickens / S.A. Callison, D.A. Hilt, T.O. Boynton [et al.] // Archives Virology. – 2007. – Vol. 152, №1, – P. 41-58.
11. Evaluation of the protection conferred by commercial vaccines and attenuated heterologous isolates in China against the CK/CH/LDL/97I strain of infectious bronchitis coronavirus / S. Liu, X. Zhang, Y. Wang [et al.] // Veterinary J. – 2009. – Vol. 179. – P. 130-136.
12. Genotyping and serotyping of Guangxi IBV isolates during 1985-2008 / P.L.M. Wei, Z.J. Wei, X.Y. Wang [et al.] // Proceedings of the VI-th International Symposium on Avian Corona- and Pneumoviruses and Complicating Pathogens. - Rauischholzhausen, Germany, 2009. – P. 59-66.
13. Jackwood M.W., Hilt D.A., Brown T.P. Attenuation, safety, and efficacy of an infectious bronchitis virus GA98 serotype vaccine // Avian Diseases. – 2003. – Vol. 47. – P. 627-632.
14. Molecular epizootiology of avian infectious bronchitis in Russia / Y.A.
Bochkov, G.V. Batchenko, L.O. Shcherbakova [et al.] // Avian Pathology. – 2006. – Vol. 35. – P. 379-393.
15. Wang L., Junker D., Hock L. Evolutionary implications of genetic variations in the S1 gene of infectious bronchitis virus // Virus Research. – 1994. – Vol.34.
– P.327-338.
7. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Овчинникова Е.В., Селиверстов А.В. Биологические свойства изолята IBV08-10 вируса инфекционного бронхита кур генотипа QX / Ветеринария и кормление. – 2012. – №5. – С.36-37.
2. Определение генотипа и степени патогенности изолята вируса инфекционного бронхита кур / О.А. Чупина, Е.В. Овчинникова, Л.О.
Щербакова [и др.] // Вет. патология. – 2007. – № 4 (23). – С. 121-126.
3. Диагностика инфекционного бронхита кур / Ю.А. Бочков, А.В.
Борисов, С.В. Фролов, В.В. Дрыгин, В.Н. Ирза, Г.В. Батченко, Н.Н. Луговская, Е.В. Овчинникова // Ветеринария. – 2003. – № 4. – С. 21-24.
4. Molecular characterization of infectious bronchitis virus isolates from Russia and neighbouring countries: identification of intertypic recombination in the S1 gene / E. Ovchinnikova, Y. Bochkov, L. Shcherbakova, Z. Nikonova [et al.] // Avian Pathology. – 2011. – Vol. 40, №5. – P. 507-514.
5. Генетическая характеристика полевых изолятов вируса инфекционного бронхита кур, выявленных в России в 2004-2005 гг. / Е.В.
Овчинникова, Г.В. Батченко, О.А. Чупина [и др.] // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. – Владимир, 2006. – Т. 4. – С. 362-369.
6. Генетическая характеристика полевых изолятов вируса инфекционного бронхита кур, выявленных в России / Е.В. Овчинникова, Ю.А.
Бочков, Г.В. Батченко [и др.] // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. – 2007. – Т. 5. – С. 303-316.
7. Диагностика инфекционного бронхита кур. Ситуация в России (2007-2008 гг.) / Е.В. Овчинникова, Л.О. Щербакова, Н.С. Мудрак [и др.] // 5-й Междунар. вет. конгр. по птицеводству. – М., 2009. – С. 66- 8. Изоляты вируса инфекционного бронхита кур, выявленные в России и ближнем зарубежье в период с 2007 по 2009 годы / Е.В.
Овчинникова, Л.О. Щербакова, Н.Г. Зиняков [и др.] // Молекулярная диагностика - 2010: сб. тр. VII Всерос. науч.-практ. конф. с междунар.
участием. – 2010. – Т. 2. – С. 157-159.
9. Изучение биологических свойств изолята вируса инфекционного бронхита кур IBV663-07 / Е.В. Овчинникова, О.А. Чупина, Л.О. Щербакова [и др.] // Генодиагностика инфекционных болезней: сбор. тр. 6-ой Всерос. науч. практ. конф. с междунар. участием. – 2007. – Т. 2. – С. 40-42.
10. Выявление патогенных микоплазм и вирусов у кур с клиническими признаками респираторной инфекции и теносиновитом на птицефабриках России / А.В. Спрыгин, Е.В. Овчинникова, З.Б. Никонова [и др.] // БИО. – 2011. – №3. – С. 19-20.
8. Список сокращений ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ИББ – инфекционная бурсальная болезнь кур ИБК – инфекционный бронхит кур ИЛТ – инфекционный ларинготрахеит птиц кДНК – ДНК-копия с РНК-матрицы КЭ – эмбрионы кур НБ – ньюкаслская болезнь птиц ОТ-ПЦР – полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией ОТ-ПЦР-РВ – обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция в режиме реального времени ПЦР – полимеразная цепная реакция РНК – рибонуклеиновая кислота ЭИД50 – 50%-ная эмбриональная инфицирующая доза dNTP – дезоксинуклеотидтрифосфаты SPF – свободный от специфических патогенов _ Подписано в печать 16 ноября Формат 6090 1/16. Усл. печ. л. 1.
Тираж 80 экз Отпечатано на полиграфической базе ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»