Фотогетеротрофные пурпурные бактерии в почвах, загрязнённых углеводородами 03. 00. 16 – экология
На правах рукописи
ДРАЧУК Сергей Владимирович ФОТОГЕТЕРОТРОФНЫЕ ПУРПУРНЫЕ БАКТЕРИИ В ПОЧВАХ, ЗАГРЯЗНЁННЫХ УГЛЕВОДОРОДАМИ 03. 00. 16 – экология
Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук
Тюмень – 2004 2
Работа выполнена на кафедре экологии Уральского государственного университета им.
А.М. Горького, г. Екатеринбург Научный руководи- кандидат биологических наук, тель: профессор ФИРСОВ Николай Ни колаевич Официальные оппо- доктор биологических наук, про ненты: фессор РУСАНОВ Виктор Владимирович;
кандидат ветеринарных наук БАЛАБАНОВА Галина Фёдоровна Ведущая организа- Уральская государственная ция: сельскохозяйственная академия
Защита состоится 3 июня 2004 г. в 15 00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.274.08 по присуждению учёной степени кандидата биологических наук при Тюменском государственном университете по адресу: 625043, г. Тюмень, ул. Пирогова, 3.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тюменского государственного уни верситета Автореферат разослан 3 мая 2004 г.
Учёный секретарь диссертационного совета, С.Н. Гашев доктор биологических наук
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Широкое применение в хозяйственной деятельности чело века нефти и нефтепродуктов приводит к загрязнению окружающей среды различными угле водородами. По данным А.М. Рябчикова (1974), при добыче и переработке нефти, а также при использовании нефтепродуктов во всем мире ежегодно теряется 45 х 106 тонн углеводо родов. Возрастающие масштабы нефтяного загрязнения окружающей среды приводят к не обходимости поиска методов борьбы с этими поллютантами. Главными природными дест рукторами нефти и нефтепродуктов являются углеводородокисляющие микроорганизмы.
Поиск непосредственных деструкторов нефти или микроорганизмов, ускоряющих в смешан ных культурах процессы потребления углеводородов, например благодаря способности к фиксации молекулярного азота - важная задача экологической биотехнологии.
Помимо методов рекультивации, предусматривающих интродукцию углеводородокис ляющих микроорганизмов в экосистему, большое значение приобретают методы, основан ные на стимуляции естественной нефтеокисляющей микрофлоры (Коронелли, 1996). Поэто му необходимо изучать все группы микроорганизмов, способные участвовать в деструкции нефти и нефтепродуктов. Исследованию микроорганизмов, ассимилирующих углеводороды, посвящено огромное количество научных публикаций. Большинство авторов сосредоточило все внимание на аэробных хемогетеротрофных бактериях и грибах. Сведения о возможном участии в биодеградации нефти фотогетеротрофных микроорганизмов очень ограничены. В то же время, в литературе можно найти сообщения о распространении бактерий, способных к фотогетеротрофному росту в пластовых водах нефтяных месторождений, хотя причины этого явления окончательно не установлены (Розанова, Худякова, 1970;
Розанова, 1971а). В обзоре, посвящённом использованию аноксигенных фототрофных бактерий в биотехнологии (Sasikala, Ramana, 1995), приводятся данные о возможности роста пурпурных бактерий на средах с нефтепродуктами и об использовании этих микроорганизмов для очистки вод, за грязнённых углеводородами.
Фотогетеротрофные пурпурные бактерии ранее объединяли в группу пурпурных не серных бактерий (сем. Rhodospirillaceae). Данные геносистематики позволили отнести боль шую часть этих микроорганизмов к – подклассу класса Proteobacteria (Stackebrandt et al., 1988).
Пурпурные несерные бактерии обладают большим разнообразием метаболических пу тей и таким свойством, как способность к азотфиксации. Большой интерес может представ лять их участие в биодеградации нефти в составе смешанных микробных культур или как самостоятельных деструкторов углеводородов. Совершенно неизученным остаётся вопрос о распространении этих микроорганизмов в почвах и грунтах, подверженных нефтяному за грязнению.
Цель настоящего исследования - изучение закономерностей распространения фото гетеротрофных пурпурных бактерий в почвах, загрязнённых нефтью и нефтепродуктами, и оценка роли этих микроорганизмов в биодеградации углеводородов.
Основные задачи исследования:
1. Выявить наличие фотогетеротрофных бактерий в почвах и грунтах, загрязнённых нефтью и нефтепродуктами. Определить их численность в этих природных субстратах в за висимости от величины углеводородного загрязнения, сравнить численность пурпурных бактерий с количеством аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов.
2. Выделить из загрязнённых биоценозов чистые культуры фотогетеротрофных пурпурных бактерий и описать их физиологические и морфологические свойства с целью установления систематической принадлежности.
3. Установить, способность этих бактерий использовать нефтепродукты в качестве единственного источника углерода и энергии.
4. Выяснить способность пурпурных бактерий к совместному росту с аэробными нефтеокисляющими микроорганизмами на средах с нефтепродуктами. Установить влияние пурпурных бактерий на рост нефтеокисляющих микроорганизмов и деструкцию ими угле водородов.
Научная новизна. На основании изучения нефтезагрязнённых почвенных проб, ото бранных в разных районах Среднего Урала и Западной Сибири, впервые показано, что фото гетеротрофные пурпурные бактерии являются частью почвенного микробоценоза в условиях загрязнения нефтью. В результате лабораторных опытов по интродукции штаммов пурпур ных бактерий в почву выявлено влияние некоторых факторов на развитие этих микроорга низмов (концентрация дизельного топлива, влажность почвы, освещённость). Впервые выде лены чистые культуры пурпурных бактерий из загрязнённой почвы, дана их физиологиче ская характеристика. Установлена возможность метаболического взаимодействия пурпурных бактерий и гетеротрофных нефтеокисляющих грибов и бактерий. Обнаружены штаммы фо тогетеротрофных бактерий, способных расти в аэробных условиях на среде с дизельным то пливом в качестве единственного источника углерода и энергии.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представление об экологии пурпурных бактерий, дают представление об участии этих мик роорганизмов в биодеградации углеводородов нефти. Результаты работы показывают, что нефтезагрязнённая почва является экологической нишей фотогетеротрофных пурпурных бактерий. Выделенные штаммы этих прокариот могут быть использованы для создания био препаратов для борьбы с нефтяным загрязнением на основе ассоциаций с аэробными нефте окисляющими микроорганизмами. Данные о преимущественном развитии этих микроорга низмов в загрязнённой почве могут использоваться для разработки методов биоиндикации таких загрязнений.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. В почвах и грунтах при загрязнении сырой нефтью или нефтепродуктами обнару жены фотогетеротрофные пурпурные бактерий, на основании морфологических и физиоло гических признаков отнесённые к роду Rhodopseudomonas, к видам Rps. acidophila, Rps. pal ustris.
2. Причинами развития пурпурных бактерий служит избыток доступных органиче ских веществ (органических кислот), которые образуются при окислении углеводородов нефтеокисляющей микрофлорой, главным образом, мицелиальными грибами.
3. Живые клетки и лизированная биомасса пурпурных бактерий (штамм Rps. aci dophila S1) оказывают стимулирующее воздействие на рост аэробной нефтеокисляющей бак терии Dietzia maris в условиях, лимитирования по азоту.
4. Отдельные представители пурпурных бактерий способны к аэробному росту в тем ноте на среде с дизельным топливом в качестве единственного источника углерода и энер гии.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на конференциях молодых учёных «Современные проблемы эколо гии, микробиологии и иммунологии», Пермь, 1999;
«Биосфера и человечество», Екатерин бург, 2000;
«Современные проблемы популяционной, исторической и прикладной экологии», Екатеринбург, 2001;
«Молодые учёные Волго-Уральского региона на рубеже веков», Уфа, 2001;
«Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии», Пермь, 2002;
на I международной межвузовской школе-семинаре «Экология 2000: эстафета поколений», Мо сква, 2000;
на научных конференциях «Б.П. Колесников – выдающийся отечественный лесо вед и эколог», Екатеринбург, 1999;
«Экобиотехнология: борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды», Пущино, 2001;
на международной научной конференции «Автотроф ные микроорганизмы», Москва, 2000.
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ.
Объём и структура диссертации. Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц и 40 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литера туры, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментальных иссле дований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, вклю чающего 150 литературных источников, из них 97 отечественных и 53 зарубежных авторов.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Отбор почвенных образцов. Пробы были отобраны на территории г. Екатеринбурга в местах точечных загрязнений нефтепродуктами (эстакады для ремонта автомобилей, места стоянок автотранспорта) в августе и сентябре 1999 года. Контролем служили почвенные пробы без визуальных признаков углеводородного загрязнения, отобранные на участках с травянистым покровом в непосредственной близости от загрязнённых участков. Кроме того, пробы почвы, загрязнённой нефтепродуктами, были взяты на территории одного из пред приятий г. Екатеринбурга (сентябрь 2000 года). Глубина отбора почвы составляла 5 см. В сентябре 2002 года на территории того же предприятия были отобраны послойные пробы почвы с углеводородным загрязнением на глубинах 2, 4, 6, 8, 10 см.
Почву, загрязнённую сырой нефтью, отбирали в различных регионах: в Западной Си бири (в районе г. Сургута, пос. Победит;
в районах населённого пункта Покачи, г. Урая и г.
Югорска), в Предуралье (район г. Кунгура). Пробы почвы, загрязнённые сырой нефтью, бы ли также отобраны в августе 2001 года в районе Тепловского и Мамонтовского нефтяных месторождений (Ханты-Мансийский АО). Пробы были отобраны на местах аварийных раз ливов нефти 1996 – 2001 годов. Типы почв – болотно-подзолистая и глеево-подзолистая.
Грунт с различной степенью углеводородного загрязнения был отобран с полотна железной дороги в районе железнодорожной станции Первомайская (г. Екатеринбург) в июне 2002 го да. Насыпной грунт представлял собой серпентинизированные перидотиты и серпентиниты (Баженовское месторождение, г. Асбест). Верховой пушицево-сфагновый торф, загрязнён ный сырой нефтью был отобран в районе Саматлорского нефтяного месторождения.
Содержание нефтяных поллютантов в почвенных образцах определяли весовым ме тодом. Углеводороды экстрагировали хлороформом, хлороформ отгоняли на водяной бане, маслянистый остаток взвешивали (Bragg et al., 1992).
Определение численности почвенных микроорганизмов. Почвенные разведения, используемые для определения количества микроорганизмов в почве, готовили по общепри нятой методике (Разумовская и др. 1960;
Методы почвенной микробиологии, 1980).
Для определения количества анаэробных фотогетеротрофных бактерий в почве прово дили посев в толщу питательной среды. В стерильные пробирки разливали по 1 мл соответ ствующего почвенного разведения, затем добавляли по 9 мл расплавленной и охлаждённой до 40 – 500С среды для пурпурных несерных бактерий, тщательно перемешивая содержимое пробирок. Для создания анаэробиоза столбик агаризованной среды в пробирке покрывали сверху слоем стерильного вазелинового масла. Пробирки инкубировали на свету (в люмино стате) при температуре 300С в течение 30 суток. По числу образовавшихся в толще агара дисковидных тёмно-красных колоний определяли количество фотогетеротрофных пурпур ных бактерий в почве. Результаты выражали в пересчёте на 1 г сухого вещества почвы. В пробирках, помещённых в темноту, образования колоний пурпурных бактерий не наблюда ли. Для выявления пурпурных бактерий в почве также осуществляли постановку накопи тельных культур, для чего в стеклянные флаконы объёмом 100 мл помещали 1 г исследуемой почвы, заливали соответствующей стерильной жидкой средой, закрывали флакон резиновой пробкой, икубировали на свету в термостате при 300С в течение 30 суток. Среда для пурпур ных несерных бактерий (среда ПНБ) имела следующий состав (г/л): яблочная кислота – 2.5;
NH4Cl – 1.2;
MgSO4·7H2O – 0.2;
CaCl2 · 6H2O – 0.07;
K2HPO4 – 0.9;
KH2PO4 – 0.6;
дрожжевой экстракт – 0.5;
агар-агар – 15;
раствор микроэлементов по Пфеннигу – 4 мл (Руководство к..., 1995). Для определения количества пурпурных бактерий, использующих масляную кисло ту, эту кислоту вносили в среду в количестве 0.3 % вместо яблочной кислоты. Кроме того, в отдельных опытах в питательную среду в виде стерильного раствора добавляли бикарбонат натрия до конечной концентрации 2 г/л, уровень рН среды стерильным раствором H3PO4 ус танавливали в пределах 6.8 – 7.0.
Для определения количества аэробных нефтеокисляющих бактерий и нефтеокисляю щих мицелиальных грибов проводили поверхностный посев на агаризованные питательные среды, разлитые в стерильные чашки Петри. Для определения числа аэробных нефтеокис ляющих бактерий использовали агаризованную среду следующего состава (г/л): NH4NO3 – 1.0;
KH2PO4 – 1.0;
Na2HPO4·12H2O – 2.0;
MgSO4·7H2O – 0.2;
Na2CO3 – 0.2;
NaCl – 1.0;
CaCl ·6H2O – 0.01;
MnSO4·5H2O – 0.02;
FeSO4·7H2O – 0.01;
агар–агар – 15. В качестве единствен ного источника углерода и энергии вносили 1 об. % дизельного топлива (Бердичевская и др.
1991). Количество нефтеокисляющих мицелиальных грибов определяли на агаризованной среде Чапека без сахарозы с дизельным топливом (1 об. %). После стерилизации рН среды доводили стерильным раствором H3PO4 до рН 5.0 – 5.5 (Каневская, 1984). Чтобы исключить рост бактерий на этой среде в неё добавляли антибиотики: бензилпенициллин (200 ед./мл) и тетрациклин (5 мкг/мл) (Литвинов, 1969;
Методы экспериментальной микологии, 1982).
Рабочая коллекция бактериальных культур. В работе использовали штаммы фото гетеротрофных пурпурных бактерий, выделенные из почв, загрязнённых углеводородами.
Помимо штаммов пурпурных бактерий, изолированных из почв, загрязнённых углеводоро дами, в работе использован штамм X, выделенный из смазочно-охлаждающей жидкости и любезно предоставленный сотрудником Института фундаментальных проблем биологии проф. И.Н.Гоготовым. Кроме того, для проведения экспериментов использовали культуры Rhodospirillum rubrum, Rhodobacter sphaeroides, Rhodopseudomonas palustris из коллекции кафедры микробиологии биологического факультета МГУ им. Ломоносова. Кроме этого, ис пользовали культуру аэробных нефтеокисляющих бактерий, идентифицированных в Лабора тории алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН как Dietzia maris, и нефтеокис ляющие плесневые грибы, выделенные из загрязнённой почвы.
Морфологию бактериальных клеток изучали методом фазово-контрастной световой микроскопии и методом электронной микроскопии.
Получение физиологической характеристики выделенных штаммов. Исследовали способность выделенных бактерий расти в автотрофных условиях на свету на среде с суль фидом натрия и бикарбонатом. Кроме того, определяли оптимальное значение pH среды, оптимум концентрации NaCl. Способность использовать органические вещества в качестве источников углерода проверяли на среде ПНБ, из которой была исключена яблочная кислота и в которую в количестве 0.3% вносили испытуемые соединения. О росте бактерий судили по изменению оптической плотности культуры при длине волны 590 нм. Оптическую плотность измеряли на фотоэлектроколориметре КФК–2–УХЛ–4.2. Количество бактериальных клеток в 1 мл культуральной жидкости определяли по соответствующей калибровочной кривой, которую строили по результатам прямого счёта бактериальных клеток на фиксированных окрашенных препаратах по Виноградскому.
Постановка опытов по интродукции пурпурных бактерий в почву. В опыте ис пользовали тяжелосуглинистую почву, отобранную на территории парка в г. Екатеринбурге.
В колбы объёмом 250 мл помещали по 50 г почвы, увлажнённой до 60 % полной влагоёмко сти. Стерильное дизельное топливо вносили в количестве 10 %. Контролем служила почва без углеводородного загрязнения. В колбы с почвой вносили чистые культуры бактерий штамма S1 и бактерий коллекционной культуры Rhodopseudomonas palustris в количестве х 103 клеток/г почвы. Колбы с почвой инкубировали на свету и в темноте. Количество фото гетеротрофных пурпурных бактерий определяли методом посева на соответствующиую ага ризованную питательную среду.
В опыте по установлению влияния концентрации нефтяного загрязнителя на фотогете ротрофные микроорганизмы в колбы с почвой вносили дизельное топливо в количестве 5, 10, 25 и 50 % и бактерии штамма S1 в том же количестве, что и в предыдущем опыте. Коли чество пурпурных бактерий определяли через 2 и через 8 месяцев методом посева на соот ветствующую агаризованную среду. Влажность почвы поддерживали на постоянном уровне (60 % полной влагоёмкости почвы).
Для выяснения влияния влажности почвы на выживание пурпурных бактерий в услови ях углеводородного загрязнения в почву, подготовленную также, как и в предыдущих опы тах, интродуцировали бактерии штамма S1 в количестве 100 х 103 клеток/г почвы. Стериль ное дизельное топливо также вносили в количестве 10 %. Контролем служила почва без уг леводородного загрязнения. Колбы инкубировали 30 суток при 300С. В почву воду либо не вносили, либо вносили по 5 или по 20 мл стерильной водопроводной воды. По окончании инкубирования определяли влажность почвы путём высушивания навесок при 1050С и коли чество пурпурных бактерий методом посева на среду ПНБ.
Исследование роста пурпурных бактерий на культуральной жидкости грибов и совместного роста с грибами. Адаптированные к дизельному топливу грибы, отнесённые к родам Alternaria, Cladosporium, Aspergillus, Penicillium, смывали с агаризованой среды и вы ращивали 14 суток на минеральном фоне среды ПНБ с 1 об. % дизельного топлива. Мицелий грибов вносили в количестве 20 – 30 мг сухой биомассы/л. Из среды исключали источник азота, чтобы увеличить выход органических кислот. Культивирование проводили в колбах объёмом 500 мл, объём среды составлял 100 мл. Грибы образовывали поверхностную плён ку. Культуральную жидкость разных штаммов грибов, освобождённую от грибных плёнок, разбавляли в 2 раза свежим минеральным фоном ПНБ и инокулировали пурпурными бакте риями. Культивировали в течение одного месяца в анаэробных условиях на свету. Контролем служил минеральный фон среды ПНБ. В другом варианте опыта пурпурные бактерии штам ма S1 вносили в ту же среду, что и в предыдущем опыте, непосредственно вместе с грибами.
Культивирование осуществляли на свету в колбах объёмом 500 мл с ватными пробками (микроаэробные условия) в течение одного месяца, объём среды составлял 100 мл. Контро лем служил минеральный фон среды ПНБ с 1 об. % дизельного топлива. После отделения биомассы грибов фильтрованием через бумагу, измеряли оптическую плотность культураль ной жидкости и по этим показателям судили о росте пурпурных бактерий. О способности нефтеокисляющих грибов накапливать органические кислоты в культуральной жидкости судили при помощи метода потенциометрического титрования (Корчемная и др., 1966).
Постановка опытов для выяснения влияния лизата клеток пурпурных бактерий на рост аэробной нефтеокисляющей актинобактерии. Для опыта использовали среду «К» (г/л): KNO3 – 1.0;
K2HPO4 – 1.0;
KH2PO4 – 1.0;
NaCl – 1.0;
MgSO4 · H2O – 0.2;
CaCl 2 – следы;
FeCl3 – следы;
pH среды – 6.8 – 7.0 (Малашенко и др., 1973).
Лизат клеток пурпурных бактерий готовили следующим образом: клетки бактерий штамма S1 осаждали ценрифугированием, отмывали средой «К» без источника азота, снова суспендировали в той же среде и кипятили 15 минут на водяной бане и центрифугировнием осаждали лизированые клетки. Супернатант, содержащий бактериальный белок использова ли для выращивания аэробной углеводородокисляющей актинобактерии Dietzia maris (штамм А2). Количество белка в супернатанте определяли методом Лоури (Практическая химия белка, 1989). Источником углерода служили пары керосина. Контролем служила среда «К» с KNO3 в качестве источника азота и с керосином, среда «К» без азота с керосином и среда «К» с лизатом клеток без керосина и без источника азота. Культивирование D. maris проводили в течение 10 суток в аэробных условиях на роторной качалке (80 оборотов/мин).
О росте судили по изменению оптической плотности культуры при длине волны 590 нм.
Аналогичный опыт проводили, используя в качестве источника углерода вместо керосина натриевую соль бензойной кислоты (0.3 %).
Постановка опыта по определению возможности совместной ассимиляции ди зельного топлива актинобактерией D. maris и пурпурной бактерий штамма S1. Опыт проводили с целью выяснить, оказывают ли азотфиксирующие фотогетеротрофные бакте рии положительное влияние на нефтеокисляющие микроорганизмы в условиях недостатка азота. В колбы объёмом 500 мл разливали по 100 мл среды «К» без источника азота, вносили эмульгированное ультразвуком дизельное топливо. Опыт ставили в следующих вариантах: в одном варианте среду с дизельным топливом засевали бактериями D. maris А2 и вносили в среду источник азота (KNO3 в концентрации 1 г/л), в другом варианте среду также засевали бактериями D. maris А2, но источник азота не вносили, в третьем варианте бактерии D. maris А2 вносили вместе с живыми пурпурными бактериями (штамм S1) без источника азота. Пур пурные бактерии были адаптированы к фиксации молекулярного азота. Контролем служила стерильная среда с дизельным топливом. D. maris вносили в количестве 40 мг сухого веса на 1 л среды, штамм S1 вносили в избытке – 1 г/л. Культивировали 10 суток на свету без пе ремешивания (микроаэробные условия). Остаточную концентрацию дизельного топлива оп ределяли на базе Центра химико-аналитических испытаний “Эксорб” (г. Екатеринбург) ме тодом инфракрасной фотометрии.
Статистическая обработка результатов. Математическую обработку полученных данных осуществляли с использованием компьютерных программ Excel (Microsoft Inc., – 1997), STATISTICA for Windows, v. 5.0 (Stat Soft Inc., 1995), рассчитывая среднюю арифме тическую, стандартную ошибку средней арифметической, доверительный интервал. Досто верность различий между средними величинами оценивали с использованием t-критерия Стьюдента (уровень значимости p0.05). Для решения отдельных задач применяли корреляционный анализ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Сравнительное изучение численности фотогетеротрофных пурпурных бактерий и аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов в почвах. В табл. 1 представлены резуль таты определения количества фотогетеротрофных пурпурных бактерий, аэробных нефтео кисляющих бактерий и нефтеокисляющих грибов в почвах с различной степенью загрязне ния углеводородами. Фотогетеротрофные пурпурные бактерии методом посева на агаризо ванные питательные среды обнаружены только в загрязнённых пробах. Их количество варь ировало от 0.7 до 570 х 103 клеток на 1 г почвы, если определение проводилось на среде с малатом и от 0.3 до 51 х 103 клеток - на среде с бутиратом. В контрольных пробах без неф тяного загрязнения эти микроорганизмы, за одним исключением, обнаружены не были. Эта закономерность была подтверждена в результате постановки накопительных культур. В на копительных культурах с контрольными почвенными пробами рост пурпурных бактерий не наблюдался, при постановке накопительных культур с загрязнёнными пробами на среде ПНБ на свету в анаэробных условиях рост пурпурных бактерий был отчётливо виден.
Таблица 1.
Микрофлора антропогенно изменённых почв с различным содержанием углеводородов возле эстакад для ремонта автомобилей.
Со- Фототроф- бактерии Нефтео- Нефтео дер- ные на среде кислотами, кисляю- кисляю с орг. х 103 сух. почвы жа- щие бак- щие гри ние клеток/г терии, бы, угле во х 106 х доро дов, яблочная к- масляная к- клеток/г КОЕ/г % та та сух. поч- сух. поч вы вы 16.5 570.2 39.4 111.0 159. 11.7 220.0 0 990.0 12. 10.9 0.7 0.3 150.0 14. 9.5 22.3 6.4 4.2 66. 7.3 2.1 2.2 9.5 6. 5.7 14.8 1.9 0.8 16. 3.0 31.1 13.0 32.9 61. 2.8 1.3 2.2 0.12 16. 2.7 25.5 0 8.8 4. 2.4 12.0 0.8 18.5 38. 1.6 105.0 6.1 39.5 47. 1.2 130.0 51.5 10.6 2. 0.5 0 0 118.0 37. 0 0.4 0 20.1 36. 0 0 0 3.6 3. 0 0 0 65.2 43. 0 0 0 2.3 10. 0 0 0 28.3 7. 0 0 0 2.0 10. 0 0 0 3.2 19. 0 0 0 9.8 16. Сравнивая результаты определения количества трёх групп микроорганизмов, можно придти к заключению, что количество аэробных нефтеокисляющих бактерий в исследован ных пробах было значительно больше, чем количество нефтеокисляющих мицелиальных грибов и фотогетеротрофных бактерий. Именно аэробные нефтеокисляющие бактерии явля ются главными деструкторами углеводородов в почве. Однако обнаружение пурпурных бак терий в почве уже само по себе может чётко указать на нефтяное загрязнение. На этом основании можно сделать вывод, что фотогетеротрофные пурпурные бактерии могут служить индикаторной группой на наличие углеводородного загрязнения почвы.
Результаты изучения послойных почвенных проб, загрязнённых нефтепродуктами, по казали, что фотогетеротрофные пурпурные бактерии способны проникать в почву на глуби ну до 10 см. Их развитие не зависит от света. Распределение этих микроорганизмов в поч венных горизонтах сходно с характером распределения углеводородных поллютантов. Ис следование микрофлоры почв, загрязнённых нефтепродуктами, позволяют высказать пред положение, что почвы, которые подвергаются действию углеводородных поллютантов, ста новятся своеобразной экологической нишей для пурпурных бактерий. Пурпурные бактерии являются частью микробоценоза почв с углеводородным загрязнением.
Фотогетеротрофные пурпурные бактерии обнаружены не только в почвах, загрязнён ных нефтепродуктами, но и в почвах, загрязнённых сырой нефтью. Эти микроорганизмы найдены в пробах, отобранных в Западной Сибири (район г. Сургута, г. Урая, г. Югорска, нас. пункта Покачи) и в Приуралье (район г. Кунгура). Изучение почвенных проб, отобран ных в августе 2001 года в районе Тепловского и Мамонтовского месторождений нефти, так же показывает, что пурпурные бактерии способны к развитию в почвах с нефтяным загряз нением. В контрольных пробах эти прокариоты обнаружены не были. В пробах со слабым нефтяным загрязнением (содержание нефти 0.3 – 6.7 %) эти микроорганизмы обнаружены в 80 % проб, при среднем уровне загрязнения (10 – 40%)– во всех пробах, при сильном загряз нении (выше 40 %) фотогетеротрофные прокариоты не выявлены. Количество аэробных нефтеокисляющих бактерий превосходило количество пурпурных бактерий и мицелиальных грибов. В контроле их численность достигала 0.01 – 38.3 х 106 клеток/г почвы, при слабом загрязнении – 0.6 – 727.3 х 106 клеток/г почвы, при среднем и сильном уровнях загрязнения – 0.57 – 491.8 х 106 клеток/г почвы. Количество грибов при тех же уровнях загрязнения изме нялось, соответственно, от 0.4 до 7.7 х 103 КОЕ/г почвы, 3.03 – 517.6 х 103 КОЕ/г почвы, 0.4 – 6039 х 103 КОЕ/г почвы.
Исследование верхового пушицево-сфагнового торфа, отобранного в районе Саматлор ского нефтяного месторождения, показало, что пурпурные бактерии встречаются в этом природном субстрате независимо от наличия нефтяного загрязнения. Пурпурные бактерии являются обычными обитателями торфа, что, видимо, связано с высокой влажностью на бо лотах и большим количеством органического вещества в этом субстрате. Благодаря способ ности к азотфиксации эти прокариоты могут успешно конкурировать с другими гетеро трофными бактериями в условиях верховых болот, отличающихся недостатком азота. Для торфа пурпурные бактерии не могут выступать в качестве индикаторов нефтяного загрязне ния. Полученные данные о распространении пурпурных бактерий в торфе согласуются с данными литературы (Imhoff, Trper, 1991).
Сравнительное изучение численности фотогетеротрофных пурпурных бактерий и нефтеокисляющих микроорганизмов в грунте. На рис. 1. представлены результаты изуче ния количества фотогетеротрофных пурпурных бактерий в грунте полотна железной дороги в зависимости от концентрации нефтяного загрязнителя. Эти бактерии обнаружены в грунте при концентрации углеводородов 0.9 – 4.1 % (максимумом численности при 1.8 %). В неза грязнённом грунте они отсутствуют. При концентрации 10.7 % в грунте обнаруживаются только отдельные колонии пурпурных бактерий в пересчёте на 1 г. Максимум численности аэробных нефтеокисляющих бактерий и грибов наблюдался также при содержании углево дородов 1.8 %. Количество аэробных нефтеокисляющих бактерий на два-три порядка было больше, Десятичный логарифм численности 0 2 4 6 8 10 Концентрация углеводородов, % Рис. 1. Изменение количества фотогетеротрофных пурпурных бактерий в грунте (в расчёте на 1г) в зависимости от концентрации углеводородного загрязнителя.
чем количество пурпурных бактерий и грибов. В целом, пурпурные бактерии чувствительнее к избыточным концентрациям углеводородов, чем нефтеокисляющие грибы и бактерии.
Микрофлора грунта, в свою очередь, чувствительнее к избытку углеводородов, чем микро флора почв. При загрязнении больше 10 % количество аэробных нефтеокисляющих бакте рий и грибов в грунте снижается по сравнению с почвами при аналогичном уровне загрязне ния. Это можно объяснить недостатком биогенных элементов в грунте по сравнению с поч вами.
Подводя итог исследованиям микрофлоры грунта на полотне железной дороги, необ ходимо подчеркнуть, что и в этом случае распространение пурпурных бактерий связано с наличием углеводородного поллютанта.
Заселение загрязнённых почв могут, вероятно, осуществлять пурпурные бактерии, на селяющие водные местообитания. Эта группа микроорганизмов широко распространена в различных водоёмах (Горленко и др., 1977). Перемещение этих бактерий возможно с талы ми или дождевыми водами.
Систематическая принадлежность выделенных штаммов пурпурных бактерий.
Изучение морфологии бактерий штаммов S1, S5, X методом электронной микроскопии ука зывают на возможность отнесения этих микроорганизмов к роду Rhodopseudomonas. В пользу этого можно привести следующие доказательства: наличие в жизненном цикле под вижных клеток с субполярными жгутиками, способность к неравномерному делению (поч кованию), внутриклеточные мембраны в виде ламелл, подстилающих цитоплазматическую мембрану и расположенных параллельно ей, грамотрицательный тип клеточной стенки (Оп ределитель бактерий Берджи, 1997).
Морфологию клеток пурпурных бактерий штаммов М2, М3, Е8, выделенных из нефте загрязнённых почв г. Екатеринбурга, и бактерий штамма МЮ3 из почвы г. Югорска иссле довали при помощи светового микроскопа с фазово-контрастным устройством. Клетки име ли форму палочек, у исследуемых бактерий наблюдалось неравномерное деление. В моло дых культурах многие бактерии были подвижны, в старых культурах были видны агломера ты в форме розеток. Морфология клеток выделенных штаммов была сходна с морфологией клеток коллекционной культуры Rhodopseudomonas palustris. Перечисленные штаммы также могут быть отнесены к роду Rhodopseudomonas.
Фенотипические признаки бактерий выделенных штаммов позволяют судить о при надлежности их к тем или иным видам рода Rhodopseudomonas. Бактерии Rps. sp. S1 и Rps.
sp. S5 отнесены к виду Rps. acidophila. В пользу этого утверждения свидетельствуют сле дующие признаки: сидячая отпочковывающаяся клетка, рост при относительно низких зна чениях pH, неспособность использовать бензоат в качестве источника углерода, размеры клеток, близкие к размерам клеток Rps. acidophila, сходный спектр потребляемых субстратов (Bergey’s Mannual..., 1989). Бактерии Rps. sp. M2 и Rps. sp. M3 по ряду фенотипических признаков также могут быть отнесены к Rps. acidophila, бактерии штаммов X, Е8 – к Rps.
palustris, бактерии штамма МЮ3 - к Rps. rutila. Наиболее предпочтительными субстратами для изучаемых микроорганизмов были органические кислоты (яблочная, янтарная, уксусная и др.).
Интродукция пурпурных бактерий в почву. Если в почву вносили пурпурные бак терии Rps. acidophila S1 (10 х 103 клеток/г почвы), то через 2 месяца в колбах с незагрязнен ной почвой их количество резко уменьшалось, а через 8 месяцев они вообще не обнаружи вались. В колбах с загрязненной почвой их количество значительно увеличивалось, что ука зывает на наличие благоприятных условий для роста пурпурных бактерий в такой почве (табл. 2). Интересно отметить, что пурпурные бактерии развивались в загрязненной почве как при освещении колб, так и в темноте. Это указывает на темновой рост бактерий Rps. aci dophila S1 в почве, загрязненной дизельным топливом. Данные о темновом росте пурпурных бактерий согласуются с результатами изучения микрофлоры почвенных горизонтов, которые показывают, что эти микроорганизмы развиваются в почве на глубине 9 – 10 см.
Таблица Численность бактерий Rps. acidophila S1 в почве в лабораторном опыте после интро дукции в количестве 10 х 103 клеток на 1 г почвы х103 кле Варианты Количество бакте- почвы рий, ток/г опыта через 2 месяца через 8 месяцев на свету в темно- на свету в темно те те Дизель ное топ- 740.0 1050.0 600.0 1230. ливо Без диз.
топлива 0.2 1.5 не обнару- не обна (кон- жены ружены троль) Пурпурные бактерии Rps.acidophila S1 развивались в почве при концентрациях ди зельного топлива 5, 10, 25 %. В незагрязненной почве и при 50 %-м загрязнении через 2 ме сяца пурпурные бактерии не выявлены не были. 50 %-е загрязнение, вероятно, полностью исключает доступ кислорода, что подавляет нефтеокисляющую микрофлору. Кроме того, нельзя исключать токсического воздействия избытка дизельного топлива непосредственно на пурпурные бактерии.
Аналогичные опыты, проведенные с коллекционными культурами показали, что бак терии Rhodospirillum rubrum не сохраняют жизнеспособность ни в загрязненной почве, ни в контрольной. Единичные клетки Rhodobacter sphaeroides сохранялись только в незагрязнен ной почве. Бактерии Rps. palustris развивались в загрязненной почве (на свету и в темноте).
Их численность возрастала с 10 х 103 на 1 г почвы до 1-2 х 106 клеток/г почвы. Судя по этим данным, способностью к заселению почв с углеводородным загрязнением обладают пред ставители рода Rhodopseudomonas.
Вероятно, определённую роль в распространении этих бактерий в почве при нефтяном загрязнении играет то обстоятельство, что углеводородная плёнка может удерживать влагу в почве, препятствуя её полному высыханию. Пурпурные бактерии рода Rhodopseudomonas не выдерживают высыхания, не образуют спор или цист. Они являются, главным образом, вод ными микроорганизмами. Влияние увлажнения на выживание пурпурных бактерий (Rps. aci dophila S1) в лабораторном опыте в почве показано в табл. 3.
Таблица Влияние увлажнения на выживание Rps. acidophila в почве при углеводородном загряз нении (10 % диз. топлива) Вносимое Влаж- почвы Пурпур- бактерии, ные х 103 клеток/г кол-во во- ность в опы ды, мл конце та,% почвы (на 50 г без диз. с диз. без диз. с диз.
почвы) топлива топли- топлива топливом вом 0 7.4 15.0 0.1 88. 5 30.8 33.0 2.9 386. 20 46.4 51.8 0.2 28. Данные табл. 3 показывают, что при отсутствии дополнительного увлажнения плёнка дизельного топлива удерживает воду, и влажность загрязнённой почвы после 30 суток про ведения опыта была в два раза больше влажности контрольной почвы (15 и 7.4 %, соответст венно). Количество пурпурных бактерий в загрязнённой почве также значительно превосхо дило их количество в контрольной почве. Однако сохранение влаги в почве – не единствен ная причина распространения пурпурных бактерий в почве при нефтяном загрязнении, т. к.
даже при значительном увлажнении незагрязнённой почвы (30.8 и 46.4 %) количество бакте рий Rps. acidophila S1 не достигло количества этих микроорганизмов в почве с дизельным топливом. Развитию этих бактерий в загрязнённой почве может способствовать подавление углеводородами конкурентов (других бактерий) или хищников (амёб, инфузорий), а также накопление доступных субстратов (органических кислот – продуктов неполного окисления алканов). Нельзя исключать непосредственную ассимиляцию углеводородов пурпурными бактериями.
Влияние нефтепродуктов на рост пурпурных бактерий. Возможность ассимиля ции пурпурными бактериями углеводородов. Исследовали влияние дизельного топлива на рост Rps. acidophila S1 на среде ПНБ с малатом и дрожжевым экстрактом на свету в ана эробных условиях. На протяжении пяти пассажей бактерии росли как в отсутствие дизель ного топлива, так и с добавлением его в количестве одного объёмного процента. На среде с дизельным топливом наблюдалось некоторое замедление роста. В третьем пассаже константа скорости деления уменьшилась на 30 % по сравнению с контролем. Это уменьшение было статистически достоверным согласно t – критерию Стьюдента. В четвёртом и пятом пасса жах статистически достоверного уменьшения скорости деления под влиянием дизельного топлива обнаружено не было, следовательно, эти микроорганизмы способны к адаптации к токсическому воздействию нефтепродуктов. При наличии субстрата исследуемые бактерии могут длительное время расти в присутствии такого нефтепродукта, как дизельное топливо.
Бактерии Rps. acidophila S1, Rps. acidophila S5 и Rps. palustris X росли на полной среде ПНБ в присутствии дизельного топлива, смазочного и вазелинового масел, хотя на Rps. palustris Х угнетающее действие оказали дизельное топливо и вазелиновое масло, на Rps. acidophila S5 – смазочное масло.
Бактерии выделенных штаммов пурпурных бактерий не росли на средах с нефтепро дуктами на свету в анаэробных условиях, если эти нефтепродукты вносили в качестве един ственного источника углерода. Потенциальные акцепторы электронов (нитрат, бикарбонат) также не способствовали анаэробному росту на средах с углеводородами.
В анаэробных накопительных культурах (с нитратом и бикарбонатом) также не наблю далось развития пурпурных бактерий на свету. В качестве инокулята для этих культур ис пользовалась почва, загрязненная углеводородами и заселенная пурпурными бактериями (место отбора - в районе г. Сургута и г. Кунгура).
Аэробного роста в темноте у бактерий Rps. acidophila S1, Rps. acidophila S5 и Rps. pal ustris X на углеводородах также не обнаружено. Однако проверка 20 штаммов пурпурных бактерий, выделенных из почв с углеводородным загрязнением, показала, что у бактерий Rps. acidophila M2, Rps. palustris E8 и у бактерий коллекционной культуры Rps. palustris на блюдается медленный рост в темноте на среде с дизельным топливом в качестве единствен ного источника углерода и энергии в аэробных условиях. На поверхности агаризованной среды (минеральный фон ПНБ с 1 об. % дизельного топлива) эти бактерии образовывали бесцветные точечные колонии. Через 14 суток прирост белка у бактерий Rps. acidophila M на жидкой среде с дизельным топливом в качестве единственного источника углерода и энергии в аэробных условиях превысил контроль на 45 %, у Rps. palustris Е8 – на 31 %, у коллекционной культуры Rps. palustris – на 15 %. У трёх других штаммов (Rps. acidophila S1, Rps. acidophila М3 и Rps. rutila МЮ3) увеличение количества белка было статистически не достоверным (согласно t – критерию Стьюдента). Приведённые данные свидетельствуют, что у трёх штаммов пурпурных бактерий есть способность к аэробной ассимиляции дизельного топлива в темноте, однако их рост на дизельном топливе гораздо более медленный по срав нению с ростом родококков и псевдомонад.
Рост пурпурных бактерий на культуральной жидкости грибов. Совместный рост с грибами. Причиной развития пурпурных бактерий в почве при нефтяном загрязнении может быть накопление продуктов неполного окисления углеводородов. Такими продуктами могут быть различные органические кислоты. Для проверки такой возможности пурпурные бакте рии различных штаммов выращивали на культуральной жидкости нефтеокисляющих мице лиальных грибов (на свету, в анаэробных условиях). Бактерии штаммов Rps. acidophila S1, Rps. acidophila S5 и Rps. palustris X росли на культуральной жидкости большей части нефте окисляющих грибов. Рост исследуемых пурпурных бактерий на культуральной жидкости грибов наблюдался также в аэробных условиях в темноте. Бактерии коллекционной культуры Rps. palustris также росли на культуральной жидкости грибов.
Пурпурные бактерии Rps. acidophila S1 могли расти совместно с нефтеокисляющими грибами на свету в микроаэробных условиях при лимите азота. Грибы образовывали поверх ностную пленку, пурпурные бактерии оседали на дно. Эти ассоциации могут, видимо, разви ваться благодаря способности грибов при росте на дизельном топливе в условиях лимита по азоту накапливать в среде органические кислоты. Пурпурные бактерии, в свою очередь, спо собны к азотфиксации и могут ассимилировать органические кислоты. В контроле на среде с дизельным топливом в качестве единственного источника углерода (без нефтеокисляющих грибов) роста исследуемых пурпурных бактерий не наблюдалось.
Создание искусственных ассоциаций нефтеокисляющих микроорганизмов и пурпурных несерных бактерий. Исследовали влияние лизата клеток пурпурных бактерий Rps. acidophila S1 (133 мкг белка/мл среды) на рост бактерий Dietzia maris А2 на среде с ке росином в условиях недостатка азота. Контролем служил рост D. maris на среде с керосином и с нитратом калия, рост на среде с керосином без азота и рост на среде без керосина и без азота, но с добавлением клеточного лизата. Рост D. maris А2 на среде с керосином и лизатом клеток пурпурных бактерий составил 14.8 х 106 клеток/мл и превосходил рост на среде с ке росином без азота (2.7 х 106 клеток/мл среды) и на среде с лизатом без керосина (6.2 х клеток/мл среды), хотя и уступал росту на среде с керосином и с нитратом калия (34.9 х клеток/мл среды). Отличия между вариантами опыта были достоверными согласно t – крите рию Стьюдента. Аналогичные данные получены при замене керосина на бензойную кислоту (0.3 %) – ароматическую кислоту, потребление которой является характерным признаком бактерий D. maris. Таким образом, лизированная биомасса пурпурных бактерий может ком пенсировать недостаток азота в среде при аэробном росте углеводородокисляющей бактерии D. maris А2 на среде с керосином и с бензойной кислотой.
Живые фотоситезирующие бактерии Rps. acidophila S1, адаптированные к фиксации молекулярного азота, оказывали положительное влияние на окисление дизельного топлива бактериями D. maris А2 в микроаэробных условиях на свету при недостатке азота. Исходная концентрация дизельного топлива составляла 59.0 мг/л среды, после 10 суток культивирова ния чистой культуры нефтеокисляющих бактерий D. maris A2 на среде без азота количество дизельного топлива уменьшилось до 46.7 мг/л, после культивирования смешанной культуры D. maris A2 и азотфиксирующих пурпурных бактерий - до 36.4 мг/л.
ВЫВОДЫ 1. Установлено, что фотогетеротрофные пурпурные бактерии являются частью мик робного сообщества почв и грунтов при загрязнении нефтяными углеводородами.
2. Показано, что пурпурные бактерии встречаются в почвах при концентрации углево дородов от 0.4 до 39 %, в грунте – от 0.9 до 4.1 %. При отсутствии углеводородного загрязне ния эти микроорганизмы не обнаружены или представлены единичными клетками в пересчё те на 1 г почвы.
3. Максимальное количество пурпурных бактерий, зафиксированное при загрязнении почвы нефтепродуктами, достигало 0.57 х 106 клеток/г почвы и наблюдалось при концентра ции углеводородов 16.5 %. При загрязнении почвы сырой нефтью максимальная числен ность достигала 7.7 х 106 клеток/г при концентрации нефти 16.1 %. В грунте максимальное количество составило 1.05 х 107 клеток/г при уровне загрязнения 1.8 %.
4. Установлены концентрации углеводородов, подавляющие развитие пурпурных бак терий в почвах и грунте. Эти бактерии не обнаружены в почвах при концентрации углево дородов выше 40 %, а в грунте – при концентрации выше 10 %.
5. Установлено, что количество пурпурных бактерий в почве в летнее время на два три порядка меньше численности аэробных гетеротрофных нефтеокисляющих бактерий и сопоставимо с количеством колониеобразующих единиц нефтеокисляющих мицелиальных грибов. В исследованных почвенных образцах при слабом углеводородном загрязнении (1. – 9.5 %) количество пурпурных бактерий варьировало в диапазоне 1.3 – 130.0 х 103 клеток/г почвы, количество аэробных нефтеокисляющих бактерий – в диапазоне 0.8 – 39.5 х 106 кле ток/г почвы, количество нефтеокисляющих грибов достигало 2.5 – 66.7 х 103 КОЕ/г почвы.
6. Выделенные из нефтезагрязнённых почв чистые культуры фотогетеротрофных пур пурных бактерий на основании морфологических и физиологических признаков отнесены к роду Rhodopseudomonas, к видам Rps. acidophila, Rps. palustris.
7. Среди 20 штаммов пурпурных несерных бактерий, выделенных из загрязненных почв, способность к аэробному росту в темноте на среде с дизельным топливом в качестве единственного источника углерода и энергии обнаружена у Rps. acidophila M2 и Rps. palus tris E8, а также у бактерий коллекционной культуры Rps. palustris. Данные в пользу анаэроб ной ассимиляции углеводородов не получены.
8. Показана возможность роста пурпурных бактерий за счёт органических кислот, обра зуемых в результате неполного окисления нефтепродуктов мицелиальным грибами. Этот факт позволяет объяснить массовое развитие пурпурных бактерий в почве с нефтяным за грязнением.
9. Установлено, что присутствие азотфиксирующих фотогетеротрофных пурпурных бактерий компенсирует недостаток азота в среде и оказывает положительное влияние на окисление углеводородов аэробными гетеротрофными бактериями Dietzia maris.
10. Полученные данные свидетельствуют о возможности использования фотогетеро трофных пурпурных бактерий в качестве индикаторов слабого нефтяного загрязнения почв (1-10 % углеводородов). Кроме того, они могут быть включены в биопрепараты, применяе мые для рекультивации территорий, загрязнённых нефтью и нефтепродуктами.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Драчук С.В., Щербакова О.А., Фирсов Н.Н. Фототрофные бактерии в почвах, загряз нённых нефтепродуктами//Современные проблемы экологии, микробиологии и иммуноло гии: Матер. региональной конф. молодых учёных. – Пермь, 1999. – С. 82.
2. Драчук С.В., Фирсов Н.Н., Маркина А.И., Помаз Н.А., Смирнова Д.Г. Пурпурные не серные бактерии в почвах нефтезагрязнённых территорий//Б.П. Колесников – выдающийся отечественный лесовед и эколог: Матер. научной конф. – Екатеринбург, 1999. – С.33.
3. Драчук С.В., Фирсов Н.Н., Маркина А.И., Помаз Н.А, Смирнова Д.Г. Фототрофные пурпурные бактерии в нефтезагрязнённых почвах//Экология 2000: эстафета поколений: Ма тер. I международной межвузовской школы – семинара. – Москва, 2000. – С. 13-14.
4. Драчук С.В., Маркина А.И., Смирнова Д.Г., Фирсов Н.Н. Роль пурпурных несерных бактерий в природных процессах биодеградации углеводородов//В кн.: Биосфера и человече ство. Сборник матер. конф. молодых учёных, посвящённой памяти Н.В. Тимофеева Ресовского. – Екатеринбург: Изд-во «Екатеринбург», 2000. - С. 80-81.
5. Драчук С.В., Фирсов Н.Н. Пурпурные несерные бактерии в почвах, загрязнённых нефтепродуктами//Автотрофные микроорганизмы: Матер. международной научной конф. – Москва, 2000. – С. 75-76.
6. Драчук С.В., Фирсов Н.Н. Распространение пурпурных несерных бактерий в почвах, загрязнённых нефтепродуктами//Экобиотехнология: борьба с нефтяным загрязнением окру жающеё среды: Матер. научной конф. – Пущино, 2001. – С. 38-39.
7. Драчук С.В., Маркина А.И., Смирнова Д.Г. Роль пурпурных несерных бактерий в биодеградации углеводородов нефти//В кн.: Современные проблемы популяционной, исто рической и прикладной экологии. - Екатеринбург: Изд-во «Екатеринбург», 2001. – С. 62-71.
8. Драчук С.В., Фирсов Н.Н. Деградация углеводородов смешанными культурами неф теокисляющих мицелиальных грибов и пурпурных несерных бактерий//Молодые учёные Волго-Уральского региона на рубеже веков: Матер. научной конф. молодых учёных. – Т.1. – Уфа, 2001. – С. 48-49.
9. Драчук С.В., Морозов А.Е., Захарова И.А., Ельчищева И.Е. Пурпурные несерные бактерии как компонент микрофлоры нефтезагрязнённых почв//Современные проблемы эко логии, микробиологии и иммунологии: Матер. межрегиональной конф. молодых учёных. – Пермь, 2002. – С. 37-38.
10. Драчук С.В., Кокшарова Н.В., Фирсов Н.Н. Микрофлора почв, загрязнённых нефте продуктами//Экология. – 2002. - №2. – С. 148-150.
11. Драчук С.В., Фирсов Н.Н, Морозов А.Е. Фотогетеротрофные пурпурные бактерии в почвах и грунтах, загрязнённых нефтью и нефтепродуктами//Теоретические и практические вопросы мониторинга, предупреждения, ликвидации и рекультивации последствий нефтяно го загрязнения: Матер. научно-практической конф. – Тюмень, 2003. – С. 14 -17.
12. Аткина Л.И., Драчук С.В., Залесов С.В., Лопатин К.И. Опыт использования торфа как адсорбента при рекультивации нефтяных загрязнений//В кн.: Леса Урала и хозяйство в них. Межвузовский сборник научных трудов. – Вып. 24. - Екатеринбург: Изд-во УГЛТУ, 2004. - С. 100 – 107 (в печати).
Драчук Сергей Владимирович ФОТОГЕТЕРОТРОФНЫЕ ПУРПУРНЫЕ БАКТЕРИИ В ПОЧВАХ, ЗАГРЯЗНЁННЫХ УГЛЕВОДОРОДАМИ Автореферат Подписано в печать. Формат 60х84 1/16.
Набор компьютерный. Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1.
Тираж 100 экз. Заказ №. Печать офсетная.
Отпечатано в ИПЦ “Изд-во УрГУ”.
г. Екатеринбург, ул. Тургенева, 4.