Неоадьювантная комбинированная химиотерапия рака молочной железы животных с использованием адриамицина, циклофосфамида и бинарной каталитической системы терафтал+аскорбиновая кислота
На правах рукописи
КАЛИШЬЯН Михаил Сергеевич Неоадьювантная комбинированная химиотерапия рака молочной железы животных с использованием адриамицина, циклофосфамида и бинарной каталитической системы «Терафтал+аскорбиновая кислота» 03.00.04 - биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
МОСКВА, 2009 г.
1
Работа выполнена в лаборатории комбинированной терапии опухолей НИИ ЭД и ТО РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН (г.Москва) Научные руководители:
профессор, доктор медицинских наук Елена Михайловна Трещалина профессор, доктор биологических наук Елена Васильевна Лукашева
Официальные оппоненты:
Концевая Светлана Юрьевна, профессор, доктор ветеринарных наук Шишкин Сергей Сергеевич, профессор, доктор биологических наук
Ведущая организация: Институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, РАМН
Защита состоится «18» декабря 2009 г. в 14. 00 на заседании диссертационного совета Д212.203.13 при Российском университете дружбы народов по адресу:
117198, г. Москва, ул.Миклухо-Маклая, д.8.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул.Миклухо-Маклая, д.6.
Автореферат разослан «16» ноября 2009 года.
Учёный секретарь диссертационного совета Д212.203. доктор биологических наук, Е.В. Лукашева профессор
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы Спонтанные опухоли собак отличаются от таковой патологии у человека значительно больше, нежели опухоли мышей. Наиболее существенные отличия обусловлены анатомо физиологическими особенностями молочных желез человека и собаки (количество, тип кровоснабжения и лимфообращения), рецепторным статусом, разной частотой эстральных циклов и чрезвычайно низкой чувствительностью к химио- и гормонотерапии РМЖ собак.
В то же время, схожая частота заболеваемости, тип рецидивирования и метастазирования, позднее обращение за первичной онкологической помощью даёт основания для исследования возможности переноса наиболее эффективных методик из гуманитарной клиники в ветеринарную с использованием доклинического изучения на опухолевых моделях у мышей [Аксель Е.М., Давыдов М.И., 2002 г.].
Одним из путей достижения операбельности развившегося неоперабельного РМЖ является предоперационное лечение (неоадьювантная терапия), направленная, прежде всего, на уменьшение массы первичной опухоли (циторедукция) с возможным уменьшением объема последующего оперативного вмешательства. Вторичными целями неоадьювантного лечения являются увеличение общей и безрецидивной выживаемости больных при ингибировании субклинических микрометастазов, а также определение чувствительности опухоли к цитостатикам для выбора схемы адьювантного лекарственного лечения [Тюляндин С.А. 2004 г.] Схемы с включением антрациклинов (доксорубицин, эпирубицин) в настоящее время являются одними из наиболее популярных комбинаций неоадьювантной химиотерапии.
Применение этих режимов позволяет добиться циторедуктивного эффекта у 50–75% пациенток, однако частота лечебного патоморфоза IV степени достигает лишь 10–15% [Bear H. D., Anderson S., Brown A. et al., 2001]. Основным путем поиска возможностей улучшения результатов лечения является внедрение в классические схемы лечения новых химиопрепаратов [Семиглазов В.Ф., Семиглазов В.В., Клетсель А.Е., 2005 г.].
Цель исследования Изучить эффективность неоадьювантной химиотерапии с использованием схемы химиотерапии адриамицин+циклофосфамид (АС) и бинарной каталитической системы терафтал + аскорбиновая кислота (БКС) на моделях опухолевого роста с различными биохимическими, иммунологическими и видовыми характеристиками.
Задачи исследования:
Изучить чувствительность и прогностическую значимость 1.
экспериментальных моделей РМЖ для выбора тактики неоадьювантной химиотерапии РМЖ собак по схеме АС..
2. Исследовать эффективность неоадьювантной химиотерапии по схеме АС+БКС на развившейся перевиваемой аденокарциноме молочной железы мышей (РЭ+, Her2?) у иммунокомпетентных мышей.
3. Определить эффективность неоадьювантной химиотерапии по схеме АС+БКС на подкожных ксенографтах рака молочной железы человека (РЭ-, Her2+) у иммунодефицитных мышей.
4. Изучить эффективность неоадьювантной химиотерапии по схеме АС+БКС на неоперабельном спонтанном раке молочной железы собак (РЭ+/-;
Her2?).
Научная новизна Впервые в неоадьювантном режиме на различных моделях РМЖ изучена эффективность химиотерапии с использованием комбинации АС и нового противоопухолевого сочетания бинарной каталитической системы - (БКС) терафтал+аскорбиновая кислота (ТФ+АК).
Впервые эффективность комбинированной химиотерапии с использованием БКС изучена на РМЖ животных, отличающихся видовыми, иммунологическими и биохимическими характеристиками, в том числе, статусом рецепторов эстрогенных гормонов (РЭ) и эпидермального фактора роста (Her2/neu).
Впервые на мышах с подкожно перевитой аденокарциномой молочной железы Са755 определены эффективные и переносимые дозы и последовательность применения БКС и АС при комбинированном неоадьювантном лечении.
Впервые на мышах с перевиваемой аденокарциномой молочной железы Са (РЭ+, Her2-) показано, что применение БКС в сочетании с АС в неоадьювантном режиме позволяет достоверно в 1,3 раза повысить общую эффективность лечения за счет усиления циторедукции и достижения значимого лечебного патоморфоза 3-4 ст.
без усиления побочного действия.
Впервые на мышах с подкожными ксенографтами рака молочной железы человека SKBR3 (РЭ-, Her2+) и показано, что в неоадьювантном режиме схема АС+ БКС при удовлетворительной переносимости лечения не дает терапевтического выигрыша против схемы АС в терапевтических дозах.
Впервые у собак со спонтанным неорперабельным РМЖ II-III ст. (РЭ+-, Her2?) при неоадьювантном лечении показано, что АС или АС+БКС оказывают практически одинаковое противоопухолевое действие в виде стабилизации процесса без значимой циторедукции опухолевой массы без терапевтического выигрыша для схемы АС+БКС.
Впервые показана плохая переносимость неоадьювантной химиотерапии у собак по схемам АС и АС+БКС в терапевтических дозах с характерными для схемы АС побочными эффектами.
Впервые установлена взаимосвязь между эффективностью неоадьювантной химиотерапии по схемам АС или АС+БКС и рецепторным статусом опухолей различной природы.
Впервые охарактеризованы терапевтические дозы АС, БКС и АС+БКС и переносимость комбинированной неоадьювантной терапии в сравнительном аспекте АС+БКС на различных моделях РМЖ.
Впервые установлена прогностическая значимость подкожных ксенографтов рака молочной железы человека линии SKBR3 (рецепторный статус РЭ-, Her2+) у иммунодефицитных мышей для определения показаний к Balb/c nude неоадьювантной химиотерапии спонтанного РМЖ собак.
Научно-практическая значимость Достоверный 30%-ный терапевтический выигрыш, в том числе на уровне лечебного патоморфоза 3-4 ст., схемы АС+БКС в сравнении со стандартной схемой АС на развившейся аденокарциноме молочной железы Са755 мышей (РЭ+, Her2-) вляется экспериментальным обоснованием клинического изучения схемы АС+БКС при НАХТ неоперабельного РМЖ у онкологических пациентов.
Наличие рецепторного статуса (РЭ+, Her2-) в модели РМЖ мышей Са755, чувствительной к неоадьювантной химиотерапии по схеме АС+БКС, и отсутствие чувствительности в модели РМЖ человека SKBR3 (РЭ-, Her2+++) дает основания для стратификации пациентов по рецепторному статусу опухоли (РЭ+, Her2-) при включении в Протокол клинического изучения.
Отсутствие чувствительности и плохая переносимость неоадьювантной химиотерапии по схеме АС для лечения РМЖ II-III ст. (РЭ+/-, Her2?) у собак является обоснованием для исключения этого вида лечения из практических рекомендаций к применению.
Данные о различной чувствительности доклинических моделей РМЖ в зависимости рецепторного статуса к новой схеме химиотерапии, модифицированной бинарным воздействием, являются новым научным феноменом, который имеет практическую ценность для экспериментального изучения новых схем комбинированного лечения злокачественных опухолей, имеющих прогностически значимый рецепторный статус.
Предпринятый методический подход доклинического и клинического изучения новой схемы комбинированной химиотерапии неоперабельного РМЖ на различных видах животных с использованием алгоритма, принятого в гуманитарной практике, позволяющий на доказательном уровне оценить эффективность лечения и прогностическую значимость использованных моделей, может быть рекомендован для подготовки клинической апробации новых схем лечения в онковетеринарии.
Внедрение Полученные в работе положительные доклинические результаты об эффективности новой схемы НПХТ РМЖ с использованием АС и БКС являются обязательным фрагментом Протокола клинического изучения у онкологических пациентов с соответствующей патологией. Отрицательные результаты по изучению стандартной схемы АС при НПХТ РМЖ II-III ст. у собак являются основанием для исключения этой схемы лечения из практических рекомендаций в ветеринарии.
Апробация диссертации Основные положения диссертации доложены на:
Третьей Всероссийской конференции по вопросам онкологии и 1) анестезиологии мелких домашних животных, Москва, 2007 г.
VI Всероссийской научно-практической конференции 2) «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 2007 г.
На межлабораторной конференции НИИ ЭДиТО и НИИ КО РОНЦ 3) им.Н.Н.Блохина РАМН 15 октября 2009 г.
Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста и состоит из введения, главы «обзор литературы», главы «материалы и методы», 2 глав собственных результатов, выводов, списка литературы, списка сокращений. Список литературы включает публикацию, из них 112 отечественных и 169 иностранных источников. Работа иллюстрирована 19 рисунками 12 таблицами и 2 схемами.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материал и методы Лабораторные животные Обычные мыши: использовали 520 мышей-самок линии C57BL6 и гибридов BDF1 массой тела 18-22 г. Мышей содержали в виварии РОНЦ. Перед опытом мышей в соответствии с размером опухоли ранжировали по группам (n=7-30). Одну группу оставляли контрольной, вводили внутрибрюшинно (в/б) однократно физ. раствор хлорида натрия.
Другие группы получали различную терапию. Группа сравнения получали каждое воздействие в монорежиме в оптимальных дозах и схеме применения.
Иммунодефицитные мыши: использовали 48 мышей-самок Balb/c nude 8-10 нед массой тела 20-22 г. разведения РОНЦ. Мышей содержали в специализированном отсеке РОНЦ с соблюдением конвенциональных условий. В каждом опыте 4 группы по 9-11 мышей.
Группы контроля (n=9) получали однократно внутривенно (в/в) по 0,6 мл физ. раствор хлорида натрия.
Опухолевые модели Аденокарцинома молочной железы мышей Са755: штамм из криохранилища Банка РОНЦ, иммуногенная, неметастазирующая опухоль, обладает гормональной зависимостью [Кубасова И.Ю – 1994, Софьина З.П., Сыркин А.Б., Голдин А. и др., 1979 г.]. Доноры – мыши-самки линии С57BL6, в опытах использовали мышей-самок BDF1 [Трещалина Е.М., Жукова О.С, Герасимова Г.К., 2005 г.]. Перед началом эксперимента в опухолях контролировали уровень РЭ.
П/к ксенографты РМЖ человека SKBR Из Банка РОНЦ использовали адаптированную к росту in vivo клеточную линию гормононезависимого рака молочной железы человека SKBR3 с высокой экспрессией рецептора эпидермального фактора роста Her2/neu. Имплантацию опухоли выполняли под кожу бока каждой мыши по 1,5 млн. клеток. В клетках опухоли до имплантации проводили прижизненную окраску трипановым синим, число жизнеспособных клеток составляло 90-95% и определяли экспрессию Her2/neu.
Схема лечения Са755 и SKBR Лечение начинали при Vcp=0,5-0,75 мм3, затем на 4 сутки у всех мышей оценивали эффективность и делили группу на 2 подгруппы: 1-ю оперировали, опухоли удаляли, фиксировали в нейтральном формалине и подвергали патоморфологическому исследованию для верификации лечебного патоморфоза;
2-ю не оперировали и оставляли под наблюдением для контроля роста опухоли и оценки эффективности лечения.
Биохимические характеристики опухолевых моделей: 1)определение уровня РЭ и белка по методу Лоури [Bergert J., Anderson R., Wilson D. 1990] в лаб. клин. биохимии НИИ КО РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН при консультативной помощи проф. Е.С.Герштейн.
2)контроль экспрессии HER2/neu контролировали в культурах клеток, использованных для первых пассажей опухолей, а также в стандартных гистологических срезах опухолей всех пассажей.
Иммуногистохимическое исследование: проводили по стандартной пероксидазной методике с использованием стрептавидин-биотиновой системы визуализации с первичными антителами А0485, в качестве системы детекции выбран набор EnVision+, в качестве хромогена – ДАБ+ (все реактивы «Dako», Дания). Оценку результатов окрашивания проводили с использованием общепринятых критериев (Food and Drug Administration, FDA, США).
Методика патоморфологического исследования опухолей: стандартная, окраска парафиновых срезов µк гематоксилин-эозином, срезы просматривали и 8- фотографировали в микроскопе «Поливар» (Австрия). На срезах оценивали число клеток с признаками апоптоза, число митозов и площадь некрозов. Соотношение морфологических признаков пролиферации и гибели клеток определяли как степень лечебного патоморфоза (ЛП).
Исследуемые препараты и условия введения Адриабластин (Адр) (Фармация и Апджон, Италия) или доксорубицин (Доксо) (ТЭВА, Польша), мышам вводили в/б однократно в дозах 3-8 мг/кг в физиологическом растворе.
Собакам вводили однократно в/в струйно в дозе 30 мг/м2.
Циклофосфамид (циклофосфан (ЦФ) быстрорастворимый Лэнс, РФ) мышам вводили в/б однократно в дозах 50 или 100 мг/кг в физиологическом растворе. Собакам вводили в/м однократно в дозе 240 мг/м2.
Бинарная каталитическая система: ТФ-ЛИО сер.01.02.05 и 030506 получен из РОНЦ во флаконах по 50 мг. Мышам вводили в/в однократно в дозе 30 мг/кг за 1 час до АК. АК – аптечный препарат 5% раствор для инъекций и вводили в/в однократно в дозе 66 мг/кг через 1 час после ТФ. Мышам с Са755 проведено 2 цикла лечения с интервалом 6 дней. Собакам вводили ТФ в/в однократно капельно в дозе 90 мг/м2, а затем через 45 минут - АК в/в однократно капельно в дозе 190 мг/м2. Внутривенные инъекции проводили через периферический катетер. Проведено 2 цикла лечения с интервалом 14 дней.
Дексаметазон вводили собакам в/м по мг для премедикации (KRKA) анафилактогенного действия Доксо и ТФ.
Все инъекционные растворы готовили ex tempore. Последовательность введения препаратов была одинаковой: первым вводили ТФ, затем через минут одновременно последовательно Адр (Доксо) и ЦФ, затем через 30 минут АК. Адр вводили после ТФ, учитывая возможную конкуренцию за мишень (-адренорецепторы) на клетках опухолей.
Оценка противоопухолевого эффекта у мышей: стандартная, использовали критерий ТРО%, время удвоения объема опухоли «», регрессию опухоли по соотношению объемов до и после лечения Vt/Vo [Chabner BA, Longo DL. - 2001].
Переносимость воздействия: в период наблюдения оценивали состояние и поведение животных, следили за гибелью.
Собаки со спонтанными опухолями молочной железы: исследование проведено у 30-ти собак со спонтанным РМЖ, которые были отобраны при амбулаторном приёме Станции по борьбе с болезнями животных Сев. администр. округа г.Москвы. Информированное согласие владельцев получено, каждому животному заведена история болезни и присвоен номер индивидуальной регистрационной карты (ИРК) в настоящем исследовании. Для проведения исследования разработан Протокол, в рамках которого использованы все позиции, включенные в аналогичный документ гуманитарной онкологии. Критерии включения пациентов в исследование: собаки различных пород и беспородные с отсутствием метастазов в органах и лимфоузлах, подтвержденным пальпаторным обследованием УЗИ;
качество жизни шкале R-графически, 2 (по ECOG), верифицированное при клиническом и инструментальном обследовании (ЭКГ, клинический и биохимический анализы крови, to тела, ЧСС, АД, частота дыхания.
Измерение исходных размеров проводилось при помощи штангенциркуля.
Группа 1. Основная: собаки с неоперабельным РМЖ II-III ст. (n=10), которые получали по 2 цикла НПХТ по схеме АС+БКС. Средний возраст 9,5±1,2 г, для наибольшего опухолевого узла Vcp=306±349 см3.
Группа 2. Контроль эффективности лекарственного лечения: собаки различных пород с неоперабельным РМЖ II-III cт. (n=10), которые получали по 2 цикла НПХТ по схеме АС.
Средний возраст 9,8±1,4 г, для наибольшего опухолевого узла Vcp=306±153 см3.
Группа 3. Контроль эффективности оперативного лечения: собаки различных пород с операбельным РМЖ опухолями (n=10), которым была выполнена унилатеральная мастэктомия без специфического противоопухолевого лечения. Средний возраст 10,5±1,5 г. 9,8±1,4 г, для наибольшего опухолевого узла Vcp=276,9±164,7 см Схема НПХТ собак: для введения собакам использованы вышеописанные препараты.
После премедикации вводили сначала Доксо, затем последовательно ЦФ, через 30 минут – ТФ и через 40 минут АК.
Оперативное лечение собак: удаление опухолей проводили в операционном блоке с соблюдением абластики и антибластики по общепринятой методике.
Оценка результатов лечения собак: проводилась по объективным критериям ВОЗ: ЧР или ПР. При отсутствии отрицательной динамики новообразования или уменьшения размеров 50% констатировали СТ процесса. Случаи СТ с объективным уменьшением зоны инвазии и перифокального воспаления при увеличении подвижности новообразования под кожей расценивали, как операбельные. Контроль эффективности выполняли на сутки после окончания 2-х циклов лечения. При достижении ЧР или ПР оценивали степень лечебного патоморфоза в биоптатах опухоли по стандартной методике, которые подвергали патоморфологическому исследованию как описано выше для мышей.
Симптоматическая терапия: для купирования клинических признаков токсичности применяли: пиридоксина гидрохлорид в/м по 0,05 г 1 раз в сутки;
церукал в дозе 0,1 мг/кг в/м 1-3 раза в сутки;
преднизолон 0,3 мг/кг 1-3 раза в сутки, энап 2,5-5,0 мг 1 раз в сутки внутрь;
супрастин в/м 0,5-1,0 мл 2 раза в сутки. При невозможности продолжения НАХТ назначали паллиативную терапию: эмицидин 2,5 мг/кг 2 раза в сутки, лигфол 0,1 мл/кг 1 раз/нед.
Статистическая обработка данных: проведена с помощью стандартного метода Фишера Стьюдента в модификации Р.Б.Стрелкова, определены доверительные интервалы средних сравниваемых величин.
СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ Изучение эффективности неоадьювантной ХТ Са755 по схеме АС+БКС (2 цикла). Для проведения полноценного лечения опухоли с периодом экспоненциального роста до дн. и исключения кумуляции гематотоксичности на 3 сутки, 1-й цикл АС проведен на сутки роста опухоли при Vcp=288-314 мм3, а 2-й цикл - через 6 дней (10-е сутки роста).
Это обеспечивало также контроль эффективности не менее 14 дней, что необходимо для оценки результата лечения.
Результаты: показано (таблица 1), что в основной группе, получившей лечение АС+БКС, уже сразу после окончания 1 цикла лечения достигнуто достоверное ингибирование роста опухоли: ТРО=66% (p0,05), а затем время удвоения опухоли было пролонгировано в 3, раза: =6,5, К=3,3.
Таблица 1. Эффективность НАХТ по схеме (2 цикла через 6 дней) Относительный объем опухоли (Vt/Vo), сутки Показатели эффективности После лечения После лечения До Группа лечения 1-й цикл 2-й цикл 1-й цикл 2-й цикл 1* К** 2 К 0 4 4 1,0 3,0 9,4 16, контроль (физ. раствор) 2,0 - 7,0 1,0 2,4 4,6 10, Доксо 3 мг/кг+ЦФ 50 мг/кг 3,0 1,5 11,4 1, ТФ 30 мг/кг + АК 66 мг/кг 1,0 1,4 4,5 16,2 5,0 2,5 11,2 1, Доксо 3 мг/кг+ЦФ 50 мг/кг 1,0 1,1 3,2 7,9 6,5 3,3 13,0 1, ТФ 30 мг/кг ++АК 66 мг/кг Примечания: *Время удвоения размеров опухоли (дни), – до 2-кратного объема, 5 – до 5-кратного объема;
**К–коэффициент усиления противоопухолевого эффекта ( опыта/ контроля);
***Различия с группой контроля достоверно, p0,05.
Контроль эффективности АС и БКС показал, что несмотря на относительно небольшие опухоли и интенсификацию лечения (2 цикла) эффективность по показателю ТРО была невысокой и отмечалась только после 2-цикла лечении, ТРОmax=68 и 55%, соответственно. Скорость рост опухоли в этих группах отставала от контроля не более чем в 2 раза, о чем свидетельствуют, 13,0 дней, К2,5. Переносимость всех видов лечения была удовлетворительной, каких-либо побочных эффектов или гибели от токсичности не наблюдали. Оценка лечебного патоморфоза (ЛП) в Са755 после НАТХ по схеме АС+БКС представлена на рисунках 1-3.
.
Рис. 3. АС+БКС. ЛП=3–4 ст.
Рис. 2. БКС. ЛП=2 ст.
Рис. 1. АС. ЛП=3 ст.
S некроза = 65–80% S некроза = 35–55% S некроза = 40–60% Митозы = 0,5–1,0% Митозы = 1,0–1,5% Митозы = 1,5% Апоптоз = 15–17% Апоптоз = 12–15% Апоптоз = 0,5% Изучение эффективности НАХТ по схеме AС+БКС на SKBR3 человека. 2-й этап доклинического изучения комбинации проведен на менее чувствительной к химиотерапии модели. До начала экспериментов была проведена верификация отсутствия гормональной зависимости SKBR3 и верификация Her2-рецепторного статуса (таблица 2).
Таблица 2. Результаты определения РЭ на клетках SKBR3.
Индивидуальное значение SKBR3 Mcpd (n=8)* фмоль/мг 7,9 6,2 0 3,7 4,1 5,0 3,1 9,0 3,4[0,65,2] белка Примечание: *среднее значение с доверительным интервалом Видно, что в группе наблюдений (n=8) число РЭ в SKBR3 в утренние часы существенно колеблется и составляет от нуля до максимального значения 9,0 фмоль/мг с большим разбросом, среднее значение показателя 3,4±2,8 фмоль/мг. Уровень РЭ свидетельствует об отсутствии гормональной зависимости опухоли.
Определение экспрессии рецепторов эпидермального фактора роста в SKBR3 показало гиперэкспрессию HER2+++, что соответствует инокуляту. Гиперэкспрессия HER2 в опухолевых клетках сохраняется на протяжении 13-ти пассажей in vivo и верифицированы в сравнении с рецептор-негативным штаммом РМЖ хранения Банка РОНЦ (рисунки 4а, б).
Рисунок 4а. SKBR3 – гиперэкспрессия HER2/neu+++ Рисунок 4б. РМЖ-4 – отсутствие гиперэкспрессии HER2/neu Из результатов НАХТ (таблица 3)следует, что БКС практически не меняет ответ опухоли на лечение: соотношение Т/С в группах АС и АС+БКС было одинаковым (50%), время удвоения опухоли составило 13 и 14 дней, соответственно.
Таблица 3. Эффективность НАХТ по схеме АС+БКС на SKBR3 человека Относительный объем опухоли (Vt/Vo) на сутки после воздействия Группа * К** 0 4 7 11 Контроль (физ. раствор) 1,0 1,7 2,0 3,5 4,7 7,0 Доксо 5,0 мг/кг в/б + 1,0 1,1 1,4 1,5 2,6 13,0 1, ЦФ 100 мг/кг в/б ТФ 30 мг/кг + 1 час + 1,0 1,3 1,8 2,2 3,9 10,0 1, АК 66 мг/кг ЦФ+Доксо+БКС 1,0 1,0 1,3 1,3 2,3 14,0 2, Приложение: * - время удвоения опухоли;
К**- коэффициент усиления эффекта Патоморфологическое исследования показало, что проведенное лечение вызывает слабый ЛП=2ст., соответствующий достигнутому уровню противоопухолевого эффекта при применении схемы АС+БКС в сравнении с АС: площадь некроза 5-10% против 5-8%, число митозов 1-2 против 2-3, количество клеток с признаками апоптоза 1–2% (рисунки 5а, б, в). Таким образом, значимый ЛП не достигнут ни в одном случае.
Рис. 5а. АС. ЛП=2 ст. Рис. 5б. БКС. ЛП=2ст. Рис. 5 в. АС+БКС. ЛП=2 ст.
S некроза = 5–8% S некроза 5-8% S некроза = 5–10% Митозы = 2–3% Митозы = 2-6% Митозы = 1–2% Апоптоз = 1–2% Апоптоз = 1-2% Апоптоз = 1–2% Полученные данные свидетельствуют о том, что SKBR3 (Her2+++, РЭ-) является агрессивной опухолью и при позднем лечении (неоадьювантный режим) характеризуется крайне низкой чувствительностью как к стандартной полихимиотерапии по схеме АС, так и к новой схеме АС+БКС.
Результаты НАХТ по схеме AС+БКС у собак со спонтанным РМЖ II-III cт.
Эффективность 2-х циклов лечения по схеме АС+БКС оценена у всех собак. У одной собаки (10%) после 1-го цикла лечения получена ЧР=69% (V0=69,7 мм3;
Vt=24,2 мм3). У одной собаки (10%) зарегистрировано увеличение подвижности наибольшего опухолевого узла справа под кожей и уменьшение зоны инфильтративного воспаления на фоне стабилизации роста опухоли. Положительная динамика степени инвазии опухоли в результате лечения была расценена, как условная СТ и послужила основанием для радикальной унилатеральной мастэктомии справа. При спокойном послеоперационном периоде в течение последующих 40-а дней у собаки отмечено появление новых опухолевых узлов в 3-й, 4-й и 5-й молочных железах левой контрлатеральной гряды. От дальнейшего лечения собаки владельцы отказались. У остальных 8-ти собак (80%) после 2-х циклов лечения наблюдалась СТ процесса без значимой положительной динамики состояния наибольшего опухолевого узла, достаточной для проведения оперативного вмешательства.
Таким образом, в результате лечения 10-ти собак с неоперабельным РМЖ II-III ст.
эффективность НАХТ по схеме АС+БКС достигнуты следущие противоопухолевые эффекты: ЧР=10%;
СТ=80%, в том числе не значимая ЧР с уменьшением зоны инвазии (10%) (таблица 4).
Переносимость лечения по схеме АС+БКС оценена у всех 10-ти собак. У 2-х собак (20%) на 12 сутки после 2-го цикла лечения отмечались кратковременно выраженная одышка, слабость, анорексия, по поводу которых предпринято симптоматическое лечение. У одной собаки (10%) выявлены симптомы сердечной недостаточности, характерные для схемы АС, собака пала при явлениях острой сердечной недостаточности. У 7-ми собак (70%) побочных эффектов не отмечено. Таким образом, большинство животных перенесли цикла лечения в полных дозах без проявлений лимитирующей токсичности. Отмечены единичные побочные эффекты, характерные для схемы АС, в одном случае приведшие к гибели животного.
Таблица 4. Эффективность и переносимость НАХТ по схеме АС+БКС при РМЖ собак Показатель эффективности Численность группы Гибель от ЧР СТ Операбельность токсичности n=10 1/10(10%) 8/10(80%) 1/10(10%) 1/10(10%)* Примечания: *Кардиотоксичность, характерная для АС.
Результаты НАХТ по схеме АС у собак со спонтанным РМЖ II-III ст. Эффективность 2-х циклов лечения по схеме АС оценена у всех собак Показано, что терапевтический эффект лечения заключался в достижении СТ=90% без значимой положительной динамики состояния наибольшего опухолевого узла, достаточной для проведения оперативного вмешательства. У одной собаки (10%) после 1 цикла лечения зарегистрировано увеличение подвижности наибольшего опухолевого узла справа под кожей и уменьшение зоны инфильтративного воспаления на фоне стабилизации роста опухоли, расчененное, как условная СТ. Положительная динамика степени инвазии опухоли, послужила основанием для радикальной унилатеральной мастэктомии справа. Послеоперационный период спокойный в течение 40 дн., отмечен рецедив опухоли. Собака была подвергнута владельцами эвтаназии через 8 мес после вмешательства по причине ухудшения общего состояния с выраженной анорексией.
Таблица 5. Эффективность и переносимость НАХТ по схеме АС при РМЖ собак Показатель Численность группы Гибель от ЧР СТ Операбельность токсичности n=10 0/10(0%) 9/10(90%) 1/10(10%) 0/10(0%) В третью группу, получавшую только хирургическое лечение, были отобраны 10 собак с развившимся операбельным РМЖ. Эти собаки были прооперированы с целью возможной патоморфологической верификации эффективности лечения в группах лекарственной терапии.
Таким образом, проведенное на собаках исследование показало, что при комбинированном лечении по схемам АС+БКС или АС, эффективность неоадьювантной терапии была практически одинаковой и недостаточной для значимого циторедуктивного эффекта, определяющего операбельность опухоли. Основной противоопухолевый эффект у 90% собак в обеих группах - СТ процесса. ЧР=10% достигнута только в группе АС+БКС. Условная операбельность значимой циторедукции опухоли при (без уменьшении зоны инвазии и неспецифического воспаления) получена только у одной собаки в каждой из сравниваемых групп (10%). Степень ЛП в обеих группах также практически одинакова (площадь некроза 5-10%, число клеток с признаками апоптоза 0,5%, число митозов 1-3%). Таковая же картина наблюдается и в опухоли оперированных собак, не подвергавшихся какому-либо виду терапии. Переносимость лечения по новой схеме АС+БКС, в основном, удовлетворительная. Большинство животных перенесли цикла лечения в полных дозах без лимитирующих проявлений токсичности. В этой группе, равно, как и в группе, получившей лечение по схеме АС, отмечены единичные кратковременные побочные эффекты, характерные для химиотерапии. Однако одна собака в группе АС+БКС погибла от кардиотоксичности. Таким образом, неоадьювантная комбинированная химиотерапия с использованием схемы АС+БКС не дает преимуществ перед схемой АС при лечении развившегося неоперабельного РМЖ собак (РЭ+/-;
Her2?) и не дает значимого циторедуктивного эффекта, как клинически, так и морфологически, но может усилить побочные эффекты схемы АС.
Таблица 6. Сравнение схем АС+БКС и АС при проведении НАХТ у собак с РМЖ Числен Схема ность ЧР СТ Патоморфоз Операбельность Переносимость группы 90% -удовлетво АС+БКС 1 ст.
10 1/10(10%) 9/10(90%) 1/10 (10%)* рительная, 1 гибель АС 1 ст. Удовлетворительная 10 1/10(10%) 9/10(90%) 1/10 (10%)* Примечание:*достигнута условно по уменьшению зоны инвазии при ЧР.
Обсуждение полученных результатов. Исследование выполнено по программе доклинического изучения [Трещалина Е.М., Жукова О.С, Герасимова Г.К., Андронова Н.В., Гарин А.М.-2005]. Для исследования использованы злокачественные опухоли молочной железы у животных с различными биохимическими характеристиками (наличие прогностически значимых рецепторов эстрогенных гормонов РЭ и эпидермального фактора роста Her2/neu), различным происхождением (перевиваемые и спонтанные), в условиях наличия или отсутствия противоопухолевого иммунитета (иммунокомпетентные и иммунодефицитные мыши), а также видовой специфичности (опухоли мышей, собак и человека) оценена сравнительная эффективность и переносимость неоадьювантной химиотерапии с использованием стандарта лечения РМЖ схемы АС и новой бинарной каталитической системы ТФ+АК. Наличие различного рецепторного статуса моделей было определяющим в этом исследовании, т.к. химиотерапия в неоадьювантном режиме с целью циторедукции для достижения операбельности назначается пациентам независимо от рецепторного статуса опухоли [Семиглазов В.Ф., Арзуманов А.С., А.А.Божок – 2003].
Актуальность исследования связана как с отсутствием подходов к неоадьювантной химиотерапии спонтанного неоперабельного РМЖ собак, но и также с отсутствием методической базы для доклинического изучения новых схем лечения этой патологии, связанной с комбинированной химиотерапией.
Показано, что 2 цикла НАХТ по схеме АС+БКС в терапевтических дозах при последовательном введении мышам с Cа755 (РЭ+;
Her2-), исходно чувствительной к схеме АС, приводит к значимой циторедукции развившейся опухоли, регистрируемой на клиническом и морфологическом уровне. Результаты по эффективности схемы АС – стандарта лечения РМЖ в неоадьювантном режиме [Kaufmann M., 2005] дают возможность считать использованную модель адекватной по чувствительности РМЖ человека. Что касается РМЖ собак, то положительные эффекты, полученные на этой модели, могли быть значимыми также для РМЖ собак (РЭ+/-;
Her2?), поскольку их рецепторный статус близок.
Исследования, выполненные на малочувствительной к химиотерапии модели РМЖ человека – подкожных ксенографтах SKBR3 (РЭ-;
Her2+) у иммунодефицитных мышей Balb/c nude показали полное отсутствие противоопухолевого эффекта обеих схемы АС и АС+БКС в неоадьювантном режиме, подтвержденное морфологически. Использованная модель является наиболее близкой по агрессивности роста первичной опухоли, но отличается по известному рецепторному статусу от РМЖ собак (РЭ+/-;
Her2?).
Поскольку прямой аналогии по свойствам использованных моделей перевиваемых опухолей мышей и человека спонтанного РМЖ собак нет, оба полученных на этих моделях результата были учтены только при обсуждении лечения, проведенного собакам.
Оказалось, что, несмотря на большее совпадение рецепторного статуса с моделью Са755, только SKBR3 прогнозировала отсутствие противоопухолевого эффекта на клиническом и морфологическом уровне для неоадьювантной терапии РМЖ собак.
Таким образом, в результате исследования, выполненного с привлечением разнообразных моделей опухолевого роста, прогностически значимыми для неоадьювантной химиотерапии РМЖ собак являются подкожные ксенографты SKBR3 у иммунодефицитных мышей.
Для практической ветеринарии важно также, что схема АС, рекомендованная для лечения РМЖ собак, в основном, в адьювантном режиме, не пригодна для неоадьювантного лечения первичной опухоли.
На основании полученных данных схема АС+БКС представляется перспективной для клинического изучения в неоадьювантном режиме при данной патологии у человека.
Отдельные наблюдения эффективности БКС при клиническом изучении по 1 фазе, продемонстрировавшие положительные результаты при РМЖ, также могут быть использованы в качестве дополнительного обоснования для такой рекомендации.
ВЫВОДЫ 1. Аденокарцинома молочной железы мышей Са755 (РЭ+, Her2?) чувствительна к неоадьювантной химиотерапии по схеме АС (адриамицин+циклофосфамид) и к БКС (бинарной каталитической системе) и высокочувствительна к сочетанию АС+БКС.
2. Эффективность неоадьювантного лечения Ca755 (РЭ+, Her2?) с использованием химиотерапии по схеме АС+БКС заключается в существенном циторедуктивном действии с выраженным лечебным патоморфозом при удовлетворительной переносимости.
3. Терапевтический выигрыш эффективности 2-х курсов неоадьювантного лечения по схеме АС+БКС в переносимых терапевтических дозах заключается в достоверном увеличении ТРО до 80% (p0,05) и развитии лечебного патоморфоза 3-4 степени в виде интегрального увеличения некротической и апоптотической гибели опухолевых клеток, обуславливает клиническую перспективность комбинации при гормоночувствительном раке молочной железы (РЭ+) при отсутствии данных об экспрессии рецепторов Her2.
4. Модель рака молочной железы человека SKBR3 (РЭ-, Her2+++) в виде подкожных ксенографтов отличается слабой чувствительностью к неоадьювантной химиотерапии по схемам АС или АС+БКС без циторедукции опухолевой массы.
5. Неоадьювантная терапия по схемам АС и/или АС+БКС не эффективна при спонтанном РМЖ собак (РЭ+/-;
Her2?).
6. Прогностически значимой для доклинического изучения новых схем неоадьювантной химиотерапии спонтанного РМЖ собак (РЭ+/-;
Her2?) является модель рака молочной железы человека SKBR3 (РЭ-, Her2+++).
Список опубликованных работ 1. Андронова Н.В., Калишьян М.С., Николаев А.Л., Герасимова Г.К., Гопин А.В., Филоненко Д.В., Калия О.Л., Ворожцов Г.Н. Комбинированная терапия злокачественных опухолей с использованием ультразвукового воздействия (экспериментальное исследование). Материалы III съезда онкологов и радиологов. 25-28 мая.-2004 г.- Минск.-.стр.326-327.
2. Калишьян М.С., Седакова Л.А., Андронова Н.В., Райхлин Н.Т., Герасимова Г.К.
Возможность проведения неоадьювантной полихимиотерапии рака молочной железы у собак с использованием каталитической системы терафтал+аскорбиновая кислота. РБЖ, 2007 г.-т.6.- №1-стр.33.
3. Калишьян М.С., Якунина М.Н., Трещалина Е.М. Сравнительный анализ спонтанных злокачественных опухолей молочной железы собак и человека (подходы к неоадьювантной химиотерапии). Часть 1. Российский ветеринарный журнал. Мелкие домашние и дикие животные. 2009г. - №2. стр. 41-43.
4. Калишьян М.С., Якунина М.Н., Трещалина Е.М. Сравнительный анализ спонтанных злокачественных опухолей молочной железы собак и человека (подходы к неоадьювантной химиотерапии) Часть 2. Российский ветеринарный журнал. Мелкие домашние и дикие животные. 2009г. - №3. стр. 42-43.
5. Калишьян М.С., Седакова Л.А., Райхлин Н.Т., Трещалина Е.М., Лукашева Е.В.
Эффективность неоадьюватной химиотерапии по схеме AС в сочетании c бинарной каталитической системой терафтал+аскорбиновая кислота на модели рака молочной железы мышей, Российский биотерапевтический журнал. 2009 г.№3 том 8 стр. 51-57.
Список сокращений А – адриамицин;
АК - аскорбиновая кислота;
БКС - бинарная каталитическая система;
ВОЗ – Всемирная организация здравоохранения;
ЛД – летальная доза;
ЛП – лечебный патоморфоз;
МПД – максимально переносимая доза;
НАХТ – неоадьювантная химиотерапия;
ОЭ общий эффект;
ПП прогрессирование процесса;
– – ПР - полная ремиссия;
РМЖ - рак молочной железы;
РП - рецепторы прогестерона;
РЭ рецепторы эстрогенов;
С – циклофосфан;
СТ – стабилизация;
ТРО - торможение роста опухоли;
ТФ – терафтал;
ЧР – частичная ремиссия.
Калишьян Михаил Сергеевич (Российская Федерация) «Неоадьювантная комбинированная химиотерапия рака молочной железы животных с использованием адриамицина, циклофосфамида и бинарной каталитической системы «Терафтал+аскорбиновая кислота» В работе изучено влияние бинарной каталитической системы (БКС) «Терафтал+аскорбиновая кислота» на эффективность неоадьювантной химиотерапии по схеме адриамицин(доксорубицин)+циклофосфамид (АС) на опухолевых моделях мышей с различными биохимическими характеристиками, иммунологическими свойствами, видовой принадлежностью и происхождением, а также на спонтанном раке молочной железы собак. При проведении исследования апробирован доклинический подход к оценке прогностической значимости моделей рака молочной железы с различным рецепторным статусом для выбора метода неоадьювантной химиотерапии рака молочной железы собак. В результате выявлена значимая эффективность новой схемы лечения АС+БКС в сравнении с АС на мышиной модели (РЭ+, Her2-) и отсутствие положительного ответа опухоли человека (РЭ-, Her2+++) и собак (РЭ+/-, Her2?). Определены эффективные дозы и последовательность введения комбинантов, оценена переносимость лечения.
Сделаны выводы о перспективности новой схемы АС+БКС для клинического изучения при НАХТ РМЖ человека и нецелесообразности применения для НАХТ РМЖ собак.
Определена прогностическая значимость модели РМЖ человека SKBR3 для РМЖ собак.
Mikhail S. Kalishyan (Russian Federation) “Neoadjuvant combined chemotherapy of animal mammary cancer with adriamycin, cyclophosphamide and binary catalytic system "Teraftal + ascorbic acid" The investigation of new schedule neoadjuvant chemotherapy with binary catalytic system (BСS) "Teraftal + ascorbic acid" and well known combination of adriamycin (or doxorubicin) + cyclophosphamide (AC) was carried out in the different tumor models in animals: mice with transplantable mammary cancer or dogs with spontaneous thats. The tumor models were with different characteristics of biochemical (receptor status of estrogenic and epidermal growth factor), immunological, species identity, and origin was determinate. The study tested preclinical approach to assess the prognostic significance of models of mammary cancer with different receptor status to select the method of neoadjuvant chemotherapy for canine mammary cancer.
The result revealed a significant efficiency of new treatment regimens AC + BСS compared with the AA on the mice model (ER+, Her2-) and the lack of positive response of human tumors (ER-, Her2+++) and canine mammary cancer (ER+/-, Her2?). Determined effective doses and the sequence of introduction of drugs, evaluated tolerability of treatment. The conclusions about the prospects of the new scheme AC + BСS for clinical study in human breast cancer neoadjuvant chemotherapy and inappropriate use for canine mammary cancer neoadjuvant chemotherapy.
To evaluate prognostic significance of a model human breast cancer SKBR3 for canine mammary cancer.