Иммунобиологические свойства бирнавируса птиц и разработка средств специфической профилактики инфекционной бурсальной болезни
На правах рукописи
АЛИЕВА Айзанат Кадыровна ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БИРНАВИРУСА ПТИЦ И РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ИНФЕКЦИОННОЙ БУРСАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ 03.02.02 – вирусология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Санкт-Петербург 2011
Работа выполнена в лаборатории препаратов, применяемых в птицеводстве, Федерального Государственного Учреждения «Всероссийский Государст венный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для живот ных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») и на базе Общества с ограниченной ответст венностью «Биовет» (ООО «Биовет», Санкт-Петербург) Научные консультанты: доктор биологических наук, профессор, академик РАМН Киселев Олег Иванович доктор биологических наук, профессор Смоленский Владимир Иванович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук Харченко Евгений Петрович доктор медицинских наук Зазимко Любовь Александровна доктор биологических наук Соловьев Борис Васильевич
Ведущая организация: Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина» (Москва)
Защита состоится « 24 » января 2012 г. в часов на заседании диссертаци онного совета Д 001.043.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт гриппа» Минздравсоцраз вития РФ (197376, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, 15/17)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государст венного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт гриппа» Минздравсоцразвития РФ
Автореферат разослан «» 2011 г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук В.Ф. Суховецкая
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Успешному развитию промышленного птицеводст ва во многом препятствуют различные инфекционные болезни, которые нано сят большой экономический ущерб, обуславливая снижение продуктивности птиц и низкую рентабельность отрасли (Фисинин В.И., 2010). В начале 60-х го дов прошлого столетия к их числу добавилась новая нозологическая единица – инфекционная бурсальная болезнь (ИББ), которая впервые была описана в США (Cosgrove A.S., 1962). ИББ широко распространена во всем мире и представляет серьезную угрозу развитию отрасли (Смоленский В.И., 1999;
Борисов А.В., 2000;
Бирман Б.Я., 2003;
Бессарабов Б.Ф. с соавт., 2008;
Lasher H.N., Shane S.M., 1994).
Вакцинопрофилактика в странах с развитым промышленным птицеводст вом считается главным способом защиты поголовья от вируса ИББ (Алиев А.С., 1991;
Соловьев Б.В., 2001;
Смоленский В.И. с соавт., 2011;
Winterfield R.W., 1969;
Cursiefsen D. et al., 1979). За истекшее десятилетие был создан широкий спектр отечественных и зарубежных живых и инактивированных вакцин про тив ИББ, но, как показывает практика, в крупных птицеводческих хозяйствах среди вакцинированной птицы наблюдаются эпизоотические вспышки ИББ.
Одна из причин проявления этих эпизоотий может быть связана со структур ными изменениями в геноме вируса ИББ. Так, в конце 80-х годов в вакциниро ванных стадах птицы в США появились антигенные варианты, а в России и в Европе – антигенно сходные с «классическими» высоковирулентные штам мы вируса ИББ (ввВИББ), которые очень быстро распространились по всему миру. В отличие от ранее известных штаммов, в том числе и от новых амери канских антигенных вариантов, штаммы ввВИББ могут вызывать до 90% смертности в стадах яичных кроссов птицы (Алиев А.С., 1993;
Box P.G., 1989;
Chettle N.J. et al., 1989;
Van den Berg T.P. et al., 1991).
В этой связи становится актуальным более глубокое изучение иммуно биологических свойств бирнавируса птиц, которому до настоящего времени не уделялось достаточного внимания. Эффективность вакцины, как живой, так и инактивированной, может в значительной степени зависеть от соответствия антигенной специфичности избранного штамма в отношении полевых изолятов вируса ИББ, циркулирующих в птицеводческих хозяйствах.
В России для профилактики ИББ используются культуральные вакцины из слабореактогенных штаммов вируса ИББ (Д-78, ВНИВИП, Бюр S-706, Winterfield 25-12, Био-92 и другие). Известно, что иммуногенная активность культуральных вакцин против ИББ значительно уступает эмбриональным вари антам вакцинного препарата (Норкина С.Н., 2002;
Hassan M.K. et al., 1996).
Отечественная живая эмбриональная вакцина из штамма БГ обладает остаточ ной реактогенностью, проявляющейся атрофией фабрициевой сумки, пораже нием почек и отрицательным влиянием на рост и развитие птицы (Жбано ва С.Ю., 2005).
Существует широкий спектр поливалентных инактивированных вакцин отечественных и зарубежных производителей для профилактики инфекцион ных болезней птиц с различными комбинациями входящих в их состав анти генов, в том числе вируса ИББ. Поливалентные вакцины применяют на роди тельском поголовье для обеспечения пассивного иммунитета у потомства и не предназначены для иммунизации цыплят раннего возраста (Смоленский В.И., 1999;
Борисов В.А., 2007). Технология изготовления моновалентной инакти вированной вакцины «Авикрон» против ИББ основана на использовании го могената фабрициевых сумок цыплят, зараженных вирулентным штаммом со ответствующего вируса. Низкая технологичность производства вакцины (ис пользование вирулентного вируса, содержание и убой большого количества зараженных вирусом ИББ птиц), потенциальная опасность предприятий изготовителей как источников эпизоотии являются причинами ограничения сферы применения вакцины и значительно усложняют (технологически и эко номически) выпуск биопрепарата в промышленных масштабах (Гусев С.А., 2000).
Очевидно, что на современном этапе развития промышленное птицевод ство России нуждается в более совершенных вакцинах против ИББ.
Мировой опыт промышленного птицеводства показал, что для профилак тики ИББ нужны живые и инактивированные вакцины. Целесообразность ис пользования живой и инактивированной вакцин или их комбинации определя ется комплексом факторов, требующих специального изучения. Детального экспериментального изучения требует также оценка возможности комбиниро вания живой вакцины против ИББ с вакцинами против других распространен ных болезней птицы, в частности, против болезни Марека.
Таким образом создание, усовершенствование и оценка эффективности средств активной специфической профилактики ИББ является актуальной зада чей для развития отечественного птицеводства.
Цель работы – разработка и внедрение в ветеринарную практику новых эффективных средств активной специфической профилактики инфекционной бурсальной болезни птиц.
Задачи исследования 1. Выяснение иммунобиологических свойств отечественных изолятов вируса ИББ, отбор штаммов со стабильными антигенными и другими свойствами для использования их в качестве производственных.
2. Разработка технологии культивирования производственных штаммов виру са ИББ и режима инактивации вируса ИББ.
3. Подбор адъювантов для изготовления инактивированных вакцин против ИББ.
4. Разработка технологии приготовления вакцинных препаратов против ИББ и методов их контроля.
5. Проведение испытаний и оценка эффективности разработанных препаратов в экспериментальных и производственных условиях.
6. Освоение промышленного производства живой и инактивированной вакцин против ИББ и внедрение их в ветеринарную практику.
7. Оценка эффективности ассоциированной вакцинации птиц против ИББ и болезни Марека (БМ).
8. Разработка и проверка в производственных условиях схемы вакцинопрофи лактики ИББ, оценка эффективности средств и методов борьбы с ИББ в птице водческих хозяйствах России.
9. Подготовка и утверждение нормативно-технической документации на раз работанные биопрепараты.
Научная новизна. Изучены иммунобиологические свойства полевых изолятов и вакцинных штаммов вируса ИББ, отобраны штаммы, обладающие стабильными антигенными свойствами для использования их в качестве произ водственных.
Выбраны в качестве вакцинных производственные штаммы 52/70-М и КБК вируса ИББ, отработана технология их культивирования в развивающих ся эмбрионах СПФ-кур. Штамм КБК паспортизирован и депонирован под № 117-ДЕП 15.10.2001 г. во Всероссийской государственной коллекции штам мов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, в каче стве производственного. Разработаны производственные технологии изготов ления живой и инактивированной вакцин ИББ на основе отобранных штаммов, оформлены инструкции по их применению. Освоено промышленное производ ство живой и инактивированной вакцин против ИББ, которые успешно внедре ны в ветеринарную практику. Научная новизна исследований подтверждена па тентом Российской Федерации на изобретение № 2205021 «Вакцина против инфекционной бурсальной болезни птиц», 27.05.2003 г.
Теоретическая значимость проведенных исследований. Теоретически обоснована необходимость использования иммунобиологических и молекуляр но-генетических подходов для отбора вируса при получении вакцинного штам ма, что позволяет гарантировать выпуск качественных и безопасных вакцин.
Полученные новые данные о культуральных, иммунобиологических и генети ческих свойствах штаммов семейства бирнавирусов расширяют границы фун даментальных знаний о вирусах этой систематической группы и возможностях их использования в различных биотехнологических процессах.
Практическая значимость исследований. Разработаны технологии из готовления и инструкции по применению живой и эмульсионной инактивиро ванной вакцин против ИББ, обоснована эффективность их практического при менения. Внедрена в ветеринарную практику и широко используется в РФ для специфической профилактики ИББ комплексная схема эффективной вакцино профилактики ИББ.
Результаты научных исследований вошли в нижеперечисленные норма тивные документы (НД), одобренные ученым советом ФГУ «ВГНКИ», утвер жденные Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России и Россельхоз надзором МСХ РФ:
1. НД на «Вакцину против инфекционной бурсальной болезни из штамма КБК» (СТО 56204140-0001-2007), 01.02.2008 г.;
2. НД «Инструкция по применению вакцины против инфекционной бурсаль ной болезни из штамма КБК (вместо «Наставления по применению...»), 03.03.2008 г.;
3. НД на «Вакцину против инфекционной бурсальной болезни (ИББ) жидкую инактивированную» (ТУ 9384-001-56204140-03) от 05.02.2004 г., без ограниче ния срока действия;
4. «Инструкция по применению вакцины против инфекционной бурсальной болезни (ИББ) жидкой инактивированной» (вместо «Наставления по примене нию…»), 04.06.2009 г.
Основные положения, выносимые на защиту 1. Изоляты вируса ИББ, выделенные в птицеводческих хозяйствах РФ, анти генно идентичны прототипному штамму 52/70-М, а их молекулярно генетическое различие не превышает 2%.
2. Аттенуированный штамм КБК вируса ИББ, селекционированный методом длительных пассажей на эмбрионах СПФ-кур, обладает свойствами, позво ляющими использовать его для производства живой вакцины, а именно: авиру лентностью для молодняка птиц, иммунногенностью и генетической стабиль ностью.
3. По разработанной технологии промышленного производства живой вакци ны против ИББ из штамма КБК осуществлено изготовление и испытание пре парата. Вакцина из штамма КБК является безвредной и эффективной при раз ных способах ее введения птице.
4. Применение новой живой вакцины может быть также эффективным при со четанной вакцинации слабоиммунного молодняка птицы против ИББ и болезни Марека.
5. Инактивированная эмбриональная вакцина на основе вирулентного штамма 52/70-М вируса ИББ превосходит культуральную инактивированную вакцину на основе вакцинных штаммов по антигенности, протективности и технологич ности производства.
6. В ряде случаев показана целесообразность одновременного применения живой и инактивированной вакцин против ИББ. Программу вакцинопрофилак тики ИББ в промышленном птицеводстве целесообразно составлять конкретно для каждого хозяйства с учетом эпизоотической ситуации и особенностей тех нологии производства.
Внедрение в практику. Промышленное производство живой и инакти вированной вакцин против ИББ по технологии, разработанной автором, органи зовано на базе ООО «Биовет». Предприятием произведено и выпущено 126 млн доз живой и 12,6 млн доз инактивированной вакцин высокого качества. При не посредственном участии автора на ФГУП «Курская биофабрика» внедрена тех нология производства живой вакцины из штамма КБК против ИББ. Производ ство осуществляется в соответствии с НД на вакцину (СТО 56204140-0001 2007), 01.02.2008 г.
Разработанные вакцинные препараты используются с целью профилакти ки ИББ в птицеводческих предприятиях Российской Федерации.
По материалам диссертации подготовлено и издано учебное пособие для студентов факультета ветеринарной медицины, слушателей курсов повышения квалификации высших сельскохозяйственных учреждений образования (Про токол № 1 методического совета Санкт-Петербургской государственной акаде мии ветеринарной медицины от 19.09.06 г.).
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на международной научно-практической конференции по проблемам эпизоото логии и инфекционных заболеваний (Одесса, 2003);
на юбилейной научно практической конференции, посвященной 35-летию ГУ «Прикаспийский зо нальный научно-исследовательский ветеринарный институт» (Махачкала, 2003);
научной конференции профессорско-преподавательского состава, науч ных сотрудников и аспирантов СПбГАВМ (Санкт-Петербург, 2004, 2008, 2010);
на международной юбилейной научно-практической конференции «Новое в эпизоотологии, диагностике и профилактике инфекционных и незаразных бо лезней птиц в промышленном птицеводстве» (Санкт-Петербург–Ломоносов, 2004);
на международной научно-практической конференции «Актуальные во просы производства и применения биологических препаратов» (Алматы, 2004);
на I международном ветеринарном конгрессе по птицеводству (Москва, 2005);
на международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы диагностики болезней животных (Алматы, 2005);
на международном научно практическом конгрессе «Актуальные проблемы ветеринарной медицины» (Москва, 2006);
на VII международном ветеринарном конгрессе по птицеводст ву (Москва, 2011);
на заседаниях специальной комиссии по проблемам вирус ных болезней методического и Ученого Советов ФГУ «ВГНКИ» (Москва, 2001–2004), а также на межлабораторном совещании ФГУ «ВГНКИ» (Москва, 2011) и на заседании ученого совета ФГБУ НИИ гриппа (Санкт-Петербург, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 39 научных работ, в том числе 16 работ в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Личный вклад автора заключается в формулировании проблемы, поста новке целей и задач исследований, теоретическом и методологическом обосно вании путей решения поставленных задач, непосредственном планировании эксперимента и выполнении исследований, обобщении и интерпретации ре зультатов. Автор лично принимала участие в апробации и промышленном про изводстве разработанных препаратов, в подготовке публикаций.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 316 страницах машинописного текста и содержит традиционные разделы: введение, обзор ли тературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и их об суждение, выводы, практические рекомендации, список литературы и прило жения. Работа иллюстрирована 57 таблицами и 5 рисунками. Список литерату ры включает 383 источника, в том числе 272 зарубежных. В приложении пред ставлены копии документов, подтверждающих достоверность результатов ра боты, ее научную и практическую значимость.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования. Работа выполнена в 1994–2010 гг.
в лаборатории препаратов, применяемых в птицеводстве, Всероссийского госу дарственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) и на базе ООО «Биовет».
В связи с многоплановостью исследований в диссертации нашли отражение ре зультаты работ, проведенных совместно с сотрудниками ГНУ ВНИВИП, а так же с ветеринарными специалистами практических лабораторий и птицеводче ских предприятий.
Вирусные штаммы и препараты. В работе использовали эталонный штамм вируса ИББ – 52/70-М, вакцинные штаммы – Д-78, ST, Cu-1M, КБК и ВНИВИП, а также эпизоотические изоляты: Синявинский, Бендерский, Ду бовляны, Таллинский, Раздельнянский;
вакцины против ньюкаслской болезни и болезни Марека.
Культивирование вируса ИББ осуществляли в первичной культуре ФЭК и ПЭК и перевиваемых культурах клеток Vero и BGM-70;
в 10–11-дневных раз вивающихся эмбрионах СПФ-кур и зараженных цыплятах 35–40-суточного возраста.
Определение биологической активности вируса ИББ. Биологическую активность вируса ИББ определяли путем титрования на первичных и переви ваемых культурах клеток, 10–11-суточных эмбрионах СПФ-кур.
Оборудование. Электронный микроскоп JEM-100CXI;
световые микро скопы «ЛОМО»;
микроцентрифуга «Eppendorf» (Германия), модель 5414;
цен трифуга «Beckman», модель J2-21;
высокоскоростная центрифуга «Sorvall» (США), модель OTD65B;
центрифуга MLW K 70-D (Германия);
бытовые холо дильники ОКА 6М 206 (Россия) (ГОСТ 16317-87);
термостат электрический ЗЦ 1125 (Украина) (ТУ 42-1878-60);
спектрофотометр «Shimadzu UV-260» (Япо ния);
микроизмельчитель тканей РТ-2 (ТУ 64-1-1505-72);
коллоидная мельница «Probst Class G.m.b.h.» (Германия), модель JV-10;
гомогенизатор Universal laboratory AID type MPW-309 (Польша);
вискозиметр капиллярный ВПЖ- (ГОСТ 10028-62) (Россия).
Животные. Для изучения биологических, антигенных и иммуногенных свойств вакцин использовали цыплят СПФ-кур, а также естественно восприим чивую к вирусу ИББ птицу разных возрастных групп и пород из благополучных по ИББ и другим инфекционным заболеваниям хозяйств.
Серологические методы. Наличие специфических антител в сыворотках крови птицы определяли в реакциях нейтрализации (РН), диффузионной пре ципитации (РДП), торможения гемагглютинации (РТГА), также с использова нием коммерческих наборов ИФА. Сыворотки тестировали в рекомендованных рабочих разведениях в соответствии с наставлениями по применению имею щихся коммерческих наборов.
Очистка вируса. Очистку вируссодержащих суспензий от балластных белков проводили протаминсульфатом (0,1–1,0%), хлороформом (0,5–2,0%) и фреоном-113 (0,5–2,0%).
Инактивация вирусного антигена. Для отработки режимов инактивации вируса ИББ использовали формальдегид, димер этиленимина и -пропио лактон.
Приготовление инактивированной вакцины. В качестве адъюванта при изготовлении экспериментальных образцов и производственных серий вакцины использовали гидроокись алюминия (ГОА), аэросил марки А-300 и минераль ное масло Маркол-52. Для изготовления экспериментальных серий вакцины го товили водную фазу, состоящую из взвеси очищенного антигена в физрастворе (29%). При постоянном перемешивании в взвесь вируса добавляли гидрофиль ный эмульгатор – твин 80 (1%). Полученную смесь гомогенизировали в течение 30 мин. Затем готовили масляную среду путем смешивания минерального мас ла – Маркол 52 (67%) и липофильного эмульгатора – арлацел (3%) с после дующей гомогенизацией в течение 30 мин. При получении готовой вакцины к водной фазе при постоянном перемешивании вносили масляную среду в соот ношении 30:70. Смесь гомогенизировали в течение 1 ч, расфасовывали во фла коны и этикетировали.
Эффективность разработанных препаратов изучали в эксперимен тальных и производственных условиях путем сравнения основных эпизоотоло гических показателей (заболеваемость, смертность, сохранность цыплят и др.) в опытных и контрольных группах. Напряженность иммунитета оценивали по уровню специфических антител в сыворотках крови привитой птицы.
Статистическая обработка полученных результатов проводилась ме тодом математической статистики, предложенным Г.Ф. Лакиным [68], с помо щью программы OpenOffice Calc. Оценку статистической достоверности разли чий проводили с использованием теста t-распределения Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Сравнительное изучение иммунобиологических свойств изолятов и эталонного штамма вируса ИББ До 1978 г. было принято считать, что вирус ИББ не имеет серологических вариантов. В связи с появлением высоковирулентных штаммов вируса ИББ в Европе и России и данных литературы об их антигенной неоднородности (Бо рисов А.В., 1995;
Щербакова Л.О. с соавт., 2002), возникла необходимость в изучении антигенной специфичности вновь выделенных изолятов вируса в сравнении с ранее известным штаммом возбудителя ИББ, имеющимся в на шей коллекции.
Для выяснения данного вопроса использовали эталонный штамм вируса ИББ – 52/70-М и эпизоотические штаммы: № 1 – Синявинский;
№ 2 – Бендер ский;
№ 3 – Дубовляны;
№ 4 – Таллинский;
№ 5 – Раздельнянский.
Антигенное родство штаммов вируса ИББ оценивали серологически пу тем титрования штаммоспецифических сывороток в РДП с каждым исследуе мым антигеном и in vivo перекрестным заражением привитых цыплят разными штаммами вируса ИББ. Исследования показали, что эпизоотические и эталон ный штаммы вируса, использованные в работе, обладают одинаковой преципи тогенной активностью со всеми штаммоспецифическими сыворотками и обра зуют одинаковые линии преципитации. Перекрестно-реагирующая активность сывороточных антител в РДП была почти одинакова в отношении гомо- и гете рологичных антигенов, что свидетельствует о наличии общих вирусоспецифи ческих антигенных детерминант.
Оценка резистентности птиц к заражению разрешающей дозой вируса ИББ показала, что процент защищенных птиц по группам колеблется в преде лах 80–100%, независимо от происхождения штамма вируса, используемого для инфицирования, и согласуются с показателями серологических исследований, проведенных на 28-е сутки после введения антигенов. Уровень антител в РДП и ИФА составил 2,5–3,0 log2 и 3560–4250 соответственно.
При расшифровке в ПЦР структуры гена VР2 выделенных и известных штаммов вируса выявлено, что все они могут быть объединены в одну группу, поскольку отличия между ними не превышали 2%. Это позволило сделать пред положение о том, что эти штаммы имеют общее происхождение и обладают родством с известным штаммом вируса ИББ, а индивидуальные иммунобиоло гические характеристики связаны с разной по длительности пассажной истори ей и технологическими параметрами их культивирования.
Полученные данные дают основания считать, что в птицехозяйствах стран СНГ циркулируют эпизоотические штаммы вируса ИББ, относящиеся к одному генотипу. Гибель цыплят в контрольной группе при заражении эпизоотическими штаммами была выше, чем в группе птиц, зараженных эталонным штаммом 52/70-М, что свидетельствует о высокой степени патогенности вновь выявлен ных изолятов по сравнению с ранее выделенным.
2. Оценка иммунобиологических свойств разных штаммов вируса ИББ, отобранных в качестве вакцинных Предварительно штаммы вируса ИББ были накоплены в соответствую щей системе культивирования. После проведения необходимого контроля (сте рильность, биологическая активность) и последующей инактивации димером этиленимина эти штаммы были использованы для получения опытных серий препарата. Для этого к инактивированной суспензии каждого вируса добавляли в качестве адъюванта 3% ГОА до конечной концентрации 1,5%.
Опытные образцы вакцин вводили однократно внутримышечно в объеме 0,5 мл цыплятам 21-суточного возраста, серонегативным к вирусу ИББ. Об ан тигенной активности штаммов судили по уровню накопления специфических антител в РДП, ИФА через 28 сут. после их введения, а протективная актив ность оценивалась по результатам заражения привитых и интактных цыплят вирулентным штаммом 52/70-М (табл. 1).
Таблица Сравнительная оценка антигенной активности вакцинных штаммов вируса ИББ Титр антител после Доза вируса Субстрат для по- иммунизации Штамм в lg ЭИД50/мл % защиты лучения вируса или ТЦД50/мл РДП ИФА КБК Эмбрионы 6,5 1,6±0,24 2370±0,35 КБК Культура ФЭК 7,0 1,4±0,39 2120±0,22 КБК Культура BGM-70 7,5 1,3±0,13 1940±0,25 ВНИВИП Культура ФЭК 7,0 1,1±0,18 1770±0,33 ВНИВИП Культура BGM-70 7,5 1,0±0,14 1250±0,14 52/70-М Эмбрионы 6,5 3,8±0,53 5650±0,32 52/70-М Цыплята 6,0 4,0 ±0,54 6340±0,18 Введение инактивированной вакцины против ИББ, приготовленной из 10%-ной суспензии фабрициевых сумок инфицированных цыплят, имел самые высокие показатели антигенной и протективной активности при испытаниях в условиях острого опыта. Показатели иммунобиологических свойств вакцины на основе суспензии гомогената тушек, экстраэмбриональной жидкости и хо рион-аллантоисных оболочек эмбрионов СПФ-кур, инфицированных штаммом 52/70-М, также оказались на достаточном уровне (3,8±0,53 log2 в РДП и 5650±0,32 в ИФА при 100%-ной эффективности иммунизации), тогда как об разцы инактивированной вакцины из эмбрионального и культурального вирус ного сырья, полученного при заражении штаммами ВНИВИП и КБК, не обес печивали выработку достаточно активного иммунитета и, как следствие, защи ту цыплят от заражения патогенным вирусом.
3. Разработка технологии производства живой вакцины из штамма КБК против ИББ Известно, что при производстве живых вакцин используются строго атте нуированные штаммы вируса, а в технологии инактивированных – патогенные штаммы возбудителя. Руководствуясь данным положением дальнейшую работу по разработке живой вакцины проводили со штаммом КБК, инактивирован ной – с патогенным штаммом 52/70-М.
Вакцинный штамм КБК получен путем 50-ти последовательных пассажей на эмбрионах СПФ-кур эпизоотического штамма, выделенного от больных цы плят-бройлеров, с последующим получением крупнобляшечного клона вируса методом негативных колоний в культуре клеток BGM-70.
В результате исследований был выбран оптимальный режим крупномас штабного культивирования вакцинного штамма КБК вируса ИББ. Технология включает получение полуфабриката вирусной биомассы путем заражения ХАО эмбрионов СПФ-кур в дозе 4,5 lg ЭИД50/мл вируса и культивирование в течение 72–96 ч при температуре 37°С. С использованием указанного режима накопле ние вируса достигало титра 6,5 lg ЭИД50/мл.
Полученные в ходе дальнейших экспериментов данные свидетельствуют о том, что вакцинный штамм КБК свободен от контаминантов, биологически активен (титр вируса 6,5 lg ЭИД50/мл), безвреден для цыплят, обладает выра женными стабильными протективными свойствами и не вызывает иммуносу прессию у вакцинированной птицы, что отвечает требованиям Международно го эпизоотического бюро (МЭБ), предъявляемым к вакцинным штаммам для производства живых вакцин против ИББ. Иммуногенная эффективность штам ма КБК в лабораторных опытах составила 100%.
На основании результатов лабораторных исследований, специфическую профилактику ИББ вакциной из штамма КБК при невысоком уровне пассивных антител рекомендуется проводить однократной подкожной прививкой с суточ ного возраста. Молодняк птицы, полученный от привитых родителей, следует вакцинировать двукратно не ранее 10–14 сут. путем перорального, интраназаль ного или окулярного введения вакцины. Вторую вакцинацию рекомендуется проводить не ранее 10 сут. после первой. При подкожном применении вакцины формируется напряженный и длительный иммунитет (6 мес., срок наблюдения) со 100%-ной защитой птицы при заражении вирулентным вирусом ИББ.
После наработки вирусного сырья его использовали для составления жи вой вакцины. В качестве защитной среды при изготовлении живой вакцины против ИББ использовали среды разного состава, из которых наиболее эффек тивной оказалась среда СПЛФ, состоящая из лактозы, гидролизата белка и же латозы. Количество защитной среды для лиофилизации составляло 400 мл на 1000 мл вирусного сырья. Установлено, что инфекционный титр вируса ИББ, высушенного в среде с СПЛФ после 12-месячного хранения при –10°С снизил ся на 0,3 lg ЭИД50/мл, а при +4°С – на 0,8 lg ЭИД50/мл. Защитные свойства дру гих сред при указанных режимах температур хранения были несколько хуже.
В лабораторных условиях проведены исследования для выяснения влияния на эффективность вакцинации против ИББ в условиях сочетанной вакцинации суточных цыплят живыми вакцинами против ИББ и болезни Марека (БМ). Для этого были сформированы три группы суточных цыплят по 50 голов. Цыплят первой группы вакцинировали против ИББ и БМ подкожно. Цыплят второй группы вакцинировали только против ИББ. Третью группу не вакцинировали, она являлась контрольной. Уровень иммунитета к вирусу ИББ оценивали серо логически в РДП и ИФА, а также по результатам контрольного заражения.
Из данных табл. 2 видно, что невосприимчивость цыплят к заражению вирусом ИББ после одновременной вакцинации их против ИББ и БМ полно стью совпадает с резистентностью цыплят к вирусу ИББ у привитых моновак циной из штамма КБК. Устойчивость к контрольному заражению у цыплят 1-й и 2-й групп наступала через 14 сут. после вакцинации и сохранялась до 60 сут.
(срок наблюдения).
Таким образом, при одновременной вакцинации цыплят против БМ и ИББ реактогенность вакцин не изменялась, а сроки развития иммунитета со ответствовали таковым при раздельной иммунизации данными вакцинами.
Способ одновременной вакцинации против БМ и ИББ включен в инструкцию по применению вакцины из штамма КБК, строго вписывается в существующую в промышленном птицеводстве схему иммунизации против болезни Марека и не требует дополнительных материальных затрат.
Таблица Иммуногенная активность штамма КБК при ассоциированной вакцинации цыплят против ИББ и БМ I группа II группа III группа Сроки вакцинированные вакцинированные контроль исследо- против ИББ и БМ против ИББ вания % защиты % защиты % защиты (сут.) РДП ИФА при био- РДП ИФА при био- РДП ИФА при био пробе пробе пробе 7 1,3 820 50 1,4 850 45 0 200 14 2,5 1080 90 2,6 1200 90 0 250 21 3,8 1350 100 3,4 1290 100 0 200 28 4,2 2110 100 3,8 2160 100 0 300 60 3,8 2400 100 3,5 2500 100 0 150 Для контроля живой вакцины против ИББ из штамма КБК были исполь зованы традиционные параметры, применяющиеся при контроле живых вирус ных вакцин: внешний вид, отсутствие контаминации вирусной, бактериальной и грибковой микрофлорой, массовая доля влаги (остаточная влажность), рас творимость, безвредность, антигенная активность, биологическая активность.
Результаты контроля безвредности живой вакцины из штамма КБК пока зали, что введение вакцинного препарата СПФ-цыплятам 14-дневного возраста в дозе 3,5 lg ЭИД50/мл не вызывает развития каких-либо клинических симпто мов и патологоанатомических изменений, свойственных вирусу ИББ.
Контроль промышленных серий живой вакцины из штамма КБК на анти генную и протективную активность проводили на СПФ-цыплятах 14-суточного возраста. В сыворотках крови цыплят специфические антитела после 21 сут.
с момента вакцинации обнаруживались в 100% случаях в РДП, а их титр в ИФА составлял не менее 2737±0,44. Протективная активность вакцины оценивалась через 21 сут. после иммунизации цыплят путем заражения патогенным штам мом 52/70-М вируса ИББ в дозе 3,0 lg ИД50/мл. Все цыплята, иммунизирован ные живой вакциной в дозе 2,0 lg ЭИД50/мл, на контрольное заражение не реа гировали и имели 100%-ную защиту. В контрольной невакцинированной груп пе птица болела с типичной клинической картиной ИББ. Однако, учитывая, что для вакцинации цыплят с пассивным иммунитетом требуется некий «запас» ви руса, в качестве иммунизирующей была выбрана доза 2,5 lg ЭИД50/мл.
После успешного испытания образцов вакцины в лабораторных условиях дальнейшее изучение эффективности препарата проводили в условиях неблаго получных по ИББ птицехозяйств ряда регионов Российской Федерации (Воро нежской, Новосибирской, Омской, Ростовской, Вологодской, Оренбургской, Псковской областей, Ставропольского и Красноярского краев).
С этой целью в течение ряда лет под нашим наблюдением находилось не сколько крупных, неблагополучных по ИББ птицехозяйств, где применяли вак цину из штамма КБК. Применение живой вакцины на неблагополучной по ИББ Забродненской птицефабрике в Воронежской области показало, что вакцинация цыплят способствует не только увеличению сохранности птицы в привитой вакциной из штамма КБК группе, но и позволяет получать более высокие при весы живой массы, снижает количество «гипотрофиков» и случаев колибакте риоза.
Позитивные результаты по применению живой вакцины против ИББ так же получены на неблагополучных по ИББ в период испытаний птицефабриках «Шекснинская» и «Череповецкая» Вологодской области. Вакцинацию птиц проводили подкожно в суточном возрасте.
На птицефабрике «Череповецкая» привили 150 350 цыплят-бройлеров.
Оценку протективных свойств проводили по показателям общей сохранности (табл. 3).
Иммунизация цыплят вакциной из штамма КБК позволила увеличить их сохранность до 93,3–97,92%. Ранее на птицефабрике использовали вакцину из штамма БГ, сохранность птицы при этом по отдельным партиям колебалась в пределах 71–88%. Полученные результаты свидетельствуют о высокой эф фективности вакцины из штамма КБК и ее преимуществе перед аналогичным препаратом из штамма БГ.
Таблица Результаты влияния вакцины из штамма КБК на сохранность птицы Гибель цыплят № корп. Кол-во цыплят Сохранность (%) голов % 54 19 300 543 2,8 97, 22 18 250 967 5,3 94, 43 19 200 1045 5,4 94, 41 19 000 869 4,6 95, 35 18 200 978 5,4 94, 21 18 500 1115 6,03 94, 13 19 100 1165 6,1 93, 12 18 800 1257 6,69 93, На птицефабрике «Шекснинская» однократно методом подкожной имму низации были привиты 8 млн цыплят. Осложнений и появления клинических признаков после применения вакцины не наблюдали. При исследовании в ИФА сывороток крови птиц, отобранных через 25 суток после иммунизации, были выявлены антитела в титрах 1225–2750, что подтверждало выраженную анти генную активность препарата. Сохранность привитого птицепоголовья состав ляла 93–95%, что свидетельствует о высокой иммуногенности вакцины.
Высокая антигенная активность препарата была также подтверждена его применением на птицефабрике «Первомайская» Псковской области, где одно кратно иммунизировали 293 181 цыплят-бройлеров в сравнении с вакциной Винтерфильд, которую, согласно инструкции, применяли двукратно методом выпаивания (табл. 4). Протективные свойства препарата оценивали по сохран ности поголовья и другим производственным показателям.
Полученные результаты свидетельствуют, что по всем производственным показателям вакцина из штамма КБК существенно превосходит (p 0,05) вак цины из штамма Винтерфильд за счет увеличения сохранности на 10,5%, сред несуточного привеса на 10,5 г, сокращения сроков откорма на 3 сут. и снижения затрат корма на единицу привесов на 0,35 кг.
Таблица Результаты сравнительных испытаний вакцин из штаммов КБК и Винтерфильд Единица Показатели Штамм КБК Штамм Винтерфильд измерения Принято на выращивание головы 81 495 78 Сохранность % 94,5 Срок выращивания сутки 45 Живая масса бройлеров граммы 1742 Среднесуточный прирост граммы 39,5 кормовые Конверсия корма 2,05 2, единицы На ППЗ «Котляревский» вакциной из штамма КБК прививали 434 тыс.
цыплят по двум схемам. В одной группе цыплят в количестве 120 тыс. вакцину вводили с питьевой водой двукратно в возрасте 8 и 18 сут., в другой – внутри мышечно в суточном возрасте. Третья группа птиц в количестве 114 тыс. одно временно вакцинировалась против двух болезней – ИББ и БМ – в суточном воз расте.
Опыты показали, что, независимо от способа применения вакцины из штамма КБК, признаков, характерных для инфекционной бурсальной болезни, выявлено не было. При двукратной вакцинации методом выпаивания положи тельная реакция в РДП по разным партиям птицы составила от 80 до 92% в воз расте 35 дней. При однократном внутримышечном применении вакцины цып лята в суточном возрасте имели положительные результаты в РДП в 100% слу чаев уже в возрасте 25 дней, как и при одновременной вакцинации против ИББ и БМ.
Титры антител в ИФА также были одинаковы как при моновакцинации против ИББ, так и при одновременном методе иммунизации (среднегеометри ческий титр в ИФА – 2627, процент корреляции – 30–35).
То обстоятельство, что метод применения вакцины не оказал негативного влияния на уровень напряженности иммунитета против ньюкаслской болезни, является существенным показателем, подтверждающим отсутствие иммуносу прессивного влияния на привитое поголовье. Титр антител в РЗГА к вирусу ньюкаслской болезни после однократной вакцинации через 15 дней составлял от 1:64 до 1:512.
Процент сохранности птицы подопытных групп за период наблюдения составил на ремонтном молодняке 97,1%, у цыплят-бройлеров – 96,4%, средне суточный прирост массы тела составил 38,4–39,2 г.
На птицефабрике «Дон» Ростовской области после однократной иммуни зации вакциной из штамма КБК 280,3 тыс. голов цыплят, размещенных в 4 кор пусах, сохранность достигала 96–97%. До начала профилактики ИББ вакциной из штамма КБК показатели сохранности колебались в пределах 86–92%. Мно голетняя плановая иммунизация новым препаратом позволила не только сохра нить благоприятную эпизоотическую ситуацию в хозяйстве, но и повысить по казатели рентабельности за счет однократного применения препарата и более низкой его стоимости.
В ОПХ «Сибирский НИИ птицеводства» Омской области вакциной из штамма КБК было привито 5,5 млн голов цыплят. Все партии цыплят, посту павшие на выращивание, прививали орально методом выпаивания по схеме:
первая вакцинация в 7–10-суточном возрасте, вторая – через 10 суток. Система тическое применение вакцины позволило не только предупредить возникнове ние острых вспышек ИББ в хозяйстве, но и улучшить производственные пока затели. Так, за период вакцинации против ИББ сохранность птиц увеличилась на 11,7%. Среднесуточный привес молодняка увеличился на 5,6 г. Затраты кор ма на 1 ц прироста массы тела снизились на 0,5 кг.
На птицефабрике «Сибирская Губерния» Красноярского края вакциной из штамма КБК привито около 15 млн голов цыплят-бройлеров. После применения вакцины гибель цыплят сократилась с 7–8% до 1,0–1,5%;
сохранность повыси лась с 89,4 до 93,6%. Полученные результаты подтверждают представленные ра нее экспериментальные данные о высоких протективных свойствах препарата.
В течение ряда лет вакцину из штамма КБК регулярно применяли на пти цефабрике «Балахоновская» Ставропольского края взамен используемого ранее препарата из штамма БГ. При периодическом серологическом обследовании привитых партий птиц антитела в РДП выявляли в 100% случаях, сохранность поголовья при этом колебалась в пределах 94–95%.
Таким образом, результаты широких производственных испытаний, про веденных в различных регионах РФ показали, что вакцина из штамма КБК без вредна для цыплят суточного возраста при разных способах введения, она не вызывает клинически выраженных признаков и патологоанатомических изме нений у подопытной птицы. Вакцина обладает выраженной антигенной актив ностью и индуцирует в организме иммунизированной птицы образование спе цифических антител. Изучение сроков формирования иммунитета вакциниро ванной птицы показало, что напряженный иммунный ответ отмечается на 21– 25 сут. после вакцинации и стабильно сохраняется на высоком уровне на весь восприимчивый период роста цыплят (до 120 сут.). Вакцина обладает выражен ными протективными свойствами, создает более высокий уровень иммунитета по сравнению с другими препаратами и предохраняет привитую птицу в небла гополучных по ИББ хозяйствах, что характеризуется отсутствием у привитой птицы признаков заболевания.
4. Разработка технологии производства инактивированной вакцины против ИББ Необходимость разработки эмульсионной инактивированной вакцины против ИББ связанна с появлением в птицепредриятиях РФ высоковирулент ных штаммов и недостаточной безопасностью живых вакцинных препаратов для молодняка птицы.
Данная работа включала разработку технологии получения вирусного сырья, режимов его очистки и инактивации, эмульгирование инактивированно го антигена и адъюванта, испытание изготовленных образцов вакцины в экспе риментальных и производственных условиях, разработку методов контроля препарата и нормативной документации.
Вирулентный штамм 52/70-М вируса ИББ был проверен на инфекцион ную активность, стерильность, контаминацию посторонними микроорганизма ми, антигенность и иммуногенность. Результаты проверки на стерильность и контаминацию показали отсутствие в посевном материале штамма 52/70-М посторонней микрофлоры, грибов и вирусов.
Важным этапом в исследовании биологических особенностей штамма 52/70-М является определение стабильности его инфекционной активности, а также антигенных и иммуногенных свойств штамма в составе инактивиро ванной вакцины. Для этого было проведено 20 последовательных пассажей 52/70-М вируса ИББ на эмбрионах СПФ-кур с определением показателей виру лентности и титра биологической активности.
Результаты проведенных исследований показали, что биологическая ак тивность штамма 52/70-М вируса ИББ при пассировании на эмбрионах СПФ кур изменяется незначительно, что указывает на его стабильность при длитель ном культивировании в данной биологической системе. Степень вирулентности штамма 52/70-М вируса ИББ также оказалась стабильной. Так, при заражении цыплят материалом вируса на уровне 5-, 10-, 15- и 20-го пассажей болезнь у цыплят проявляется однотипно и характеризуется, как правило, острым тече нием: отказом от корма, угнетением и диареей. Во всех случаях отмечали падеж не менее 40% птиц.
Высокая концентрация балластных белков в вирусной суспензии, накоп ленной в эмбрионах кур, зараженных вирусом ИББ, требует проведения предва рительной очистки вирусного материала. Известно, что балластные белки пре пятствуют осуществлению процесса инактивации, способствуют развитию вос палительных реакций в месте инъекции препарата, а также являются дополни тельной нагрузкой на иммунную систему птиц и снижают стабильность эмуль сии. Для удаления балластных примесей из вирусного материала были испытаны комбинированные варианты очистки детергентами и центрифугированием.
Результаты проверки иммунобиологических свойств суспензий вируса ИББ, очищенных разными способами, показали, что наиболее успешным явля ется использование фреона-113 в конечной концентрации 1% с последующим низкоскоростным центрифугированием.
В табл. 5 приведены характеристики биологических и физических показа телей очищенных суспензий вируса ИББ, определенных с помощью РДП, ИФА и спектрофотометрии, которые подчеркивают зависимость влияния концентра ции химических реактивов на степень удаления примесей и иммунобиологиче ские показатели вируса.
Для отработки режимов инактивации вируса ИББ были испытаны тради ционные инактиванты, использующиеся в ветеринарной биотехнологии: фор мальдегид, димер этиленимина и -пропиолактон. В результате проведенных экспериментов было установлено, что эффективным и надежным способом инактивации вируса ИББ является 0,2%-й раствор димера этиленимина при +37°С в течение 24 ч инкубации. С целью безопасности и большей уверенности в надежности инактивации, особенно при работе с производственными объе мами вируса, экспозиция воздействия инактиванта была увеличена до 30 ч.
Данный режим инактивации позволял необратимо подавить инфекционную ак тивность вируса в производственных объемах при максимальном сохранении антигенных и протективных свойств вакцинного штамма.
Таблица Эффективность очистки эмбрионального вируса ИББ от балластных белков Характеристика вирусного Титр антител материала Концентрация Способ очистки концентра реагента, % ция белков, прозрачность, % РДП, log2 ИФА мг/мл 0,1 3,75±0,12 39,4±2,16 2,5±0,55 4630±0, Протаминсульфат 0,5 3,50±0,23 54,2±3,25 2,6±0,84 4540±0, 1,0 2,80±0,15 79,1±2,64 1,2±0,52 2150±0, 0,5 3,46±0,16 48,5±2,47 2,3±0,24 4230±0, Хлороформ 1,0 2,95±0,25 44,2+2,24 1,5±0,56 2450±0, 2,0 2,5±0,15 82,2±2,53 1,0+0,17 1860±0, 0,5 3,28±0,26 30,8±3,28 2,9±0,69 5310±0, Фреон-113 1,0 2,98+0,18 50,8±3,25 2,8±0,54 5240±0, 2,0 2,97±0,15 56,2±1,29 2,5±0,45 4280±0, Контроль – 4,25±0,23 20,4±0,24 2,8±0,46 5340±0, без очистки Примечание: контрольный образец – эмбриональный вирус ИББ, очищенный низкоскоро стным центрифугированием.
В процессе конструирования инактивированной вакцины против ИББ бы ли испытаны рекомендованные для практики адъюванты: ГОА, аэросил марки А-300 и минеральное масло Маркол-52.
Антигенную активность опытных серий вакцин с разными адъювантами оценивали на цыплятах 21-суточного возраста, которым препараты вводили внутримышечно в объеме 0,5 мл. Спустя 4 недели сыворотку крови исследова ли в РДП и ИФА (табл. 6).
Таблица Антигенная активность инактивированного вируса ИББ с различными адъювантами Титр антител Инактивированный антиген вируса ИББ Количество голов РДП (log2) ИФА С гидроокисью алюминия 10 3,9±0,34 5896±0, С аэросилом 10 4,4±0,46 6526±0, С минеральным маслом 10 5,2±0,25 9214±0, Без адъюванта 10 2,2±0,37 4124±0, Контроль (непривитый) 10 0 Как следует из результатов опыта наиболее высокой антигенной активно стью обладает препарат с масляным адъювантом. Установлен максимальный уровень антител на его введение (5,2±0,25 log2 в РДП и 9214±0,63 в ИФА).
Адъювантная способность гидроокиси алюминия и аэросила существенно не различалась. Наименее выраженный иммунный ответ отмечали у цыплят, кото рым вводили инактивированный антиген без адъюванта. В дальнейшей работе при изготовлении инактивированной вакцины против ИББ использовали мас ляный адъювант.
Для определения в инактивированной вакцине против ИББ оптимального компонентного состава – соотношения дисперсной фазы (инактивированный вирус) и дисперсной среды (Маркол-52) – были изготовлены опытные образцы препарата с различным весовым содержанием водной и масляной фаз (20/80, 30/70 и 40/60).
Установлено, что наиболее стабильную эмульсию (более 12 мес. при тем пературе +2…+8°С) и выраженные иммуногенные свойства имел биопрепарат, приготовленный из 70 частей масляного адъюванта Маркол-52 и 30 частей вод ной фазы инактивированного вируса ИББ.
Эксперименты по изучению продолжительности и напряженности имму нитета у птиц, привитых инактивированной вакциной против ИББ, полученной на базе Маркола-52, показали, что оба введенных объема вакцинного препарата (0,3 и 0,5 мл) вызывали выработку напряженного иммунитета у птиц продол жительностью 12 мес. как при подкожной, так и при внутримышечной инъек ции (срок наблюдения).
Опытно-промышленные образцы инактивированной эмульгированной вакцины против ИББ имели стабильную эмульсию и обладали выраженной ан тигенной активностью в процессе хранения продолжительностью 12 мес. (га рантийный срок реализации вакцины) при температуре +2…+8°С.
При изучении иммунобиологических свойств инактивированной эмуль гированной вакцины против ИББ в условиях промышленных птицеводческих предприятий было показано, что вакцина не вызывала у привитых птиц по ствакцинальных осложнений местного или общего характера, что свидетельст вует о ее безвредности.
В производственных опытах, проведенных на птицефабрике «Синявин ская» Ленинградской области установлено, что однократное подкожное введе ние инактивированной вакцины в возрасте 10 сут. в дозе 0,3 мл обеспечивает успешную профилактику инфекции. Сохранность молодняка птицы, вакцини рованного убитой вакциной, составила 97,1%. При контроле напряженности иммунитета через 3 недели после прививки установили наличие группового иммунитета в 99% случаях, среднегеометрический титр антител в ИФА соста вил 1504, а в РДП – 3,5 log2, высокий бурсальный индекс цыплят сохранялся на протяжении всего срока выращивания и в возрасте 120 дней составил более 4,0, что свидетельствует о сохранности фабрициевой сумки и высокой иммуноло гической реактивности организма вакцинированной птицы.
Сравнительные испытания живой вакцины из штамма БГ и инактивиро ванной вакцины провели в условиях птицефабрики «Гайская» Оренбургской области на общем поголовье 130 340 голов с целью разработки эффективной схемы профилактики болезни в дальнейшем. Для этого первую группу цыплят прививали инактивированной вакциной в 10 сут. согласно наставлению, вто рую – в 16 сут.;
третью и четвертую группы цыплят одновременно иммунизи ровали инактивированной вакциной и вакциной из штамма КБК в 10 и 16 сут.
соответственно;
цыплят пятой группы прививали вакциной из штамма БГ в и 17 сут.
Об эффективности вакцин и схем их применения судили по благополу чию хозяйства по ИББ, общей сохранности, продуктивности, деловому выходу ремонтного молодняка и по результатам исследований сыворотки крови на на личие специфических антител в РДП у 30-, 40-, 50- и 60-ти дневных цыплят.
Одновременно изучали уровень поствакцинального иммунитета против нью каслской болезни, а также определяли бурсальный индекс в разные сроки вы ращивания птицы.
Производственные показатели выращивания цыплят при сравнительных испытаниях вакцин представлены в табл. 7.
Таблица Производственные показатели цыплят, привитых разными вакцинами против ИББ на птицефабрике «Гайская» Номера групп I II III IV V Показатели Количество голов 26 380 25 300 26 800 26 110 25 Сохранность, % 97,2 99,2 98,5 99,4 91, Среднесут. прирост массы, г 11,3 11,1 11,4 11,97 10, Масса 1 гол. при переводе 1320 1260 1300 1350 в 112 дней, г % деловой молодки 94,6 94,5 97,3 97,4 85, Однородность, % 86,4 87,1 87,5 88,3 78, % яйцекладки в 150 сут. 76,8 81,8 82,1 82,9 68, Выбраковка, % 1,24 0,8 0,7 0,49 3, Вакцинопрофилактика ИББ по указанным схемам вакцинации против ИББ обеспечивают полную защиту цыплят от полевого вируса. Введение инак тивированной вакцины не вызывает побочных реакций местного и общего ха рактера. Цыплята, привитые инактивированной вакциной в разные сроки от дельно и в ассоциации с живой вакциной, имеют наиболее высокие показатели сохранности (до 99,4%). Среднесуточный прирост их массы соответствует нор мативным требованиям. При этом достигаются положительные результаты: вы сокий процент выхода деловой молодки (97,4%), низкий процент выбраковки (0,49%) и высокая однородность стада (88,3%).
Динамика серологических показателей реакции на введение вакцин сви детельствует о том, что наиболее активный групповой иммунитет установлен в 4-й группе, где цыплят в 16 сут. иммунизировали одновременно живой и инактивированной вакцинами. Среднеарифметический титр сывороток в РДП составил 3,8 log2. Высокие показатели бурсального индекса (более 5,2) отмече ны в I–IV группах, в то время как в V группе низкие показатели бурсального индекса наблюдали, начиная с 30-суточного возраста.
Таким образом, результаты проведенного опыта свидетельствуют, что эффективность профилактики болезни ИББ тесно связана с типом вакцины, со блюдением правил ее применения, наличием материнских антител, которые от рицательно влияют на выработку поствакцинального иммунитета как при вве дении живой, так и инактивированной вакцины.
Применение вакцины из штамма БГ позволяет купировать инфекцию, но вызывает поражения бурсы и почек, что приводит к снижению общей сохран ности и продуктивности птицы.
Высокая сохранность и продуктивность птицы в условиях данного хозяй ства были достигнуты при совместном применении инактивированной и живой вакцин против ИББ в 16–18 сут.
Позитивный эффект от применения эмульсионной инактивированной вакцины против ИББ из штамма 52/70-М был также получен при ее испытании во время острой вспышки ИББ на птицефабрике «Лебедевская» Новосибирской области, где впервые инфекция была установлена 29 марта 1997 года среди цы плят 52-дневного возраста. Продолжительность заболевания равнялась 10 сут.
Суточный отход птицы составил до 883 из 19 500 голов, т.е. 4,5%. Всего в этой группе пало 4672 головы (26,8%).
В дальнейшем заболевание проявлялось как среди цыплят более раннего возраста (27-дневного), так и среди молодняка в возрасте 92 дней. Продолжи тельность заболевания составляла 7–10 сут. Заболеваемость и смертность на растали быстро, достигая максимума на 3–4 день, в течение последующих 5– 7 суток шел спад заболеваемости и гибель птиц прекращалась. В отдельных партиях количество заболевших цыплят достигло 100%, а смертность – 44,2%.
За время эпизоотии на птицефабрике «Лебедевская» отход птицы от ИББ соста вил 77 583 головы, что соответствует 15,6% от общего поголовья (498 480).
В период с мая 1997 г. по настоящее время на птицефабрике для вакцина ции цыплят используется инактивированная вакцина из штамма 52/70-М. Пер вые партии цыплят иммунизировали данной вакциной в возрасте 10 дней. При этом процент падежа от ИББ был ниже, чем среди цыплят, иммунизированных вакцинами из штаммов Д-78, БЮР-706. После применения вакцины в более поздние сроки, в возрасте 15–18 дней, клинических признаков ИББ и отхода цыплят не отмечалось.
Совместно со специалистами птицефабрики проведено сравнительное изучение эффективности профилактики болезни с помощью вакцин из разных штаммов вируса ИББ. Результаты этих испытаний приведены в табл. 8.
Таблица Экономические показатели по группам цыплят, вакцинированных против ИББ Вакцинный штамм Контрольная Показатели группа БГ Д-78 БЮР-706 52/70-М % сохранности 92,7 54,4 59,5 96,8 55, Среднесуточный привес 12,0 11,1 10,4 12,9 10, Вес одной головы при 1320 1165 1139 1377 переводе в 110 дней, г % делового молодняка 89,3 48,7 66,5 96,8 61, % однородности 76 68 65 86,5 50% яйцекладки, дн. 163 176 172 157 % выбраковки 3,4 4,7 2,6 2,2 4, Экономическая эффективность +8084 –13 790 –7630 +11 966 – на 1000 голов, руб.
Работу проводили в условиях неблагополучия птицехозяйства по ИББ. Как видно из данных табл. 8, наиболее высокий уровень сохранности птицы (96,8 %) был в группе, привитой инактивированной вакциной из штамма 52/70-М. Уро вень сохранности у цыплят, вакцинированной живыми вакцинами из штаммов Д-78 и БЮР-706 был значительно ниже (55,4 и 59,5% соответственно) и как в контрольной группе (55,0%).
Птицефабрика «Витязовская» Краснодарского края в течение ряда лет была неблагополучна по ИББ и стабильных результатов по профилактике ин фекции с помощью живых вакцин получать не удавалось.
В производственных опытах для специфической профилактики ИББ ис пытаны вирусвакцина из штамма Винтерфилд 2512 и инактивированная вакци на из штамма 52/70-М.
Результаты сравнительных испытаний представлены в табл. 9.
Всего за период испытания инактивированной вакциной привито 1 млн 78 тыс. голов птицы. Поствакцинальных осложнений и случаев болезни ИББ среди вакцинированной птицы не выявлено. Эффективность препарата контро лировали серологически (ИФА и РДП) и по бурсальному индексу в разные сро ки после применения вакцины. Процент положительно реагирующих проб сы вороток составляет 90–100%. Бурсальный индекс в 30-дневном возрасте – 4,1, в 40-дневном – 5,2 и в 50-дневном – 7,2.
Таблица Результаты сравнительных испытаний вакцин против ИББ на птицефабрике «Витязовская» Вакцинный штамм Показатели Винтерфилд 2512 52/70-М Всего поголовье, гол. 1 507 860 1 078 Сохранность, % 97,82 98, Среднесуточный прирост, г 10,7 11, Деловой выход молодняка, % 80 На основании результатов производственных показателей и лаборатор ных исследований сывороток крови птицы, проведенных специалистами пти цефабрики, можно сделать вывод о том, что инактивированная вакцина из штамма 52/70-М обладает выраженной протективной активностью, безвредна для молодняка и эффективна в очаге инфекции для купирования острых вспы шек заболевания.
Производственные испытания на птицефабрике «Витязовская» показали отсутствие у привитой птицы поствакцинальных осложнений местного и обще го характера, что свидетельствует о безвредности вакцины. При анализе основ ных производственных показателей (сохранность, продуктивность, конверсия корма) птицы родительских стад, иммунизированной инактивированной вакци ной против ИББ, существенных отличий от нормативных показателей выявлено не было. Вакцина из штамма 52/70-М пригодна для профилактики ИББ среди цыплят яичных кроссов при однократном ее применении с 10–12-дневного воз раста в зависимости от уровня материнского иммунитета.
Эффективность профилактики ИББ среди цыплят-бройлеров с помощью инактивированной вакцины из штамма 52/70-М оценивали на птицефабрике «Баксанская» Кабардино-Балкарской Республики в сравнении с широко ис пользуемыми для тех же целей в птицеводстве мясного направления живыми вакцинами.
Развернутые производственные показатели эффективности выращивания цыплят-бройлеров, иммунизированных двумя живыми (из штамма БГ и Вин терфилд 2512) и инактивированной вакцинами против ИББ представлены в табл. 10.
В группе птицы, привитой инактивированной вакциной, сохранность бы ла выше на 4,4 и 3,5% по сравнению с птицей из групп, где применялись живые вакцины из штаммов БГ и Винтерфилд 2512. Соответственно, затраты корма уменьшились на 6,2%, индекс продуктивности был выше в 1,5 раза. Чем выше индекс продуктивности, тем лучше технические показатели стада. Это европей ский коэффициент, используемый для сравнения показателей стад.
Таблица Производственные показатели эффективности выращивания бройлеров, иммунизированных живыми и инактивированной вакцинами против ИББ на птицефабрике «Баксанская» Группы цыплят, иммунизированных против ИББ живая вакцина инактивированная Показатели эффективности вакцина штамм штамм БГ (штамм 52/70-М) Винтерфилд Сохранность, % 91,5 92,4 95, Живая масса 1 гол., г 1860 1985 Среднесуточный прирост, г 43,3 49,4 52, Конверсия корма, кг 2,3 1,91 1, Индекс продуктивности 208,5 249,1 279, Выход тушек 1-й категории, % 78,2 81,8 87, В последствии в производственных испытаниях на данной птицефабрике использовали комбинированный способ применения живой и инактивирован ной вакцин. Схема и результаты опыта приведены в табл. 11. Эффективность вакцин и схему их применения оценивали по благополучию хозяйства по ин фекции, общей сохранности, продуктивности, деловому выходу ремонтного молодняка и по результатам исследований сыворотки крови птицы на наличие специфических антител в РДП и ИФА у 35-дневных цыплят. Одновременно изучали уровень поствакцинального иммунитета против ньюкаслской болезни, а также определяли бурсальный индекс в разные сроки выращивания птицы.
Данные, полученные в производственных условиях, подтверждают ре зультаты лабораторных исследований и свидетельствуют об эффективности комбинированной прививки живой и инактивированной вакцинами против ИББ при специфической профилактике болезни. Согласно результатам серологичес ких исследований, наиболее высокие титры в РДП и ИФА выявлены в группе цыплят, которых в суточном возрасте одновременно прививали живой и инак тивированной вакцинами подкожно в разные точки и ревакцинировали в 18 суточном возрасте живой вакциной методом выпаивания. Бурсальный индекс Таблица Результаты производственных испытаний вакцин против ИББ на птицефабрике «Баксанская» Результаты опыта Сроки Способ Кол-во Вакцина вакцинации ИФА РДП (log2) вакцинации птиц, гол. РЗГА % гибели (сут.) БИ от ИББ (log2) сут. 35 сут. Живая Выпойка 7 и 14 21500 2,3 1,2 2730 4340 4,2 2,3 2, Инактивированная Подкожно 1 28340 – 2,6 – 4130 5,6 3,6 Инактивированная + живая Подкожно 1 25400 – 3,1 – 5430 5,2 3,2 Инактивированная + живая Подкожно 1 и 18 29750 – 3,5 5780 4,0 2,8 и ревакцинация живой и выпойка Примечание. РЗГА – средний геометрический титр антигемагглютининов к вирусу ньюкаслской болезни.
и титр антигемагглютининов в этой группе цыплят были максимальными, что указывает на высокую иммунологическую реактивность данной группы птицы.
Наблюдения показали, что испытываемая вакцина из штамма 52/70-М не вызы вает у птицы осложнений местного и общего характера.
Таким образом, в результате экспериментальных опытов и производст венных испытаний выбрана оптимальная схема специфической профилактики ИББ, которая предусматривает одновременное подкожное введение в суточном возрасте инактивированной и живой вакцин в разные точки с последующей ре вакцинацией живой вакциной через 10–12 суток. Показана совместимость раз работанных биопрепаратов при их комбинированном введении, в том числе от сутствие инактивации живой вакцины. Полученные нами данные соответству ют результатам исследований Ciambrone J.J., Clay R.P. (1986).
Проведенные эксперименты показали, что успех вакцинопрофилактики цыплят зависит от правильно выбранного срока первой вакцинации, исполь зуемого штамма и метода его введения.
На основании проведенных с положительным эффектом лабораторных и производственных испытаний и применения вакцины в условиях хозяйств была разработана нормативно-техническая документация (НТД) на вакцину эмульсионную инактивированную против ИББ из штамма 52/70-М. В НТД во шли постоянно действующие технические условия на вакцину, инструкция по применению и регламент по изготовлению и контролю препарата.
ВЫВОДЫ 1. Сравнительный анализ иммунобиологических и молекулярно-генетических свойств вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса ИББ, циркулирующих в птицехозяйствах, показал их высокую антигенную гомологию.
2. Штамм КБК вируса ИББ, полученный методом селекции и аттенуации пас сажами на эмбрионах СПФ-кур, обладает базовыми свойствами вакцинного штамма для производства живой вакцины: антигенной гомологичностью с по левыми изолятами вируса, высокой иммуногенностью, генетической стабиль ностью, апатогенностью при различных способах введения, отсутствием имму носупрессивного эффекта.
3. Технология промышленного производства живой вакцины против ИББ на основе штамма КБК вируса ИББ включает: культивирование вируса в эмбрио нах СПФ-кур, стабилизацию вируссодержащего материала в защитной среде с последующей лиофилизацией и хранением вакцины при температуре +4…+6°С в течение 12 месяцев.
4. Живая вакцина на основе авторского штамма КБК вируса ИББ безвредна и эффективна при различных способах вакцинации: подкожном, пероральном, интраназальном и интраокулярном. Выбор способа введения вакцины опреде ляется наличием и уровнем материнских антител, а также эпизоотической си туацией в хозяйстве.
5. Живая вакцина на основе штамма КБК вируса ИББ может применяться в сочетанной вакцинации суточных цыплят против ИББ и болезни Марека.
6. Промышленная технология изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против ИББ на основе штамма 52/70-М включает: культивирование вируса ИББ на эмбрионах СПФ-кур, его очистку от балластных белков, инакти вацию димером этиленимина и получение эмульсии антигена с адъювантом.
7. Инактивированная эмульсионная вакцина против ИББ безвредна, антигенно активна, эффективна при однократном парентеральном введении и вызывает формирование напряженного и продолжительного иммунитета.
8. Инактивированная эмульсионная вакцина против ИББ сохраняет исходные антигенные, иммуногенные свойства и стабильность эмульсии при хранении препарата при температуре +2…+8°С в течение 12-месячного срока наблюдения.
9. Эмульсионная инактивированная вакцина против ИББ в условиях птице водческих хозяйств высокоэффективна для купирования острых вспышек и для профилактики субклинической формы болезни.
10. На основании практики использования разработанных вакцин против ИББ подтверждена экономическая и противоэпизоотическая эффективность разных схем их применения.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ Результаты научных исследований вошли в нормативные документы, ко торые были одобрены ученым советом ФГУ «ВГНКИ», утверждены Департа ментом ветеринарии Минсельхозпрода России и Россельхознадзором МСХ РФ:
1. НД на «Вакцину против инфекционной бурсальной болезни из штамма КБК» (СТО 56204140-0001-2007), 01.02.2008 г.;
2. НД «Инструкция по применению вакцины против инфекционной бурсаль ной болезни из штамма КБК (вместо «Наставления по применению...»), 03.03.2008 г.;
3. НД на «Вакцину против инфекционной бурсальной болезни (ИББ) жидкую инактивированную» (ТУ 9384-001-56204140-03) от 05.02.2004 г., без ограниче ния срока действия;
4. «Инструкция по применению вакцины против инфекционной бурсальной болезни (ИББ) жидкой инактивированной» (вместо «Наставления по примене нию…»), 04.06.2009 г.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Алиева, А.К. Сравнительная оценка эффективности различных методов вакцинации против инфекционной бурсальной болезни птиц / А.С. Алиев, Р.С. Сираждинов, А.К. Алиева // Актуальные вопросы диагностики, про филактики и борьбы с болезнями сельскохозяйственных животных: тез. на уч.-практ. конф. – Ставрополь, 1999. – С. 33–34.
2. Алиева, А.К. О специфической профилактике инфекционной бурсальной болезни птиц / А.С. Алиев, Р.С. Сираждинов, Н.В. Никитина, А.К. Алие ва // Актуальные вопросы диагностики, профилактики и борьбы с болезнями сельскохозяйственных животных: материалы науч.-практ.
конф. – Ставрополь, 1999. – С. 35–36.
3. Алиева, А.К. Вакцина против инфекционной бурсальной болезни птиц из штамма КБК / А.С. Алиев, А.К. Алиева // Ветеринария. – 2003. – № 3. – С. 26–29.
4. Алиева, А.К. Вiрусвакцина протiв iнфекционной бурсальноi хвороби птицi зi штамму КБК / А.С. Алиев, А.К. Алиева // Ветерiнарна медiцiна Украiни. – 2003. – № 3. – С. 37–40.
5. Алиев, А.С., Алиева, А.К., Оганесян, В.А. Вакцина против инфекционной бурсальной болезни птиц // Патент № 2205021, опубл. 27.05.2003.
6. Алиева, А.К. Особенности иммуногенеза при инфекционной бурсальной болезни / А.К. Алиева // Пятая международная конференция по птицевод ству. – Алушта, 2004. – С. 496–497.
7. Алиева, А.К. Ассоциированная вакцинация против инфекционной бур сальной болезни и болезни Марека / А.К. Алиева, А.С. Алиев // Материалы междунар. юбилейной науч.-практ. конф. – СПб.–Ломоносов, 2004. – С. 63–65.
8. Алиева, А.К. Эпизоотические особенности и клинико-морфологическая ха рактеристика инфекционной бурсальной болезни в промышленном птице водстве стран СНГ. Сообщение 1 / А.К. Алиева, А.С. Алиев // Актуальные вопросы производства и применения биологических препаратов: сб. мате риалов междунар. науч.-практ. конф. – Алматы, 2004. – С. 293–302.
9. Алиева, А.К. Эпизоотические особенности и клинико-морфологическая ха рактеристика инфекционной бурсальной болезни в промышленном птице водстве стран СНГ. Сообщение 2 / А.К. Алиева, А.С. Алиев // Актуальные вопросы производства и применения биологических препаратов: сб. мате риалов междунар. науч.-практ. конф. – Алматы, 2004. – С. 303–316.
10. Алиева, А.К. Диагностика инфекционной бурсальной болезни / А.С. Алиев, А.К. Алиева // Актуальные вопросы диагностики болезни животных: спе циальный выпуск материалов междунар. конф. – Алматы, 2005. – С. 32–37.
11. Алиева, А.К. Птицеводство Казахстана, современное состояние и перспек тивы развития / А.С. Алиев, Г.К. Калыкова, А.К. Алиева // Материалы I междунарного ветеринарного конгресса по птицеводству. – М., 2005. – С. 5–6.
12. Алиева, А.К. Вирусвакцина против инфекционной бурсальной болезни из штамма «КБК» / А.К. Алиева, А.С. Алиев // Актуальные проблемы ветери нарной медицины: материалы конф. – СПб., 2005. – С. 6–7.
13. Алиева, А.К. Производственные испытания живой вакцины из штамма КБК для специфической профилактики инфекционной бурсальной болезни / А.К. Алиева, А.С. Алиев // Актуальные проблемы ветеринарной медицины:
материалы междунар. науч.-практ. конгр. – СПб., 2005. – С. 9–11.
14. Алиева, А.К. Разработка методов очистки вируса инфекционной бурсаль ной болезни / А.К. Алиева, А.С. Алиев, А.И. Банников // Актуальные про блемы ветеринарной медицины: материалы конф. – СПб., 2005. – С. 7–9.
15. Алиева, А.К. Применение РНГА для выявления специфических антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни / А.К. Алиева, А.С. Алиев, Э.П. Корнеева, А.И. Банников // Материалы I междунарного ветеринарного конгресса по птицеводству – М., 2005. – C. 68–70.
16. Алиева, А.К. К вопросу специфической профилактики инфекционной бур сальной болезни / А.К. Алиева, А.С. Алиев, В.А. Оганесян // Материалы I междунарного ветеринарного конгресса по птицеводству – М., 2005. – С. 112–115.
17. Алиева, А.К. Принципы специфической профилактики инфекционной бур сальной болезни / А.С. Алиев, А.К. Алиева // Актуальные проблемы вете ринарной медицины: материалы междунар. науч.-практ. конгр. – СПб., 2006. – С. 47–51.
18. Алиева, А.К. Инфекционная бурсальная болезнь птиц: учеб.-метод. посо бие / А.С. Алиев, А.К. Алиева, В.А. Бакулин. – СПб., 2006. – 11 с.
19. Алиева, А.К. Эффективность ассоциированной вакцинации против инфекционной бурсальной болезни и болезни Марека / А.К. Алиева, А.С. Алиев // Птица и птицепродукты. – 2006. – № 6. – С. 46–47.
20. Алиева, А.К. Ассоцiйована вакцiнация протiи iнфекцiонной хворобi и хворобi Марека / А.К. Алиева // Ветерiнарна медiцiна Украiни. – 2008. – № 3. – С. 17–18.
21. Алиева, А.К. К вопросу культивирования вируса инфекционной бурсаль ной болезни / А.К. Алиева // Актуальные вопросы медицинской биологии и паразитологии: материалы юбилейной науч.-практ. конф., посвященной 200-летию кафедры биологии им. акад. Е.Н. Павловского. – СПб., 2009. – С. 11.
22. Алиева, А.К. Оценка биологических свойств вакцинного штамма КБК ви руса инфекционной бурсальной болезни / А.К. Алиева // Актуальные во просы медицинской биологии и паразитологии: материалы юбилейной на уч.-практ. конф., посвященной 200-летию кафедры биологии им. акад.
Е.Н. Павловского. – СПб., 2009. – С. 10.
23. Алиева, А.К. Желудочно-кишечные болезни птиц вирусной этиологии / А.К. Алиева, А.С. Алиев // Птица и птицепродукты. – 2009. – № 4. – С. 50–54.
24. Алиева, А.К. Эпизоотология и профилактика инфекционной бурсальной болезни / А.К. Алиева, А.С. Алиев // Эпизоотология, иммунология, фарма кология, санитария. – 2009. – № 2. – С. 27–34.
25. Алиева, А.К. Перспективы применения цитокинов в птицеводстве / А.К. Алиева, А.С. Алиев // Птица и птицепродукты. – 2010. – № 2. – С. 34–36.
26. Алиева, А.К. Роль цитокинов в регуляции иммунитета у птиц / А.К. Алиева, А.С. Алиев // Ветеринария. – 2010. – № 12. – С. 24–28.
27. Алиева, А.К. Сравнительное изучение схем вакцинации цыплят-бройлеров против инфекционной бурсальной болезни / А.К. Алиева, А.С. Алиев // Материалы VII междунар. ветеринарного конгр. по птицеводству. – М., 2011. – С. 85–88.
28. Алиева, А.К. Изучение антигенной специфичности полевых изолятов и эталонного штамма «52/70-М» вируса болезни Гамборо / А.К. Алиева, А.С. Алиев // Материалы VII междунар. ветеринарного конгр. по птицевод ству. – М., 2011. – С. 94–97.
29. Алиева, А.К. К вопросу изучения антигенной идентичности полевых изолятов и эталонного штамма «52/70-М» вируса болезни Гамборо / А.К. Алиева, А.С. Алиев, Г.Р. Юсупова // Ученые записки КГАВМ им. Н.Э. Баумана. – 2011. – Т. 206. – С. 3–8.
30. Алиева, А.К. Оценка различных схем вакцинации цыплят-бройлеров против инфекционной бурсальной болезни / А.К. Алиева, В.И. Смолен ский, А.С. Алиев, Г.Р. Юсупова // Ученые записки КГАВМ им. Н.Э. Баумана. – 2011. – Т. 207. – С. 33–37.
31. Алиева, А.К. Разработка инактивированной вакцины против инфекци онной бурсальной болезни / А.К. Алиева, О.И. Киселев, М.Г. Алиев, Г.Р. Юсупова // Ученые записки КГАВМ им. Н.Э. Баумана. – 2011. – Т. 207. – С. 28–33.
32. Алиева, А.К. Оценка иммуносупресивной активности вакцинного штамма «КБК» вируса инфекционной бурсальной болезни птиц / А.К. Алиева // Ветеринарный врач. – 2011. – № 3. – С. 17–18.
33. Алиева, А.К. Изучение режима инактивации вируса инфекционной бурсальной болезни птиц / А.К. Алиева, А.С. Алиев // Ветеринарный врач. – 2011. – № 4. – С. 5–7.
34. Алиева, А.К. Иммунобиологические свойства живой вакцины против инфекционной бурсальной болезни птиц / А.К. Алиева, В.И. Смоленс кий // Птица и птицепродукты. – 2011 – № 4. – С. 16–18.
35. Алиева, А.К. Иммунобиологические свойства инактивированной вак цины против инфекционной бурсальной болезни / А.К. Алиева, А.С. Алиев // Ветеринария и кормление. – 2011. – № 4. – С. 20–21.
36. Алиева, А.К. Производственные испытания вакцин против инфекци онной бурсальной болезни птиц в неблагополучном хозяйстве / А.К. Алиева, С.Ю. Жбанова // Вопросы нормативно-правового регули рования в ветеринарии. – 2011. – № 2. – С. 29–30.
37. Алиева, А.К. Оценка эффективности вакцин против инфекционной бурсальной болезни птиц / А.К. Алиева, Г.В. Бегинин // Ветеринарная медицина. – 2011. – № 3. – С. 18–21.
38. Алиева, А.К. Аттенуация бирнавируса птиц и оценка его иммунобиоло гических свойств // А.К. Алиева, А.С. Алиев // Ветеринарная медици на. – 2011. – № 3. – С. 22–25.
39. Алиева, А.К. К вопросу вакцинации против инфекционной бурсальной болезни птиц / А.К. Алиева, Г.В. Бегинин // Международный вестник ветеринарии. – 2011. – № 3. – С. 6–9.
Автор выражает искреннюю благодарность и признательность всем сотрудникам учреждений, принимавших участие в проведении отдельных фрагментов работы и обсуждении их результатов