Полиморфизм ряда генов метаболизма костной ткани и остеопороз у человека

На правах рукописи

Москаленко Михаил Викторович ПОЛИМОРФИЗМ РЯДА ГЕНОВ МЕТАБОЛИЗМА КОСТНОЙ ТКАНИ И ОСТЕОПОРОЗ У ЧЕЛОВЕКА специальность: 03.02.07 – генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2011 2

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН в Лаборатории пренатальной диагностики наследственных и врожденных болезней человека Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор, член-корр. РАМН, зав. лаб.

Владислав Сергеевич Баранов, НИИАГ им. Д.О. Отта СЗО РАМН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Виктория Николаевна Горбунова, ГОУ ВПО СПбГПМА доктор медицинских наук, профессор Имянитов Евгений Наумович, НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова Ведущее учреждение: Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН

Защита состоится 2011 г. в часов на заседании Диссертационного совета « » Д 212.232.12 по защите диссертаций на соискание ученых степеней кандидата и доктора биологических наук при Санкт-Петербургском Государственном университете по адресу: 199034 Санкт Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан 2011 г.

« »

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук Л.А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Наступивший XXI век, по мнению многих ученых, это – век генетики.

Прямым и важнейшим достижением генетики стала расшифровка (прочтение) генома человека.

Международная программа "Геном человека" определила бурное развитие и активное внедрение в медицинскую практику молекулярной медицины и представления о существовании "генов предрасположенности" – генов, мутантные аллели которых совместимы с рождением и жизнью в постнатальном периоде, но при определенных неблагоприятных условиях могут способствовать развитию того или иного заболевания (Баранов и др. 2000, 2009). По образному высказыванию Фрэнка Коллинса – директора Международной Программы "Геном человека": "Каждый из нас генетически несовершенен. По мере разработки все новых генетических тестов у каждого человека можно обнаружить мутацию, предрасполагающую к тому или иному заболеванию". (Collins, 1999). В геноме человека насчитывается около 22 тысяч генов. Мутации некоторых из них, приводят к одному из многочисленных наследственных заболеваний. Методы молекулярной диагностики позволяют выявить не только гены наследственных болезней, но и гены предрасположенности к тому или иному сочетанному (мультифакторному) заболеванию (МФЗ). Среди болезней, вызванных наличием мутаций в генах предрасположенности, различают заболевания "с поздним началом" и мультифакториальные (полигенные) болезни (Баранов и др., 2000). Генетическая предрасположенность к заболеваниям с "поздней манифестацией" (рак молочной железы, хорея Гентингтона, болезнь Альцгеймера и др.) имеет, как правило, моногенную природу и может быть обнаружена уже при рождении ребенка, однако симптомы болезни развиваются в более позднем возрасте. Предрасположенность к мультифакториальным (сочетанным или комплексным) болезням (сахарный диабет, атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, бронхиальная астма, остеопороз, эндометриоз, некоторые психические и онкологические заболевания) также может быть определена сразу после рождения, но их манифестация в значительной мере зависит от провоцирующего действия неблагоприятных факторов внешней среды, специфичных для конкретного заболевания.

Данная работа посвящена изучению особенности аллельного полиморфизма генов метаболизма костной ткани у лиц с высоким риском развития остеопороза – одного из частых МФЗ. Остеопороз, по данным Всемирной Организации Здравоохранения, вышел по значимости на четвёртое место среди неинфекционных заболеваний после сердечнососудистой и онкологической патологии, а так же диабета. Интерес к остеопорозу как важной медицинской и социальной проблеме очень высок. Это связано, прежде всего, с тем, что в развитых странах всё большее внимание уделяется людям пожилого возраста, продолжительность жизни которых увеличивается, а активная созидательная деятельность сохраняется достаточно долго. Широкая распространенность, тяжесть исходов, особенно при переломах шейки бедра, и потеря способности к самообслуживанию определяют высокую социальную значимость данного заболевания. Рассчитано, что в среднем 40% женщин постменопаузального периода переносят, по крайней мере, один перелом вследствие остеопороза (Audi et al., 1999). Более миллионов американцев страдают остеопорозом, из них около миллиона ежегодно переносят переломы вследствие этого заболевания (Melton, 1997). На лечение и профилактику остеопороза в США тратится более 10 млрд. долларов ежегодно (Melton, 1997). Учитывая вышеприведенные факты, определение молекулярно-генетических причин остеопороза является достаточно актуальной задачей.

Существует несколько подходов для оценки вклада того или иного гена-кандидата в патогенез остеопороза. Один из них состоит в определении степени корреляции между аллельным полиморфизмом гена-кандидата и факторами, провоцирующими развитие болезни. С этой целью проводится сравнение частот аллелей предполагаемых генов-кандидатов у больных остеопорозом с таковыми у лиц, не имеющих данного заболевания и, соответственно, сохраняющих нормальную минеральную плотность костной ткани.

Подтверждение наличия ассоциации между аллелями генов костного ремоделирования и остеопорозом у больных в популяции Северо-западного региона России позволит использовать данный алгоритм для тестирования индивидуумов на выявление предрасположенности к заболеванию.

Результаты такого исследования важны для более рациональной организации системы профилактики и лечения этого заболевания еще на ранних досимптоматических стадиях его развития.

Работа была поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований (№ 06 04-08319-офи, № 08-04-12225-офи) и CRDF (ST-012-0).

Цель и задачи исследования. Изучить особенность частот аллелей генов-регуляторов метаболизма костной ткани у больных остеопорозом различной этиологии и в популяции Северо-западного региона России.

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить частоты аллелей генов метаболизма костной ткани (COL1A1, VDR, CALCR и BGLAP) у женщин Северо-западного региона России, у больных с тяжёлым остеопорозом, у женщин постменопаузального периода и у пациентов с глюкокортикоид-индуцированным остеопорозом.

2. Определить ассоциацию аллелей и генотипов по генам COL1A1, VDR и CALCR с риском развития заболевания у больных тяжёлым остеопорозом.

3. Определить ассоциацию аллелей и генотипов по генам COL1A1, VDR, BGLAP и CALCR со скоростью потери МПК и уровнем экскреции маркера остеорезорбции дезоксиперидинолина (ДПИД) у женщин в постменопаузе.

4. Определить ассоциацию аллелей и генотипов по генам COL1A1 и VDR с риском развития глюкокортикоид-индуцированного остеопороза у пациентов при лечении астмы.

5. Разработать и апробировать лабораторный макет «остео-чипа» для одновременного анализа полиморфизма некоторых генов метаболизма костной ткани (VDR, COL1A1, CALCR, BGLAP, GSTM1, GR, MTHFR и ER).

Научная новизна работы. Впервые проведен сравнительный анализ частот аллелей генов COL1A1, VDR, BGLAP и CALCR у женщин постменопаузального периода, у пациентов с остеопорозом и в популяции Северо-Западного региона России, проанализирована корреляция полиморфных вариантов изученных генов с тяжестью заболевания. Впервые показана неслучайная ассоциация между развитием глюкокортикоид-индуцированным остеопорозом и полиморфизмом генов VDR, CALCR, BGLAP, MTHFR и GSTM1 у больных бронхиальной астмой. Впервые проведен проспективный анализ уровней МПК в зависимости от паттерна аллелей и генотипов по генам COL1A1, VDR, BGLAP и CALCR.

Впервые показано, что гомозиготность по аллелю t гена VDR, аллелю s гена COL1A1 и аллелю Т гена CALCR увеличивает риск высокой потери МПК у женщин Северо-Западного региона России в постменопаузе. Впервые показан синергический (аддитивный) эффект сочетаний изученных «функционально неполноценных» генотипов по генам VDR и COL1A1 при развитии и прогрессировании остеопороза. Впервые создан лабораторный макет «остео-чипа», предназначенного для одновременного анализа полиморфизма нескольких генов костного метаболизма.

Практическая значимость. Анализ генетического полиморфизма генов VDR и COL1A1 можно рекомендовать в качестве прогностического теста для оценки риска быстрой потери МПК и развития тяжёлого остеопороза у женщин в постменопаузе. Анализ генетического полиморфизма генов VDR, CALCR, BGLAP, MTHFR и GSTM1 можно рекомендовать в качестве прогностического теста для оценки риска развития вторичного остеопороза при лечении астмы глюкокортикоидами. Материалы диссертационной работы вошли в методические рекомендации для врачей эндокринологов и гинекологов «ОСТЕОПОРОЗ. Генетическая предрасположенность. Современная диагностика, профилактика» (67 стр. 2003).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Аллели и генотипы по генам COL1A1, VDR и CALCR ассоциированы с развитием остеопороза.

2. Наличие определенных аллелей и генотипов по генам COL1A1, VDR и CALCR, а также сочетанных генотипов по генам VDR и COL1A1 ассоциировано с различной скоростью потери МПК у женщин в постменопаузе.

3. Наличие определённых аллелей и генотипов по генам COL1A1, VDR и CALCR ассоциировано с различным уровнем секреции маркера остеорезорбции дезоксиперидинолина (ДПИД) у женщин в постменопаузе.

4. Носительство генотипа tt по гену VDR, генотипа СТ по гену CALCR, генотипа СТ по гену BGLAP и генотипа СТ по гену MTHFR и делеции в гене GSTM1 ассоциировано с низкими значениями Z-score и абсолютными значениями МПК поясничного отдела позвоночника у пациентов с глюкокортикоид-индуцированным остеопорозом.

Апробация работы. Результаты работы представлены на 2-ом съезде ВОГИС (Санкт-Петербург, 2000), на 2-ом Российском съезде медицинских генетиков (Курск, 2000), II-ой международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2005), Международном конгрессе по предиктивной медицине (Виши, Франция, 2001), на Европейских конгрессах по генетике человека (Бирмингем, Великобритания, 2003), (Мюнхен, Германия, 2004), (Прага, Чехия, 2005), на Международном конгрессе по генетике человека (Вена, Австрия, 2001). Диссертация апробирована на научных семинарах Лаборатории пренатальной диагностики наследственных и врожденных болезней человека ГУ Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН, Кафедры генетики и селекции СПбГУ.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 50 работ, из них 8 – в изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 171 странице машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (методы и результаты), их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 240 ссылок. Диссертация иллюстрирована таблицами и 42 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Характеристика исследуемых групп. Приём, клиническое обследование, измерение МПК и уровня ДПИД у 555 пациентов проводилось при непосредственном участии врачей научно исследовательского института акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН (Зазерская И.Е., Кузнецова Л.В., г. Санкт-Петербург), Санкт-Петербургской академии профилактической медицины (Котова С.М., г. Санкт-Петербург), ЦМСЧ №122 (г. Санкт-Петербург), ГОУ ВПО Российского Государственного Медицинского университета Росздрава (Баранова И.А., г. Москва) и НИИ пульмонологии (Путилин А.М., г. Москва).

В научно-исследовательской работе использовались образцы ДНК, выделенной из ядер лимфоцитов крови 70 больных тяжёлым остеопорозом (женщины в возрасте 50-65 лет, в менопаузе, с Т критерием менее –2,5 SD), пациентов Санкт-Петербургской академии профилактической медицины. В исследовании были использованы образцы ДНК 179 здоровых неродственных представительниц Северо Западного региона России в качестве популяционного контроля. В данную группу включены здоровые женщины в возрасте от 20 до 44 лет (средний возраст 33,8+0,4 лет), родившиеся в Санкт-Петербурге или в ближайших районах. В структуре группы выделены подгруппы: 20-24 года – 34 чел., 25-29 лет – 35 чел., 30-34 года – 40 чел., 35-39 лет – 30 чел., 40-44 года – 40 чел. Все были обследованы в поликлинике ЦМСЧ №122 с 2001 по 2003 г. В группу исследования включены только женщины, у которых на основании клинико-лабораторного обследования не выявлено причин вторичного остеопороза, в том числе признаков хронических заболеваний, не работающие на вредных производствах и регулярно (1 раз в 12 месяцев) наблюдавшиеся врачами поликлиники или стационара ЦМСЧ № 122. Основная часть исследованных образцов ДНК была выделена из ядерных клеток крови 169 женщин с эстрогендефицитным состоянием, вступивших в менопаузу естественным путем ( пациенток – группа ЕМ) и после хирургического вмешательства (82 пациентки – группа ХМ). В ЕМ группе обследовано 87 женщин в постменопаузе в возрасте от 44 до 54 лет (средний возраст: 52,5±0, лет), родившихся и проживающих в Санкт-Петербурге. На базе "Центра здоровья женщины" и гинекологического отделения ЦМСЧ-№122, поликлинического отделения ГУ НИИ АиГ РАМН им Д.О. Отта с 1998 по 2005г. выполнялись прием пациенток, анкетирование, подписание информированного согласия, клиническое обследование, определение уровня ДПИД, остеоденситометрия. В исследование включены только те женщины, у которых на основании сбора анамнеза и клинико-лабораторного обследования установлено: длительность естественной постменопаузы от 3 до 5 лет (в среднем 4,2±0,8 года), отсутствие симптомов предшествующей недостаточной функции яичников, отсутствие тяжелых соматических заболеваний, которые могли бы являться причиной вторичного остеопороза. В ХМ группу включены 82 женщины после билатеральной эвариоэктомии в возрасте от 38 до 52 лет (средний возраст 46,2±2,3 лет), родившиеся и проживающие в Санкт-Петербурге. В исследование включены только те послеоперационные пациентки, у которых длительность эстрогендефицитного состояния составила от 3 до 5 лет (в среднем 4,3±0,6 лет). Причиной хирургического вмешательства явились доброкачественные заболевания яичников, до операции имел место регулярный менструальный цикл, и отсутствовали симптомы недостаточной функции яичников;

не приобретены тяжелые соматические заболевания, которые могли бы явиться причиной вторичного остеопороза. Все пациентки достаточно регулярно наблюдались врачами до операции, не работали на вредных производствах и не применяли препаратов, влияющих на минеральный обмен. Оперативные вмешательства обследованным выполнялись с 1993 по 2000 год на базе гинекологического или хирургических отделений ЦМСЧ №122, СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова, ИАГ РАМН им. Д.О.Отта, ЦНИРРИ, городских больниц г. Пушкина № 3 и железнодорожной.

Также в исследование включены образцы ДНК 137 пациентов в возрасте от 20 до 45 лет обоих полов (женщины в пременопаузе), страдающих БА и принимавших СГК не менее 6 месяцев. Образцы крови пациентов предоставлены ГОУ ВПО Российским Государственным Московским университетом.

Данные пациенты ранее не получали терапии антиостеопоретическими препаратами. Критериями исключения явились наличие у пациентов патологии органов дыхания, отличной от БА, наличие заболеваний и состояний, вызывающих развитие вторичного остеопороза другой этиологии, наличие у пациенток беременности или лактации во время обследования, отсутствие согласия на участие в исследовании. Анкетирование проводилось для отбора больных и оценки факторов, влияющих на МПК и риск развития переломов. В перечень вопросов вошли следующие пункты: возраст, наличие сопутствующих заболеваний и состояний, гинекологический статус женщины, курение и злоупотребление алкоголем, степень физической активности, возраст начала БА и ее длительность, возраст начала приема СГК и его длительность, суточная и кумулятивная доза СГК, переломы на фоне приема СГК. Был измерен рост и вес пациентов, оценен индекс массы тела. Суточное потребление кальция с продуктами питания рассчитывалось по дневнику пациента в соответствии с диетическими таблицами.

Минеральную плотность кости у пациентов и пациенток определяли методом двухэнергетической рентгеновской денситометрии (DEXA) на аппарате QDR 4500С фирмы Hologic (США) на базе МСЧ № 122 и для пациентов с ГИ-остеопорозом и БА на базе ГУ НИИ ревматологии (г.

Москва). Диагностику остеопороза осуществляли согласно рекомендациям ВОЗ (1994 г.) по Т-score, т.е. в стандартных отклонениях (SD) от нормативных показателей пиковой костной массы (ПКМ) здоровых женщин и по Z-score в SD от поло-возрастного норматива. Величина SD до 1 расценивалась как норма, от 1 до 2,5 SD – как остепения, ниже 2,5 SD – как остеопороз. Для статистических расчетов также использовали абсолютные значения МПК в г/см2. Определение содержания ДПИД (Веtа CrossLарs) в сыворотке крови проводилось на электрохемилюминесцентном анализаторе Еlеsуs наборами фирмы Roche (Франция) на базе лаборатории иммунологии НИИ акушерства и гинекологии имени Д.О. Отта.

Экстракция геномной ДНК из лимфоцитов периферической крови и клеток буккального эпителия. Выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови и клеток буккального эпителия проводили в соответствии с методикой, приведенной в руководстве Сэмбрука (Sambrook et al., 1989), с некоторыми модификациями.

Проведение полимеразной цепной реакции. Нуклеотидные последовательности искомых фрагментов генов выбирали из интернет-базы “Nucleotide” (“NCBI”, США). Праймеры, необходимые для проведения ПЦР этих фрагментов, подбирали с использованием программы “Oligo 6” (США).

Специфичность праймеров проверяли в программе “Nucleotide-nucleotide BLAST” (“NCBI”, США).

Во всех группах изучен полиморфизм генов: COL1A1 (rs1800012), VDR (rs731236), BGLAP (rs1800247) и CALCR (rs1801197). Дополнительно, в группе пациентов с бронхиальной астмой изучен полиморфизм генов: COL1A1 (rs1107946), VDR (rs11568820), GSTM1 (делеция), MTHFR (rs1801133), GR (rs6195) и ER1 (rs2234693). Характеристика изученных генов представлена в таблице 1.

Таблица 1. Характеристика исследованных генов и их полиморфных вариантов.

Ген, локализация Название белкового продукта гена Полиморфизм rs1107946 -1997G/T 1 цепь коллагена 1 типа COL1A1 (17q21.3 – q22) rs1800012 +1245G/T (S/s) rs11568820 -3731A/G Рецептор к витамину D VDR (12p12-q14) rs731236 +61968C/T (T/t) Остеокальцин BGLAP (17q21.3 – q22) rs1800247 -198C/T (H/h) Рецептор к глюкокортикоиду GR (5q31) rs6195 N363S A/G Рецептор к кальцитонину CALCR (7q21.3) rs1801197 +1340C/T (C/T) Глютатион-S-трансферазы М GSTM1 (1p13) делеция (-/+) del Рецептор к Эстрогену ER1 (6q25.1) rs2234693 +1943C/T MTHFR (1р36.3) Метилентетрогидрофолатредуктаза rs1801133 +677C/T Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили по стандартной схеме (Saiki, 1989) при помощи программируемого термоциклера МС-2 «Терцик» с использованием термофильной ДНК полимеразы и специфических олигопраймеров. Во всех группах пациентов и в популяции определение полиморфных вариантов генов COL1A1 (rs1800012 и rs1107946), VDR (rs731236), BGLAP (rs1800247) и CALCR (rs1801197) проводили методом ПЦР с последующим рестрикционным анализом. Определение в группе пациентов астматиков полиморфизма генов VDR (rs731236 и rs11568820), GSTM1 (делеция), MTHFR (rs1801133), ER (rs2234693) и GR (rs6195) проводили методом гибридизации на олигонуклеотидном биочипе.

Статистическая обработка данных. При сравнении результатов использовали точный критерий Фишера (Животовский, 1991), пакеты программ “GraphPad InStat” (США) и STATISTICA 6.0 (США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов по генам VDR, COL1A1, CALCR и BGLAP у больных тяжёлым остеопорозом, женщин постменопаузального периода и в популяции Северо западного региона России На первом этапе исследований проанализировано распределение частот аллелей и генотипов генов COL1A1, VDR, CALCR и BGLAP у женщин постменопаузального периода (группа I), у больных тяжёлым остеопорозом (группа II) и в популяции Северо-западного региона России (популяционная выборка – только женщины). Полученные результаты представлены в таблице 2. Результат анализа частот генотипов по генам COL1A1, VDR, CALCR и BGLAP показал, что распределение анализируемых генотипов в популяции Северо-западного региона России соответствуют распределению Харди Вайнберга (2=1,42 COL1A1;

2=0,1013 VDR;

2=1,01 CALCR;

2=0,02 BGLAP;

df=1;

p0,05).

Таблица 2. Распределение генотипов и частот аллелей генов COL1A1, VDR и CALCR в популяции, в группе женщин постменопаузального периода и у болных тяжёлым остеопорозом Сравнение с Сравнение с Группы и количество популяцией: популяцией:

Частоты аллелей, % Частоты генотипов, % индивидуумов (n) 2;

df=1 2;

df= S s SS Ss ss COL1A Популяционная выборка 64,8 33,5 1, 81,62,3 18,44,8 — — (n=179) 0,25 12, Группа I (n=168) 68,5 22,6 8, 79,82,5 20,24,9 р=0,6136 p=0, 48,93 56, Группа II (n=70) 32,9 34,3 32, 50,05,9 50,05,9 p0,0001 p0, T t TT Tt tt VDR Популяционная выборка 41,3 44,7 14, 63,73,2 36,34,2 — — (n=179) 0,02 1, Группа I (n=169) 39,1 50,9 10, 64,53,2 35,54,4 р=0,8859 p=0, 8,92 11, Группа II (n=70) 18,6 60,0 21, 48,66,1 51,45,9 p=0,0028 p=0, T TT TС С СС CALCR Популяционная выборка 58,1 33,5 8, 74,92,6 25,14,2 — — (n=179) 0,82 3, Группа I (n=149) 58,4 39,6 2, 78,22,7 21,85,1 р=0,3646 p=0, 2,86 6, Группа II (n=32) 68,8 31,3 0, 84,44,9 15,67,4 p=0,0907 p=0, Как следует из полученных данных (таб. 2), частота аллеля s гена COL1A1 в группе II почти в три раза выше (50,0%±5,9) таковой в популяции (18,4%±4,8) (p0,0001). В группе I отмечено некоторое повышение частоты аллеля s (20,2%±4,9), но оно оказалось статистически недостоверным по сравнению с популяционной (p=0,6136). По нашим данным, частоты генотипов SS, Ss и ss в группе I составляют 68,5%, 22,6% и 8,9% соответственно, что достоверно отличается от таковых в популяции Северо-западного региона России (64,8%, 33,5% и 1,7%;

p=0,0018). Интересно отметить увеличение более чем в четыре раза частоты генотипа ss в группе I, по сравнению с таковой в популяции, несмотря на недостоверность отличия по частоте аллеля s (20,2%±4,9 и 18,4%±4,9, соответственно).

Наиболее интересные результаты получены при анализе распределения генотипов в группе II. Так у пациентов с тяжёлым остеопорозом частота генотипа ss достигала 32,9%, по сравнению с 1,7% в популяции. Причем частота генотипа SS более чем в 2 раза меньше, чем в популяции, тогда как частота генотипа ss в 19 с лишним раз превысила популяционный уровень (p0,0001).

Интересные данные получены и при изучении частоты аллеля t гена VDR, частота которого оказалась достоверно выше в группе II (51,4%±5,9), по сравнению с популяционной (36,3%±4,2) (p=0,0028). Частота этого же аллеля в группе I (35,5%±4,4) практически не отличалась от популяционной (p=0,8859). Частоты генотипов TT, Tt и tt в группе II равнялись 18,6%, 60,0% и 21,4% соответственно и достоверно отличались от таковых в популяции Северо-западного региона России (41,3%, 44,7% и 14,0%;

p0,003) (таб. 2). Важно отметить двукратное снижение частоты генотипа ТТ и существенное возрастание частоты генотипа tt по сравнению с популяционной. Распределение генотипов в группе I практически не отличалось от популяционного (p=0,3844). Интересно отметить, что частота характерного для популяции генотипа Tt (44,7%) в группе I заметно увеличивается и достигает 50,9%, в то время как частоты генотипов ТТ (39,1%) и tt (10,1%) уменьшаются по сравнению с таковыми в популяции (41,3% и 14,00, соответственно).

При изучении полиморфизма гена CALCR определено, что частота аллеля Т достоверно не отличалась от таковой в популяции (74,9%±2,6) как в группе I (78,2%±2,7) (р=0,3646), так и в группе II (84,4%±4,9) (p=0,0907). Для группы I распределение генотипов достоверно не отличалось от популяционного (ТТ-68,8%, ТС-31,3% и СС-0,0%;

p=0,1980). Интересно отметить, что хотя нами не выявлено отличий в частотах аллелей для группы II, частоты генотипов TT, ТС и СС достоверно отличались от таковых в популяции (58,4%, 39,6%, 2,0% и 58,1%, 33,5%, 8,4% соответственно;

p=0,0328). В группе II не было идентифицировано ни одного пациента с генотипом СС, и резко увеличилась частота генотипа ТТ.

Исследование полиморфизма гена BGLAP проведено на сравнительно небольшой группе больных тяжёлым остеопорозом. Согласно нашим данным частоты аллелей и генотипов в группе I и II не отличались от таковых в популяции Северо-западного региона России. Частота генотипов HH, Hh и hh по гену BGLAP в популяции составила 3,6%, 32,5% и 63,9% соответственно.

Таким образом, проведённый анализ частот генотипов и аллелей генов VDR, COL1A1, CALCR и BGLAP в группе I (женщины постменопаузального периода) не выявил достоверных отличий от таковых в популяционной выборке. В целом, полученные результаты свидетельствуют о гетерогенности исследуемой группы женщин и её сходстве с популяционной выборкой. При анализе группы II (пациентки с тяжёлым остеопорозом) установлено достоверное отличие частот аллелей и генотипов по генам VDR, COL1A1 и CALCR от таковых в популяционной выборке. Важно отметить резкое увеличение числа гомозигот ss и tt, причём для гена COL1A1 частота гомозигот ss была равна частоте гомозигот SS. Полученные результаты доказывают наличие ассоциации генотипов по генам рецептора витамина D и коллагена с развитием тяжёлого остеопороза. Важно отметить, что, отсутствие ярких отличий в анализируемых группах между частотами аллельных вариантов гена CALCR не должно снижать интерес к изучению данного полиморфизма. Можно педполагать, что дальнейшие молекулярно-генетические исследования гена CALCR и увеличение выборки позволят получить более объективную информацию о природе и механизмах действия рецептора кальцитонина, как одного из важных регуляторов кальциевого метаболизма.

2. Сравнительный анализ частоты аллелей и генотипов по генам COL1A1, VDR, CALCR и BGLAP у пациенток с различной скоростью потери МПК В зависимости от причины наступления менопаузы, выделено две группы женщин. Первая состояла из пациенток, у которых менопауза наступила в результате хирургического вмешательства.

Вторая включала женщин с естественной менопаузой. Анализ частот генотипов и аллелей генов COL1A1, VDR, CALCR и BGLAP у женщин с менопаузой разного генеза не выявил достоверных отличий в частотах генотипов и аллелей, что позволило нам объединить их в дальнейшем в одну группу, независимо от причины наступления менопаузы. Для данной группы пациенток общим неблагоприятным фактором было наличие эстрогендефицитного состояния. Данной группе пациенток была проведена остеоденситометрия поясничного отдела позвоночника в начале и через 12 месяцев от начала обследования. В зависимости от динамики изменения МПК за 12 месяцев при одинаковой продолжительности постменопаузы (независимо от ее причины), все пациентки были разделены на две группы. Первую (медленная потеря – МП) составили 53 пациентки с минимальной скоростью потери МПК (до 3% в зоне поясничного отдела L1-L4 за 12 месяцев), вторую (быстрая потеря – БП) – 116 женщин с высокой скоростью потери МПК (более 8%). У пациенток МП потери МПК составили в зоне L1 на 2,8±0,4%, L2 на 1,9±0,7%, L3 на 2,1±0,3 % и L4 на 2,6±0,4% (общее значение L1-L4 – 2,35±0,47%). Пациентки БП в среднем снизили МПК в зоне L1 на 7,9±0,93%, L2 на 7,6±0,66%, L3 на 8,0±0,96% и L4 на 8,2±0,72% (в целом L1-L4 – на 8,16±0,76%). Результаты анализа частот аллельных вариантов и генотипов по генам COL1A1, VDR, CALCR и BGLAP представлены в таблице 3.

Частота аллеля s гена COL1A1 у женщин с быстрой потерей МПК составила 26,3±6,2% и была достоверно выше популяционной (18,4±4,8%) (p=0,0303), она более чем в 4 раза превысила таковую в группе с медленной потерей МПК (6,7±9,4%) (p0,0001). Интересно, что частота аллели s в популяции была ближе к таковой в группе с БП, чем к частоте в группе МП. Результат анализа частот генотипов по гену COL1A1 показал достоверное отличие частот в группе женщин с быстрой потерей МПК от таковых в популяции (p=0,0009). Частота гомозигот ss по гену COL1A1 в группе с быстрой потерей МПК составила 12,1%. Вместе с тем, женщины с медленной потерей МПК оказались преимущественно гомозиготами по аллелю S. В этой группе его частота превысила 88%. Женщины в группе МП с генотипом ss, как и в популяции, встречались лишь в единичных случаях (1,9% и 1,7%, соответственно), но за счёт высокой частоты пациенток с генотипом Ss мы наблюдали достоверные различия с популяционным контролем (p=0,0033). Частота гомозигот SS среди женщин с быстрой потерей МПК составила 59,5%, и была достоверно ниже популяционной (64,8%). Сходный характер распределения частот наблюдался и в отношении гетерозигот Ss. Особенно редко генотип Ss встречался в группе женщин с медленной потерей МПК, где его частота составила всего 9,6%.

Таблица 3. Распределение генотипов и частот аллелей гена COL1A1, VDR, CALCR и BGLAP в популяции и у женщин в постменопаузе с различной скоростью потери МПК.

Группы и число Сравнение с популяцией Сравнение с популяцией Частоты аллелей, % Частоты генотипов, % обследуемых пациентов и между собой и между собой (n) 2;

df=1 2;

df= S s SS Ss ss COL1A 7,44 11, Группа МП (n=52) 88,5 9,6 1, 93,32,5 6,79, p0, p=0, p=0, р=0, 15, 14, Популяционная выборка 64,8 33,5 1, 81,62,3 18,44,8 — — (n=179) 4,69 14, Группа БП (n=116) 59,5 28,4 12, 73,74,8 26,36,2 p=0,0303 p=0, T t TT Tt tt VDR 11,86 12, Группа МП (n=53) 67,9 28,3 3, 82,14,1 17,98, p0, p0, p=0, р=0, 19, 27, Популяционная выборка 41,3 44,7 14, 63,73,2 36,34,2 — — (n=179) 2,79 8, Группа БП (n=116) 25,9 61,2 12, 56,55,9 43,55,7 p=0,0951 p=0, T C TT TC CC CALCR 2,86 10, Группа МП (n=43) 34,9 60,5 4, 65,16,4 34,98, p=0, p=0, р=0,0907 p=0, 11, 14, Популяционная выборка 58,1 33,5 8, 74,92,6 25,14,2 — — (n=179) 5,30 7, Группа БП (n=106) 67,9 31,1 1, 83,53,9 16,57,9 p=0,0213 p=0, Аналогичная зависимость прослеживалась и в отношении частот аллелей и генотипов по гену VDR (таб. 3). В группе с быстрой потерей МПК частота аллеля t (43,5±5,7%) достоверно не отличалась от таковой в популяции (36,3±4,2%) (p=0,0951), но была более чем в два раза выше частоты этого аллеля в группе с медленной потерей МПК (17,9±8,8%) (p=0,0006). Число женщин с медленной потерей МПК, гомозиготных по аллелю t, составило 3,8 % и было более чем в 3 раза меньше таковых в популяции (14,0%) (p=0,0020). В то же время частота генотипа tt среди женщин с быстрой потерей МПК достигала 12,9% и была практически равна популяционной, но, как и для гена COL1A1, высокая разница в частотах других генотипов делала эти две группы статистически отличными (p=0,0136).

Частота гетерозигот (генотип Tt) cреди женщин с быстрой потерей МПК составила 61,2% и была достоверно выше таковой в популяции (44,7%) и у женщин с медленной потерей МПК (28,3%).

Частота ТТ гомозигот в этой группе составила всего 25,9% по сравнению с 41,3% в популяции и 67,9% гомозигот среди женщин с медленной потерей МПК.

Для гена CALCR достоверные отличия в частотах аллелей были получены при сравнении группы пациенток с БП с популяционной выборкой и группой с МП. Частота аллеля Т в группе женщин с быстрой потерей МПК достигала 83,5±3,9%, в популяции она составила 74,9±2,6% (р=0,0907), а в группе с медленной потерей - 65,1±6,4% (p=0,0213). Интересно отметить, что хотя нами не выявлено достоверных отличий в частотах аллелей гена CALCR для женщин с медленной потерей МПК, распределение генотипов ТТ, ТС и СС в этой группе достоверно отличалось от популяционного (34,9%, 60,5%, 4,7% и 58,1%, 33,5%, 8,4% соответственно;

p=0,0050). У женщин с медленной потерей определено двукратное увеличение частоты гетерозигот ТС и уменьшение гомозигот ТТ (60,5% и 34,9% соответственно) по сравнению с популяционной (33,5% и 58,1%) и женщинами с быстрой потерей МПК (31,1% и 67,9%).

Результат анализа частот аллелей H и h, а также генотипов HH, Hh и hh по гену BGLAP показал, что их распределение в исследуемых группах пациенток очень сходное. Частота аллеля H имела тенденцию к увеличению в группе БП (20,84,8%) по сравнению с таковой в МП (13,59,5%) и в популяции (19,9±6,9%).

В дальнейшем, в ходе анализа частот генотипов у всех пациенток в постменопаузе с помощью критерия ANOVA Краскела-Уоллиса и рассчитанных между генотипами точных значений р по U критерию Манна-Уитни нами получены прямые доказательства ассоциации аллельных вариантов полиморфизма генов VDR, COL1A1 и CALCR с уровенем потери МПК (в г/см2) поясничного отдела позвоночника. Чтобы доказать достоверность отличий в частотах генотипов изучаемых генов в группах женщин с различной скоростью потери МПК, нами был проведён анализ количественных изменений МПК за 12 месяцев в зависимости от различных генотипов. Для полиморфизма rs (S/s) гена COL1A1 после выполнения повторных измерений МПК и расчёта значений МПК (рис. 1) были получены достоверные отличия как по критерию ANOVA Краскела-Уоллиса (2=9,53;

df=2;

p=0,0085), так и по U-критерию Манна-Уитни (рис. 1).

0. 0. p = 0,2163 p = 0, 0. 0. 0. разница МПК L1-L4, г/см 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. р = 0,0081* Mean 0. ±SE SSSS Ss ss 101 ±SD Col1a Рисунок 1. Показатели количественных изменений МПК в течение 12 месяцев в зависимости от генотипа по гену COL1A1. Точные значения р между двумя группами рассчитаны по U критерию Манна-Уитни,*достоверное отличие 0. р =0,0103* 0. 0. р 0,0001* разница МПК L1-L4, г/см 0. 0. 0. 0. 0. р 0,0001* 0. Mean 0. ±SE TT Tt101 TT tt ±SD VDR Рисунок 2. Показатели количественных изменений МПК в течение 12 месяцев в зависимости от генотипа по гену VDR. Точные значения р между двумя группами рассчитаны по U критерию Манна-Уитни,*достоверное отличие Особенно впечатляющие результаты получены при анализе полиморфизма rs731236 (T/t) гена VDR. После выполнения повторных измерений МПК и расчёта разницы в значениях МПК были получены достоверные отличия как по критерию ANOVA Краскела-Уоллиса (2=17,50;

df=2;

p=0,0002), так и U-критерию Манна-Уитни (рис. 2).

Для полиморфизма rs1801197 (C/T) гена CALCR после повторных измерений МПК и расчёта разницы в значениях МПК были получены достоверные отличия по критерию ANOVA Краскела Уоллиса (2=7,04;

df=2;

p=0,0296), а U-критерий Манна-Уитни показал достоверные отличия между носителями генотипов ТТ и СС (рис. 3).

0. р =0, 0. р =0, 0. разница МПК L1-L4, г/см 0. 0. 0. 0.010 р =0,0363* Mean 0.005 ±SE TT TC CC ±SD CALCR Рисунок 3. Показатели количественных изменений МПК в течение 12 месяцев в зависимости от генотипа по гену CALCR. Точные значения р между двумя группами рассчитаны по U критерию Манна-Уитни,*достоверное отличие Таким образом, полученные результаты указывают на наличие чёткой ассоциации аллельных вариантов генов VDR, COL1A1 и CALCR не только с развитием тяжёлого остеопороза, но и со скоростью потери МПК. Доказана ассоциация полиморфизма изученных генов с развитием остеопороза у женщин в постменопаузе, независимо от её происхождения. Распределение аллелей у женщин с различной скоростью потери МПК позволило рассчитать коэффициент соотношения шансов (OR), показывающий, во сколько раз выше вероятность иметь повышенную скорость потери МПК при наличии неблагоприятного генотипа (таб. 4). У женщин с генотипом tt по гену VDR более чем в 3, раза увеличен коэффициент соотношения шансов потери МПК в постменапаузе и, соответственно, развития остеопороза [CI 95%: ORmin=2,02 ORmax=6,18]. При наличии генотипа ТТ по гену CALCR коэффициент соотношения шансов возрастает в 2,7 раза [CI 95%: ORmin=1,53 ORmax=4,81], а для носителей генотипа ss по гену COL1A1 - в 4,9 раз [CI 95%: ORmin=2,18 ORmax=11,24]. Особый интерес для генетического тестирования наследственной предрасположенности к остеопорозу могли бы представить женщины с генотипом ss по гену COL1A1 и tt по гену VDR.

Таблица 4. Коэффициенты соотношения шансов для генов COL1A1, VDR и CALCR при сравнении популяционной выборки (ПВ) и групп женщин с различной скоростью потери МПК COL1A1 VDR CALCR OR [ORmin-max] OR [ORmin-max] OR [ORmin-max] OR [ORmin-max] OR [ORmin-max] OR [ORmin-max] Группы при сравнении с при сравнении с при сравнении с при сравнении с при сравнении с при сравнении с ПВ МП ПВ МП ПВ МП 1,58 4,94 1,35 3,53 1,70 2, Женщины с быстрой потерей МПК [1,06-2,35] [2,18-11,24] [0,97-1,89] [2,02-6,18] [1,10-2,62] [1,53-4,81] 0,32 0,38 0, Женщины с медленной — — — потерей МПК [0,14-0,72] [0,22-0,66] [0,38-1,04] Важно подчеркнуть, что на основании уже полученных данных определение аллельных вариантов полиморфизма генов COL1A1 и VDR перспективно с целью раннего, досимтоматического выявления женщин, принадлежащих к группе высокого риска по развитию остеопороза в постменопаузе вследствие высокой скорости потери МПК. Максимальная частота носителей хотя бы одного из генотипов ss или tt по генам COL1A1 и VDR наблюдается у больных тяжёлым остеопорозом.

Их минимальная частота зарегистрирована у женщин с медленной потерей МПК. Важно отметить практически равную частоту гетерозигот по двум этим генам. Эти данные свидетельствуют о независимом воздействии аллелей генов COL1A1 и VDR на состояние МПК у женщин в постменопаузе (рис. 4). Полученные данные свидетельствуют о важности анализа полиморфизма rs731236 (T/t) гена VDR, rs1800012 (S/s) гена COL1A1 и возможно rs1801197 (T/C) гена CALCR.

82, 80 70, 45, 36, 25, 18, 15,1 15, 13, 14, 3, МП ПВ БП ТО МП ПВ БП ТО МП ПВ БП ТО ss -- или -- tt SsTt другие Рисунок 4. Частоты генотипов генов COL1A1 и VDR у женщин Северо-западного региона России (ПВ), в группе женщин с медленной потерей МПК (МП), с быстрой потерей МПК (БП) и у больных тяжёлым остеопорозом (ТО) Таким образом, несмотря на большое количество работ, посвященных ассоциации генов COL1A1 и VDR с переломами и с риском развития остеопороза, имеющиеся данные еще не позволяют сделать окончательный вывод о роли этих генов в поддержании МПК у женщин в постменопаузе.

Действительно, проведенный анализ аллельных частот этих генов у женщин постменопаузального периода (без учёта динамики МПК) и в популяционной выборке не позволил выявить ассоциации соответствующих аллелей или их генотипов. Вместе с тем, наши данные хорошо согласуются с результатами исследований, которые показали ассоциацию аллельных вариантов генов COL1A1 и VDR с потерей МПК в ранней постменапаузе (Gong et al., 1999;

Efstathiadou et al., 2001). Причем эта ассоциация не зависела от значения МПК в пике костной массы, но коррелировала с уровнем её потери (MacDonald et al., 2001). Характер такого воздействия может варьировать в зависимости от наличия других неблагоприятных факторов. Показано, что ЗГТ (заместительная гормональная терапия) у женщин в постменопаузе, а также высокое потребление витамина D и кальция – значительно снижают негативное влияние полиморфных аллелей генов COL1A1 и VDR. На фоне такого лечения у женщин не происходит резкого снижения МПК (Harris et al., 2000;

Recker R, Deng H-W., 2002).

3. Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов по генам VDR, COL1A1 и CALCR у женщин в постменопаузе с различным уровнем экскреции маркера остеорезорбции Сделана попытка оценить влияние аллельных вариантов генов COL1A1 и VDR не только на поддержание МПК, но и на интенсивность резорбции костной ткани у женщин постменопаузального периода. Интенсивность резорбции оценивалась по уровню дезоксипиридинолина (ДПИД), который является высокоспецифичным биохимическим маркером костной резорбции. К биохимическим маркерам резорбции кости относят, прежде всего, фрагменты коллагена I типа, попадающие в кровоток из зоны резорбции костного матрикса. Среди продуктов деградации коллагена I типа особого внимания заслуживают те фрагменты, в состав которых входят молекулы зрелого коллагена, имеющие поперечные сшивки. Оценка уровня экскреции ДПИД характеризует количество продуктов деградации зрелого коллагена. Мы оценивали уровень ДПИД в моче, который зависит не только от уровня МПК, но и от генотипа пациентки.

При анализе частот аллельных вариантов гена COL1A1, в зависимости от уровня ДПИД, были получены достоверные отличия (2=28,27;

df=2;

р0,0001). Выявлено всего 2 пациентки (7,4%) с генотипом ss при нормальном уровне ДПИД. В то же время при высоком уровне ДПИД генотип ss встречался у 68,5% обследованных. Частота гетерозигот (генотип Ss) среди женщин с высокими значениями ДПИД равнялась 24,1%, а гомозигот по аллелю S - 7,4%. Частота гетерозигот Ss среди женщин с нормальными значениями ДПИД более чем в два раза выше таковой при повышенном ДПИД (55,6%), а гомозигот по аллелю S - более чем в пять раз - 37,0% (рис. 5).

% % SS Ss ss SS Ss ss TT Tt tt TT Tt tt скорость костной резорбции в высокая скорость костной скорость костной резорбции в высокая скорость костной пределах нормальных значений резорбции пределах нормальных значений резорбции ДПИД 7,4 нмоль ДПИД /нмоль ДПИД 7,4 нмоль ДПИД /нмоль ДПИД 7,4 нмоль ДПИД /нмоль ДПИД 7,4 нмоль ДПИД /нмоль креатинина, n=27 креатинина, n=54 креатинина, n=27 креатинина, n= Рисунок 5. Распределение генотипов по генам COL1A1 и VDR у женщин в постменопаузе в зависимости от скорости резорбции костной ткани.

Среди двух групп пациенток с нормальным и превышающим норму показателем ДПИД были получены достоверные отличия в распределении генотипов по гену VDR (2=27,17;

df=2;

р0,0001). У пациенток с уровнем ДПИД, не превышающим норму, гомозигот по аллелю t не было выявлено (рис.

5). В то же время, генотип tt обнаружен у 32,7% женщин с высокой уровнем ДПИД в моче. Частота гетерозигот (генотип Тt) среди женщин с высокими значениями ДПИД составила 67,3%, а с нормальными значениями ДПИД – 66,7%. Гомозиготы по аллелю Т при нормальной скорости костной резорбции встретились в 33,3% случаев, а в группе с высокими показателями ДПИД данный генотип не выявлен.

При анализе распределения генотипов по гену CALCR достоверных отличий получено не было (2=3,62;

df=2;

р=0,1634). Частота генотипа ТС у пациенток с нормальным показателем ДПИД почти в два раза меньше таковой у женщин с уровнем ДПИД, превышающим норму. Из пятидесяти пациенток с высокой скоростью резорбции генотип СС был обнаружен только у одной (2,0%), в то время как среди 26 женщин с нормальным уровнем ДПИД такой генотип зарегистрирован лишь у двух пациенток (7,7%).

Таким образом, результаты проведённых исследований подтверждают представление о полигенности патогенеза остеопороза. Костная ткань является результатом согласованной работы многих генов. Уже идентифицировано более 300 генов, принимающих непосредственное участие в процессах формирования костной ткани и её функционирования. В исследованных выборках здоровых лиц, достигших половой зрелости, генетическое разнообразие в подавляющем большинстве случаев не выходит за рамки “нормального” фенотипа. Инактивирующая мутация одного из главных генов остеогенеза способна разрушить согласованную работу системы полигенов, что неизбежно ведёт к появлению «аномального» фенотипа в сравнительно раннем возрасте. По-видимому, некоторые селективно нейтральные (полиморфные) аллели в системе полигенов, детерминирующих процессы костного обмена, в изменившихся условиях внутренней среды (дефицит эстрогенов при менопаузе) могут приводить к нарушению костного гомеостаза и процессов ремоделирования кости и, как следствие, к значительной потере МПК и увеличению уровня ДПИД. Например, аллель s полиморфного локуса (нуклеотид Т) изменяет последовательность 1 интрона гена COL1A1, вследствие чего данная область имеет почти в два раза большее сродство (аффинность) к транскрипционному фактору Sp1, по сравнению с S аллелем (нуклеотид G) (Hobson et al., 1998). Увеличение степени аффинности приводит к двукратному усилению транскрипции 1 цепей проколлагена (белкового продукта гена COL1A1) с последующим изменением соотношения 1 и 2 белковых цепей в молекуле коллагена и образованием гомотримера только из 1 цепей (Mann et al., 2001). Биохимические анализы образцов кости гетерозигот Ss по гену COL1A1 показали уменьшение прочности костной ткани по сравнению с гомозиготами SS (Ralston S, 2002). Возможно, что наличие патологического гомотримерного коллагена 1 типа приводит к изменению его четвертичной структуры с последующим нарушением минерализации костного матрикса.

Известно, что действие отбора не распространяется на гены, негативный эффект которых проявляется в пострепродуктивный период. Нельзя также исключить, что определённый вклад в патогенез остеопороза вносят накапливающиеся с возрастом соматические мутации. Для получения более чёткого представления о причинах остеопороза и разработки на этой основе мер по его эффективной профилактике предстоит ещё большая работа. Прежде всего, она касается идентификации всех генов, определяющих состояние кости, а также выявления взаимодействий между самими генами и их продуктами с оценкой влияния на эти процессы факторов внутренней и внешней среды.

Тем не менее, уже сейчас генетическое тестирование женщин репродуктивного возраста по генам COL1A1, VDR и CALCR в сочетании с обязательным денситометрическим анализом и определением уровня дезоксипиридинолина (ДПИД) позволят начать разработку комплексной программы профилактики остеопороза.

4. Создание лабораторного макета "остео-чипа" С целью одновременного анализа полиморфизма сразу нескольких генов, участвующих в метаболизме костной ткани, нами была предприянта попытка создания лабораторного варианта "остео чипа". Разработанная нами тест-система полностью отвечает всем тенденциям и направлениям мировой практики. В чипе использован анализ небольшого числа генов-кандидатов для проведения оптимальной диагностики и профилактики заболеваний костной ткани. Даный биочип, позволял бы одновременно анализировать полиморфизм следующих генов: VDR (rs731236, rs11568820), COL1A (rs1800012, rs1107946), BGLAP (rs1800247), GSTM1 (делеция), CALCR (rs1801197), MTHFR (rs1801133), GR (rs6195) и ER1 (rs2234693). Помимо традиционных генов-кандидатов остеопороза, нами были включены гены GSTM1 и MTHFR. Согласно результатам наших предыдущих пилотных исследований (данные ещё не опубликованы), аллельные варианты этих генов коррелируют с МПК пациентов астматиков.

Все этапы разработки, изготовления и апробации лабораторного макета "остео-чипа" выполнялись в разное время совместно с Глотовым А.С. и Гра О.А., а также с коллегами из ООО «ИМБ-Биочип» и сотрудниками Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (г. Москва).

Основным критерием при размещении на биочипе олигонуклеотидов, было группирование генов по блокам на основе сходства их функции, где в первый блок вошли гены, белковые продукты которых составляют матрикс костной ткани, во второй – гены кальциотропных гормонов, факторов и их рецепторов, а в третий – ген, ответственный за метаболизм гомоцистеина. Согласно выбранным критериям, олигонуклеотидные пробы в составе биочипа были сгруппированы в 3 блока (рис. 6).

Олигонуклеотидные пробы, нанесенные в ячейки микрочипа, представляют собой фрагменты генов метаболизма костной ткани. Для исключения ошибок и повышения точности каждая проба на микрочипе продублирована.

«Дикий» COL1A1 COL1A1 BGLAP CALCR VDR VDR ER GSTM1 GR MTHFR тип -1997G 1245G -298C 1340C -3731A 61968C 3341C +/+ N363S/A 677C COL1A1 COL1A1 BGLAP CALCR VDR VDR ER GSTM1 GR MTHFR «Мутантный» -1997G 1245G -298C 1340C -3731A 61968C 3341C +/+ N363S/A 677C тип COL1A1 COL1A1 BGLAP CALCR VDR VDR ER GSTM1 GR MTHFR -1997T 1245T -298T 1340T -3731G 61968T 3341T +/+ N363S/G 677T COL1A1 COL1A1 BGLAP CALCR VDR VDR ER GSTM1 GR MTHFR -1997T 1245T -298T 1340T -3731G 61968T 3341T +/+ N363S/G 677T 1 блок 2 блок 3 блок Рисунок 6. Схема первого варианта лабораторного макета «остео-чипа» и картина гибридизации продуктов мультиплексного ПЦР на «остео-чипе».

Олигонуклеотиды в двух верхних наборах ячеек соответствуют ДНК-фрагментам «дикого» типа, в двух нижних – «мутантным» ДНК-последовательностям. Подобное расположение облегчает интерпретацию результатов гибридизации. Выявление флюоресцентного сигнала в ячейках двух верхних строк биочипа для каждого из генов, означает, что анализируемый образец содержит аллели дикого типа. Появление сигнала в нижних строках свидетельствует о наличии аллелей «мутантного» типа. Детекция сигнала в ячейках одного из столбцов означает гетерозиготное носительство аллелей для каждого из генов. Созданный “остео-чип” позволяет анализировать 10 полиморфных локусов в восьми различных генах. На рисунке 6 приведен пример гибридизационной картины, включающей все блоки биочипа для образца со следующим генотипом: COL1A1 G/G – Т/Т, BGLAP C/Т, CALCR C/C, VDR A/A – C/C, ER T/T, GSTM1 +/+, GR A/А и MTHFR C/T.

Нами были отработаны оптимальные режимы мультиплексной ПЦР с целью повышения эффективности амплификации в каждом блоке. В блоки 1, 2 и 3 входят следующие гены: COL1A (полиморфизм rs1107946), COL1A1 (полиморфизм rs1800012, известный как S/s), BGLAP (полиморфизм rs1800247, известный как H/h);

CALCR (полиморфизм rs1801197, известный как C/T), VDR (полиморфизм rs11568820), VDR (полиморфизм rs731236, известный как T/t), ER (полиморфизм rs2234693), GSTM1 (del полиморфизм +/-), GR (полиморфизм rs6195) и MTHFR (полиморфизм rs1801133). Для проверки эффективности дискриминации аллелей анализируемых генов проведена мультиплексная гибридизация продуктов второго этапа амплификации с зондами биочипа (37 циклов) с использованием меченых нуклеотидов (dUTP), согласно ранее описанной методике (Глотов и др., 2005). Гибридизационные картины были получены при анализе двух различных образцов (более испытаний), генотипы которых были установлены ранее методом ПДРФ. Было показано совпадение результатов генотипирования с помощью биочипа и метода ПДРФ.

Таким образом, применение данного чипа открывает возможности для массового скрининга с целью выявления лиц группы высокого риска развития остеопроза.

5. Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов по генам VDR, CALCR, BGLAP, GSTM1 и MTHFR у пациентов, больных тяжелой бронхиальной астмой, длительно принимающих глюкокортикоиды (ГК) Глюкокортикоиды (ГК) включены в арсенал обязательных средств современной терапии различных заболеваний, в том числе бронхиальной астмы. За более чем полувековой период накоплен огромный опыт, касающийся показаний, противопоказаний, лечебного и побочных эффектов ГК.

Взаимосвязь остеопороза с терапией глюкокортикоидами (ГК) была установлена практически сразу после начала использования этих препаратов и впервые описана у больных бронхиальной астмой.

Индивидуальная чувствительность к ГК на данный момент хорошо известна, но механизмы ее до сих пор нуждаются в уточнении. Глюкокортикоид-индуцированный остеопороз (ГИ-остеопороз) считается наиболее частым и тяжелым осложнением терапии ГК. Терапия глюкокортикоидами препятствует нормальному остеогенезу. При этом значительную роль играет нарушение абсорбции кальция в кишечнике, обусловленное как снижением образования в печени, так и замедленным превращением его в кальцитриол вследствие торможения активности 1–гидроксилазы почек (Bowman, 1997).

Глюкокортикоиды нарушают функционирование рецепторов к витамину D, препятствуя их связыванию с кальцитриолом. При ГИ-остеопорозе нивелируется значение многих известных факторов риска. Он развивается у людей любого возраста и пола. Попытка определить минимальную (т.н. «пороговую») дозу ГК, при превышении которой возрастает риск развития переломов, и требуются неотложные диагностические и лечебные мероприятия, не увенчалась успехом. В последние годы появились данные и о том, что применение ингаляционных глюкокортикоидов также сопровождается снижением МПК (Institute for clinical systems improvement, 2004., London: Royal College of Physicians, 2002). У пациентов пожилого и старческого возраста отмечено увеличение относительного риска развития остеопоротических переломов (Hubbard et al., 2002;

Suissa et al., 2004).

Отсутствие четких рекомендаций для оценки риска развития ГИ-остеопороза заставляет искать новые маркеры его проспективной диагностики. Анализ ассоциации кандидатных генов метаболизма костной ткани с показателями МПК, риском переломов и с развитием остеопороза в условиях лечения ГК был нами проведен с помощью метода биочипов.

Исследование включало 137 больных бронхиальной астмой (БА) - как мужчин, так и женщин, и было проведено со строгим ограничением возрастных рамок (женщины до 50 лет). Кроме бронхиальной астмы, пациенты не имели иных заболеваний и состояний, которые могли бы привести к развитию вторичного остеопороза. Было проведено генотипирование образцов ДНК по 9-ти однонуклеотидным заменам и 1 делеции в семи генах, участвующих в метаболизме костной ткани (см.

раздел 4). С помощью разработанного нами лабораторного варианта "остео-чипа" удавалось чётко определять генотипы пациентов по генам VDR, ER, GSTM1, GR и MTHFR, тогда как анализ полиморфизма генов COL1A1, BGLAP и CALCR проводился с помощью метода ПДРФ. При анализе частот генотипов и аллелей генов COL1A1, VDR (только rs11568820), ER и GR у больных БА с различными показателями МПК (в абсолютных значениях г/см2, Т-score и Z-score), длительно принимающих ГК, достоверных различий выявлено не было. Вместе с тем, при сравнении абсолютных значений МПК выявлены статистически значимые различия для полиморфизма гена VDR rs731236 (T/t) по критерию ANOVA Краскела-Уоллиса ( =6,28;

df=2;

p=0,043). Попарный сравнительный анализ между генотипами по U-критерию Манна-Уитни показал, что пациенты с генотипом tt по гену VDR характеризовались более низкими значениями МПК, по сравнению с носителями генотипов Tt и TT.

Для полиморфизма гена CALCR rs1801197 (C/T) при сравнении абсолютных значений МПК также были получены статистически значимые различия по критерию ANOVA Краскела-Уоллиса (2=6,86;

df=2;

p=0,032). Сравнительный анализ по U-критерию Манна-Уитни также показал статистически значимые различия: носители генотипов С/T и T/T по гену CALCR характеризуются более низкими значениями МПК, по сравнению с носителями генотипа С/С. Для однонуклеотидной замены в гене BGLAP rs1800247 (H/h) при сравнении абсолютных значений МПК были получены статистически значимые различия по критерию ANOVA Краскела-Уоллиса (2=8,88;

df=2;

p=0,012). Сравнительный анализ по U-критерию Манна-Уитни показал, что носители генотипа hh по гену BGLAP имеют достоверно более высокие значения МПК по сравнению с носителями генотипов HH и Hh.

Таким образом, изученные гены непосредственно вовлечены в процессы остеогенеза, хотя биомеханизмы их действия различны. Рецепторы к кальцитонину и витамину D влияют на уровень гормональной регуляции остеогенеза, тогда как остеокальцин является важной составной частью костного матрикса.

При этом в отношении генов GSTMT и MTHFR методами непараметрической статистики удалось обнаружить ассоциацию аллельных вариантов данных генов с показателями Z-score. При сравнении показателей МПК проксимального отдела бедренной кости в целом по Z–score для полиморфизма гена MTHFR rs1801133 (677CT) выявлены статистически значимые отличия (ANOVA Краскела-Уоллиса) p=0,0013).

* * * * * Рисунок 7. Корреляция между полиморфизмом генов GSTM1 и MTHFR и значениями МПК и Z-score у пациентов, больных БА. Точные значения р между двумя группами рассчитаны по U-критерию Манна-Уитни,*достоверное отличие Пациенты с СС и ТТ генотипами имели более низкую МПК по сравнению с носителями генотипа СТ (U–критерий Манна–Уитни, р = 0,0004 и р = 0,0666, соответственно). Для полиморфизма гена GSTM1 были получены статистически значимые различия по U–критерию Манна–Уитни (р=0,016) (рис. 7).

При одновременном анализе полиморфизма генов GSTM1 и MTHFR и показателей МПК обнаружено, что пациенты с наличием делеции в гене GSTM1 и генотипом СС по гену MTHFR имели достоверно более низкие значения МПК (ANOVA Краскела-Уоллиса p=0,0414) по сравнению с таковыми у пациентов других генотипов (рис. 7). Важно отметить, что наибольшие значения МПК были зарегистрированы у пациентов с делецией в гене GSTM1 и, по крайней мере, с одним алеллем Т гена MTHFR. Более выраженные отличия были получены при сравнении полиморфизма двух генов с показателями Z-score (ANOVA Краскела-Уоллиса p=0,0012), где особенно высокие значения Z-score были у пациентов, которые имели хотя бы один функциональный аллель гена GSTM1. Поскольку белковые продукты «генов-кандидатов» остеопороза GSTМ1 и MTHFR играют важную роль в защите организма от оксидативного стресса, который является независимым фактором риска развития остеопороза, можно предполагать, что изменение активности соответствующих ферментов определяет эффективность компенсаторной реакции организма на оксидативный стресс. При действии оксидативного стресса происходит индукция развития остеокластов и ингибирование дифференцировки остеобластов свободными радикалами, вследствие чего усиливается костная резорбция и снижается МПК (Bjelakovi et al., 2007).

Наша работа является первой и пока еднственной, в которой изучалось развитие вторичного ГИ-остеопороза в зависимости от обмена фолиевой кислоты (метилентетрагидрофолатредуктаза (MTHFR) – обеспечивает превращение фолиевой кислоты в её метаболически активную форму – тетрагидрофолиевую кислоту). Нами показано, что у больных БА, получавших длительную терапию СГК, аллель 677С отрицательно коррелирует с уровнем МПК по Z-score, то есть наличие функционального полноценного фермента MTHFR в сочетании с приемом ГК предрасполагает к разрежению костной ткани и развитию вторичного ГИ-остеопороза. Возможно, такой парадоксальный эффект обусловлен тем, что длительная терапия ГК приводит к увеличению выработки цитокина TNF- (фактора некроза опухолей), который является важным регулятором активности остеокластов, ответственных за снижение МПК (Lane N.E. and Yao W., 2009).

Таким образом, аллельные варианты в генах GSTM1 и MTHFR у больных с тяжёлой формой бронхиальной астмы (БА), получавших длительную терапию ГК, ассоциированы с нарушением формирования пика костной массы и, следовательно, с повышенным риском развития остеопороза.

Эти результаты позволяют приблизиться к пониманию патогенеза остеопороза, возникающего на фоне лечения тяжелой формы БА, а также сформировать группу высокого риска развития ГИ-остеопороза среди больных, принимающих ГК. Предполагается, что дальнейшее изучение генетических факторов предрасположенности к ГИ-остеопорозу, в том числе анализ полиморфизма в генах цитокинов и рецепторов стероидных гормонов, позволит выявить все прогностически значимые генетические факторы риска развития осложнений, возникающих вследствие длительной гормональной терапии БА, и, таким образом, оптимизировать стратегию применения глюкокортикоидов при лечении БА.

ВЫВОДЫ 1. Установлено отличие частот аллелей и генотипов по генам COL1A1, VDR и CALCR у больных тяжёлым остеопорозом от таковых в популяции Северо-западного региона России.

2. Показано отличие частот генотипов и аллелей генов COL1A1, VDR и CALCR у женщин с быстрой потерей МПК от таковых у женщин с медленной потерей МПК.

3. Генотипы ss по гену COL1A1, tt по гену VDR и ТТ по гену CALCR ассоциированы с высоким уровнем секреции маркера остеорезорбции –дезоксиперидинолина (ДПИД) у женщин в постменопаузе.

4. Выявлена ассоциация абсолютных значений МПК, T-score и Z-score поясничного отдела позвоночника с генотипами по генам VDR, CALCR, BGLAP, GSTM1 и MTHFR у пациентов с глюкокортикоид-идуцированным остеопорозом.

5. Разработан и апробирован лабораторный макет «остео-чипа» для одновременного анализа полиморфизма некоторых генов метаболизма костной ткани (VDR, COL1A1, CALCR, BGLAP, GSTM1, GR, MTHFR и ER).

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ в журналах рекомендованных ВАК 1. Москаленко М.В., Асеев М.В., Зазерская И.Е., Котова С.М., Иващенко Т.Э., Баранов В.С. Анализ ассоциации аллелей гена COL1A1 с развитием остеопороза // Генетика, 2002, Т38, №12, с1699-1703.

2. Зазерская И.Е., Асеев М.В., Кузнецова Л.В., Москаленко М.В., Айламазян Э.К., Баранов В.С.

Анализ ассоциации генов VDR3 и Col1A1 с постменопаузальным остеопорозом // Остеопороз и остеопатии, 2002, №2, с2- 3. Москаленко М.В., Асеев М.В., Котова С.М., Баранов В.С. Анализ ассоциации аллелей генов Col1a1, VDR и CALCR с развитием остеопороза // Экологическая генетика, 2004, Т2, №1, с38- 4. Зазерская И.Е., Асеев М.В., Кузнецова Л.В., Москаленко М.В., Иващенко Т.Э., Баранов В.С.

Влияние аллельных вариантов гена VDR3 на скорость потери минеральной плотности костной ткани у женщин в ранней постменопаузе // Журнал акушерства и женских болезней, 2005, Т54, №2, с23-30.

5. Москаленко М.В., Асеев М.В., Федотова А.А., Зазерская И.Е., Баранов В.С. Анализ распределения аллелей гена эстрогенового рецептора у женщин с постменопаузальным остеопорозом // Медицинская генетика, 2005, Т4, №5, с232а- 6. Путилин А.М., Москаленко М.В., Баранова И.А., Асеев М.В., Дёмин Н.В., Баранов В.С., Чучалин А.Г. Исследование полиморфизма гена рецептора витамина D при глюкокортикоид–индуцированном остеопорозе у больных тяжёлой бронхиальной астмой // Пульмонология, 2006, с68- 7. Чучалин А.Г., Баранова И.А., Москаленко М.В., Путилин А.М., Асеев М.В., Дёмин Н.В., Иващенко Т.Э., Гораб Д.Н. Изучение генетической предрасположенности к глюкокортикоид–индуцированному остеопорозу у больных тяжёлой бронхиальной астмой // Вестник Российского Медицинского Университета, 2006, №4 (51), с39- 8. В.С. Оганов, О.Л. Виноградова, Н.С. Дудов, В.С. Баранов, А.С. Миненков, А.В. Бакулин, В.Е.

Новиков, О.Е. Кабицкая, М.В. Москаленко, А.С. Глотов, О.С. Глотов, Д.В. Попов Анализ ассоциации костной массы у спортсменов с биохимическими и молекулярно-генетическими маркёрами ремоделирования костной ткани // Физиология человека, 2008, Т34, №2, с56-65.

9. О. А. Гра, М. В. Москаленко, Н. А. Филимонова, И. А. Баранова, А. С. Глотов, С. А. Суржиков, О.

В. Королева, И. В. Голденкова-Павлова, Т. В. Наседкина Ассоциация полиморфных вариантов генов MTHFR и GSTM1 с развитием глюкокортикоид-индуцированного остеопороза у больных бронхиальной астмой // Молекулярная Биология, Т45, №5, 2011 (в печати).

в иностранных журналах и материалах международных конференций 10. M.Aseev, M.Moskalenko, V.Baranov. Bone mineral density in relation to Taq I polymorphism at the VDR gene. // Progress in prevention of genetic diseases, Prague, Czech Republic, June 3-5, 1999.

11. Moskalenko M.V., Aseev M.V., Zazerskaya I.E., Baranov V.S. The association alleles of COL1A1, VDR3, CALCR genes and sever osteoporosis in women from Russia. // Eur J Hum Genetics, 2001, V9, P 12. Moskalenko M.V., Aseev M.V., Baranov V.S. Non-association alleles of ER gene and postmenopausal osteoporosis in women from Russia. // International Congress in Predictive Medicine, P14, Vichy, France, June – 1 July 2001.

13. Moskalenko M.V., Aseev M.V., Zazerskaya I.E., Baranov V.S. Allelic association of COL1A1 and VDR genes with one-year rates of bone mineral loss in postmenopausal women // Eur J Hum Genetics, 2002, V10, P 14. Moskalenko M.V., Aseev M.V., Zazerskaya I.E., Baranov V.S. VDR, Col1a1 and BGLAP genes polymorphism in development of postmenopausal osteoporosis // Eur J Hum Genetics, 2003, V11, P 15. M. V. Moskalenko, M. V. Aseev, I. E. Zazerskaya, V. S. Baranov The analysis of association between polymorphism of BGLAP gene and gynecologic diseases at osteoporosis in postmenopausal women // Eur J Hum Genetics, 2004, V12, P 16. Moskalenko M.V., Putilin А.М., Baranova I.A., Aseev M.V., Demin G.S., Ghorab D., Demin N.V., Chuchalin A.G., Baranov V.S. Analysis of polymorphisms of the Col1a1 and VDR genes in severe asthma patients treated with oral glucocorticoids // Calcif Tissue Int, 2006, V78, S 17. D. Ghorab, G. Demin, A. Glotov, M. V. Moskalenko MICROARRAY TECHNOLOGY IN MEDICAL ANALYSIS AND RESEARCH OF BONE METABOLISM GENES // 35th European Symposium on Calcified Tissues, Barcelona, 24-28 May 2008.

18. Gra O.A., Moskalenko M.V., Goldenkova-Pavlova I.V., Nasedkina T.V. Biotransformation gene polymorphisms and the risk of glucocorticoid-induced osteoporosis // European Human Genetics Conference, Gothenburg, Sweden, June 12 - 15, 2010. European Journal of Human Genetics другие основные публикации И.Е. Зазерская, М.В. Асеев, Л.В. Кузнецова, М.В. Москаленко, Д.А. Ниаури, В.С. Баранов 19.

ОСТЕОПОРОЗ. Генетическая предрасположенность. Современная диагностика, профилактика // методическое пособие, под ред. акад. РАМН, з.д.н., проф. Э.К. Айламазяна, ООО “МГК”, 2003, 32 стр.

20. Москаленко М.В., Асеев М.В., Зазерская И.Е., Кузнецова Л.В., Баранов В.С. Изучение генетической предрасположенности к остеопорозу // в сб. Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике, выпуск 4, ООО “Альфа Виста”, Новосибирск, 2003, с120- 21. Асеев М.В., Москаленко М.В., Баранов В.С. Болезни и гены предрасположенности.

ОСТЕОПОРОЗ // в книге Генетический паспорт – основа индивидуальной и предиктивной медицины, под редакцией В.С. Баранова. СПб, издательство «Н_Л», 2009, с161- 22. Москаленко М.В. Асеев М.В. Баранов В.С. Модификация методики определения GТ полиморфизма гена Сol1А1 и использование её для диагностики риска развития остеопороза. // Тезисы докладов II съезда ВОГиС, т 2, с277, С-Петербург, 1-5 февраля, 2000.

23. Асеев М.В., Зазерская И.Е., Кузнецова Л.В., Москаленко М.В., Иващенко Т.Э., Айламазян Э.К., Баранов В.С. Анализ ассоциации аллелей генов VDR3 и COL1A1 с постменопаузальным остеопорозом // Научно-практический симпозиум «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении», с89, Москва, 20-21 июня, 2002.

24. Путилин А.М., Москаленко М.В., Асеев М.В., Демин Н.В., Федотова А.А., Баранова И.А. Анализ полиморфизма гена VDR при глюкокортикоид-индуцированном остеопорозе у больных бронхиальной астмой // II съезд по остеопорозу, с44, Ярославль, 29 сентября – 1 октября, 25. Гораб Д.Н., Москаленко М.В., Путилин А.М., Асеев М.В., Баранова И.А. Анализ полиморфизма генов VDR и Col1a1 у больных бронхиальной астмой при глюкокортикоид-индуцированном остеопорозе. // Научная школа молодых ученых «Актуальные проблемы современной генетики» при Международной конференции "Генетика в России и мире, посвященной 40-летию Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН" Москва, 28 июня - 2 июля 2006.

26. Гораб Д.Н., Москаленко М.В., Глотов А.С., Вашукова Е.С., Полушкина Л.Б., Иващенко Т.Э., Пинелис В.Г., Баранов В.С. Анализ генов костного метаболизма у гормонозависимых пациентов, страдающих бронхиальной астмой, с использованием БиоЧип технологии.// Международная Школа Молодых Ученых по Молекулярной генетике «Геномика и Биотехнология», Звенигород, 4-8 декабря 2006.