Периферичекий и аксиальный домены хромосомного скэффолда: структура и динамика в клеточном цикле

На правах рукописи

Шеваль Евгений Валерьевич ПЕРИФЕРИЧЕКИЙ И АКСИАЛЬНЫЙ ДОМЕНЫ ХРОМОСОМНОГО СКЭФФОЛДА: СТРУКТУРА И ДИНАМИКА В КЛЕТОЧНОМ ЦИКЛЕ 03.01.03 – молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва – 2011

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Поляков Владимир Юрьевич Научные оппоненты: доктор биологических наук Глазков Михаил Васильевич доктор биологических наук Коломиец Оксана Леонидовна доктор биологических наук Попенко Владимир Иванович

Ведущая организация: Институ т биоорганической химии имени М.М.

Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится «_» 2011 г. в _ часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.76. по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, ГСП-2, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, ауд. 536.

C диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «_»2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, И.А. Крашенинников кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Изучение особенностей организации и функционирования генома является одним из наиболее важных разделов современной биологии. За последние годы в этой области достигнут существенный прогресс, однако, до настоящего времени остается не решенной одна из ключевых проблем, а именно, проблема компактизации ДНК в составе митотических хромосом. За более чем столетнюю историю изучения сменилось несколько общепринятых и, как казалось, окончательных гипотез, однако, уровень наших сегодняшних знаний в этом чрезвычайно важном направлении совершенно неудовлетворителен.

Для теоретического обобщения экспериментальных данных в генетике, клеточной и молекулярной биологии широко используется подход, связанный с моделированием структуры хромосом. Анализ соответствующей литературы показывает, что большинство предлагаемых моделей представляют собой графическую прорисовку полученных в одной или нескольких работах данных, т.е.

собственно моделями не являются. Так же опубликовано множество умозрительных моделей, зачастую оторванных от реальных наблюдений. В отличие от теоретической физики, где существуют достаточно строгие правила выдвижения моделей и жесткие требования к их последующей эмпирической проверке, построение моделей хромосом является подчас способом ухода от рассмотрения этой клеточной структуры во всей ее сложности. В особенности, это относится к работам, в которых a priori отвергаются все данные (даже полученные в эксперименте!), не согласующиеся с предлагаемой моделью.

В последние годы наибольшее распространение получили две модели, принципиально по-разному трактующие морфологию хромосом (рис. 1). Первая из них, радиально-петельная модель, была сформулирована в 1977 году (Laemmli et al., 1977) и в течение почти двух десятилетий была общепринятой. Ключевая идея этой модели состоит в том, что в интерфазных и митотических хромосомах имеются скелетные структуры (ядерный матрикс в интерфазе и хромосомный скэффолд в митозе), устойчивые к экстракции 2M NaCl или полианионами. В составе митотических хромосом негистоновые белки, которые, как полагают, организуют Рис. 1. Актуальные модели структурной организации митотических хромосом. (А) – радиально-петельная модель. Хромосомный скэффолд локализуется в осевой области хромосом и играет роль белкового скелета. Фибриллы ДНК периодически взаимодействуют со скэффолдом, образуя петлевые домены. (Б) – хромонемная модель иерархического фолдинга). Данная модель рассматривает (модель митотическую хромосому как результат последовательного сворачивания молекулы ДНК в ряд иерархически соподчиненных фибриллярных структур – нуклеосомная фибрилла, фибрилла диаметром 30 нм, элементарная хромонема (100-130 нм), профазная хроматида (~250 нм).

скэффолд, локализуются в аксиальных областях. К скэффолду прикрепляется ДНК, формируя петлевые домены, компактизирующиеся при участии гистоновых белков.

Вторая модель, получившая широкое распространение в последнее десятилетие, – хромонемная модель или модель иерархического фолдинга. Современная интерпретация хромонемной модели отталкивается от многократно повторенных наблюдений о существовании в составе митотических хромосом 100-130 нм фибрилл – элементарных хромонем (Sparvoli et al., 1965;

Ченцов, Поляков, 1974;

Belmont et al., 1989). Недавно было показано, что кроме хромонем в составе хромосом можно выявить еще один уровень компактизации ДНК – фибриллы толщиной около 250 нм (Strukov et al., 2003). Есть основания предполагать, что эти фибриллы представляют собой ранне-профазные хроматиды, но окончательно проблема еще не решена. Таким образом, в хромонемной модели хромосома трактуется как система иерархически сопряженных уровней последовательной компактизации хроматина (нуклеосомная фибрилла – нуклеомерная фибрилла – элементарная хромонема – профазная хроматида – метафазная хроматида).

При сравнении радиально-петельной и хромонемной моделей следует учитывать следующее. Радиально-петельная модель сформулирована на основании изучения экстрагированных ядер и хромосом, в которых действительно выявляются осевой скелет и радиальные петли ДНК. Все дальнейшие построения, касающиеся компактизации таких хромосом in vivo, носят отчасти спекулятивный характер. Так, предполагается, что компактизация петлевых доменов происходит при участии только гистоновых белков, хотя экспериментальных доказательств этому факту не представлено. Известно, что солевая экстракция удаляет большую часть (по массе) как гистоновых, так и негистоновых белков, причем, экстрагируемые белки изучены достаточно слабо. Хромонемная модель отталкивается от изучения нативных или частично деконденсированных in vivo или in vitro хромосом (преимущественно с использованием электронного микроскопа, хотя в последние годы разработаны методы анализа и с использованием световой микроскопии).

Фактически, в настоящее время существуют два крайних подхо да к исследованию структурной организации хромосом, каждый из которых имеет свои достоинства и ограничения. В частности, скэффолд изучают на модели изолированных хромосом. Процесс изоляции хромосом требует проведения длительной инкубации в цитостатиках и короткой инкубации в гипотоническом растворе перед пермеабилизацией мембран в конденсирующем буфере. Т.е. работа идет с реконструированными in vitro К-метафазными хромосомами, которые могут по структуре отличаться от нативных метафазных хромосом. При использование такого подхода отсутствует возможность анализировать профазные и метафазные хромосомы, в которых высшие уровни организации хроматина проявляются в наиболее явном виде. Наконец, морфологически хромосомный скэффолд охарактеризован только на распластанных препаратах и совсем не исследован с помощью техники ультратонких срезов. Таким образом, все имеющиеся (весьма скудные) данные о ключевом элементе радиально-петельной модели – хромосомном скэффолде – получены в достаточно неудачных с точки зрения хромонемной модели экспериментальных системах.

В этом контексте чрезвычайно актуальным представляется получение экспериментальных данных о структуре и динамике хромосомного скэффолда на разных этапах митоза, с использованием электронно-микроскопических и иммуноцитохимических методов анализа.

Цели и задачи исследования Целью настоящей работы является изучение структуры хромосомного скэффолда и ядерного матрикса и их роли в поддержании структурной целостности макромолекулярных комплексов хроматина.

В работе поставлены следующие задачи:

1) Разработать метод выявления хромосомного скэффолда на всех этапах митоза.

2) Выявить фракции белков хромосомного скэффолда устойчивые и неустойчивые к солевой экстракции.

3) Изучить особенности структурной организации хромосомного скэффолда на всех стадиях митоза.

4) Охарактеризовать структурную организацию промежуточных уровней компактизации петлевых доменов.

Научная новизна работы Разработан новый метод экстракции белков из клеток, растущих в прикрепленном состоянии. Выявлены и охарактеризованы с использованием морфологических подходов фракции устойчивых и неустойчивых к солевой экстракции белков, входящих в перихромосомный слой хромосом на всех этапах клеточного цикла и в некоторых экспериментальных состояниях. Впервые показано, что хромосомный скэффолд состоит из двух структурных компонентов – периферического и аксиального. Показано, что периферический домен хромосомного скэффолда представляет собой результат агрегации белков перихромосомного слоя.

Представлено полное описание ультраструктурной организации трансформаций компонентов, образованных белками перихромосомного слоя, в ходе клеточного цикла. Представлены экспериментальные доказательства в пользу упорядоченной упаковки петлевых доменов и получены свидетельства участия в их компактизации негистоновых белков, не вхо дящих в состав остаточных структур.

Научное значение работы Данная работа является фундаментальным научным исследованием, направленным на выяснение принципов структурной организации митотических хромосом животных. Проведенные исследования углубляют и расширяют наши знания о высших уровнях компактизации хроматина и принципах структурной организации митотических хромосом и интерфазных ядер животных.

Апробация работы Результаты диссертационной работы были представлены на теоретических семинарах отдела электронной микроскопии НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ. Отдельные аспекты работы представлялись на Московском семинаре по клеточной биологии, семинарах в Институте общей генетики имени Н.И. Вавилова РАН, Съездах общества клеточных биологов (2003, 2007), Всероссийских совещаниях “Структура и функции клеточного ядра” (2005, 2010), Российских конференциях по электронной микроскопии (2008, 2010), Международной научной конференции в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии” “Биотехнология (2004), Международной научно-практической конференции “Перспективы и проблемы развития биотехнологии в рамках единого экономического пространства стран содружества” (2005), Международной научной конференции “От классических методов генетики и селекции к ДНК-технологиям” (2007), Всероссийском конгрессе “Симбиоз-2009”, Совещании по структуре клеточного ядра (The Wilhelm Bernhard Workshop) (2005), конгрессе FEBS (2006) и 50-м симпозиуме ASCB (2010).

Публикации, по теме диссертации По результатам диссертационной работы опубликовано 21 статья в журналах, статья в сборнике, 15 тезисов стендовых сообщений и докладов.

Объем и структура диссертации Диссертационная работа изложена на 170 страницах и состоит из следующих разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты, Заключение, Выводы, Список литературы и Приложение. Иллюстративный материал включает 44 рисунка.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ Метод визуализации хромосомного скэффолда в делящихся клетках Наиболее адекватной моделью для изучения структурной организации и динамики хромосомного скэффолда являются культивируемые клетки. Однако для того чтобы иметь возможность анализировать хромосомный скэффолд методом электронной микроскопии на всех стадиях клеточного деления, необходимо точно выявлять клетки нужных фазы митоза в световом микроскопе. С этой целью разработан метод экстракции гистонов из культивируемых клеток in situ. Суть метода состоит в том, что клетки, растущие на покровном стекле, пермеабилизируют в буфере, содержащем 5мМ MgCl2, а затем инкубируют в экстрагирующем растворе.

Экстракцию проводили по методам, принятым в молекулярной биологии для анализа скэффолда и ядерного матрикса. Основное преимущество предложенного метода – нет необходимости проводить обработку цитостатиками и инкубировать клетки в гипотонических условиях, что может приводить к модификации или разрушению высших уровней компактизации хроматина.

В хо де солевой экстракции морфологическая организация клеток сильно изменяется. Для того, чтобы анализировать клетки с использованием электронной микроскопии (включая иммуноэлектронную микроскопию) необходимо точно выявлять клетки интересующих стадий с использованием только фазового контраста (т.е. простого и относительно малоинформативного метода). Для выработки критериев распознавания клеток разных стадий митоза после экстракции в режиме фазового контраста мы провели эксперименты по визуальному наблюдению процесса экстракции. С этой целью мы находили и фотографировали митотические клетки сразу после пермеабилизации, затем проводили солевую (2M NaCl) экстракцию, после чего клетки фотографировали повторно (рис. 2). Интерфазные ядра после экстракции слегка набухают. Особенности организации ядрышка позволяют достаточно точно дифференцировать интерфазу и профазу, но отличить разные стадии профазы на основе одного только фазового контраста невозможно.

Хромосомы внутри экстрагированных профазных ядер, метафазных и анафазных клеток не выявляются. Центральная область метафазных клеток занята зоной деконденсированных хромосом. В анафазных клетках можно видеть две такие зоны.

Разные этапы телофазы и ранней G1 легко различаются на основании анализа формы клеток и структуры остаточных ядрышек.

Таким образом, уже на основании одного метода наблюдений (фазового контраста) удается выявить все основные стадии митоза после солевой экстракции.

Более дробное выявление этапов митоза возможно в случае проведения иммуноцитохимии, т.е. на основании анализа распределения исследуемых антигенов.

Рис. 2. Определение структурных особенностей экстрагированных клеток различных стадий митоза. Клетки фотографировали дважды: один раз сразу после пермеабилизации (верхний ряд) и повторно после экстракции (нижний ряд). Ядрышки интерфазных, профазных и телофазных клеток обозначены стрелками;

хромосомы профазных, метаф азных и анафазных клеток – маленькими треугольными стрелками;

остаточное тельце телофазной клетки – большой треугольной стрелкой.

Предложенный способ экстракции апробирован на фибробластах мыши L929 (рис. 2), на клетках XL-2 (фибробласты Xenopus laevis), HeLa (карцинома человека) и СПЭВ (эмбриональная почка свиньи). Во всех перечисленных типах культивируемых клеток удается обнаружить клетки всех стадий митоза, причем никаких значимых о тличий от приведенного выше описания выявлено не было.

Таким образом, разработан метод, позволяющий анализировать скэффолд митотических хромосом на различных стадиях митоза с использованием современных методов анализа.

Хромосомный скэффолд образован двумя структурными компонентами – периферическим и аксиальным Перед экстракцией пермеабилизированные клетки можно обработать нуклеазами (ДНКаза I или смесь ДНКазы I и РНКазы А), удалив таким образом материал петлевых доменов. Морфологическое описание хромосомного скэффолда мы начнем именно с таких, предобработанных нуклеазами клеток. Как видно на рис. 3А остаточные хромосомы на стадии метафазы представляют собой сложно организованные структуры, включающие два компонента – периферический и аксиальный домены. Периферический домен, который в виде сплошного футляра окружает аксиальный, обладает высокой плотностью;

аксиальный элемент имеет более диффузную структуру. Для идентификации природы этих дву х компонентов использована иммуноэлектронная микроскопия. В работе мы анализировали два белка: (1) мажорный белок аксиального хромосомного скэффолда – топоизомеразу II и (2) белок перихромосомного слоя – pKi-67.

В клетках, фиксированных in situ, исследуемые белки выявляются либо на периферии хромосом – pKi-67 (рис. 3Б), либо в аксиальных районах метафазных хроматид – топоизомераза II (рис. 3В). Аксиальный домен остаточных хромосом содержит топоизомеразу II (рис. 3Г), т.е. соответствует аксиальному хромосомному скэффолду. Периферический домен остаточных хромосом метится антителами к pKi 67, т.е. является результатом индуцированной солью агрегации компонентов перихромосомного слоя (рис. 3Д). Учитывая, что оба элемента, периферический и аксиальный, обладают общим свойством, а именно, устойчивостью к солевой экстракции, термин хромосомный скэффолд формально справедлив для обоих компонентов остаточных хромосом. В тоже время, полученные нами данные позволяют особо выделить ранее не идентифицированную субструктуру остаточных хромосом – периферический хромосомный скэффолд.

В радиально-петельной модели постулируется, что со скэффолдом взаимодействуют специфические участки хромосом – основания петлевых доменов, которые в зависимости от способов выявления носят название SARs (scaffold associated regions) или MARs (matrix associated regions) (см. обзор: Razin et al., 1995).

Важно определить, взаимодействуют ли основания петлевых доменов с периферическим доменом остаточных хромосом или только с аксиальным. Для этого клетки перед экстракцией обрабатывали ДНКазой I, добиваясь, чтобы в хромосомах осталось минимально детектируемое количество ДНК. Остатки ДНК выявляются преимущественно в аксиальной области остаточных хромосом, меченной топоизомеразой II (рис. 3Е). Это свидетельствует о том, что периферический хромосомный слой не участвует в организации петлевых доменов, по крайней мере, в таком роде, как это свойственно белкам аксиального скэффолда.

Рис. Периферический хромосомный скэффолд. Электронная микроскопия 3. (А) экстрагированной метафазной клетки скэффолд обозначен стрелкой, (аксиальный периферический – треугольной стрелкой). (Б) Локализация pKi-67 в метафазной клетке.

Гранулы серебра распределены преимущественно на периферии хромосом (треугольные стрелки). (В) Топоизомераза II локализуется в аксиальном районе метафазных хроматид (стрелки). (Г) Аксиальный домен экстрагированных хромосом содержит топоизомеразу II (стрелки). (Д) Периферический хромосомный скэффолд содержит pKi-67 (треугольные стрелки). (Е) Локализация фрагментов ДНК, ассоциированных с хромосомным скэффолдом.

М асштабная линейка – 1 мкм.

Следует отметить, что известны экспериментальные данные, которые косвенно свидетельствуют в пользу существования периферического домена хромосомного скэффолда. Включение белков перихромосомного слоя в состав хромосомного скэффолда было неоднократно описано в литературе. Например, фракционирование белков хромосом, поверхность ко торых метилась тритием, показало, что белки периферии хромосом входят в состав хромосомного скэффолда (Belyaev et al., 1992).

С использованием иммуноцитохимии было показано, что белки перихромосомного слоя – pKi-67 (Verheijen et al., 1989) и LFM-1 (Vega-Salas et al., 2002), не экстрагируются из хромосом (т.е. являются белками скэффолда). Недавно были опубликованы результаты протеомного изучения белков хромосомного скэффолда (Gassmann et al., 2005). Среди выявленных 79 белков 9 локализуются в митозе на периферии хромосом (среди них: В23/нуклеофозмин, фибрилларин и др.). Все эти факты были проигнорированы, т.к. противоречили общепринятой радиально петельной модели (что, впрочем, не помешало авторам бесстрашно их опубликовать).

Существование периферического хромосомного скэффолда ни в коей мере не снижает ценность экспериментальных данных накопленных в рамках радиально петельной модели. Но, наверное, не стоит думать, что белки устойчивые к экстракции обязательно играют структурную роль или, что экстрагируемые белки не играют такой роли. Теоретически некоторые структурные негистоновые белки могут взаимодействовать с хроматином таким образом, что солеустойчивые комплексы формироваться не будут (сходно с гистоновыми белками).

Белки перихромосомного слоя входят в состав хромосомного скэффолда и ядерного матрикса на протяжении всего клеточного цикла Для анализа ассоциации белков перихромосомного слоя с остаточными структурами в митозе мы использовали клетки, обработанные 2M NaCl без предварительной нуклеазной обработки. Анализ проводился с использованием световой иммуноцитохимии, стандартной электронной и иммуноэлектронной микроскопии. Последний метод позволяет составить наиболее полную картину, поэтому ниже приводятся результаты выявления pKi-67 в экстрагированных клетках всех стадий митоза на ультраструктурном уровне.

В экстрагированных интерфазных ядрах pKi-67 выявляется в периферическом слое ядрышка и в составе небольших агрегатов на периферии ядра в контакте с остаточной ядерной оболочкой (рис. 4А, Б). На этапе ранней профазы pKi- обнаруживается в агрегатах неправильной формы (иногда удлиненных), которые могут соответствовать скэффолдам профазных хромосом (рис. 4В, Г). В некоторых Рис. 4. Иммуноэлектронное выявление pKi-67 в экстрагированных клетках HeLa. (А) Интерфазное ядро и (Б) его фрагмент при большем увеличении. Остаточные ядрышки (ядрышковый матрикс) обозначены буквой Я, скопления pKi-67 в нуклеоплазме стрелкой.

(В, Г) Ранняя профаза. Остаточные хромосомы (маленькие стрелки) содержат гомогенно распределенный pKi-67. (Д, Е) Поздняя профаза. Кольцевидные pKi-67-содержащие структуры, по-видимому, соответствуют остаточному перихромосомному слою,т.е.

периферическому хромосомному скэффолду (маленькие стрелки). (Ж) Общий вид экстрагированной метафаз ной клетки. pKi-67 выявляется в многочисленных плотных тельцах (маленькие стрелки на панели З). (З) Также удается выявить скопления материала, окруженные радиально расходящимися фибриллами дегистонизированной ДНК (маленькие треугольные стрелки). Предположительно эти комплексы являются фрагментами аксиального скэффолда. (И) Окрашивание антителами к топоизомеразе II подтверждает это предположение. (К, Л) Фрагментация периферического хромосомного скэффолда. (К) Участок метафазной клетки с поперечными срезами остаточных хромосом разной степени разрушенности (большие треугольные стрелки) и (Л) серийные срезы (1-6) одной из этих хромосом. (М) Анафазная клетка и (Н) фрагмент этой клетки при большем увеличении.

Остаточные хромосомы обозначены большими треугольными стрелками, отдельные скопления материала периферического хромосомного скэффолда – маленькими стрелками, аксиальный скэффолд – маленькими треугольными стрелками. (О) Ранняя и (П) поздняя телофаза. На вставках представлены увеличенные изображения остаточных проядрышек (пя). М асштабная линейка: А, В, Д, Ж, К, М, О, П – 2 мкм, Б, Г, Е, З, И, Л, Н – 0,5 мкм.

профазных клетках (поздние профазы) pKi-67 связан с дискретными агрегатами, формирующими кольцевидные структуры (рис. 4Д, Е). Вероятнее всего, в данном случае удается видеть остаточные хромосомы, в которых произошло формирование перихромосомного слоя. В метафазных клетках выявляются многочисленные агрегаты, содержащие pKi-67 (рис. 4Ж, З). На первый взгляд, эти комплексы бессистемно заполняют всю зону деконденсированных хромосом. Похожие комплексы выявляются и после окрашивания антителами к топоизомеразе II (рис.

4И). Но от комплексов, содержащих топоизомеразу II, радиально расходятся фибриллы ДНК. На некоторых срезах можно было наблюдать, как комплексы, содержащие pKi-67, окружают агрегаты с радиально-расходящимися фибриллами ДНК (рис. 4З). Изредка удается обнаружить неразрушенные фрагменты скэффолда Выявляются они преимущественно на периферии зоны (рис. 4К).

деконденсированных хромосом. При анализе серийных ультратонких срезов можно наблюдать, что при приближении к центру клетки скэффолд становится фрагментированным (рис. 4Л). По-видимому, в ходе экстракции выпетливающиеся фибриллы ДНК оказывают давление на хромосомный скэффолд (и на аксиальный, и на периферический его домены), что ведет к распаду единой структуры на дискретные, связанные между собой элементы. Как будет показано ниже, такой же распад мы наблюдали и в ходе изучения блоков прицентромерного гетерохроматина интерфазных ядер фибробластов мыши, т.е. эта особенность, вероятно, является общей для всех комплексов конденсированного хроматина как в митозе, так и в интерфазе.

Аналогичные комплексы выявлены и в анафазных клетках, но на этой стадии чаще, чем в метафазе выявляются неразрушенные фрагменты остаточных хромосом (в большинстве случаев – дистальные участки плечей анафазных хроматид) (рис. 4М, Н). Если фрагменты достаточно протяженные, то можно видеть, что периферический скэффолд неоднороден (стрелки на рис. 4Н).

В ядрах телофазных клеток метка выявляется в формирующихся ядрышках и проядрышках. Для ранней телофазы характерны проядрышки удлиненной или неправильной формы (рис. 4О). На завершающих этапах телофазы выявляются округлые проядрышки (рис. 4П). Важно отметить, что проядрышки являются частью внутренней сети ядерного матрикса и ничем морфологически от окружающего материала не отличаются.

Мы также проанализировали ассоциацию pKi-67 с остаточными структурами в нескольких экспериментальных системах, и во всех случаях мы наблюдали ассоциацию части белка с остаточными структурами. По-видимому, периферический домен хромосомного скэффолда представляет собой результат индуцированной солевым раствором агрегации белков перихромосомного слоя. Причем, компоненты перихромосомного слоя входят в состав остаточных структур на протяжении всего клеточного цикла.

Ассоциация белков с остаточными структурами В данном разделе приведены некоторые полученные нами данные об остаточных структурах интерфазного ядра (ядерном матриксе). Учитывая важную роль, которая приписывается в радиально-петельной модели этому образованию, можно ожидать хорошей изученности белков ядерного матрикса. Однако существует один парадокс, который так и не получил объяснения в литературе. Во фракции ядерного матрикса выявляется всего несколько процентов суммарного ядерного белка, т.е. большая часть негистоновых белков не является белками ядерного матрикса. В то же самое время, Рис. 5. Частичная экстракция белка ядерного матрикса PCNA из ядер в ходе солевой экстракции. С матриксом связан только PCNA, входящий в состав репликационных комплексов. Нуклеоплазматический белок как реплицирующихся, так и нереплицирующихся (стрелки) клеток удаляется в ходе экстракции.

Нематриксный PCNA можно удалить и без экстракции путем инкубации клеток в растворе низкой ионной силы, содержащем -меркаптоэтанол или дитиотреитол.

Причем, в последнем случае потеря белка столь велика, что эффект заметен даже при окрашивании неспецифическими гистологическими красителя ми.

нам не удалось найти в литературе упоминаний о негистоновых белках, не входящих в состав ядерного матрикса, как будто бы эти белки чрезвычайно редки. Мы рассмотрели эту проблему на нескольких экспериментальных моделях, из которых ниже будут описаны две.

Для работы мы использовали один из белков репликационного аппарата клеток – В нереплицирующихся клетках гомогенно распределен по PCNA. PCNA нуклеоплазме, в реплицирующихся клетках накапливается в сайтах репликации. Во время репликации только часть PCNA (20-30%) вхо дит в состав репликационного аппарата, большая же часть белка остается распределенной по нуклеоплазме (Bravo, Macdonald-Bravo, 1987). Мы показали, что с ядерным матриксом связан только белок, входящий в состав репликационных сайтов (рис. 5). Нуклеоплазматический белок (т.е. весь белок нереплицирующихся клеток и 70-80% белка реплицирующихся клеток) экстрагируется. Таким образом, ассоциация белка с ядерным матриксом есть свойство не столько самого белка, сколько тех комплексов, в состав которых белок входит.

Еще большее значение имеет другое наблюдение. Коровые гистоны, как известно, не вхо дят в состав ядерного матрикса. Обычно большая часть коровых гистонов входит в состав нуклеосом. Однако, если экспрессировать гистон H2B, то в течение некоторого времени в клетке существует заметная фракция белка, не вошедшего в состав нуклеосом. Мы измерили содержание гистона Н2В в ядерном матриксе таких клеток. Если в контрольных клетках ядерный матрикс содержит 2.5±1.49 от суммарного содержания гистона Н2В, то в клетках, в которых гистон не включился в состав нуклеосом в неэкстрагируемой фракции находится уже 23.4±15.15 белка (большой разброс объясняется тем, что количество белка в свободной фракции неодинаково в разных клетках). Т.е. коровый гистон Н2В “становится” белком ядерного матрикса. В этом также можно видеть свидетельство того, что устойчивость белка к экстракции определяется преимущественно свойствами его окружения. Из этого также следует, ч то нас не должно удивлять, что в состав остаточных структур входят белки, которые согласно радиально-петельной модели не играют структурной функции. И наоборот, нельзя a priori исключать, что структурные белки могут экстрагироваться солью. Это свойство говорит об особом способе взаимодействия с окружающими компонентами, но не о функции.

В заключении необходимо сделать следующее замечание. За последние десять лет получены многочисленные экспериментальные данные, свидетельствующие в пользу динамичного поведения белков в живой клетке (см. обзор: Misteli, 2008).

Большинство исследованных белков связывается со своими функциональными сайтами лишь на крайне короткое время, после чего начинает свободно перемещаться по ядру. Полученные нами данные по особенностям ассоциации с ядерным матриксом нескольких исследованных белков (PCNA, B23, pKi-67 и топоизомераза позволяют предположить, что с матриксом ассоциируют именно II) взаимодействующие со своими функциональными нефункциональными) (или сайтами связывания белки. Белок, свободно диффундирующий по ядру, экстрагируется солью. Это позволяет трактовать ядерный матрикс как некий мгновенный снимок всех белков, которые в момент пермеабилизации клеток были связаны со своими сайтами связывания. Иначе говоря, остаточные структуры могут служить для идентификации сайтов связывания (даже самого кратковременного, Рис. Электронная микроскопия клеток после экстракции в 6. 2M NaCl. (А) Иммуноэлектронное выявление топоизомеразы II в экстрагированной метафазной клетке;

(Б) увеличенный фрагмент клетки (обведен контуром на А). (В) Иммуноэлектронное выявление топоизомеразы II в экстрагированной анафазной клетке;

(Г) увеличенный фрагмент клетки (обведен контуром на В). Стрелки указывают на остаточные центромеры, большие треугольные стрелки – на хромосомный скэффолд, меленькие треугольные стрелки – на остатки цитоплазмы. Остаточные хромосомы, помеченные звездочкой (*), разделены на дискретные фрагменты. М асштабные линейки – 2 мкм (A, B);

0,5 мкм (Б, Г).

лишь бы оно оказалось солеустойчиво), но не для идентификации возможных функций белка.

Выявление хромосомного скэффолда и промежуточных структур компактизации петлевых доменов в экстрагированных митотических клетках После разработки нового метода получения хромосомного скэффолда мы предприняли попытку одновременно выявить компоненты, которые постулируются разными моделями. Идея состояла в следующем. Если проводится максимально сильную экстракцию, мы должны выявить только хромосомный скэффолд и развернутые петлевые домены. Учитывая, что при использовании разработанного протокола мы не разрушаем гипотонией высшие уровни компактизации хроматина, можно надеяться, что промежуточная по силе деконденсация позволит выявить одновременно и хромосомный скэффолд и какие-то промежуточные мотивы компактизации хроматина. Добиться такого эффекта можно двумя способами: (1) использовать протокол экстракции, удаляющей только часть белков хроматина, (2) предварительно стабилизировать хроматин, что позволит сохранить дополнительные белки хроматина даже после сильной экстракции.

Первый подход был реализован с использованием непродолжительной (10 мин) экстракцией полианионами (смесью сульфата декстрана и гепарина), которая приводит к значительному набуханию, но не к полному разрушению хромосом. При этом топоизомераза II выявляется в осевых районах набу хших хромосом. Весь дальнейший анализ проводили с использованием электронной микроскопии. В обработанных 2M NaCl клетках хромосомные скэффолды выявляются, как правило, в виде небольших комплексов или глобулярных), содержащих (нитчатых топоизомеразу II (рис. 6). От остаточных хромосом радиально расходятся фибриллы дегистонизированной ДНК. Метафазные клетки, обработанные смесью полианионов, устроены принципиально сходно, но вся зона деконденсированных хромосом пронизана сетью фибрилл ДНК, в составе которой легко угадываются отдельные элементарные комплексы, состоящие из расходящихся фибрилл ДНК (рис. 7А).

Особенно хорошо эти комплексы видны после конденсации фибрилл ДНК, индуцированной инкубацией экстрагированных клеток в буфере, содержащем 5мМ MgCl2 (рис. 7Б). Иммуноэлектронная микроскопия продемонстрировала, что топоизомераза II содержится в фрагментах хромосомного скэффолда, но не выявляется в составе описанных выше комплексов радиально-расходящихся фибрилл ДНК. Это позволяет сформулировать следующее предположение: выявленные комплексы представляют собой результат неполной экстракции петлевых доменов, причем после частичной экстракции хроматин имеет розеточную организацию.

Вторая модель, использованная для выявления комплексов компактизированных петлевых доменов, состоит в предварительной стабилизации хроматина облучением видимым светом в присутствии бромистого этидия. Стабилизация хроматина делает его более устойчивым к экстракции, после которой удается выявить многочисленные Рис. 7. Электронная микроскопия клеток, обработанных смесью сульфата декстрана и гепарина. (A) Общий вид экстрагированной метафазной клетки;

(Б) – фрагмент при большем увеличении. На врезке можно видеть дискретные элементы (треугольные стрелки) сети фибрилл ДНК, пронизывающей зону деконденсированных хромосом. Стрелками обозначены элементы, которые являются либо остаточными хромосомами, либо остатками цитоплазмы. (В) Конденсация дискретных элементов сети в буфере, содержащем ионы M g2+. (Г) – фрагмент при большем увеличении. Врезка демонстрирует особенности структурной организации элементов хроматиновой сети после конденсации. М асштабные линейки - 2 мкм (A, В);

0,2 мкм (Б, Г);

0,1 мкм (врезки на панеля х Б и Г).

комплексы хроматина, образованные радиально-расходящимися фибриллами дегистонизированной ДНК (т.е. также имеющими розеточную организацию).

Известно, что в частично деконденсированных in vitro хромосомах элементарные хромонемы представляют собой цепочку глобул – элементарных хромомеров (Zatsepina et al., 1983). Деконденсированные элементарные хромомеры выглядят как розетки, образованные электронно-плотной сердцевиной и окружающими ее петлями.

После частичной деконденсации конденсированного хроматина с последующим распластыванием хроматина на поверхности воды удается выявить розеточные комплексы хроматина, образованные плотной центральной гранулой и расходящимися от нее петлями ДНК (Sonnenbichler, 1969;

Prusov et al., 1983;

Ascoli et al., 1988). Общая длина ДНК в составе одной розетки 15-30 мкм, что сопоставимо со средней длиной петлевого домена (21.4 мкм согласно рассчетам Pienta, Coffey, 1984).

Таким образом, в литературе представлены данные, которые косвенно свидетельствуют в пользу упаковки ДНП-фибриллы в упорядоченные комплексы, имеющие после деконденсации/слабой депротеинизации розеточную организацию.

Мы отождествляем выявленные нами промежуточные структуры с элементарными хромомерами и трактуем их как результат упорядоченной упаковки петлевых доменов. Можно предположить, что в этой компактизации принимают участие белки, не входящие в состав остаточных структур митотических хромосом.

Синтетическая модель организации митотической хромосомы Как было указано во вводной части автореферата диссертации, в настоящее время наиболее распространены две модели организации митотических хромосом – радиально-петельная и хромонемная модели. В основе этих моделей лежат две различные группы наблюдений. Радиально-петельная модель основывается на данных, полученных в хо де изучения комплексов, получающихся после жесткой экстракции белков из хроматина. В рамках этой экспериментальной стратегии накоплен материал, который должен учитываться при построении любой модели.

Однако не менее надежный материал получен и в рамках хромонемной модели. Эта модель строится преимущественно на результатах анализа нативных (т.е.

фиксированных in situ) хромосом или частично деконденсированных in vivo или in vitro хромосом. Представляется, что каждая модель описывает только один из аспектов организации хроматина, но не единственный универсальный принцип. Но кроме точных эмпирических наблюдений обе модели содержат значительное число выводов и допущений, которые, как это характерно для теоретических умозаключений, по большей части неверны. В частности, в рамках радиально петельной модели постулируется, что в компактизации петлевых доменов не принимают участие негистоновые белки. Строго говоря, модель строилась в предположении, что в хромосомах существует прочный скелет, этот скелет должен быть устойчив к сильной эктракции, а все неустойчивые к экстракции компоненты не могут иметь структурной функции. Однако имеются данные о неустойчивости этого скелета к растворам низкой ионной силы (Hancock, 2000), что заставляет предполагать, что скелет не существует в хромосоме, а формируется под действием соли (т.е. соль вызывает агрегацию белков). Такая агрегация и формирование элементов, напоминающих ядерный матрикс, описаны в работе Tan et al., 2000.

Следовательно, нельзя исключить, что некоторые негистоновые структурные белки хроматина экстрагируются солью.

Хромонемная модель, отрицая существование хромосомного скэффолда как основы построения митотической хромосомы, игнорировала факт обогащения аксиального района белками аксиального скэффолда. В одном из недавних вариантов хромонемной гипотезы (Kireeva et al., 2004), предполагается, что белки скэффода обеспечивают сворачивание 250 нм профазной хроматиды в метафазную, действуя в виде некоего “клея”. Из этого следует, ч то аксиальный скэффолд может не принимать участие в организации петлевых доменов. Примем это положение, и рассмотрим к каким последствиям это приведет.

Стандартная радиально-петельная модель описывает хромосому, которая намного тоньше и длинней нормальной метафазной хромосомы. Попытка ввести в модель элементы спирализации скэффолда была опровергнута экспериментальными наблюдениями. Если допустить, ч то аксиальный скэффолд не принимает участия в организации петлевых доменов, то проблема просто исчезает. Напротив, снимается противоречие с хромонемной моделью. Трудно предположить, что от элементарного хромомера, который лежит на периферии хромосомы, тянутся основания петлевых доменов к аксиальному скэффолду. Но если аксиальный скэффолд не организует основания петлевых доменов, то ситуация проясняется.

Но что же организует тогда основания петлевых доменов? Вероятно, с основаниями петлевых доменов взаимодействуют белки хромосомного скэффолда (нельзя исключить, что те же белки, что организуют аксиальный скэффолд, хотя экспериментальные данные имеются только о взаимодействии топоизомеразы II с основаниями петлевых доменов).

Экстракция полианионами в наших условиях, по-видимому, не вызывает полного разрушения петлевых доменов (рис. 8), что макроскопически выражается в относительно несильном набухании хромосом (сравнительно с солевой экстракцией).

Это позволяет выявлять промежуточные комплексы компактизации петлевых Рис. 8. Синтетическая модель организации митотической хромосомы. (A-В) Этапы деконденсации хромосомы. (A) Конденсированная хромосома с аксиальным скэффолдом.

(Б) Набухшая хромосома после экстракции смесью сульфата декстрана и гепарина. (В) Хромосома, экстрагированная солевым раствором. Красным обозначен аксиальный скэффолд, содержащий топоизомеразу II, голубым - хроматин. (Г-Е) Этапы деконденсации хромонемы. (Г) Конденсированная 100-130 нм хромонема. (Д) Частичная экстракции смесью сульфата декстрана и гепарина позволяет выявить интермедиаты компактизации петлевых доменов, имеющие розеточную организацию. (Е) Петлевые домены после солевой экстракции. Красные прямоугольники – основания петлевых доменов (SARs/M ARs). (Ж) Общая схема организации митотической хромосомы. Компактизация петлевых доменов ведет к формированию 100-130 нм хромонемы. Элементы скэффолда, участвующие в формировании оснований петлевых доменов, включаются в состав конденсированной хромонемы. Хромонема сворачивается в 200-250 нм фибриллу, которая упаковывается в метаф азную хроматиду. Аксиальный скэффолд участвует в упаковке 200-250 нм фибриллы в метафазную хроматиду, но не в формирование хромонемы.

доменов, которые мы трактуем как деконденсированные хромомеры. Рисунок иллюстрирует вероятные шаги деконденсации хромомера при экстракции полианионами и 2M NaCl. В данной модели хромонема имеет прерывистую структуру и состоит из хромомеров, которые соответствуют петлевым доменам.

Деконденсация хромонемы ведет к формированию двух типов структур – розеток, как результат частичной деконденсации полианионами, или петлевых доменов, как результат полной деконденсации 2M NaCl. Таким образом, мы считаем и петлевые домены, и розетки образованиями, возникающими вследствие деконденсации хроматина. Какова истинная топология хроматиновой фибриллы внутри элементарного хромомера остается неясным.

На рисунке 8 приведена схема, которая учитывает сделанные в нашей работе наблюдения и одновременно обобщает некоторые положения радиально-петельной и хромонемной моделей. Хромосома формируется как результат конденсации петлевых доменов в упорядоченные структуры (возможно, при участии негистоновых белков, не входящих в состав ядерного матрикса/хромосомного скэффолда1 ). При сближении конденсировавшихся петлевых доменов формируется фибрилла нм 100- (хромонема). При этом основания петлевых доменов лежат внутри хромонемы.

Аксиальный скэффолд не участвует в организации петлевых доменов, а, согласно идее А.С. Белмонта, отвечает за упаковку 250 нм фибриллы в метафазную хроматиду.

Таким образом, в хромосоме сосуществуют два скэффолда: диффузный и аксиальный, причем первый участвует в компактизации хромонем, а второй – в компактизации 250 нм фибриллы.

Представленная схема не устраняет всех противоречий, которые можно найти в литературе, поэтому ее следует рассматривать, как рабочую модель, которая позволяет наилучшим образом трактовать данные настоящего исследования, а также значительный массив литературных данных.

Конститутивный гетерохроматин – модель для изучения ядерного матрикса специфического локуса хромосом Конститутивный гетерохроматин – локусы хромосомы, которые не содержат транскрибирующихся генов и не декомпактизуются в интерфазе. В ядрах клеток мыши домашней конститутивный гетерохроматин сблочен в дискретные структуры, в цитологической литературе называемые хромоцентрами. Показано, что хромоцентры представляют собой блоки гетерохроматина, локализованные в прицентромерных районах митотических хромосом.

Хромоцентры в культивируемых клетках мыши отчетливо видны при окрашивании ДНК красителем Хекст 33258 как округлые блоки, более яркие на фоне Высказывалось достаточно обоснованное предположение, что эту роль могут выполнять HM G-белки и BAF-1 (M arko, 2008). Однако экспериментальный базис этого предположения недостаточен для того, чтобы считать его чем-то большим, чем простая гипотез а.

основной массы диффузного хроматина. Необходимо отметить, что если при окрашивании Хекстом 33258 крупные хромоцентры имеют гомогенную структуру, т.е. ДНК распределена в составе хромоцентров гомогенно, то большой сателлит распределен в них неравномерно. Неоднородность распределения большого сателлита в хромоцентрах может определяться тем, что это не единственный тип сателлита, описанный в составе прицентромерного гетерохроматина (Kuznetsova et al., 2005), причем, показано, что разные сателлиты сгруппированы в отдельные кластеры (Kuznetsova et al., 2006).

В работе использовано два способа экстракции клеток – 2M NaCl и смесь полианионов (сульфата декстрана и гепарина). Гибридизация in situ показала, что оба протокола вызывают разрушение плотных хромоцентров, и сателлитная ДНК выявляется в виде многочисленных точек, плотность распределения которых уменьшается на периферии. В качестве основного маркера на хромоцентры были использованы антитела к топоизомеразе II – одному из наиболее изученных белков ядерного матрикса. Хромоцентры в контрольных клетках окрашиваются антителами практически гомогенно. После солевой экстракции клеток (без дополнительной нуклеазной обработки) интенсивность окрашивания нуклеоплазмы по сравнению с интенсивностью окрашивания хромоцентров уменьшается, что говорит о частичной экстракции белка. После экстракции морфология маленьких хромоцентров не изменяется, в то время как крупные хромоцентры сильно набухают и теряют гомогенность структуры – в их составе выявляются отдельные гранулы, обычно связанные в цепочки. ДНК после экстракции выхо дит за пределы ядер, однако в районах хромоцентров интенсивности флуоресценции Хекст 33258 остается повышенной. Таким образом, хромоцентры могут быть идентифицированы на основании распределения ДНК даже после экстракции. Однако размеры зоны повышенной яркости больше, чем размеры остаточных хромоцентров, выявляемых на основании окрашивания антителами к топоизомеразе II. Важно отметить, что интенсивность флуоресценции Хекст 33258 в районах остаточных хромоцентров не коррелирует с интенсивностью окрашивания антителами.

Окрашивание клеток, экстрагированных 2M NaCl после предварительной обработки ДНКазой I, также показывает, что топоизомераза II входит в состав ядерного матрикса хромоцентров, однако набухания хромоцентров, столь типичного для экстракции без предварительной нуклеазной обработки, не происходит.

Кроме солевой экстракции мы использовали экстракцию смесью полианионов (сульфата декстрана и гепарина). Экстракция без нуклеазной обработки приводит к набуханию хромоцентров, однако, характер этого набухания резко отличается от набухания хромоцентров после солевой экстракции. В последнем случае концентрация ДНК снижается по мере удаления от центра остаточных хромоцентров, и зоны повышенной концентрации ДНК не имеют четкой границы. Набухшие в результате экстрации полианионами хромоцентры сохраняют равномерность распределения ДНК и четкие контуры. Топоизомераза II выявляется во всем объеме набухших хромоцентров, но распределение белка не равномерно. Если экстракции предшествует обработка ДНКазой то выявляются плотные остаточные I, хромоцентры, локализация топоизомеразы II в которых идентична наблюдаемой после солевой экстракции.

Таким образом, анализ локализации топоизомеразы II в экстрагированных клетках показывает, что два разных типа экстракции приводят к различным результатам, если не проводилась обработка ДНКазой I. При солевой экстракции формируются структуры, которые можно назвать “мини-нуклеоидами”. Эти образования состоят из центральной области, содержащей топоизомеразу II, которую окружает гало из петель сателлитной ДНК. Центральная часть (т.е.

собственно ядерный матрикс) незначительно деконденсируются, что позволяет выявить содержащие топоизомеразу II гранулы и цепочки гранул, в то время как структура неэкстрагированных хромоцентров практически гомогенна. Экстракция полианионами ведет к заметному набуханию хромоцентров, но “мини-нуклеоиды” не формируются. Это косвенно свидетельствует о том, что и полной экстракции белков петлевых доменов и полной релаксации ДНК в данном случае не происходит. Если экстракции предшествовала обработка нуклеазой, то структура ядерного матрикса не зависит от использовавшегося для экстракции раствора.

Для изучения морфологии остаточных структур мы провели электронно микроскопическое изучение экстрагированных клеток. В клетках экстрагированных 2M NaCl без нуклеазной обработки внутри остаточных ядер выявляются остаточные ядрышки и отдельные фрагменты внутренней сети ядерного матрикса (рис. 9А).

Рис. 9. Электронная микроскопия клеток после экстракции 2M NaCl без предварительной обработки ДНКазой I (А–В) или после нуклеазной обработки (Г–Е). Для иммуноголдинга использовали антитела к топоизомеразе II (Б, В, Е). Стрелки – остаточные хромоцентры, треугольные стрелки – ядрышки. М асштабная линейка – 2 мкм (А, Б, Г), 0,5 мкм (В), 1 мкм (Д, Е).

Выявить остаточные хромоцентры не удается. С помощью иммуноэлектронной микроскопии ядрах экстрагированных солью без нуклеазной обработки выявляются скопления топоизомеразы II, которые соответствуют хромоцентрам (рис. 9Б). От этих скоплений радиально расходятся нити дегистонизированной ДНК, которые могут являться частью “мини-нуклеоидов”, выявляемых при гибридизации in situ (рис. 9В). Обращает на себя внимание, что топоизомераза II выявляется не в составе плотного материала (остаточных ядрышек или внутренней сети ядерного матрикса), а в составе отдельных, небольших, агрегатов устойчивого к экстракции материала, морфологически не связанных друг с другом.

В клетках обработанных ДНКазой I перед экстракцией остаточные ядрышки плотные, внутренняя сеть ядерного матрикса сформирована толстыми фибриллами, образующими плотную сеть (рис. 9Г). Рядом с ядрышками и на периферии ядер обнаруживаются менее плотные округлые образования, локализация которых совпадает с локализацией хромоцентров в нативных клетках (рис. 9Д). Мы показали, что это – остаточные хромоцентры (рис. 9Е).

После экстракции смесью полианионов ядра резко набухают (рис. 10А). Внутри остаточных ядер хромоцентры легко выявляются как округлые скопления тонко фибриллярного материала (рис. 10Б). При проведении иммуноголдинга такие образования содержат топоизомеразу II (рис. 10В). Анализ материала остаточных хромоцентров на большом увеличении показывает, что они образованы многочисленными фокусами радиально-сходящихся хроматиновых фибрилл. Если клетки предварительно обрабатывают ДНКазой, то морфология остаточных ядер сходна с таковой для случая солевой экстракции (рис. 10Г).

Таким образом, показано, что солевая экстракция клеток без предварительной нуклеазной обработки ведет к резкому набуханию остаточных хромоцентров.

Сходное набухание было описано выше для целых хромосом метафазных и анафазных хромосом. Неожиданной оказалась невозможность выявить ядерный матрикс хромоцентров в такой ситуации, тем более что в клетках, обработанных ДНКазой I, остаточные хромоцентры выявляются очень четко. Вероятнее всего, мы имеем дело именно со сложностью выявления, так как, судя по результатам иммуноцитохимии, эти элементы остаются. Выше мы описали, что набухание хромосомного скэффолда в ходе экстракции (выражающееся, в частности, в том, что Рис. Электронная микроскопия клеток после экстракции полианионами без 10.

предварительной обработки ДНКазой I (А–В) или после нуклеазной обработки (Г). Для иммуноголдинга использовали антитела к топоизомеразе II (В, Г). Стрелки – остаточные хромоцентры, треугольные стрелки – ядрышки. М асштабная линейка – 2 мкм (А), 0,25 мкм (В–Д).

длина остаточных хромосом в несколько раз больше, чем длина неэкстрагированных нативных хромосом) сопровождается его распадом на отдельные элементы. По видимому, это происходит в хо де экстракции под давлением петель дегистонизированной ДНК.

В случае экстракции полианионами выявить материал, который можно было бы надежно отождествить с ядерным матриксом, не удается. Таким образом, рассуждения, сделанные для солевой экстракции, можно распространить и на эту экспериментальную модель. Однако зона остаточных хромоцентров пронизана фибриллами ДНК, формирующими плотную сеть. В составе сети можно было выделить отдельные комплексы радиально-сходящихся фибрилл. Это наблюдение может свидетельствовать о том, что в случае такой обработки экстрагируются не все белки и, как следствие, петлевые домены полностью не разворачиваются. Т.е. таким способом визуализируются промежуточные структуры компактизации петлевых доменов.

О механизме формирования перихромосомного слоя В настоящее время показано, что большинство известных белков, участвующих в формировании различных структурно-функциональных комплексов интерфазного ядра и митотических хромосом, обладают высокой мобильностью. В частности, сказанное относится к белкам В23 и pKi-67, ко торый в интерфазе взаимодействует с различными компартментами ядрышка, а в метафазе входит в состав перихромосомного слоя. Молекулярные механизмы, с помощью которых высоко мобильные белки аккумулируются и удерживаются в ядерных компартментах и на периферии митотических хромосом, остаются, практически, не изученными.

В связи с тем, что большинство белков перихромосомного слоя являются по своему происхождению белками ядрышка, логично предположить, что удержание (retention) этих белков в ядрышках и хромосомах обеспечивается наличием одинакового “адреса”.

Для проверки этой гипотезы нами разработана экспериментальная модель, в которой культивируемые клетки трансформировались плазмидой, экспрессирующей белок коровой частицы нуклеосом Н2В. В норме этот белок входит в состав хроматина и, практически, не визуализуется в составе ядрышек. В клетках с Рис. 11. (A) – N-концевой участок гистона Н2В (положительно заряженные аминокислоты выделены красным) и участки белка, использованные для анализа. (Б) – все участки за исключением 1-11 приводят к накоплению EGFP в ядрышке. (В) –активность участка в качестве сигнала ядрышковой локализации (NoRS activity) коррелирует с зарядом тестируемой последовательности (Predicted charge). (Г) – наибольшей активностью обладают участки с наибольшей плотностью заряда, что косвенно св идетельствует об отсутствии четких границ у сигналов ядрышковой локализации.

эктопической экспрессией внедренного гена, Н2В динамически накапливается в составе ядрышек интерфазных клеток, и после экстракции оказывается в составе ядерного матрикса, тем самым, проявляя сходство с белками процессинга рРНК.

Нами показано, что накопление и удержание белка в ядрышке связано с N концевым участком гистона. Гистон Н2В, лишенный этого домена, в ядрышке аккумулироваться не способен. Стандартным способом выяснения роли того или Рис. 12. Ассоциация химерного белка EGFP-R9 (зеленый флуоресцирующий белок с девятью аргининами на С-конце) с перихромосомным слоем (стрелка) в метаф азе. Верхний ряд фотографий – общий вид клетки, нижний – фрагмент.

иного участка белка является анализ химерных белков, образованных флуоресцентным белком и тестируемой последовательностью. Для изучения механизма накопления мы создали несколько конструктов, представленных на рисунке 11А. Большинство из сконструированных белков аккумулировалось в ядрышке (рис. 11Б). Мы разработали способ количественной оценки уровня аккумуляции (т.е. активности тестируемого участка в качестве сигнала ядрышковой локализации). В результате была выявлена положительная корреляция между активностью участка белка в качестве сигнала ядрышковой локализации и его зарядом (рис. 11В). При этом существует корреляция и между удельной активностью и удельным зарядом последовательности (отнесенной к длине последовательности) (рис. 11Г). Наличие такой корреляции говорит о том, что активностью неравномерно распределена по N-концевому участку. Эти данные позволили предположить, что активность участка в качестве сигнала ядрышковой локализации связана с его положительным зарядом, а сами взаимодействия имеют электростатическую природу.

В дальнейшем для работы мы стали использовать белки, образованные EGFP и коротким участком, содержащим несколько (9-19) положительно заряженных аминокислот или аргининов). Такие белки также динамически (лизинов накапливаются в ядрышке и демонстрируют некоторые свойства ядрышковых белков (кроме накопления в ядерном матриксе). Для целей данной работы принципиально важно, что локализация таких конструктов в митозе повторяет локализацию белков позднего процессинга рРНК. В частности, искусственные белки аккумулируются на периферии митотических хромосом (рис. 12). Таким образом, накопление белков на поверхности митотических хромосом может определяться электростатическим взаимодействиями.

ВЫВОДЫ 1. Разработан метод анализа остаточных структур хромосом всех стадий митоза в клетках, культивируемых в прикрепленном состоянии.

2. Включение белков в состав остаточных структур определяется свойствами комплексов, в состав которых белки входят в момент экстракции клеток. Остаточные структуры могут служить для идентификации сайтов связывания высоко-динамичных белков, но не для идентификации возможных функций белков.

3. Хромосомный скэффолд состоит из двух структурно-обособленных доменов – аксиального и периферического.

4. Периферический домен хромосомного скэффолда представляет собой результат индуцированной солевым раствором агрегации белков перихромосомного слоя. Компоненты перихромосомного слоя входят в состав периферического скэффолда на протяжении всего клеточного цикла.

5. Неполная экстракция белков из хроматина позволяет одновременно выявлять в составе хромосом и остаточные структуры, и частично деконденсированные петлевые домены.

6. Предложена модель организации хромосом, по которой иерархия высших уровней компактизации хромосом поддерживается несколькими независимыми системами негистоновых белков – белками аксиального скэффолда и белками, компактизирующими петлевые домены.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах1. Sheval E.V., Prusov A.N., Kireev I.I., Fais D., Polyakov V.Yu. Organization of higher level chromatin structures (chromomere, chromonema and chromatin block) examined using visible light-induced chromatin photo-stabilization // Cell Biology International.

2002. V. 26. P. 587-591.

2. Sheval E.V., Kireev I.I., Polyakov V.Yu. Stabilization of macro molecular chromatin complexes in mitotic chromosomes by light irradiation in the presence of ethidium bromide // Cell Biology International. 2004. V. 28. P. 835-843.

3. Sheval E.V., Churakova J.V., Dudnik O.A., Vorobjev I.A. Examination of the proliferative activity of tumor cells in human lymphoid neoplasms using a morphometric approach // Cancer. 2004. V. 102. P. 174-185.

Шеваль Е.В., Курчашова С.Ю., Тимирбулатова Э.Р., Поляков В.Ю. Получение и 4.

характеристика препаратов ядерного матрикса и хромосомного скэффолда in situ // Цитология. 2005. Т. 47. С. 77-82.

Шеваль Е.В., Кожуро Ю.И., Максимова Н.П., Поляков В.Ю. О цитотоксическом 5.

действии гербицида трефлана на клетки корешков Hordeum vulgare L // Сельско хозяйственная биология. 2005. № 1. С. 120-125.

6. Sheval E.V., Po lzikov M.A., Olson M.O.J., Zatsepina O.V. A higher concentration of an antigen within the nucleolus may prevent its proper recognition by specific antibodies // European Journal of Histochemistry. 2005. V. 49. P. 117-124.

Поляков В.Ю., Зацепина О.В., Киреев И.И., Прусов А.Н., Фаис Д., Шеваль Е.В., 7.

Коблякова Ю.В., Голышев С.А., Ченцов Ю.С. Структурно-функциональная модель митотической хромосомы // Биохимия. 2006. Т. 71. С. 6-16.

8. Lidsky P.V., Hato S., Bardina M.V., A minev A.G., Palmenberg A.C., Sheval E.V., Polyakov V.Yu., van Kuppeveld F.J.M., Agol V.I. Nucleocytoplasmic traffic disorder induced by cardioviruses // Journal of Virology. 2006. V. 80. P. 2705-2717.

Шеваль Е.В., Поляков В.Ю. Роль хромосомного скэффолда в поддержании 9.

структурной целостности митотических хромосом // Онтогенез. 2006. Т. 37. С.

405-418.

10. Karpova O.V., Zayakina O.V., Arkhipenko M.V., Sheval E.V., Kiselyova O.I., Poljakov V.Yu., Yaminsky I.V., Rodionova N.P., Atabekov J.G. Potato virus X RNA mediated assembly of single-tailed ternary 'coat protein-RNA-movement protein' complexes // Journal of General Virology. 2006. V. 87. P. 2731-2740.

11. Sheval E.V., Polyakov V.Y. Visualization of the chromosome scaffold and intermediates of loop domain compaction in extracted mitotic cells // Cell Biology International. 2006. V. 30. P. 1028-1040.

12. Sheval E.V., Polyakov V.Y. The peripheral chromosome scaffold, a novel structural component of mitotic chromosomes // Cell Biology International. 2008. V. 32. P. 708 712.

13. Григорьев А.А., Булычева Т.И., Шеваль Е.В., Калинина И.А., Зацепина О.В.

Цитологические признаки подавления общего уровня синтеза белка, выявляемые с помощью новых моноклональных антител // Цитология. 2008. Т. 50. С. 338-346.

14. Sheval E.V., Kazhura Y.I., Poleshuk N.A., Lazareva E.M., Smirnova E.A., Maximova N.P., Polyakov V.Y. Trifluralin-induced disorganization of microtubular cytoskeleton alters the development of roots in Hordeum vulgare L // Acta Biologica Hungarica.

2008. V. 59. P. 465-478.

15. Голышев С. А., Вихрева П. Н., Шеваль Е. В., Кирьянов Г. И., Поляков В. Ю. Роль метилирования ДНК и посттрансляционных модификаций гистонов в организации и поддержании структуры гетерохроматиновых доменов (хромоцентров) // Цитология. 2008. Т. 50. С. 972-982.

16. Sheval E.V., Dudnik O.A., Abramchuk S.S., Polyakov V.Y. Perichromosomal layer proteins associate with chromosome scaffold and nuclear matrix throughout the cell cycle // Биологические мембраны. 2009. Т. 26. С. 126-142.

17. Волкова Е.Г., Курчашова С.Ю., Шеваль Е.В., Поляков В.Ю. Самоорганизация агрегатов мембран эндоплазматического ретикулума в клетках с гиперэкспрессией нуклеопорина POM121 // Биологические мембраны. 2009. Т.

26. С. 401-407.

18. Брагина Е.Е., Замятнина В.А., Гаврилов Ю.А., Шеваль Е.В., Волкова Е.Г., Курило Л.Ф., Шилейко Л.В., Левчук Т.Н., Кузьмичев Л.Н., Поляков В.Ю.

Упаковка хроматина и фрагментация ДНК: два типа нарушений наследственного материала сперматозоидов // Медицинская генетика. 2009. Т. 8. С. 29-35.

19. Шеваль Е.В., Поляков В.Ю. Структурная организации ядерного матрикса хромоцентров культивируемых фибробластов мыши // Цитология. 2010. Т. 52. С.

412-419.

20. Krupina K.A., Sheval E.V., Lidsky P.V. Variability in inhibition of host RNA synthesis by entero- and cardioviruses // Journal of General Virology. 2010. V. 91. P.

1239-1244.

21. Musinova Y.R., Lisitsyna O.M., Golyshev S.A., Tuzhikov A.I., Polyakov V.Y., Sheval E.V. Nucleolar localization/retention signal is responsible for transient accumulation of histone H2B in the nucleolus through electrostatic interactions // Biochimica et Biophysica Acta. 2011. V. 1813. P. 27-38.

Статьи в сборниках и тезисы докладов и стендовых сообщений 22. Шеваль Е.В., Курчашова С.Ю., Тимирбулатова Э.Р., Поляков В.Ю. Получение и характеристика остаточных структур интерфазных ядер и митотических хромосом культивируемых клеток in situ // Материалы 1-го Съезда Общества клеточной биологии. - Цитология. 2003. Т. 45. С. 947.

23. Шеваль Е.В., Кожуро Ю.И., Лазарева Е.М., Кононенко Н.В., Максимова Н.П., Поляков В.Ю. Особенности цитотоксического действия гербицида трефлана на клетки корешков Hordeum vulgare L // Материалы III Международной научной конференции в растениеводстве, животноводстве и “Биотехнология ветеринарии”, Москва. 2004. С. 157.

24. Шеваль Е.В., Кожуро Ю.И., Кононенко Н.В., Максимова Н.П., Поляков В.Ю.

Цитологический анализ нарушений онтогенеза, как метод изучения токсического действия гербицидов на сельскохозяйственные растения Материалы // Международной научно-практической конференции «Перспективы и проблемы развития биотехнологии в рамках единого экономического пространства стран содружества». Минск. 2005. С. 273.

25. Шеваль Е.В., Поляков В.Ю. Хромосомный скэффолд и высшие уровни компактизации митотических хромосом // Структура и функции клеточного ядра: Тезисы докладов и сообщений XV Всероссийского совещания. Цитология. 2005. Т. 47. С. 842.

26. Голышев С.А., Шеваль Е.В., Вихрева П., Поляков В.Ю. Гетерогенность структуры и состава хромоцентров в клетках линии L929 // Структура и функции клеточного ядра: Тезисы докладов и сообщений XV Всероссийского совещания.

- Цитология. 2005. Т. 47. С. 804.

27. Jarskaja O.O., Kunafina E.R., Sheval E.V., Olson M.O.J., Zatsepina O.V. Premature induction of nucleolus derived foci at metaphase of mitosis by inhibition of CDK-type kinases // 19th International Workshop on the Cell Nucleus (The Wilhelm Bernhard Workshop), Mnsterschwarzach Abbey, Germany, 2005, P. 33-34.

28. Kozhuro Yu., Sheval E., Poleshuk N., Polyakov V. Characteristics of the cytotoxic action of treflan on root cells of barley // 31st FEBS congress “Molecules in health & disease”. – The FEBS Journal. 2006. V. 273. Supplement 1. P. 112.

29. Шеваль Е.В., Поляков В.Ю. Периферический домен хромосомного скэффолда – новый парадокс клеточной биологии // Материалы II Съезда Общества клеточной биологии. - Цитология. 2007. Т. 49. № 9. С. 807.

30. Кожуро Ю.И., Шеваль Е.В., Максимова Н.П., В.Ю.Поляков. Программируемая гибель клеток в корневой меристеме ячменя индуцированная трефланом // Тезисы докладов IX съезда ОО «Белорусское общество генетиков и селекционеров» и Международной научной конференции «От классических методов генетики и селекции к ДНК-технологиям». 2007.

31. Шеваль Е.В., Волкова Е.Г., Голышев С.А., Курчашова С.Ю., Поляков В.Ю.

Особенности формирования ядерной оболочки при гиперэкспрессии ламина В1 // Материалы II Съезда Общества клеточной биологии. - Цитология. 2007. Т. 49. С.

806-807.

32. Sheval E.V. Cell population structure and tumor cell proliferative indices in lymphoid neoplasms // In Tumor markers research focus. Ed. D.H. Chang. 2007. P. 241-256.

33. Шеваль Е.В., Волкова Е.Г., Голышев С.А., Курчашова С.Ю., Поляков В.Ю.

Избыточная экспрессия белков ламины и поровых комплексов позволяет влиять на отдельные этапы формирования ядерной оболочки // Тезисы докладов XXII Российской конференции по электронной микроскопии. 2008. С. 329.

34. Волкова Е.Г., Шеваль Е.В. Избыточная экспрессия белков ламины и поровых комплексов позволяет влиять на процесс формирования ядерной оболочки.

Материалы II Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов “Симбиоз-2009” // 2009. С. 203-204.

35. Мусинова Я.Р., Лисицына О.М., Шеваль Е.В. Несопряженное с функционированием удержание белков в ядрышке: к вопросу о механизме действия сигналов ядрышковой локализации // XXIII Российская конференция по электронной микроскопии. Черноголовка, 2010. С. 394.

36. Мусинова Я.Р., Шеваль Е.В., Поляков В.Ю. Сигнал ядрышковой локализации в гистоне Н2В // Структура и функции клеточного ядра: Тезисы докладов и сообщений XVI Всероссийского совещания. - Цитология. 2010. Т. 52. С. 675-676.

37. Musinova Y.R., Lisitsyna O.M., Golyshev S.A., Polyakov V.Y., Sheval E.V. Non specific retention as a possible mechanism for histone H2B accumulation in the nucleolus // American Society for Cell Biology 50th Annual Meeting. P.